Ingeniería Genética-I.G. Microbiología General- Biol 3705 Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
Objetivos <ul><li>Al terminar de discutir este capítulo, el estudiante estará capacitado para: </li></ul><ul><ul><li>Menci...
Objetivos <ul><li>Distinguirá las etapas de la recombinación  del DNA, hacer una quimera </li></ul><ul><li>Explicará la té...
Introducción- I.G. <ul><li>Ingeniería   genética -manipulación y modificación genoma organismos </li></ul><ul><li>Biotecno...
Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
Introducción- I.G. <ul><li>rDNA - DNA recombinado, insertar genes en célula, modificando genéticamente organismos </li></u...
Steps in Cloning a Gene Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Figure 14.1
Herramientas y Téc. De  I.G. <ul><li>Características DNA </li></ul><ul><ul><li>Sube temp. de 90-95C se desnaturaliza, si e...
Extraccion de DNA Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
Extracción de DNA <ul><li>Cultivo </li></ul><ul><li>Sonido/bolitas vidrio </li></ul><ul><li>Vortex + fenol +calor- romper ...
Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
Endonucleasas de Restricción <ul><li>Enzimas reconocen y cortan secciones palindrómicas (4-5-6-7 pares) </li></ul><ul><li>...
Restriction Endonucleases and Their Recognition Sequences Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Table 14.2
Enzima de Restricción <ul><li>Enzima de restricción Bam HI </li></ul><ul><li>Se obtiene de  Bacillus   amyloliquefaciens <...
Endonucleasas de Restricción <ul><li>No cortan DNA de donde provienen- está modificado por adición de grupos metilo (CH 3 ...
Endonucleasas Restricción <ul><li>Hay cortes que no son “sticky ends”. Se llaman “blunt ends” y es menos eficiente </li></...
Eco R1 Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Figure 14.3
Enzima de Restricción Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
Otras Enzimas- I.G. <ul><li>Ligasas - sellan pedazos cortados previamente  por endonucleasas, sellan genes en plásmido y c...
Synthesis of cDNA Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Figure 14.4
Recombinant DNA molecules <ul><li>Jackson, Symons, and Berg (1972) </li></ul><ul><ul><li>generated first recombinant DNA m...
Recombinant plasmid construction Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Figure 14.5
Análisis DNA- Electroforesis <ul><li>Proceso verificación cortes DNA sean los correctos </li></ul><ul><li>Electroforesis -...
Electroforesis <ul><li>Bandas se  ven con bromuro de etidio y luz UV </li></ul><ul><li>Estándares permiten saber los corte...
Gel Electrophoresis <ul><li>used to separate molecules based on their charge and size </li></ul><ul><li>agarose or acrylam...
Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
Electroforesis Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
Hibridización Acidos Nucleicos y Sondas (“Probes”) <ul><li>Banda de DNA puede hibridizarse con otra- permite detectar secu...
Sondas de DNA Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
Sondas de DNA <ul><li>DNA probe - a length of single-stranded DNA that matches part of the gene and is linked to a radioac...
“ Southern Blot” <ul><li>Método donde se fragmenta DNA y separa por electroforesis, se desnaturaliza (1 hebra) e inmobiliz...
Southern blotting technique <ul><li>developed by Edwin M. Southern (1975) </li></ul><ul><li>used to detect specific DNA fr...
Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
Southern Blotting Technique Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Figure 14.6
Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
Métodos de Recombinación DNA <ul><li>rDNA- DNA recombinado, se conoce desde 1970 </li></ul><ul><li>Se crean clones: </li><...
Características  Vectores Clonación <ul><li>Llevar DNA donado </li></ul><ul><li>Aceptar hospedero de clonación </li></ul><...
Cloning Vectors and Creating Recombinant DNA <ul><li>there are four types of cloning vectors </li></ul><ul><ul><li>plasmid...
Cosmids <ul><li>do not exist in nature </li></ul><ul><li>these vectors have been constructed to contain features from both...
Artificial Chromosomes <ul><li>used when large fragments of DNA must be cloned </li></ul><ul><li>bacterial artificial chro...
Caract. Vectores Clonación <ul><li>Vectores tienen información de resistencia a antibióticos  (ampicilina,  tetraciclina);...
