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TABLA 6.- RESULTADOS DEL EFECTO DEL EXTRACTO ACUOSO DE Aloe barbadensis SOBRE UNA CEPA INDIGENA DE BHV-
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TABLA 7.- RESULTADOS DEL EFECTO DEL EXTRACTO ACUOSO DE Aloebarbadensis sobre la cepa MOTA/89 de BHV-2.
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La protección a la infección viral mediante la activación del sistema inmune se
conoció con el desarrollo d...
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Aloe barbadensis

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EXTRACTO INYECTABLE DE ALOE BARBADENSIS ANTIVIRAL E INMUNOACTIVADOR. PROCEDIMIENTO DE OBTENCION

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  1. 1. (19) REPUBLICA DE CUBA Oficina Cubana de la Propiedad Industrial (11) No de publicación: CU 22397 A1 (21) No. de solicitud : 236/89 (51) Int. Cl: A61K 35/78 (12) Certificado de Autor de Invención (22) Fecha de presentación:1989.12.04 (30) Prioridad: (45) Fecha de publicación:1996.01.31 (71) Solicitantes:INSTITUTO SUPERIOR DE MEDICINA MILITAR ; (CU) (72) Inventor/es:Villa Espinosa, Aleida (CU) ; Abela Cañizarez, Isabelina Ramona (CU) ; González-Quevedo Rodríguez, Mario Oswaldo (CU) ; Larionova, María ; (SU) (73) Titular: INSTITUTO SUPERIOR DE MEDICINA MILITAR ,domiciliado en Ave. Monumental y Carretera del Asilo, Hab. del Este, CH; (CU) (74) Agente: González-Quevedo Rodríguez, Mario Oswaldo; (CU) (54) Título: EXTRACTO INYECTABLE DE ALOE BARBADENSIS ANTIVIRAL E INMUNOACTIVADOR.PROCEDIMIENTO DE OBTENCION (57) Resumen: La presente invención está relacionada con la medicina. Se ha obtenido un extracto inyectable con propiedades antivirales de amplio expectro: virucida, virustático inmunoactivador, contra virus DNA y RNA en concentraciones de 0,6-30 mg/día a partir de hojas frescas y completas de plantas de zona tropical donde el suelo, la edad de la planta, época de recolecta y características de las hojas, han sido predeterminadas. Las hojas bioestimuladas son utilizadas en la obtención del extracto mediante tres reflujos acuosos y cloruro de sodio hasta obtener índices de oxidación de 1400-1800 mg 02/1 densidad óptica 0,09-0,3 4 pH 5-7, libre de lectinas y estéril, es estable más de 3 años protegido de la luz. Es inocuo para el organismo y contentivo de polisacáridos neutros totales manano mayoritario 0,05-0,15% aloe-emodina 0,1-0,5 mg% y aloina 0,6-1,6 mg %; ácido orgánico málico mayoritario 0,01-0,05 %. El tratamiento antiviral y para inmunoactivación con la formulación de la invención es sistémica, eficaz para la activación de macrófago y linfocitos T a partir de 7-14 días post inyección, así como un fuerte virucida y magnífico virustático contra hepatitis A, enfermedad de Aujesky Herpes mamilitis, renotraqueitis infecciosa bovina, encefalomiocarditis y otras en concentraciones de 0,6-30 mg/día.
  2. 2. CU 22397 A1 2 236/89 MEMORIA DESCRIPTIVA EXTRACTO INYECTABLE DE Aloe barbadensis ANTIVIRAL E INMUNOACTIVADOR. PROCEDIMIENTO DE OBTENCION La presente invención está relacionada con la medicina y específicamente dirigida a la realización sencilla de la terapia y/o profilaxis de afecciones virales que deterioran la salud humana y animal. La terapéutica ha sido optimizada con un extracto inyectable no tóxico de amplio espectro de la planta medicinal Aloe barbadensis Miller. Los métodos efectivos de tratamiento y prevención de infecciones virales son útiles y muy estimados, ya que los virus son causa frecuente de daños en la salud por períodos prolongados y aún dan en ocasiones al traste con la vida de personas y animales. Los fármacos antivirales están clasificados en dos grandes grupos. Grupo 1. Drogas o sustancias antivirales propiamente dichas. Grupo 2. Drogas o sustancias inmunomoduladoras con acción antiviral. Entre los primeros se destacan los siguientes: Grupo 1.1 Sustancias virucidas: Actúan directamente sobre los viriones destruyéndolos, neutralizándolos, inactivándolos, etc., generalmente sobre viriones completos o el genoma viral, cuando estos se encuentran fuera de la célula del hospedero. Grupo 1.2 Sustancias virustáticas: Actúan sobre algunas de las fases del proceso replicativo viral, disminuyendo la infección productiva y permitiendo el hospedero pasar por una enfermedad específica con síntomas mínimos o leves. Grupo 2. Este grupo de sustancias es utilizada para explotar fructíferamente los distintos mecanismos que se encuentran en la resistencia natural del hospedero hacia las infecciones virales y en la recuperación de ellas; es decir mejoran aquellos mecanismos inespecíficos o específicos que bajo circunstancias naturales producen al final la recuperación del hospedero después de una enfermedad más o menos grave o prolongada. En la etapa actual, ni las vacunas, ni los compuestos antivirales presentan eficacia de amplio espectro: en el primer caso, deviene de los diversos y complejos mecanismos de replicación viral y al hecho de no encontrarse inhibidores que puedan ser al mismo tiempo, sumamente activos sobre muchos procesos virales y no tóxicos para las células del hospedero, cuando se administran dosis antivirales efectivas. El Interferón es un ejemplo de sustancia antiviral de amplio espectro, su origen es de células animales y su obtención y producción es muy costosa.
