Métodos para detectar la resistencia a fármacos anti tuberculosis

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Spanish version regarding of drug susceptibility tests of M. tuberculosis.

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Métodos para detectar la resistencia a fármacos anti tuberculosis

  1. 1. Métodos para determinar la resistencia a los fármacos anti-tuberculosis 1“UN DÍA PARA ESTAR AL DÍA EN TUBERCULOSIS” H O S P I TA L R E B A G L I AT I ESSALUD Méd. Alberto Mendoza Ticona Instituto Nacional de Salud Unión Nacional Contra la Tuberculosis Instituto de Biotecnología y Salud
  2. 2. 2
  3. 3. Pruebas de diagnóstico Medicina basada en evidencias Como evaluar una prueba diagnóstica: - Para seleccionar una prueba a usar:  Sensibilidad  Especificidad - Para evaluar la credibilidad de los resultados de la prueba:  Valor predictivo positivo  Valor predictivo negativo  Coeficiente de probabilidades positivo  Coeficiente de probabilidades negativo  Nomograma de Fagan
  4. 4. Nomograma de Fagan 4
  5. 5. 5
  6. 6. Pruebas de susceptibilidad anti -TB 6 Pruebas Fenotípicas Pruebas genotípicasEnsayos de nitrato reductasa (Griess)* MTBDRplus y MTBDRslMODS* Xpert MTB/RIFEnsayos de fagos* INNO-LiPA Rif. TBEnsayos de agar en capa delgada Secuenciamiento de genes de resistenciaProporciones en medio LJ*Proporciones en agar 7H10, 7H11*Reacción de reducción con colorantesbiológicosSistema MGITSistema BACTEC 460 y 960* Pueden ser evaluados de manera directa o indirecta.
  7. 7. 7Métodos de Referencia
  8. 8. Pruebas de susceptibilidad convencionales 8 Pruebas fenotípicas  Ausencia de crecimiento de MTB en presencia de drogas.  Tres métodos importantes en medios sólidos:  Método de proporciones  Método de tasa de resistencia  Método de la concentración absoluta
  9. 9. Método de proporciones 9 Más ampliamente usado como referencia Medios sólidos: LJ, Ogawa, agar 7H10, 7H11 Proporción de resistencia > 1% (INH, RIF y PAS) Proporción de resistencia > 10% (demás drogas)
  10. 10. Concentraciones críticas de los principales antibióticos para el método de proporciones 10 Antibiótico LJ 7H10 7H11 INH 0,2 0,2 - 1,0 0,2 - 1,0 RIF 40,0 1,0 1,0 EMB 2,0 5,0 7,5 S 4,0 2,0 2,0 – 10,0 PAS 0,5 2,0 8,0 KM 20,0 5,0 6,0 ETH 20,0 5,0 10,0 Ofloxacina 2,0 2,0 2,0 Capremocyna 20,0 10,0 10,0 Cycloserina 40,0 30,0 30,0 Ciprofloxacina - 2,0 2,0Adaptado de: Kent y Kubica 1985; NCCLS 2000
  11. 11. Método de la razón de resistencia 11 Razón entre el MIC de una cepa problema sobre el MIC de una cepa de referencia (H37Rv)  Regla  Si MIC problema/MIC ref ≤ 2, sensible  Si MIC problema/MIC ref ≥ 8, resistente MIC: La menor concentración de droga con la que se obtiene un número de colonias menor de 20.
  12. 12. Método de la concentración absoluta 12 Usa un inóculo estandar Interpretación más fácil Usa concentración crítica de cada droga Compara con medio libre de drogas Interpretación:  Incubación entre 4 a 6 semanas  Sensible: Número de colonias < 20 con un control 3+ o 4+ en el crecimiento control.