Vector de Clonación - Plásmido <ul><li>Vector de clonación  </li></ul><ul><li>pBR322 – plásmido </li></ul><ul><ul><li>Cont...
Plasmido pBR322 Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
Bacteriofago Lambda Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
Construction of a Recombinant Plasmid Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Figure 14.13
Reacción de Polimerasa en Cadena- PCR <ul><li>Técnica bien sensitiva, puede detectar una sola célula cancerosa </li></ul><...
The Polymerase Chain Reaction (PCR) <ul><li>enables the rapid synthesis of many copies of a specific DNA fragment from a c...
PCR <ul><li>En 20 ciclos se producen 1 millón de copias, máquina puede hacer 20 ciclos en 2-3 horas </li></ul><ul><ul><li>...
Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
Quimera <ul><li>Quimera – inserción en hospedero de clonación y expresión genética </li></ul><ul><li>Ejemplo – Construcció...
Quimera – cont. <ul><li>3. Permite que lados “sticky ends” de (1) y de (2) se junten por complementaridad. Enzima  ligasa ...
Quimera – cont. <ul><li>6. Se cultivan colonias de  E. coli  transformadas </li></ul><ul><li>7. Se coloca (6) en medio de ...
Inserting Recombinant DNA into Host Cells <ul><li>most common hosts </li></ul><ul><ul><li>E. coli   - procaryotic host </l...
Inserting Recombinant DNA into Eucaryotic Host Cells <ul><li>electroporation </li></ul><ul><li>microinjection </li></ul><u...
Expression of Foreign Genes in Host Cells <ul><li>cloned genes, in the new host cell, are called  heterologous genes ,and ...
Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
Verificacion Cultivo Clonado Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
Construction of Genomic Libraries <ul><li>used when gene of interest is on a chromosome that has not been sequenced </li><...
III. Productos Bioquímicos de Tecnología de DNA Recombinante <ul><li>Tecnología DNA recombinante usada por compañias farma...
The Numerous Applications of Genetic Engineering <ul><li>in medicine </li></ul><ul><ul><li>many useful proteins </li></ul>...
Insulina rDNA <ul><li>Insulina recombinada </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
Productos de Tec. rDNA <ul><li>Hoy se produce insulina y HGH por rDNA. También se elaboran vacunas. </li></ul><ul><li>Otro...
Organismos Genéticamente Modificados  - GMO’s <ul><li>Transfección – proceso de introducir genes extraños a un organismo <...
GMO’s <ul><li>GMO’s pueden realizar bioremediación  ( degradación de sustratos contaminantes como hidrocarburos, benceno, ...
Bioengineering of Plants Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Figure 14.19
GMO’s <ul><li>Animales: </li></ul><ul><ul><li>Genes extraños se insertan al óvulo usando alto voltaje o microinyección </l...
Terapia Genética <ul><li>Sustituir genes defectuosos por genes funcionales usando vectores de clonación. </li></ul>Prof. A...
Terapia Genetica Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
Social Impact of Recombinant DNA technology <ul><li>there is scientific and philosophical concern about </li></ul><ul><ul>...
Referencias <ul><li>www.slic2.wsu.edu:82/.../pages/Chap10.html   </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
Biotecnología en Bacterias <ul><li>José Morey </li></ul><ul><li>Misraim  Vélez </li></ul>
Producción de vacuna recombinante
Producción de vacuna recombinante
Producción de vacuna recombinante
Ventajas <ul><li>Desarrollo de productos médicos </li></ul><ul><ul><li>Antibióticos </li></ul></ul><ul><ul><li>Vacunas </l...
Conclusión <ul><li>Los microorganismos son máquinas flexibles y fascinantes capaces de producir un vasta variedad de compu...