  3. 3. CU 22397 A1 3 La presente propuesta de invención abarca todas las propiedades antivirales citadas anteriormente, sin embargo no existen medicamentos de origen vegetal en formulación inyectable que logre contener las propiedades descritas. Algunos principios activos de plantas de conocida actividad antiviral pero sin formulaciones son Phenge Heptatrine (PHT) y el L Tertienyl (LT) ambos de las hojas de la Bidens pilosa; el Thiophane A, Z-(4 Acetoxy-3-cloro-1 butyl 1), L-thiophene, ACBP thiophene de la Tajetes patula. En 1970 los hindúes Khurona y Bhargor reportaron (woo25 Naprarlert) J. Gen.Appl.Microbiol 16:225-230 el hallazgo de un efecto antiviral in vitro de las hojas secas de Aloe vera en solución alcohólica 95% sobre los virus Mild Mosaic, Distartion Rignspot y Ringspot de la Papaya. Estos resultados difieren sustancialmente a los de la presente invención porque Khuroma y Bhargor presentaron una formulación alcohólica con hojas secas de Aloe vera para el tratamiento de infecciones de virus vegetales. El norteamericano Robert Sydinskis en 1987 registró patente 4,670-265 un método de tratamiento para los herpes simples 1 y 2 de la piel con la aplicación tópica de extractos de varias plantas que contienen antraquinonas y Aloe emodina componentes que fueron extraídos con metanol, etanol, etilacetato, acetona o glicerina o utilizados en bruto (hojas, gel, savia de Aloe vera) en todas las porciones pudo demostrar el efecto virucida a estos dos virus DNA in vitro con los procedimientos de unidades formadoras de placas virales y ensayos clínicos en humanos enfermos de Herpes Labial recurrente, el autor demostró que el efecto virucida de ese principio activo es directamente proporcional al tiempo y temperatura de incubación, así como concentración de la muestra. Pudo descubrir además que la ventaja principal con otras drogas antivirales tópicas es su no toxicidad en sus niveles antivirales aunque no alcanzó conocer si el citado compuesto tiene efecto sobre el ciclo replicativo intracelular del herpes simple u otros virus por Ej.: los virus RNA, o si era efectivo en aplicación sistemática o si activa el sistema inmune para la protección antiviral. La formulación de la presente solicitud es para uso sistemático efectivo contra virus DNA y RNA por lo que es de amplio espectro. Otro descubrimiento importante lo constituye el registrado por el norteamericano Mc Analley Bill H en el tratado de cooperación de patentes PCT E.U. 86/01335, WO 87/00052 él descubrió el Carrysin, polisacárido que confiere actividad biológica al gel de Aloe vera y que purificó por ultrafiltración y caracterizó mediante el procedimiento de cromatografía líquida de alta resolución, resonancia magnética entre otros. Este principio activo lo utilizó en ensayos clínicos con buenos resultados lo que le sugirió que la citada sustancia podía estar involucrada entre los antivirales pero no lo comprobó científicamente, además de no hacer formulación y utilizar un principio activo solamente en el ensayo.
