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La Membrana Celular
El DNA: Blanco de tóxicos
Aminoácidos     y Proteínas
AMINOACIDOSName (Residue)         S.C.   MW    pK     VdW vol. C, P, HAlanine          ALA    A     71              67    ...
Péptidos
ESTRUCTURA SECUNDARIA       DE LAS PROTEINAS                       -HélicesLa estructura es repetida cada 5.4 Å a lo larg...
Hojas Beta
Beta-Hairpin turnsFormados entre dos cadenas beta antiparalelas.
ESTRUCTURA TERCIARIA  DE LAS PROTEINAS
Serina ProteasasEstas tres proteasas son el resultado de EvoluciónDivergenteDifieren en Especificidad: Chymotrypsin tiene ...
LA TRIADA CATALITICALas Serina Proteases derivan su nombre por tener unaserina altamente reactiva, Ser-195, el cual atrae ...
The Chou-Fasman method of secondary structure prediction Name            P(a) P(b) P(turn) f(i) f(i+1) f(i+2) f(i+3)   Ser...
Serina Proteasas
Proteínasde Membrana
http://bioinformatics.weizmann.ac.il/hydroph/http://www.netaccess.on.ca/~dbc/cic_hamilton/protein.html
Signal Transduction             PCB        O          .         2O2                        Annexin?                       ...
Signal Transduction
Signal Transduction en laIdentificación de Sabores
ANALISIS DE PROTEINAS
CROMATOGRAFIA
Cromatografía   Líquida
Intercambio Iónico
Cromatografía de Afinidad
Cromatografía deFiltración en Gel
El Ligando de Afpak-894 es STI, un inhibidor de Trypsin.
Afpak-AHR-894, Ligando: HeparinaAnálisis de Lipoproteínas y componentes       coagulantes en la sangre
El ligando de Afpak AAB-894 es Aminobenzamidine         (Inhibidor de Serine Protease).              Análisis de Tripsina
DICROISMO CIRCULAR
RESONANCIA   MAGNETICA      NUCLEAR
ESPINPropiedad fundamental de la naturaleza como la carga o masa.El Espín es expresado en múltiplos de 1/2 y puede ser (+)...
ESPINEn Presencia de un campo magnético de fuerza B, unapartícula con un Espín neto puede absorver un fotón defrecuencia f...
Núcleos Con EspínCasi todos los elementos de la Tabla Periódica tienen unIsótopo con un espín nuclear diferente de cero. R...
CROMATOGRAFIA DE GASESESPECTROMETRIA DE MASAS
Espectro de Masas
3-Phenyl-2-propenal      C9H8O    MW = 132.16
3-Methylbutyramide     C5H11NO   MW = 101.15
From Gas Phase Ions to Peaks on a Mass Spectrum
Degradación de EdmanReacción empleada para determinar la secuencia de AA     El N-Terminal del péptido es tratado con Feni...
PROTEOMICS    Identificación Requiere Separación2-D PAGE: Técnica de mayor alta RESOLUCION
ENFOQUE ISOELECTRICO    El punto isoeléctrico es el pH al cual el número de        cargas netas positivas y negativas es c...
2-D PAGEElectroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida2-D PAGE: Técnica de mayor alta RESOLUCIONResolución de pépti...
2-D PAGEOriginalmente la Desventaja era la Falta de Reproducibilidad.La razón?Los “Ampholytes” usados para construír los g...
2-D PAGE    Obtención de proteínas de absoluta pureza bioquímica Análisis de Proteínas con modificaciones post-translacion...