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

Cap 14 ing. genetica

1,781 views

Published on

Published in: Education
0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total views
1,781
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
7
Actions
Shares
0
Downloads
33
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

No notes for slide
  • cleavage catalyzed by Eco RI
  • Cap 14 ing. genetica

    1. 1. Ingeniería Genética-I.G. Microbiología General- Biol 3705 Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    2. 2. Objetivos <ul><li>Al terminar de discutir este capítulo, el estudiante estará capacitado para: </li></ul><ul><ul><li>Mencionar vocabulario de ingeniería genética (biotecnología, clonación, otras) </li></ul></ul><ul><ul><li>Denominar técnicas de ingeniería genética como: endonucleasas de restricción, transcriptasa inversa, electroforesis, sondas de DNA, etc. </li></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    3. 3. Objetivos <ul><li>Distinguirá las etapas de la recombinación del DNA, hacer una quimera </li></ul><ul><li>Explicará la técnica de reacción en cadena de polimerasa (PCR) </li></ul><ul><li>Mencionará algunos productos obtenidos a través de rDNA </li></ul><ul><li>Distinguirá metodología para realizar cultivos transgénicos, plantas y animales </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    4. 4. Introducción- I.G. <ul><li>Ingeniería genética -manipulación y modificación genoma organismos </li></ul><ul><li>Biotecnología - desarrollo productos industriales usando organismos para nuestro beneficio </li></ul><ul><ul><li>Aplicacion tecnológica que usa sist. Biológicos, para hacer o modificar productos o procesos para uso específico </li></ul></ul><ul><li>DNA se aisla, maneja, y modifica </li></ul><ul><li>Secuenciar DNA- orden de bases </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    5. 5. Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    6. 6. Introducción- I.G. <ul><li>rDNA - DNA recombinado, insertar genes en célula, modificando genéticamente organismos </li></ul><ul><li>clonar - insertar y propagar DNA, requiere vectores especiales </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    7. 7. Steps in Cloning a Gene Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Figure 14.1
    8. 8. Herramientas y Téc. De I.G. <ul><li>Características DNA </li></ul><ul><ul><li>Sube temp. de 90-95C se desnaturaliza, si enfria temp. vuelven a unirse las bandas por enlaces de H </li></ul></ul><ul><ul><li>DNA se corta con endonucleasas de restricción </li></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    9. 9. Extraccion de DNA Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    10. 10. Extracción de DNA <ul><li>Cultivo </li></ul><ul><li>Sonido/bolitas vidrio </li></ul><ul><li>Vortex + fenol +calor- romper paredes y/o capsida; + detergente- remover membrana </li></ul><ul><li>Proteasas-precipitar proteínas + sales </li></ul><ul><li>Agitar mezcla con cloroformo y fenol- DNA en medio de 2 fases </li></ul><ul><li>DNA precipitarlo con etanol frío (insoluble en alcohol) </li></ul><ul><li>Pellet DNA lavarlo con alcohol frío </li></ul><ul><li>Secar y colocar en buffer </li></ul><ul><li>Confirmar presencia en electroforesis </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    11. 11. Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    12. 12. Endonucleasas de Restricción <ul><li>Enzimas reconocen y cortan secciones palindrómicas (4-5-6-7 pares) </li></ul><ul><li>Se nombran por la 1a letra del género - bacteria aislada, 1as. 2 letras de la especie y núm. De endonucleasa </li></ul><ul><ul><li>EcoR1- G-A-A-T-T-C </li></ul></ul><ul><ul><li>C-T-T-A-A-G </li></ul></ul><ul><ul><li>usado para cortar DNA en pequeñas porciones </li></ul></ul><ul><ul><li>usado para remover e insertar en DNA </li></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    13. 13. Restriction Endonucleases and Their Recognition Sequences Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Table 14.2