  4. 4. CU 22397 A1 4 El extracto inyectable de la presente invención le fue probada científicamente tras ensayos in vitro, in vivo y clínicos sus propiedades virucidas, virustáticas y de inmunoactivación, en la formulación se combina la acción de antraquinonas, polisacárido neutro tipo manano, aminoácidos, ácidos orgánicos y minerales, esta solicitud posibilita con su formulación la no utilización de la planta Aloe barbadensis en forma bruta basado en conocimientos empíricos tal como sucede en dolencias de hepatitis, viruela aviar, etc. Muchas investigaciones se han realizado en el mundo sobre las propiedades beneficiosas o en combinaciones; el contenido en principio activo y procedimiento de obtención y purificación, en este sentido cabe destacar las invenciones norteamericanas registradas en las patentes de E.U. 3,360,510 (1967); 3,360,511 (1967); 3,360,951 (1968); 3,920,816 (1975); 3,892,853 (1975); 4,708,873 (1985); 4,555,987 (1985); 4,725,578 (1985) y las japoneses 55,4086 (1980); 4,598,069 (1985); 625128 (1987); 625129 (1987), 6272624 (1987). Ninguna de las patentes de métodos terapéuticos con Aloe citados están referidas a la actividad antiviral e inmunomoduladora, en algunos casos como las patentes 625128 y 625129 japonesas el destino farmacéutico del producto obtenido es el resultado de la gran actividad lectina del Aloe empleado, otras la utilizan como laxante por su contenido de savia amarilla y le preservan como en los registros de patentes 3,360,510; 3,360,511; 3,360,951 o utilizan Aloes que tienen en la hoja componentes citotóxicos patentes 3892,853. Además de todo esto existen estudios que indican que la savia de los Aloes es tóxica para la piel humana. Juan E. Danhof et al (Estabilized Aloe vera: effect on human skin cells. Drug and cosmetic end 52-54 p. 105-106, 1983). Los contenidos de savia y lectinas del Aloe le confieren toxicidad y se encuentran íntimamente relacionados con su ambiente de cultivo, lugar de crecimiento, variedad, época del año; las bondades terapéuticas de esta planta son superiores en aquellos climas que le proporcionan una vida más fisiológica. La variedad de Aloe utilizada en la formulación de esta invención crece en condiciones fisiológicas, en clima tropical, dicha formulación no contiene actividad lectinas por lo que se le ha eliminado la toxicidad y es permisivo de administración inyectable. Muchos son los países que necesitan invernaderos para el cultivo de los Aloes, el rendimiento y la composición química varía con las condiciones climáticas por lo que a veces es poco económica su explotación. La especie aborescens importada de los invernaderos de la URSS a Cuba no progresa en clima tropical. En la URSS elaboran el producto "Extracto de Aloe", en Polonia la denominada Bioestimina, ambas a partir de la especie arborescens para las especificaciones terapéuticas: cicatrización, anti-inflamatorios, enfermedades oftálmicas, úlceras del estómago, asma bronquial (Sidorenko, N. 1953 Aloe planta medicinal URSS. Kiev. Aloe Extract. Datos clínicos (1951-1957) V.O. Sojuzchimexport, URSS, Moscú, Kibalchich, P. 1957. Aloe arborescens. MEDGIZ. Moscú. Stepanova O. 1977 Fisiologicheski activnie veshestva 3:290-301. Las especies arborescens y barbadensis poseen diferencias cuantitativas y cualitativas en su composición química.
  5. 5. CU 22397 A1 5 El Aloe arborescens cultivado en invernaderos en la URSS posee aloina, ácido crisofánico, Aloe emodina aloinosidos A y B (Abdurjmanova, G, 1978 Farmatsia 2:40-42) pero no se reportan aloinosidos en el Aloe arborescens de Africa (Mc Carthy T.J. 1968. Planta Médica 3:348-356). En el extracto inyectable de Aloe barbadensis antiviral e inmunoactivador de la presente invención el contenido de antraquinonas libres (agliconas) se calcularon como Aloe emodina y los glicosidos antraquinonas como aloina. Para cuantificar las antraquinonas presentes en el extracto activo se utilizó el método colorimétrico de Auterhoff y Ball modificado. La composición es cualitativa de este grupo de componentes químicos se realizó mediante cromatografía en capa fina de sílica gel 625 (cloroformo: metanol, agua (30:15:1), 5% KOM en metanol, UV 254 nm) utilizando como patrones de referencia aloina y Aloe emodina. El extracto activo se concentró previamente al vacío y el residuo disuelto en metanol fue aplicado en la placa. Entre los compuestos activos característicos para la especie del género Aloe se encuentran los polisacáridos, inclusive hasta para la misma especie pueden presentarse variaciones en dependencia de la época del año y las condiciones climáticas; así del Aloe vera de la zona sur de la India se aislaron cuatro gluco-mananos parcialmente acetilados con trazas de ácido galacturónico, galactosa, xilosa, arabinosa (Govoda, D.C. 1979 Carbahydrate Research 72:201-205). La mezcla de polisacáridos a partir del Aloe barbadensis cultivado en Belgol del Este tenía como principal componente el ácido péptico compuesto prácticamente por ácido galacturónico y cantidades menores de galactano, arabinano y glucomanano (Mandal G, 1980 Carbohydrate Research 86:247-257, 87:201-257). El Aloe barbadensis cultivado