La útil dilución bacteriana...

1. Centro de Bachillerato Tecnológico Industrial y de Servicios Noº128
Práctica 4. Dilución bacteriana.
Sub módulo 3: Ejecuta técnicas de identificación de microorganismos con base en las normas.
Equipo 3. Integrantes: Cabral Brandon, González Lesly, Hernández Nayeli, Hernández Alan, Jiménez Fabiola,
Lagunas Itzel, Lira Vanesa, Mata Lizbet.
Facilitadora: Ing. Acosta Jessica
Fecha: Inició 22 de Octubre del 2014, 28 de Octubre del 2014.
Introducción
En diversos estudios microbiológicos (como análisis
de alimentos, de agua de bebida, de productos
farmacéuticos o del medioambiente entre otros) en
este caso sería el agua de tubería, se requiere
conocer el número de microorganismos presentes
en un material con un objeto de determinar su
calidad. Para esto se emplea la técnica de recuento
por dilución bacteriana que consiste en inocular una
serie de frascos tipo antibiótico con 9 ml del medio
de cultivo apropiado según el tipo de bacteria a
evaluar. Se obtiene 1 ml de la muestra usando una
jeringa descartable estéril de 1 o 2 ml. Se inocula el
2do frasco con una nueva jeringa, se retira 1 ml del
frasco no. 2, previamente agitado y se inocula el
frasco no. 3 y así sucesivamente, utilizando una
nueva jeringa para cada frasco.
Posteriormente se aplica lo que se conoce como
número más probable, que es una estrategia
eficiente para estimar densidades de población, lo
que ayuda cuando una evaluación cuantitativa de
elementos no es factible. Después de la dilución en
serie de la muestra de cultivo en un medio líquido
adecuado para el crecimiento de dicho organismo de
un volumen 10 veces mayor. Luego de incuban las
muestras de esos tubos y pasando un tiempo de
examinan.
Resumen
Primero que nada, se obtuvieron muestras de agua
de diferentes puntos de la ciudad.
En 7 tubos de ensaye pusimos 9ml de agua
esterilizada o destilada, en el primer tubo agregamos
1ml de muestra del cual después tomamos otro
mililitro de muestra y la vaciamos en el siguiente
(tubo 2), de este también tomamos 1ml y lo vaciamos
en el tubo 3 y así sucesivamente.
Ya se tenían 7 cajas Petri con M.C Nutritivo para
cada serie, de la dilución que realizamos en cada
tubo tomamos una muestra del tubo 1 para inocularlo
en la caja 1, una muestra del tubo 2 para inocular en
la caja 2, etc.
Después desechamos las diluciones que habíamos
realzado en los tubos. Así terminamos con la primera
parte de la práctica.
Para la siguiente parte se tienen 7 tubos con Caldo
Nutritivo, tomamos 1ml de muestra (se tomó
directamente) y lo vaciamos en uno de los 7 tubos.
De este primer tubo de ensaye tomamos otro mililitro
y lo pasamos a el segundo tubo, así repetimos la
operación que se realizó con los otros tubos.
Los llevamos a la incubadora y cuando fue momento
de sacarlos observamos el crecimiento que había
tanto en las cajas Petri con M.C Nutritivo como en
los tubos de ensayo con Caldo Nutritivo.
De los tubos de ensaye con Caldo Nutritivo se
realizaron 2 series cada una con diferentes muestras
de agua.
Abstract
First of all, water samples was obtained from different
parts of the city.
In 7 test tubes we put 9ml of sterilized or distilled
water, in the first tube add 1ml of sample which then
took another milliliter of sample and empty it in the
following ( tube 2 ) , this also take 1ml and emptied
in the tube 3 and so on.
And 7 Petri dishes were had with MC Nourishing for
each series of dilution in each tube we do take a
sample to inoculate the tube 1 in the box 1 , a sample
of the tube 2 in the box to inoculate 2, etc.

2. Discard the dilutions after we had highlighted in the
tubes. Thus ended the first part of practice.
For the next part will have 7 tubes containing nutrient
broth, take 1ml of sample (I was taken directly) and
pour into one of 7 tubes. In this first test tube took
another milliliter and had a second tube, so we repeat
the operation that was carried out with the other
tubes.
We took them to the incubator and when it was time
to remove them had observed the growth in both
Petri dishes with MC Nutritional and test tubes with
nutrient broth.
In test tubes with Nourishing Broth 2 series were
performed each with different water samples.