Clase 2 Diplomado Quimica Ambiental UdeC
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Clase 2 Diplomado Quimica Ambiental UdeC

  1. 1. Diplomado en Química Ambiental I Introducción a la Biología Celular y Molecular Jesús Olivero Verbel. Ph.D Universidad de Cartagena Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas Grupo de Química Ambiental y ComputacionalDepartamento de Postgrado y Educación Continua Agosto 19 de 2002
  2. 2. La Membrana Celular
  3. 3. El DNA: Blanco de tóxicos
  4. 4. Aminoácidos y Proteínas
  5. 5. AMINOACIDOSName (Residue) S.C. MW pK VdW vol. C, P, HAlanine ALA A 71 67 HArginine ARG R 157 12.5 148 C+Asparagine ASN N 114 96 PAspartate ASP D 114 3.9 91 C-Cysteine CYS C 103 86 PGlutamate GLU E 128 4.3 109 C-Glutamine GLN Q 128 114 PGlycine GLY G 57 48 -Histidine HIS H 137 6.0 118 P,C+Isoleucine ILE I 113 124 HLeucine LEU L 113 124 HLysine LYS K 129 10.5 135 C+Methionine MET M 131 124 HPhenylalanine PHE F 147 135 HProline PRO P 97 90 HSerine SER S 87 73 PThreonine THR T 101 93 PTryptophan TRP W 186 163 PTyrosine TYR Y 163 10.1 141 PValine VAL V 99 105 H
  6. 6. Péptidos
  7. 7. ESTRUCTURA SECUNDARIA DE LAS PROTEINAS -HélicesLa estructura es repetida cada 5.4 Å a lo largo del eje.3.6 AA por rotación.Separación entre residuos: 5.4/3.6 = 1.5 ÅCada grupo C=O y N-H de la cadena principal está unido porun puente de hidrógeno a un residuo distante 4 AA.Los planos del péptido son más o menos paralelos a los ejesde las hélices y los dipolos dentro de la misma están alineados.Las cadenas laterales son orientadas hacia fuera de la hélice,generalmente hacia el nitrógeno terminal.
  8. 8. Hojas Beta
  9. 9. Beta-Hairpin turnsFormados entre dos cadenas beta antiparalelas.
  10. 10. ESTRUCTURA TERCIARIA DE LAS PROTEINAS
  11. 11. Serina ProteasasEstas tres proteasas son el resultado de EvoluciónDivergenteDifieren en Especificidad: Chymotrypsin tiene una cavidad en lacual acomoda las cadenas hidrofóbicas de F, Y y W.Trypsin tiene un AA Aspartate (189) en el fondo de la cavidaden vez de Ser-189, como en Chymotrypsin. Este Asp forma unpuente salino con el grupo positivo de las cadenas de Lys y Argde los sustratos.Elastase posee Ala, la entrada a la cavidad es bloqueada porVal-216 y Thr-226 (estos residuos son Gly en chymotrypsin).
  12. 12. LA TRIADA CATALITICALas Serina Proteases derivan su nombre por tener unaserina altamente reactiva, Ser-195, el cual atrae el grupocarboxylo del sustrato.Esto resulta en un intermediario que es una Acylenzima,el cual consiste en el sustrato unido covalentemente a laenzima por la ser.La reactividad depende de la conformación de la cadenalateral de la Ser con otras dos cadenas laterales polares.Aproximadamente en una línea recta.La Ser-195 es posicionada al final de la línea.El otro origen es Asp-102 y en el centro la His-57.
  13. 13. The Chou-Fasman method of secondary structure prediction Name P(a) P(b) P(turn) f(i) f(i+1) f(i+2) f(i+3) Serina ProteasasAlanine 142 83 66 0.06 0.076 0.035 0.058Arginine 98 93 95 0.070 0.106 0.099 0.085Aspartic Acid 101 54 146 0.147 0.110 0.179 0.081Asparagine 67 89 156 0.161 0.083 0.191 0.091Cysteine 70 119 119 0.149 0.050 0.117 0.128Glutamic Acid 151 037 74 0.056 0.060 0.077 0.064Tyrosine 69 147 114 0.082 0.065 0.114 0.125Valine 106 170 50 0.062 0.048 0.028 0.053
  14. 14. Serina Proteasas
  15. 15. Proteínasde Membrana
  16. 16. http://bioinformatics.weizmann.ac.il/hydroph/http://www.netaccess.on.ca/~dbc/cic_hamilton/protein.html
  17. 17. Signal Transduction PCB O . 2O2 Annexin? P PKC sPLA2 cPLA 2 AA TK 2+ PKC Ca MAPK Ca-ATPase
  18. 18. Signal Transduction
  19. 19. Signal Transduction en laIdentificación de Sabores
  20. 20. ANALISIS DE PROTEINAS
  21. 21. CROMATOGRAFIA
  22. 22. Cromatografía Líquida
  23. 23. Intercambio Iónico
  24. 24. Cromatografía de Afinidad
  25. 25. Cromatografía deFiltración en Gel
  26. 26. El Ligando de Afpak-894 es STI, un inhibidor de Trypsin.