en Texas (valle del Río Grande) contiene polisacáridos tipo manano acetilado (Mc Analley 1986 US Patent 86/01 335). Entre los cultivos de Aloe arborescens se ha detectado también esta gran versatilidad. Los polisacáridos del gel de Aloe arborescens cultivado en Georgia, URSS contienen sustancias pécticas con 55% de ácido galacturónico y la presencia de glucosa galactosa, manosa, xilosa, arabinosa (Ovodova, R.C. 1975, Khimija Prirodnykh soedinerei 11:3-5). De la misma especie cultivada en Japón fue aislado e identificado el polisacárido B-D manano parcialmente acetilado (Yugi A. 1977. Planta Med 31:17-20). A partir del crudo de polisacáridos obtenidos de esta especie cultivada en Polonia en invernadero para la producción de bioestimina, fueron determinadas galactosa, glucosa, arabinosa y manosa (Kodym, A 1979 Herba Polonica 3: 193-199). El extracto inyectable de Aloe barbadensis antiviral e inmunoactivador de la presente solicitud de invención está compuesto por los polisacáridos neutros manano mayoritario y
  6. 6. CU 22397 A1 6 galactosa, glucosa, rkamnosa y xilosa en cantidades menores. Los polisacáridos del extracto total de Aloe barbadensis contiene 43% de polisacáridos neutros y 1,6% de polisacáridos ácidos. Son estudios químicos de crudo de polisacáridos se realizaron utilizando las técnicas de fraccionamiento con Cetablon (Bromuro de cetil-trimetil amonio), hidrólisis ácida y respectivamente cromatografía de los monosacáridos en papel Wahtman #1 (N-butanol: piridina, agua (6:4:3), revelador ftalato de anilina. Otro grupo de compuestos importantes presentes en el género Aloe son los ácidos orgánicos. Se destaca la función de los ácidos carboxílicos como estimulantes de los procesos biológicos y la influencia positiva de los grupos carboxílicos (Stepanova, O. 1977. Fisiologecheski activnie veshestva 9:94-7). El contenido de ácidos orgánicos varía con la época del año y tiene fluctuación diurna según la especie y ambiente de cultivo. En los tejidos externos es aproximadamente 10 veces mayor a su contenido en el gel. Las hojas de Aloe barbadensis están compuestas aproximadamente de 73% del gel y 27% de tejidos externos, mientras que la de Aloe arborescens es de 48% y 52% respectivamente. Los ácidos orgánicos detectados en las hojas de Aloe arborescens son ácidos succínico, cítrico, málico y trazas de ácido tartárico y los ácidos cinámicos y oxicinámico (en forma de cumarinas). En el extracto inyectable de Aloe utilizado en el tratamiento antiviral y de inmunoactivación de la presente invención se detecta presencia de ácido málico como mayoritario, cítrico y tartárico. Para el estudio cromatográfico de los ácidos orgánicos se utilizaron las placas preelaboradas de celulosa Merek, fase móvil: Isobutanol - Acido fórmico 5 N (2:3) revelador solución de bromocresol y bromofenol, como patrones de referencia se aplicaron ácido málico, cítrico, tartárico. Para estimar el contenido de los ácidos totales libres utilizamos el método de Bennet-Claret (Mc Carthy, T.J. 1966. Planta Medica 2:200-203). Los minerales forman sales o complejos y se encuentran unidos a los compuestos orgánicos en las plantas de Aloes, la composición mineral dependen mucho del lugar donde crece la planta, el suelo, el tiempo de recolección, las condiciones climáticas, por eso su contenido en sales y la composición elemental de las hojas de Aloe y sus extractos difieren unos de otros (Kozak, C.A. 1977, Fisiologecheski-activnie Veshestva, 9:302-307). El Aloe arborescens hojas secas poseen silicio 0,3%, magnesio 5%, calcio 5%, hierro 0,1%, manganeso 0,06%, fósforo 0,1%, cobre 0,0001%. Las hojas secas de Aloe barbadensis han encontrado 2,86% calcio, 1,21% magnesio, 1,56% potasio, 2,66% de cloro. (Joshi, A.J. 1978 Sakyu Kenkyu 24 (2) 49-54). La composición mineral cuantitativa y cualitativa de micro y macro elementos del extracto inyectable de Aloe barbadensis empleado en el tratamiento antiviral y de inmunoactivación en esta invención presenta como elementos mayoritarios calcio y magnesio y el hierro, aluminio, manganeso y cobre en cantidades menores, para la determinación se empleó el método semi-cuantitativo en absorción atómica. La composición cuantitativa y cualitativa de aminoácidos también es variable, en el extracto inyectable de Aloe barbadensis de la presente invención están ausentes la tirosina y la
  7. 7. CU 22397 A1 7 ornitina, posee a diferencia con el extracto de arborescens de la URSS y la biostimina de Polonia; prolina y valina compartiendo similitud al ser contentivos de fenilafoserina, ácido aspártico, todos detectados en analizador de aminoácidos LKB 1450 sistema litio. Extracto inyectable de Aloe barbadensis con actividad antiviral e inmunoactivador las hojas frescas y completas de la planta de zona tropical donde el suelo, edad de la planta, época de recolecta, características de las hojas han sido predeterminadas, se bioestimulan sometiéndola a condiciones adversas durante 9-20 días de la elaboración del extracto en tres reflujos acuosos y salinos hasta obtener índice de oxidación de 1400-1800 mg O/l densidad óptica de 0,09-0,3 y pH 3-7, estable por más de 3 años