Materiales y métodos
Materiales
 Cajas Petri
 Tubos de ensaye
 Asas de platino
 Mechero de Bunsen
 Gradilla
 Agar nutritivo
 Caldo nutritivo
 Agua estéril
 Agua de la llave
 Porta objetos
 Cubre objetos
 Microscopio
Métodos
Técnicas de vaciado: Se prepararon 2 tipos de
cultivos: agar nutritivo y caldo nutritivo una vez
obtenidos se hizo el vaciado de agar nutritivo sobre
cajas Petri y el caldo nutritivo sobre dos series de
tubos de ensayo. Luego de esto se preparaban los
tubos de ensayo para esterilizar.
Estriado: Una vez que se cuajó el agar nutritivo en
las cajas Petri se toma un poco de muestra del tubo
#1 y se estría en la caja #1, un poco del tubo #2 y se
estría en la caja #2 y así sucesivamente hasta llegar
al final de cada uno de ellos.
Dilución: En los tubos de ensayo se enumeraron del
1 al 7 y en cada uno de ellos se le vertió 10 ml, 9 ml
de agua estéril y 1 ml de agua de la llave,
primeramente esto se llevó a cabo en el tubo #1
después de este tubo se tomó 1 ml de muestra y se
vertió en el tubo #2 y así sucesivamente hasta llegar
al #7 y se hizo lo mismo con la serie #2.
Morfología de colonias: Una vez que se dejó
reposar las cajas Petri se observaban las colonias de
bacterias que habían crecido sobre el agar nutritivo
permitiendo saber que el agua de la llave no está del
todo limpia tomando en cuenta la forma, borde,
superficie, color y el número de colonia, al igual que
con los tubos de ensayo se observaba la turbidez
que se produjo en cada uno de ellos.
Tinción de Gram: En ello se toma un poco de una
de las colonias de bacterias que crecieron en las
cajas Petri y en porta objetos se colocaba 1 gota de
agua y con un asa de platino se pone la muestra de
la colonia, dejando que se seque y fijándola sobre un
mechero. Luego de esto se tiñe la muestra con
diferentes tinturas tales como cristal violeta, lodo-
Lugol, alcohol-cetona, safranina y aceite de
inmersión para así después poder observarlas en un
microscopio.
Resultados
En los tubos de ensayo, pudo observarse el
crecimiento de colonias provenientes de una
muestra de agua potable. En la primera serie de
tubos de ensayo (7 tubos), el primer tubo en el que
se agregó un ml de muestra estaba más turbio, por
lo que presentaba un mayor crecimiento de colonias;
en los tubos siguientes, la turbidez fue
disminuyendo, en el tubo 7 se apreció la menor
turbidez de la serie. En la segunda serie de tubos (7
tubos), el primer tubo presentó la mayor turbidez,
esta última fue disminuyendo en los tubos
siguientes, y en el tubo 7 se apreció una menor
turbidez y una película sobre el medio líquido. En los
primeros tubos de cada serie se observaron colonias
sedimentadas.
Al cultivar un medio de cultivo como nutritivo que en
este caso fue el que se utilizó y se obtuvieron
cantidades de crecimiento en colonias tanto
mínimas como mayores en los agares, que en la
siguiente tabla se mostraran los resultados de estos.

3. m. c forma colo
r
superfi
cie
borde coloni
as
1-
Nutriti
vo
Puntifor
me
Blan
co
Plana Redonde
ado
6
2-
Nutriti
vo
Puntifor
me
Blan
co
Plana Redonde
ado
17
3-
Nutriti
vo
Puntifor
me
Blan
co
Plana Redonde
ado
12
4-
Nutriti
vo
Puntifor
me
Blan
co
Plana Redonde
ado
26
5-
Nutriti
vo
Puntifor
me
Blan
co
Plana Redonde
ado
60
6-
Nutriti
vo
Puntifor
me
Blan
co
Plana Redonde
ado
29
7-
Nutriti
vo
Puntifor
me
Blan
co
Plana Redonde
ado
67
Como se muestra en la tabla respecto a la forma,
color , borde y superficie se tuvieron los mismos
resultados ya que es el mismo medio de cultivo, si
en este caso se utilizara otro pues las características
ya mencionadas serian diferentes , pero al respecto
de las colonias que crecieron se encuentra una gran
diferencia.
De igual manera cabe mencionar que en los agares
3 & 4 hubo crecimiento de filamentosa.
También al realizar la tinción en la que se toma una
pequeña cantidad de muestra de cada uno de los
agares se obtuvieron los siguientes resultados:
Muestra Forma Tipo
Nutritivo #1 Cocos Positivo
Nutritivo #2 Cocos Negativo
Nutritivo #3 Cocos Positivo
Nutritivo #4 Bacilos Negativo
Nutritivo #5 Cocos Positivo
En esta ocasión solo se lograron observar bacterias
en 5 de los agares.