  13. 13. BACTEC 460 13Becton – DickinsonMiddelbrook 7H9Acido palmítico – C14 (12B vial)El consumo del ac. graso produce CO2SIREPZConsiderado Gold Standar para dorgas de primera líneaSobre todo PZMás rápido que medio sólidoDesventajas:Descontinuación, costo y desechos radiactivos
  14. 14. MGIT 14 The Mycobacterial Growth Indicator Tube (BD) Versión manual y automatizada Contiene caldo Middlebrook 7H9 modificado unido a una sustancia fluorescente sensible al consumo de oxígeno. Requiere luz UV para revelar la fluorescencia Interpretación: la presencia de fluorescencia en el tubo con droga dentro de los dos días de reacción positiva del tubo control. Indirecto y Directo
  15. 15. BACTEC 960/320 15 Basado en el mismo principio, usa tubos MGIT Tiene una lectura automatizada Aprobado como Gold Estándar Buena concordancia con PS en medio sólido y BACTEC 460
  16. 16. 16 Métodos rápidos para TB-MDRBwanga F, et al. Direct susceptibility testing for multi drug resistant tuberculosis: A meta-analysis. BMC Infectious Diseases 2009, 9:67Disponible en: http://www.biomedcentral.com/1471-2334/9/67
  17. 17. Ensayo de Reducción de Nitratos (NRA) 17 Directo e Indirecto Reactivo de Griess Capacidad del MTB de reducir nitrato a nitrito. Reactivo de Griess Lectura:  Indirecto 7 y 14 días  Directo 14, 21 y 28 días Recientemente recomendado por la OMS. Incorporada al MINSA desde 2005
  18. 18. MODS (1) 18 Desarrollado en Perú, (Caviedes , 2000) Simultáneamente detecta TB y susceptibilidad a H, R y MDR Utiliza caldo 7H9, enriquecimiento OADC mezcla de antibióticos PANTA Principio: identificación mediante microscopio invertido de la formación de microcolonias características de MTB (cordones) Tiempo entre 7 a 21 días (para declarar negativo)
  19. 19. NaOH- NALC PBS 7H9 Centrifuga 15 min 3000g PANTA Vortex y dejelo Llene OADC 15 minutes tubo hasta 15ml Decontaminación de la muestra 900μl/pozoMODS isoniacida Cultivo y prueba rifampicina de susceptibilidad directa sin droga sin droga 1 2 3 Control 4 5 19 negativo
  20. 20. MODS (2) 20 Avalado por OMS desde 2009 para detectar TB y TB-MDR directa e indirectamente. Menor rendimiento con INH. Descentralizado en 4 regiones de Perú. Nuevas propuestas de versiones de microscopía electrónica y telediagnóstico y teledocencia (Zimic 2010) Prototipo de un nuevo kit comercial (Hardy Diagnostic)
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  22. 22. Métodos basados en Fagos 22 Basado en la capacidad de MTB de permitir el crecimiento de micobacteriofagos (D-29) Versiones “in house” y comerciales (FastPlaque TB) Resultados buenos para R, no para H, pero baja especificidad Evaluaciones en forma directa e indirecta. No es respaldado por OMS.
  23. 23. Cultivo en agar de capa delgada (TLA) 23 Capa delgada de agar 7h11 O método de la microcolonia Visualización de las características culturales de las microcolonias con microscopio estándar (Welch 1993) Es muy bueno para detectar TB, pero requiere mayor evidencia para detectar TB-MDR.
  24. 24. Color test 24 Desarrollado en Perú (Herrera B) En proceso de validación (Evans C) Detecta TB y resistencia a H, R y Quinolona (Cx) La colonia cambia de color Ahorra el proceso de decontaminación Envase con solución desinfectante Inoculación directa en los 4 campos
  25. 25. 25
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  28. 28. Métodos colorimétricos(CRI) 28Son métodos indirectos.Usan indicadores de reducción o sales detetrazoliumpara detectar el crecimeinto de micobacterias adiversas concentraciones de drogas (MIC)La resistencia se detecta al producirse cambio enel color del indicador añadido al medio.Alamar blue cambia a rosadoSal de tetrazolium, amarillo cambia púrpura(MTT)REMA (Resazurin microtiter assay)Utilizado en drogas de 1 y 2 línea.Recomendado por OMS, julio 2010
  29. 29. Line Probe Assays 29 Extrae ADN de muestra o cultivo. Amplifica secuencia especifica (PCR) Hibridación reversa con DNA específico inmovilizado en líneas paralelas en una tira de papel. La hibridación es inferida porque se colorea la banda respectiva  INNO-LiPA (Complejo MTB y rPOB para RIF)  Geno Type MTBDRplus (Complejo MTB, INH y RIF)  Geno Type MTBDRplus (Complejo MTB, Fq, Km, Ak, Etb)
  30. 30. Regiones genómicas asociadas con resistencia a drogas de 1era y 2da línea Antibiótico Gen Producto Frecuencia de mutación (%)Estreptomicina rpsL Prot. Ribosomal S12 ̴ 60 rrs RNAr 16S < 10Rifampicina rpoβ Subunidad β RNApol > 95 katG Catalasa-peroxidasa 60-70 oxyR-ahpC Alkilhidroxireductasa ̴ 20Isoniacida inhA Enoyl ACP reductasa < 10 kasA β ketoacil ACP sintetasa < 10 ndh NADH deshidrogenasa NAEtambutol embCAB Arabinosiltransferasas ̴ 70Pyrazinamida pncA Amidasa 70-100Etionamida inhA Enoyl ACP reductasa < 10 ethA Flavoprot. monooxigenasa NAKanamicina rrs RNAr 16S ̴ 65Fluoroquinolonas gyrA Subunidad α DNA girasa > 90 gyrB Subunidad β DNA girasa NACapreomicina tlyA RNAr metiltransferasa NA rrs RNAr 16S NAAcido para-aminosalicilico thyA Timidilato sintetasa NA
  31. 31. Genotype MDRTBplus & MTBDRsl Primers marcados con biotina
  32. 32. GenoScanGT Blot 48 Flujo de Trabajo Software BLOTRIX
  33. 33. Identificación del Complejo M. tuberculosis y su resistencia a Rifampicina y/o Isoniacida usando el Genotype MTBDRplus
  34. 34. Identificación del Complejo M. tuberculosis y su resistencia aFluoroquinolonas, Aminoglicósidos/Péptidos cíclicos y Etambutol usando el Genotype MTBDRsl
  35. 35. GeneXpert MTB/RIF 35 Test molecular automatizado que detecta MTB y resistencia a RIF Usa un heminested Real Time PCR para amplificar la secuencia del gen rpoB Utiliza la plataforma MTB/RIF (GeneXpert, Cepheid) Integra los procesos sonre la muestra y elPCR dentro de un cartucho de plastico:  Lisis de la bacteria (sonicación)  Extracción de AND  Amplificación y  Detección del amplicón El resultado se obtiene dentro de las 2 horas.