protegido de la luz con notable eficiencia antiviral de amplio espectro contra virus DNA y RNA como virucida y virustático y de inmunoactivación. La invención será de más fácil comprensión al considerarse el siguiente ejemplo de ejecución. Por ejemplo: Después de la recolecta, las hojas seleccionadas se lavan con agua y se transportan a temperatura de 4-10º C donde se mantienen durante 9-20 días, después de la bioestimulación 200-500 g de las hojas son molidas y llevadas a 3 extracciones sucesivas realizadas con 1,5:1:0,5 volúmenes respectivamente de agua destilada. La primera extracción se realiza 4-10º C durante 0,5-2 horas luego el extracto se somete a ebullición durante 1-5 min. La segunda extracción se realiza a temperatura de ebullición de 1-5 minutos y la tercera a temperatura ambiente durante 10-30 min. Los tres extractos se unen y se mide el volumen total y se calcula el índice de oxidación (oxidometría:permanganatometría), adicionar entonces cloruro de sodio para una concentración de 0,5 M según volumen final. El extracto se somete a ebullición durante 3-10 min se clarifica por filtración (membrana de acetato o nitrato de celulosa o asbesto 0,7 U) y ajustar el volumen con agua destilada según oxidación, ajustar pH 5-7 envasar en ámpulas por 1 ml esterilizar en autoclave 30 min 121º C - 1 atms. Los resultados de los estudios realizados fueron los siguientes: Dosis máxima tolerada evaluada por el método de formación de colonias con células de mieloma P3 X63 Ag8 en fase de crecimiento exponencial se cultivaron en una capa de alimentación de esplenocitos de ratón Balb/c. Se incluyeron concentraciones del extracto liofizado entre 300 pig a 30 mg sin encontrar el punto final por la no toxicidad. Tres subcultivaciones seriadas sobre monocapas de fibroblasto de ratón con intervalos de 5 días se realizaron con el extracto al 10% en el medio de cultivo completo sin que las mismas mostraron daño citopáticos, vacualización, degeneración temprana,
  8. 8. CU 22397 A1 8 desprendimiento celular. El anclaje de las células, la velocidad de multiplicación y tiempo de completamiento de las monocapas se vieron muy favorecidas. La morfología y morbilidad de células cultivas in vitro a diferentes tiempos con varias concentraciones del extracto de forma repetida sin cambio del medio de cultivo y valoradas con los métodos MAY GRUNWALD Giensa, Van Giesson y técnicas de exclusión de tripan azul al 0,4% en NaCl, reveló que la morfología celular no sufre modificaciones, la viabilidad de las células se incrementa con el número de repeticiones de la dosificación del extracto por día. La dosis letal media (DL50 ratón) y la toxicidad subaguda se calcularon en ratones albinos de 25+ 2 g de peso. Los animales se sacrificaron a los 30 días y la mayoría de las observaciones histológicas en los cortes de órganos (cerebro, pulmón, hígado, bazo, riñón, corazón y médula ósea) estudiados fueron lesiones relacionadas con los cambios orgánicos que aparecen en la eutanasia. El extracto inyectable a Aloe barbadensis no produjo lesiones en los órganos vitales ni tampoco en médula ósea. La DL50 ratón es de 3,6 mg del extracto por gramo de peso. La actividad lectina del extracto incluyó evaluaciones de la actividad blastogénica sobre linfocitos humanos cultivados in vitro con PHA y extracto de Aloe barbadensis con métodos cualitativos de Giensa y cuantitativo con la adición de timidina tritiada de actividad específica 23 Ci/mM, el rango de concentraciones del extracto fue de 0,6 - 30 mg Ug/ml de cultivo. Además incluyeron las pruebas de hemoglutinación con eritrocitos humanos en dilución hasta 1:1024. Los linfocitos cultivados que recibieron extracto de Aloe barbadensis no manifestaron transformación blástica correspondiéndose con los controles cultivados sin nitrógeno. Todas las concentraciones de Extracto de Aloe barbadensis bajo prueba se mantuvieron con niveles de incorporación de 3H Timidina inferior a 2 veces los cpm de los controles con suero fetal bovino, lo que demostró la no inducción de transformación blastogénica. La hemoglutinación fue negativa en todas las diluciones y ninguna dilución de suero reaccionó positiva en la inmunodifusión con el extracto de Aloe barbadensis. La actividad virucida del Extracto Aloe barbadensis in vitro se detectó con la prueba de unidades reductores de placas y virus neutralización entre las concentraciones variables desde 0,3-30 mg con 1000 DL50CT y 100 URP de las cepas modelos herpes bovino tipo 1 y 2 y encefalomiocarditis viral (BHV-1), (BHV-2) (VEMC), empleando sistema de cultivo celulares sensibles a la replicación de estos virus. Las concentraciones, a partir de los cuales se observó una reducción del 50% o más del número de placas virales en relación al control de virus replicados en células sin Aloe, fueron consideradas positivas de acción antiviral. Las diluciones donde el efecto citopático viral (ecp) apareció en el 50% del sistema bajo prueba, fueron indicativos de actividad antiviral. Las mejores dosificaciones antivirales se definieron por aquellas concentraciones que redujeron las placas virales e inhibieron el ECP viral en 50% o más.