    14. 14. Enzima de Restricción <ul><li>Enzima de restricción Bam HI </li></ul><ul><li>Se obtiene de Bacillus amyloliquefaciens </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    15. 15. Endonucleasas de Restricción <ul><li>No cortan DNA de donde provienen- está modificado por adición de grupos metilo (CH 3 ) </li></ul><ul><li>Cortan en “cohesive ends” o “sticky ends”- parean entre sí </li></ul><ul><ul><li>ej. DNA cortado con EcoR1 siempre producirá los mismos “sticky ends” </li></ul></ul><ul><ul><li>permite ‘sticky ends” se junten ( enlaces H) al enfriar temp. no importa de donde provengan </li></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    16. 16. Endonucleasas Restricción <ul><li>Hay cortes que no son “sticky ends”. Se llaman “blunt ends” y es menos eficiente </li></ul><ul><ul><li>Ej. C-C-C </li></ul></ul><ul><ul><li>G-G-G </li></ul></ul><ul><ul><li>Proceso de ligación es menos eficiente que con “sticky ends” </li></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    17. 17. Eco R1 Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    18. 18. Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Figure 14.3
    19. 19. Enzima de Restricción Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    20. 20. Otras Enzimas- I.G. <ul><li>Ligasas - sellan pedazos cortados previamente por endonucleasas, sellan genes en plásmido y cromosomas </li></ul><ul><li>Transcriptasa inversa- usada convertir RNA en DNA; copias hechas con esta enzima se denominan- cDNA (“complimentary”)- permite sintesís DNA de r,m,t RNA sin introns (eucariotas), descubierta en 1970 </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    21. 21. Synthesis of cDNA Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Figure 14.4
    22. 22. Recombinant DNA molecules <ul><li>Jackson, Symons, and Berg (1972) </li></ul><ul><ul><li>generated first recombinant DNA molecules </li></ul></ul><ul><li>Cohen and Boyer (1973) </li></ul><ul><ul><li>produced first plasmid vector capable of being replicated within a bacterial host </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>vectors – carriers of foreign DNA </li></ul></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    23. 23. Recombinant plasmid construction Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Figure 14.5
    24. 24. Análisis DNA- Electroforesis <ul><li>Proceso verificación cortes DNA sean los correctos </li></ul><ul><li>Electroforesis -muestras cortadas colocarlas en gel (agarosa) y se expone a campo eléctrico </li></ul><ul><ul><li>DNA carga -, se moverá al área + </li></ul></ul><ul><ul><li>partículas más peq. se moverán más rápido </li></ul></ul><ul><ul><li>visualiza con bromuro de etidio y luz uv </li></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    25. 25. Electroforesis <ul><li>Bandas se ven con bromuro de etidio y luz UV </li></ul><ul><li>Estándares permiten saber los cortes y tamaño de ellos </li></ul><ul><li>Permite decidir si 2 muestras son idénticas </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    26. 26. Gel Electrophoresis <ul><li>used to separate molecules based on their charge and size </li></ul><ul><li>agarose or acrylamide gels can be used to separate DNA fragments </li></ul><ul><li>DNA is acidic; it migrates from the negative to the positive end of the gel </li></ul><ul><ul><li>each fragment’s migration rate is inversely proportional to the log of its molecular weight </li></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    27. 27. Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    28. 28. Electroforesis Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    29. 29. Hibridización Acidos Nucleicos y Sondas (“Probes”) <ul><li>Banda de DNA puede hibridizarse con otra- permite detectar secuencias específicas de nucleótidos de muestras desconocidas </li></ul><ul><li>Areas de hibridización se pueden visualizar por: </li></ul><ul><ul><li>Marcadores radiactivos </li></ul></ul><ul><ul><li>Isótopos- emiten radiación </li></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    30. 30. Sondas de DNA Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    31. 31. Sondas de DNA <ul><li>DNA probe - a length of single-stranded DNA that matches part of the gene and is linked to a radioactive atom. The single-stranded probe seeks and binds to the gene. Radioactive signals from the probe are then made visible on x-ray film, showing where the probe and gene matched. Previous page: What does a predictive gene test tell you? TOC page: Table of Contents Next page: What is the current status of predictive gene testing for cancer? Know of a great site to add to this list? </li></ul><ul><li>Earth & Space </li></ul><ul><li>Biology </li></ul><ul><li>Biotechnology </li></ul><ul><li>Botany </li></ul><ul><li>Computers & Technology </li></ul><ul><li>Conferences & Opportunities </li></ul><ul><li>Environment </li></ul><ul><li>Genetics </li></ul><ul><li>Mathematics </li></ul><ul><li>Microbiology </li></ul><ul><li>Microscopy </li></ul><ul><li>Reference </li></ul><ul><li>Debates & Ethics </li></ul><ul><li>Science Ed. Resources </li></ul><ul><li>Science News </li></ul><ul><li>Teacher Pages </li></ul><ul><li>Virology </li></ul><ul><li>Virtual Field Trips </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    32. 