  36. 36. Boehme et al. N Engl J Med 2010;363:1005-15. 36
  37. 37. Pruebas rápidas en Perú 37 Prueba País n Sensi- Especifi- Valor Valor Concor bilidad cidad predicti predictiv dancia vo o + - H R H R H R H R H RGRIESS1 Perú 192 99,1 93, 100 100 100 100 98,7 92 99, 96,4(Asencios) 5 5MODS Perú 338 88, 100 99,6 100 98,2 100 96,4 100 nr nr(Moore) 9MTBDR plus Peru 208 97 99.1 98.7 95 nr nr nr nr 97.6 97.1(Asencios)GeneXpert Peru 741 na 97.6 na 98,1 na nr na nr na nr(Boheme) y otrosH: Isoniacida R: Rifampicina
  38. 38. Comparación de pruebas rápidas 38Características GRIESS MODS MTBDR GeneXpert plusEsputo BK + + + + +Esputo BK - - + -? +Muestras extrapulmonares - +* - -Cultivo de micobacterias + - + +(indirecta)Pacientes antes de inicio + + + +de tratamientoPacientes en tratamiento o - - + +/-fracasoTiempo de proceso (días) 14 – 21 5 – 21 1–2 <1Identifica MTB - + + +Costo por prueba, solo S/.8 S/.12 S/.30 S/.140reactivosCosto de equipamiento 48 000 53 000 100 000 25000 * Datos solo para diagnostico en LCR, líquido pleural, heces, no para susceptibilidad.USD
  39. 39. Nuevas declaraciones de políticas de OMS 39 Respaldado por OMS No respaldado por OMS GeneXpert (2010) Fagos MODS (2010) Cultivo en agar de capa fina NRA (2010) Pruebas colorimétricas (2010) MTDRplus (2008) Inno Lipa (2008)WHO. Non-commercial culture and drug-susceptibility testing method forscreening of patients at rosk of MDR-TB. Policy Statement. (pre publication), Juliode 2010.
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  43. 43. Interpretación de una prueba 43 Caso 1.  Niño de 10 años con BK ++, tío que vive en su casa tiene TB- MDR confirmada Caso 2  Mujer de 30 años, vive en zona residencial de Arequipa, tiene BK de esputo +, sin factores de riesgo para TB-MDR, primer episodio de TB Probabilidad pre-test de que tengan TB-MDR: Caso 1: 50% Caso 2: 5%
  44. 44. En Arequipa existe MODS 44 Identificacion Método de de TB-MDR proporciones en LJ MODS Resistente Sensible Total Resistente 40 1 41 Sensible 4 462 466 Total 44 463 507 Sensibilidad (%) 90.91 81.28 100.00 Especificidad (%) 99.78 99.25 100.00 Índice de validez (%) 99.01 98.06 99.97 Valor predictivo + (%) 97.56 91.62 100.00 Valor predictivo - (%) 99.14 98.20 100.00Razón de verosimilitud + 420.91 59.28 2988.39Razón de verosimilitud - 0.09 0.04 0.23
  45. 45. Nomograma de Fagan Caso 1 Caso2 Rojo Azul Pre: 50% Pre: 5% Post +: 100% Post +: 83% Post - : 5% Post -: 0,3%45
  46. 46. Programa de diagnóstico rápido de TB-MDR del INS 46 Simultáneo con el cultivo  No se necesita aislamiento  Menos demora primario, entonces  Menor capacidad del  bajo costo laboratorio  menor carga de trabajo  No se manipulan cultivosMétodo Griess MODS medio solido (LJ) medio liquido (7H9)
  47. 47. LIBRE ACCESO A CONFERENCIAS 47 41 Conferencia Mundial de la IUATLD Berlín 2010http://uwclh.conference2web.com/content/all
  48. 48. 48 Méd. Alberto Mendoza Instituto Nacional de SaludInstituto de Biotecnología y Salud Contacto: mendozalberto@hotmail.com mdrxdr@gmail.com Web site: www.tbperu.org Teléfonos: 9807-59549 / 617 6200 - 2143

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