  9. 9. CU 22397 A1 9 TABLA 1.- ACTIVIDAD VIRUCIDA DEL EXTRACTO INYECTABLE DE Aloe barbadensis FRENTE A 100 DI50 CT O 100 UFP DEL VEMC EN LA LINEA CELULAR BB82. Tiempos de incubación en min. 15 30 60 Aloe barbadensis (MG) VNT URP VNT URP VNT URP 0,3 0 NR 0 NR 0 NR" 0,6 50 25 25 39 25 30 1,2 25 58 25 67 50 60 2,4 100 90 100 95 100 90 4,8 100 89 100 91 100 91 6,0 100 93 100 95 100 100 % de protección % de reducción de placas virales nº reducción del nº de placas TABLA 2.- ACTIVIDAD VIRUCIDA DEL EXTRACTO ACUOSO INYECTABLE DEL Aloe barbadensis FRENTE A 100 DI50 CT O 100 UFP DEL BHV-2 EN CELULAS CULTIVADAS in vitro. Tiempos de incubación en min. 15 30 60 Aloe barbadensis (MG) VNT URP VNT URP VNT URP 0,3 0 NR 0 NR 0 NR" 0,6 0 NR 25 30 25 30 1,2 50 53 50 53 75 79 2,4 25 58 75 77 75 83 4,8 100 91 100 91 100 95 6,0 100 95 100 92 100 95 % de protección
  10. 10. CU 22397 A1 10 % de reducción de placas virales Nº reducción del Nº de placas TABLA 3.- ACTIVIDAD VIRUCIDA DEL EXTRACTO INYECTABLE DEL Aloe barbadensis FRENTE A 100 DI50 CT O 100 UFP DEL BHV-1 CELULAS CULTIVABLES in vitro. Tiempos de incubación en min. 15 30 60 Aloe barbadensis (MG) VNT URP VNT URP VNT URP 0,3 0 NR 0 NR 0 NR" 0,6 50 63 50 72 75 93 1,2 100 95 100 100 100 100 2,4 50 91 75 97 50 91 4,8 25 46 50 52 50 83 6,0 25 36 50 56 50 87 % de protección % de reducción de placas virales Nº reducción del Nº de placas La actividad virucida in vitro encontrada en el Extracto de Aloe barbadensis fue comprobada in vitro con 100 y 1000 DL50 de la cepa VEMC en ratones albinos de 10 + 2g de peso encontrándose la efectividad virucida a partir de la concentración 1,2 mg. La determinación de la actividad virustática incluyó la infección viral en los sistemas biológicos 1-3 horas antes del tratamiento con el Extracto de Aloe barbadensis en concentraciones variables. La protección más efectiva frente a las cepas virales DNA y RNA incluidas en los ensayos in vitro se reveló a partir de 6 mg/ml en aplicación única al cultivo celular infectado. La validación de estos resultados en ensayos preclínicos en ratones con 100 DI50 ton confirmó la dosificación de 6 mg/durante 3 días como mínima para proteger a los ratones de la infección con el virus EMC quizás el más letal que afecta a esta especie
  11. 11. CU 22397 A1 11 TABLA 4.- VIRUSTATICA DEL EXTRACTO INYECTABLE DE Aloe barbadensis SOBRE DIFERENTES VIRUS DESPUES DE 1 HORA DE ABSORCION. Virus de ensayo BHV-1 BHV-2 EMC Aloe barbadensis (mg) VNT URP VNT URP VNT URP 0,3 0 NR 0 NR 0 NR 0,6 0 NR 0 NR 0 NR 1,2 0 NR 0 NR 0 NR 2,4 0 NR 0 NR 0 NR 4,8 0 52 25 56 25 50 6,0 50 56 75 62 50 58 % de protección % de reducción de placas virales Nº reducción del Nº de placas - Para verificar el estado de portador en los ratones que sobrevivieron al desafío viral después de 14 días de infección (Actividad virucida y virustática) se les hizo convivir con otros ratones susceptibles no infectados por más de 30 días. La sobrevivencia de los nuevos susceptibles fue de 100% (Virucida) y de 75% (Virustático), lo que indica una eliminación mínima de virus, cuando se inyecta durante la infección. - Para el efecto protector preventivo del Extracto inyectable de Aloe barbadensis a infecciones por virus en sistemas de cultivos celulares en tratamientos con este a diferentes concentraciones y diferentes intervalos de tiempo demostró que las células que reciben tratamiento durante 96-120 h como mínimo antes de la infección viral en concentraciones a partir 4,8-6 mg pierden sensibilidad a la réplica viral.