32. “ Southern Blot” <ul><li>Método donde se fragmenta DNA y separa por electroforesis, se desnaturaliza (1 hebra) e inmobiliza en un papel de filtro. Una sonda se incuba con la muestra y si halla áreas complementarias se hibridizará </li></ul><ul><li>Uso de sondas usadas diagnosticar infecciones e identificación de microorg. Hay kits comerciales para identificación de bacterias y virus </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    33. 33. Southern blotting technique <ul><li>developed by Edwin M. Southern (1975) </li></ul><ul><li>used to detect specific DNA fragments </li></ul><ul><li>often uses radioactive DNA hybridization probes </li></ul><ul><li>autoradiography </li></ul><ul><ul><li>method for detecting radioactively labeled molecules </li></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    34. 34. Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    35. 35. Southern Blotting Technique Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Figure 14.6
    36. 36. Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    37. 37. Métodos de Recombinación DNA <ul><li>rDNA- DNA recombinado, se conoce desde 1970 </li></ul><ul><li>Se crean clones: </li></ul><ul><ul><li>Remover el gen seleccionado de X organismo (donante), cortado con endonucleasas y aislado </li></ul></ul><ul><ul><li>Propagación en un hospedero diferente </li></ul></ul><ul><ul><li>Gen insertado a un vector (plásmido o virus) </li></ul></ul><ul><ul><li>Insertar en hospedero de clonación (bacteria o levadura) </li></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    38. 38. Características Vectores Clonación <ul><li>Llevar DNA donado </li></ul><ul><li>Aceptar hospedero de clonación </li></ul><ul><li>Plásmidos excelentes , pequeños, fácil de manejar- pueden transferirse por transformación </li></ul><ul><li>Bacteriófagos- buenos vectores, inyectan DNA a hospedro bacteriano por transducción </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    39. 39. Cloning Vectors and Creating Recombinant DNA <ul><li>there are four types of cloning vectors </li></ul><ul><ul><li>plasmids (most commonly used) </li></ul></ul><ul><ul><li>phages and viruses </li></ul></ul><ul><ul><li>cosmids </li></ul></ul><ul><ul><li>artificial chromosomes </li></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    40. 40. Cosmids <ul><li>do not exist in nature </li></ul><ul><li>these vectors have been constructed to contain features from both phages and plasmids </li></ul><ul><ul><li>they have a selectable marker, multiple cloning sites from plasmids and a cos site from  phage </li></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    41. 41. Artificial Chromosomes <ul><li>used when large fragments of DNA must be cloned </li></ul><ul><li>bacterial artificial chromosomes (BACs) </li></ul><ul><li>played important role in the human genome project </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    42. 42. Caract. Vectores Clonación <ul><li>Vectores tienen información de resistencia a antibióticos (ampicilina, tetraciclina); lo que ayuda a usar medios selectivos y los clones recombinados sean evidentes </li></ul><ul><li>Hospedero de clonación deberá crecer rápido, usar medios de cultivo ordinarios, genoma conocido como E.coli , Saccharomyces , Bacillus subtilis </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    43. 43. Vector de Clonación - Plásmido <ul><li>Vector de clonación </li></ul><ul><li>pBR322 – plásmido </li></ul><ul><ul><li>Contiene genes de resistencia a antibióticos : </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>Ampicilina </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Tetraciclina </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>Tamaño DNA = menos de 5 kb (4,363 nucleótidos) </li></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    44. 44. Plasmido pBR322 Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    45. 45. Bacteriofago Lambda Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    46. 46. Construction of a Recombinant Plasmid Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Figure 14.13