Conclusiones
Cabral Brandon: Esto nos ayuda porque los
estudios microbiológicos estudian los alimentos,
agua, productos farmacéuticos y productos o del
medio ambiente. Por qué nos ayuda a saber la
calidad del producto si es que está contaminado o
no, usan do los tipos de estriado para poder
realizarlo.
González Lesly: En esta práctica se estudió la
dilución bacteriana por el meto del número más
probable para poder conocer y calcular el número de
microorganismos que se encuentran en el agua
potable de diferentes casas, para poder observar
cantas bacterias son las que se encuentran en el
agua que tomamos día a día, y que tanto es que
están contaminadas las tuberías de la ciudad, no se
realizó el objetivo ya que al momento de estar
haciendo el procedimiento de dilución por número
más probable el tubo 7 se contamino de alguna
manera, por estar fuera del triángulo de seguridad,
siendo así el más contaminado de la serie, se
observó bastante turbidez en los tubos pero siendo
el tubo numero 7 presentando más turbidez que al 1.
Mientras que en las cajas Petri se observó poco
crecimiento de colonias a 24 hr de incubación,
mientras que al momento de volverlas a revisar a las
96 hrs se notó un gran crecimiento de bacterias y
hongos.
Hernández Nayelli: Sobre la práctica y el estriado
primeramente hay que tener mucho en cuenta las
reglas que hay para realizar este, saber que estriado
en la placa se hará y antes de esto practicar para que
en la placa salga bien y que al momento de su
cultivación las bacterias o lo que valla a crecer se
halla hecho de manera correcta así como estriar
dentro del trianguló que se hace con los mecheros
para que estas no se contaminen dependiendo del
agar.
Como también podemos darnos cuenta como ya se
dijo anteriormente podemos observar los cambios
que estas presentan ya sea en el color y el número
de colonias que nacen en los cultivos y así tomar
muestras y poder ver qué tipo de bacterias estamos
tratando y tener un mejor conocimiento de estas.
Hernández Alan: La dilución bacteriana permite
aplicar la técnica del NMP, la cual busca establecer
una estimación del número de bacterias tomando en
cuenta las densidades del medio y las colonias.
Debido a lo anterior, la dilución bacteriana es muy
importante debido a que permite obtener resultados
cuantitativos relacionados con la cantidad de
bacterias.
En la realización de la práctica no se empleó la
técnica NMP, solamente se realizó la dilución
bacteriana. Esta última, permitió comprobar que la

4. turbidez de un medio líquido va disminuyendo
conforme disminuye la dilución inoculada en este (la
cual contiene por lo menos una bacteria que permita
dar origen a otras).
Jiménez Fabiola: Gracias a la dilución se pueden
evaluar diferentes grupos bacterianos, en este caso
en este caso se analizaron algunas muestras de
agua de diferentes viviendas de la ciudad; y se pudo
notar como el agua que bebemos no está muy
contaminada como parece, sí, tiene bacterias y no
nos damos cuenta, pero la práctica nos ayudó a ver
qué gérmenes y microorganismos hay en lo que
nuestro cuerpo ingiere.
Lagunas Itzel: Este procedimiento tiene una gran
importancia al determinar la calidad de cierto
producto. El uso de esta técnica de simple ejecución
y fácil interpretación, se pueden evaluar diferentes
grupos bacterianos según el medio de cultivo que
contenga el frasco.
Lira Vanessa: Al realizar la práctica se toman en
cuenta diversas cosas como desde que al estriar se
debe de realizar dentro del triángulo de los mecheros
ya que si esto no se hace pues afectaría al agar y
este se contaminaría y ya no se le podría dar uso, al
igual que tener los materiales limpios, al igual que
entre más se practiquen las cosas más se aprende.
Respecto a la morfología y tinción es importante
realizara ya que se pueden observar cambios
cuando se utilizan diferentes medios de cultivo y así
se puede tener un conocimiento más amplio del tipo
de bacteria que crece, la forma y el color que
obtienen, o entre otras cosas. Para que de la misma
manera se pueda destacar que es lo que define a
una bacteria, sus propiedades y lo que la caracteriza.
Mata Lucero: La dilución bacteriana nos ayuda
principalmente al conteo rápido de las bacterias, nos
permite hacerlo por medio de una disminución de
microorganismos que pasan de una muestra a otra
reduciendo así el número de bacterias que crezcan.