  12. 12. CU 22397 A1 12 TABLA 5.- RESULTADOS DEL EFECTO DEL EXTRACTO ACUOSO DE Aloe barbadensis SOBRE UNA CEPA PATOGENA DE VEMC. Tiempos de tratamientos previos (en horas) 1 6 12 24 48 96 120 Aloe barbadensis(mg) inh URP inh URP inh URP unh URP inh URP inh URP inh URP 0,3 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 5 0 16 0,6 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 10 0 5 0 24 1,2 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 12 0 7 0 22 2,4 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 7 0 12 25 36 4,8 0 NR 0 NR 0 NR 0 2 0 15 25 23 50 58 6,0 0 NR 0 NR 0 NR 0 10 0 20 25 52 75 72 inh = Expresado como el % de inhibición del ecp viral URP = Expresado como el % de reducción de placas virales NR = Nº Reducción de placas
  13. 13. CU 22397 A1 13 TABLA 6.- RESULTADOS DEL EFECTO DEL EXTRACTO ACUOSO DE Aloe barbadensis SOBRE UNA CEPA INDIGENA DE BHV- 1. Tiempos de tratamientos previos (en horas) 1 6 12 24 48 96 120 Aloe barbadensis (mg) inh URP inh URP ihn URP inh URP inh URP inh URP inh URP 0,3 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 5 0 16 0 10 0,6 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 10 0 25 0 16 1,2 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 12 0 32 25 32 2,4 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 22 25 40 25 46 4,8 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 25 46 50 91 75 91 6,0 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 25 50 75 95 100 100 inh = Expresado como el % de inhibición del ecp viral URP = Expresado como el % de reducción de placas virales NR = Nº Reducción de placas
  14. 14. CU 22397 A1 14 TABLA 7.- RESULTADOS DEL EFECTO DEL EXTRACTO ACUOSO DE Aloebarbadensis sobre la cepa MOTA/89 de BHV-2. Tiempos de tratamientos previos (en horas) 1 6 12 24 48 96 120 Aloe barbadensis (mg) inh URP inh URP inh URP inh URP inh URP inh URP inh URP 0,3 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 5 0 16 0 23 0,6 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 5 0 42 0 48 1,2 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 10 25 62 25 67 2,4 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 12 25 87 50 72 4,8 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 0 15 50 90 75 91 6,0 0 NR 0 NR 0 NR 0 NR 25 16 75 95 100 98 inh = Expresado como el % de inhibición del ecp viral URP = Expresado como el % de reducción de placas virales NR = Nº de Reducción de placas
  15. 15. CU 22397 A1 15 La protección a la infección viral mediante la activación del sistema inmune se conoció con el desarrollo de los experimentos preclínicos en ratones, desafiando los mismos con 100 y 1000 DL50 ratón de cepa VEMC por vía oral e intraperitoneal. Estos ratones habían recibido concentraciones variables del Extracto inyectable de Aloe barbadensis por vía intramuscular en intervalos de 7-15 días (cada experimento 1 inyección única) previos a la infección viral. Como sustancias inmunoactivadoras con actividad antiviral conocida se incluyeron al adyuvante Completo de Freund ACF (Gartie y cols, 1968, Nature 216:1242-1244) por vía subcutánea 0,4 ml/ratón y el Bacilo Carmette Guarine BCG (Floch, F., Werner, G.H., 1976. Ann.Inmunol.:127, 173-186) por vía endovenosa 1 mg/ratón es decir alrededor de 10 bacilos vivos. Durante los días 9 y 30 post infección los ratones desafiados sobrevivientes se investigaron mediante serología pareada por seroneutralización y el mismo día 30 recibieron una reinfección con las mismas dosis virales del desafío y se evolucionaron 15 días más. Después de 45 días de observación a los sobrevivientes se les realizó estudios de células peritoneales. Los exámenes incluyeron conteo global de macrófagos, viabilidad, rosetos EA (para receptores FC de Lgs), fagocitosis, migración e inhibición de la migración de macrófagos, linfoblastogénesis con PHA, PWM y LP5, rosetas activas y espontáneas. Los ratones inyectados por lo menos 10 días antes con ACF, BCG o Aloe barbadensis a la provocación con 