    47. 47. Reacción de Polimerasa en Cadena- PCR <ul><li>Técnica bien sensitiva, puede detectar una sola célula cancerosa </li></ul><ul><li>Necesita materiales: </li></ul><ul><ul><li>“ primers”- oligonucleótidos 15-30 bases </li></ul></ul><ul><ul><li>DNA polimerasa- Taq polimeras (Thermus aquaticus) </li></ul></ul><ul><ul><li>Máquina realiza ciclos: desnaturaliza a 94C, priming-enfriar de 50 (A=T), 65C (G=C)- 3 enlaces H, extensión- 72C </li></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    48. 48. The Polymerase Chain Reaction (PCR) <ul><li>enables the rapid synthesis of many copies of a specific DNA fragment from a complex mixture of DNA and other cellular components </li></ul><ul><li>reaction mix contains </li></ul><ul><ul><li>primers </li></ul></ul><ul><ul><li>target DNA </li></ul></ul><ul><ul><li>thermostable DNA polymerase such as Taq polymerase </li></ul></ul><ul><ul><li>each of the four deoxyribonucleotide triphosphates </li></ul></ul><ul><li>thermocycler is the instrument used </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    49. 49. PCR <ul><li>En 20 ciclos se producen 1 millón de copias, máquina puede hacer 20 ciclos en 2-3 horas </li></ul><ul><ul><li>desnaturalizar </li></ul></ul><ul><ul><li>“ priming” </li></ul></ul><ul><ul><li>extensión </li></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    50. 50. Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    51. 51. Quimera <ul><li>Quimera – inserción en hospedero de clonación y expresión genética </li></ul><ul><li>Ejemplo – Construcción Quimera </li></ul><ul><ul><li>1. Se aisla gen interferón humano (500 pb y codifica proteina de 166 amino ácidos). Se corta con endonucleasa Hind III </li></ul></ul><ul><ul><li>2. Se abre el plásmido (vector de clonación) con Hind III </li></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    52. 52. Quimera – cont. <ul><li>3. Permite que lados “sticky ends” de (1) y de (2) se junten por complementaridad. Enzima ligasa sellará uniones = quimera </li></ul><ul><li>4. Quimera se introduce por transformación en hospedero de clonación E. coli </li></ul><ul><li>5. Cultivo de E. coli con quimera se coloca en medio de cultivo con ampicilina; solo crecerá E. coli que tenga el plásmido ( lleva gen de R-amp). Se seleccionan colonias de la placa petri. </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    53. 53. Quimera – cont. <ul><li>6. Se cultivan colonias de E. coli transformadas </li></ul><ul><li>7. Se coloca (6) en medio de cultivo especial- condiciones óptimas que permita expresión del gen interferón humano por su transcripción y traducción; se sintetiza la proteina y la libera al medio de cultivo </li></ul><ul><li>8. Procesamiento final – purificación proteina y remoción del microorg. </li></ul><ul><li>9. Así se han sintetizado hormonas, enzimas, etc. </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    54. 54. Inserting Recombinant DNA into Host Cells <ul><li>most common hosts </li></ul><ul><ul><li>E. coli - procaryotic host </li></ul></ul><ul><ul><li>S.cerevisiae – eucaryotic host </li></ul></ul><ul><li>hosts are engineered to lack restriction enzymes and rec A </li></ul><ul><li>DNA introduction into microbes </li></ul><ul><ul><li>transformation </li></ul></ul><ul><ul><li>electroporation </li></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    55. 55. Inserting Recombinant DNA into Eucaryotic Host Cells <ul><li>electroporation </li></ul><ul><li>microinjection </li></ul><ul><li>gene gun </li></ul><ul><li>Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens (used to introduce foreign DNA into plant genomes) </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    56. 56. Expression of Foreign Genes in Host Cells <ul><li>cloned genes, in the new host cell, are called heterologous genes ,and may not be expressed unless they are modified </li></ul><ul><ul><li>recombinant gene must have a promoter that host RNA polymerase recognizes </li></ul></ul><ul><ul><li>introduced eucaryotic genes must be modified to have a procaryotic leader sequence and all introns must be removed </li></ul></ul><ul><li>expression vectors are used to overcome problems with expression of recombinant genes in host cells </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    57. 57. Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    58. 58. Verificacion Cultivo Clonado Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    59. 59. Construction of Genomic Libraries <ul><li>used when gene of interest is on a chromosome that has not been sequenced </li></ul><ul><li>the library is constructed by cleaving the genome and then cloning the fragments into vectors </li></ul><ul><li>the libraries are screened for the genes of interest in a variety of ways </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    60. 