  27. 27. Afpak-AHR-894, Ligando: HeparinaAnálisis de Lipoproteínas y componentes coagulantes en la sangre
  28. 28. El ligando de Afpak AAB-894 es Aminobenzamidine (Inhibidor de Serine Protease). Análisis de Tripsina
  29. 29. DICROISMO CIRCULAR
  30. 30. RESONANCIA MAGNETICA NUCLEAR
  31. 31. ESPINPropiedad fundamental de la naturaleza como la carga o masa.El Espín es expresado en múltiplos de 1/2 y puede ser (+) o (-).Protones, electrones y neutrones poseen Espín.Electrones individuales desapareados, protones y neutronesposeen un Espín de 1/2.El Deuterio (2H) posee un electrón, un protón y un neutrón.Espín Electrónico = 1/2. Espín Total Nuclear = 1.Dos o más partículas con Espín de signos opuestos pueden unirsey eliminar las manifestaciones observables del Espín. Ej. Helio.En RMN, los espines nucleares desapareados son los deimportancia.
  32. 32. ESPINEn Presencia de un campo magnético de fuerza B, unapartícula con un Espín neto puede absorver un fotón defrecuencia f.La frecuencia “f” depende de la relación giromagnética dela partícula = B.Para el Hidrógeno, B = 42.58 MHz/T.
  33. 33. Núcleos Con EspínCasi todos los elementos de la Tabla Periódica tienen unIsótopo con un espín nuclear diferente de cero. RMN sólopuede ser empleada en Isótopes cuya abundancia naturalsea lo suficientemente alta para ser detectada. Núcleo Protones Neutrones Espín Desapareados Desapareados Neto (MHz/T) 1H 1 0 1/2 42.58 2H 1 1 1 6.54 31P 0 1 1/2 17.25 23Na 2 1 3/2 11.27 14N 1 1 1 3.08 13C 0 1 1/2 10.71 19F 0 1 1/2 40.08
  34. 34. CROMATOGRAFIA DE GASESESPECTROMETRIA DE MASAS
  35. 35. Espectro de Masas
  36. 36. 3-Phenyl-2-propenal C9H8O MW = 132.16
  37. 37. 3-Methylbutyramide C5H11NO MW = 101.15
  38. 38. From Gas Phase Ions to Peaks on a Mass Spectrum
  39. 39. Degradación de EdmanReacción empleada para determinar la secuencia de AA El N-Terminal del péptido es tratado con FenilIsotiocianato, formando un complejo. Luego de tratamiento ácido, el N-terminal es removido por rompimiento del primer enlace peptídico formando una Feniltiohidantoina. Existen 20 Fenilhidantoinas.
  40. 40. PROTEOMICS Identificación Requiere Separación2-D PAGE: Técnica de mayor alta RESOLUCION
  41. 41. ENFOQUE ISOELECTRICO El punto isoeléctrico es el pH al cual el número de cargas netas positivas y negativas es cero. En la electroforesis de Enfoque Isoeléctrico, el gel de polyacrylamide is tratado con ampholines, los cuales son sustancias que mantienen un gradiente de pH a través de la longitud del gel. La proteína será enfocada en el sitio en el que el pH esigual al punto isoeléctrico. Allí la proteína deja de moverse. Permite la separación de proteínas en su forma nativa!!
  42. 42. 2-D PAGEElectroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida2-D PAGE: Técnica de mayor alta RESOLUCIONResolución de péptidos mediante el desarrollo de dospasos ortogonales de separación.Separación por Enfoque isoeléctrico y por MasasNúmero de Manchas es variable y depende de:•Tamaño y tipo de muestra•Procedimiento de tinciónEn un gel pueden apreciarse en forma visible 1000 proteínas(Blomberg et al., 1995)Klose y Kobalz (1995) logró separar 10.000 proteínas.
  43. 43. 2-D PAGEOriginalmente la Desventaja era la Falta de Reproducibilidad.La razón?Los “Ampholytes” usados para construír los gradientes de pHEn la actualidad los Gradientes de pH son immobilizados (IPGs).La estandarización de los procedimientos ha permitido elestablecimiento de bases de datos de Geles en 2-D.SWISS-2DPAGE y YEAST 2-D GEL DATABASESEl uso de IPGs las comparaciones cualitativas y cunatitativasen los patrones de expresión de proteínas.IPGs permiten cargar hasta 15 mg de proteína.
  44. 44. 2-D PAGE Obtención de proteínas de absoluta pureza bioquímica Análisis de Proteínas con modificaciones post-translacionales tales como fosforilación, geranilación, glycosilación y desdoblamiento proteolítico, entre otros.Estudios de Patología y Toxicología (Lee and harrington, 1997)Identificación de candidatos a vacunas (Chakravarti et al., 2001).

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