Todo esto lo identificamos por medio de la turbidez
que existe en cada uno de los tubos de ensaye. Es
muy probable que el resultado que obtengamos si no
se hace de una forma lo bastante correcta no sea el
resultado exacto pero es el más cercano a este.
Meléndez Araceli: Tomamos muestras de agua de
diferentes puntos de la ciudad con la finalidad de
saber que tan contaminadas están las tuberías de
cada parte de la ciudad ya que cada compañero vive
en diferentes áreas muy alejadas de las otras, a
través de esta práctica los resultados esperados
eran que las zonas con más años es decir más viejas
estuvieran más contaminadas las tuberías, durante
la práctica se obtuvieron algunos resultados
deseados pero lamentablemente algunos no
deseados como la contaminación nuestra.
Discusión
Gracias a la realización de esta práctica se aprendió
a hacer las diluciones en caldos, se tomó como
muestra el agua potable de las casas de los
integrantes del equipo, siendo todas de diferentes
sectores, estas muestras se cultivaron en cajas Petri
obteniendo poco crecimiento de colonias
puntiformes en el medio. Mientras que en las
diluciones en tubo el objetivo no se cumplió, ya que
al momento de observar el crecimiento y turbidez se
presentó más en el tubo 7 que en el 1, debido a que
algún paso quedo inconcluso, o la jeringa con la que
se estaba vaciando la muestra se contamino. Y por
último se realizaron las tinciones para así poder
determinar la morfología de la bacteria.
Bibliografía
 Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao,
B.Serrano y O.Velázquez. (2009). Técnicas
para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª
ed. Facultad de Química, UNAM. México.
 Laboratorio de Microbiología Industrial .
(2013). Técnica de recuento por dilución.
Octubre 31, 2014, de MAG .Sitio web:
http://www.laboratoriomag.com.ar/sitio2/index.
php/tecnicas-recomendadas/tecnica-de-recuento-
por-dilucion

5. Anexos
DILUCION BACTERIANA
El conteo bacteriano señala la magnitud de la
población total bacteriana. En ese sentido se puede
determinar por diversas técnicas que se basan en
algunos de los siguientes tipos de medida: cuenta
celular (directamente al microscopio o mediante un
contador electrónico de partículas o indirectamente
con la cuenta de colonias), masa celular (en forma
directa pesando el contenido celular del nitrógeno o
indirectamente por turbidimetría, proporcional al
número de células) y actividad celular
(indirectamente relacionando el grado de actividad
bioquímica al tamaño de la población bacteriana).
Conteo en caja de Petri
Método más usado para contar bacterias. Un caldo
de cultivo con microorganismos es diluido y
posteriormente muestras del mismo son distribuidas
en la caja de Petri contenedora de agar. Es de
suponerse que cada célula se dividirá en sus
múltiples alrededores para producir colonias
separadas en el agar. Cada célula es llamada unidad
formadora de colonias (UFC). Después de la
incubación, el número de colonias se reflejará en el
número de células UFC originalmente presentes. Es
importante considerar un número limitado de
colonias pues de no ser así, éstas pueden sobre
poblarse y dificultar el conteo de las mismas (rango
sugerido de acuerdo a FDA 25-250 colonias). El
conteo se facilita utilizando un contador de colonias.
Este método es deseable porque arroja el total de
células viables (sólo células vivas); en contraste con
el conteo microscópico y el conteo de peso seco.
Una desventaja radica en el tiempo que requiere
para producir las colonias, ya que se necesitan como
mínimo veinticuatro horas o más. Por otra parte, no
es cien por ciento fiable porque generalmente las
colonias crecen unidas en cadenas o en grupos.
Conteo por filtración
Es realizado cuando la cantidad de bacterias es muy
pequeña, como en casos de lagos y arroyos
relativamente puros. En esta técnica se necesitan al
menos 100 mL de agua que atraviesen una
membrana delgada de un filtro, con poros tan
pequeños que no permitan el paso de bacterias, de
esta forma éstas son retenidas en la superficie del
filtro. Posteriormente el filtro es transferido a una caja
de Petri que cuenta con un caldo nutritivo, en la cual
las colonias surgen de las bacterias en la superficie
del filtro. Las colonias bacterianas formadas por este
método son distintivas cuando ocupan un medio
diferencial.
Este método es aplicado frecuentemente en la
detección y enumeración de bacterias coliformes, las
cuales son indicadores de contaminación fecal en la
comida o en el agua.