1000 DL50r por vía oral sobrevivieron, mientras que ninguno soportó la agresión intraperitoneal. Frente a 100 DL50r, la sobrevivencia fue de 100% para la vía oral con los 3 productos; 66% por vía intraperitoneal con la protección con Extracto inyectable de Aloe barbadensis y ACF; la inyección de BCG no protegió a los ratones de la agresión intraperitoneal con 100 DL50r de VEMC. La serología pareada arrojó títulos de 1:4 + 1 log y la reinfección de estos animales no produjo enfermedad clínica o muerte. Las células del exudado peritoneal de los ratones sensibilizados con extracto inyectable de Aloe barbadensis y ACF mostraron una caída de 2-2,5 log en el título intracelular del VEMC con relación a los macrófagos de los animales no tratados. El alcance de la réplica viral de la cepa VEMC en los macrófagos peritoneales de ratones infectados con BCG no se diferenció de la réplica de ese virus en las células de ratones testigos. En la respuesta de activación celular del sistema inmuno se destaca el incremento de la población de macrófagos y sus índices de fagocitosis; así como la población global de linfocitos T. En una epidemia de Aujesky (Pseudorabia) en cerdos fue empleado el Extracto inyectable de Aloe barbadensis para el tratamiento antiviral no específico de los animales clínicamente afectados y, para proteger a los recién nacidos de la infección
  16. 16. CU 22397 A1 16 viral, así como toda el área pericial N > 500. La epidemia fue detenida muy rápidamente. En una epidemia la gastroenteritis viral en cerdos N > 500 con diagnóstico de Corona virus se aplicó el Extracto inyectable de Aloe barbadensis a las categorías crías y precebas disminuyéndose rápidamente la morbilidad y morbiletalidad. Se llevaron a cabo ensayos clínicos en 60 pacientes con síntomas clínicos de Hepatitis A que recibieron el tratamiento con Extracto inyectable de Aloe barbadensis (el 50% recibió tratamiento convencional de hepatitis); se pudo comprobar la pronta normalización de las transaminasas y el perfil hepático en general y por consiguiente una mejoría clínica en un tiempo más corto que aquellos que recibieron el tratamiento médico convencional. No realizaron ensayos clínicos en 30 pacientes inmunodeficientes multicausal (Politraumatizados, quemados, infecciones virales) con el Extracto inyectable de Aloe barbadensis, los mismos mostraron pronta mejoría clínica y en los estudio de inmunidad celular a ellos realizados antes y después del tratamiento se comprobó la activación de macrófagos y linfocitos T. Las ventajas técnico-económica de la presente invención son las siguientes: 1. Realización sencilla y económica. 2. Desde el punto de vista socio-económico también tienen gran repercusión tanto en medicina humana como en medicina veterinaria; cualquier epidemia viral cuesta a un país millones de pesos, si se empleara una profilaxis o terapia antiviral proveniente de un recurso natural como el de la presente invención esos casos pudieran reducirse sobremanera. REIVINDICACIONES 1.- Extracto inyectable de Aloe barbadensis antiviral e inmunoactivador caracterizado porque tiene propiedades como virucida, virustático e inmunoactivador contra virus DNA y RNA, es inócuo para el organismo y contiene como principios activos fundamentales polisacáridos totales entre 0,05 - 0,15%, antraquinonas libres entre 0,1-0,5 mg% aloina 0,6-1,6 mg% y ácidos orgánicos málico mayoritario entre 0,01-0.05%. 2.- Procedimiento de obtención del extracto inyectable de Aloe barbadensis caracterizado porque se parte de las hojas frescas y completas de plantas de zona tropical y el suelo,la edad de la planta, la época de recolecta y las características de las hojas predeterminadas, se bioestimulan las hojas durante 9-20 días a 4-10ºC, se reflujan tres veces en cloruro de sodio-agua destilada hasta estabilizar el índice de oxidación a 1400-1800 mg O2/l, densidad óptica 0,09-0,3, pH 5-7, libre de lectinas y estéril.

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