GENERALIDADES
Cuando se requiere investigar el contenido de
microorganismos viables en un alimento, la técnica
comúnmente utilizada es la cuenta en placa. Esta
técnica no pretende detectar a todos los
microorganismos presentes, pero el medio de
cultivo, las condiciones de temperatura y la
presencia de oxígeno, permiten seleccionar grupos
de bacterias cuya presencia es importante en
diferentes alimentos; por ejemplo, las bacterias
mesofílicas aerobias, o mesófilos aerobios son un
indicador general de la población que pueden estar
presente en una muestra y, por lo tanto, de la higiene
con que ha sido manejado el producto. Este grupo
en particular, se determina en la mayor parte de los
alimentos, pero para algunos productos, también es
importante determinar la presencia de bacterias
termofílicas, psicrofílicas y/o psicrotróficas para
predecir la estabilidad del producto bajo diferentes
condiciones de almacenamiento. La técnica básica
es la misma, pero cambian las condiciones de
incubación, medios de cultivo y algunos otros
detalles, que se mencionan en la técnica. Si se
modifican las condiciones de incubación o se somete
la muestra a algún tratamiento previo, el método
puede aplicarse también a la detección de otros
grupos como anaerobios o esporulados, desde
luego, con la adecuada selección de medios de
cultivo.
El método permite numerosas fuentes de variación,
algunas de ellas controlables, pero sujetas a la
influencia de diversos factores por lo que es muy
importante apegarse a la técnica y controlar
cuidadosamente las condiciones.
FUNDAMENTO
La técnica se basa en contar las “unidades
formadoras de colonias” o UFC presentes en un
gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada
colonia que desarrolla en el medio de cultivo de
elección después de un cierto tiempo de incubación
a la temperatura adecuada, proviene de un
microorganismo o de un agregado de ellos, de la
muestra bajo estudio; ese microorganismo o
microorganismos son capaces de formar la colonia,

6. es decir una UFC. Para que las colonias puedan
contarse de manera confiable, se hacen las
diluciones decimales necesarias de la muestra,
antes de ponerla en el medio de cultivo; la técnica
para realizar este procedimiento se describe en
“Preparación y dilución de muestras de alimentos
para su análisis microbiológico”.
NMP (NUMERO MAS PROBABLE)
Es una técnica de estimación estadística basada en
el hecho que a mayor número de bacterias en una
muestra, mayor será la dilución necesitada para
reducir la densidad hasta el punto en que ninguna
bacteria se le permita crecer en la serie de tubos de
dilución. Muestras microbianas son añadidas a tubos
con caldos de lactosa y la presencia o ausencia de
gas formado en la fermentación y da un estimado de
número de células. Este método es más útil cuando
las bacterias que están siendo contados no crecerán
en medios sólidos, como en el caso de
Chemoautotrof phic nitrifying bacteria. También es
útil cuando el crecimiento de la bacteria es en un
medio líquido diferencial, usado para identificar
microbios, como en bacterias coliformes. El NMP es
la única afirmación en la cual existe 95% de
probabilidad que la población bacteriana sea de
rango correcto, siendo el número estadístico más
probable.
EL METODO DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP)
es una estrategia eficiente de estimación de
densidades poblacionales especialmente cuando
una evaluación cuantitativa de células individuales
no es factible. La técnica se basa en la
determinación de presencia o ausencia (pos o neg)
en réplicas de diluciones consecutivas de atributos
particulares de microorganismos presentes en
muestras de suelo u otros ambientes. Por lo tanto,
un requisito importante de este método es la
necesidad de poder reconocer un atributo particular
de la población(es) en el medio de crecimiento a
utilizarse. El estimado de densidad poblacional se
obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en
diluciones seriadas y el uso de una tabla
probabilística.
Algunas de las ventajas del NMP son: (i) la
capacidad de estimar tamaños poblacionales
basados en atributos relacionados a un proceso
(selectividad); por ejemplo se puede determinar la
densidad poblacional de organismos que pueden
nodular leguminosas en una muestra de suelo
usando el método de infección de plantas, (ii) provee
una recuperación uniforme de las poblaciones
microbianas de suelos diversificados, (iii) determina
sólo organismos vivos y activos metabólicamente, y
(iv) suele ser más rápido e igual de confiable que los
métodos tradicionales de esparcimiento en platos de
cultivo, entre otros.
En este ejercicio, se utilizará una variante de esta
metodología para estimar la densidad total de
bacterias presentes en una muestra. El atributo
particular a utilizarse será la capacidad de
microorganismos a formar colonias en medios
sólidos de crecimiento.