60. III. Productos Bioquímicos de Tecnología de DNA Recombinante <ul><li>Tecnología DNA recombinante usada por compañias farmaceúticas – manufacturar medicinas contra: </li></ul><ul><ul><li>diabetis y enanismo </li></ul></ul><ul><ul><li>Antes se usaba insulina porcina y bovina para los diabéticos, aunque podia ocasionar reacciones alérgicas </li></ul></ul><ul><ul><li>Enanismo se trataba con hormona de crecimiento (HGH) extraída de cadáveres </li></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    61. 61. The Numerous Applications of Genetic Engineering <ul><li>in medicine </li></ul><ul><ul><li>many useful proteins </li></ul></ul><ul><ul><li>gene therapy </li></ul></ul><ul><li>in agriculture </li></ul><ul><ul><li>use of genetic engineers allows for the direct transfer of desirable traits to agriculturally important animals and plants </li></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    62. 62. Insulina rDNA <ul><li>Insulina recombinada </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    63. 63. Productos de Tec. rDNA <ul><li>Hoy se produce insulina y HGH por rDNA. También se elaboran vacunas. </li></ul><ul><li>Otros productos </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    64. 64. Organismos Genéticamente Modificados - GMO’s <ul><li>Transfección – proceso de introducir genes extraños a un organismo </li></ul><ul><li>Transgénico – organismo modificado genéticamente (GMO’s) </li></ul><ul><ul><li>Pseudomonas fluorescens – se añadió 1 gen de Bacillus thuringiensis que codifica para la producción de un insecticida- proteina </li></ul></ul><ul><ul><li>Liberación de GMO’s regulado por EPA </li></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    65. 65. GMO’s <ul><li>GMO’s pueden realizar bioremediación ( degradación de sustratos contaminantes como hidrocarburos, benceno, otros) </li></ul><ul><li>Plantas: </li></ul><ul><ul><li>Uso Agrobacterium tumefaciens – transfiere fragmento de su DNA a planta y la recombina; tiene plásmido- usarlo como vector de clonación para alterar la planta </li></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    66. 66. Bioengineering of Plants Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla Figure 14.19
    67. 67. GMO’s <ul><li>Animales: </li></ul><ul><ul><li>Genes extraños se insertan al óvulo usando alto voltaje o microinyección </li></ul></ul><ul><ul><li>Se han logrado ratones transgénicos con enfermedades de alzheimer, fibrosis cística, etc. </li></ul></ul><ul><ul><li>Usando animales transgénicos se ha logrado: sintetizar factores de coagulación de humanos; sustancia disuelve coágulos sanguíneos </li></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    68. 68. Terapia Genética <ul><li>Sustituir genes defectuosos por genes funcionales usando vectores de clonación. </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    69. 69. Terapia Genetica Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    70. 70. Social Impact of Recombinant DNA technology <ul><li>there is scientific and philosophical concern about </li></ul><ul><ul><li>the use of embryonic stem cells in gene therapy. This is currently a major controversial issue in the U.S. </li></ul></ul><ul><ul><li>the production of genetically engineered food </li></ul></ul><ul><ul><li>the possibility of the production of genetically engineered organisms by bioterrorists </li></ul></ul><ul><ul><li>and other issues </li></ul></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    71. 71. Referencias <ul><li>www.slic2.wsu.edu:82/.../pages/Chap10.html </li></ul>Prof. Aida L. Méndez UPR-Aguadilla
    72. 72. Biotecnología en Bacterias <ul><li>José Morey </li></ul><ul><li>Misraim Vélez </li></ul>
    73. 73. Producción de vacuna recombinante
    74. 74. Producción de vacuna recombinante
    75. 75. Producción de vacuna recombinante
    76. 76. Ventajas <ul><li>Desarrollo de productos médicos </li></ul><ul><ul><li>Antibióticos </li></ul></ul><ul><ul><li>Vacunas </li></ul></ul><ul><ul><li>Hormonas </li></ul></ul><ul><ul><li>Productos dificiles de obtener, en grandes cantidades </li></ul></ul>
    77. 77. Conclusión <ul><li>Los microorganismos son máquinas flexibles y fascinantes capaces de producir un vasta variedad de compuestos útiles. Podemos esperar ver muy pronto la utilización de estos en la bioremediación y la producción de nuevos metabolitos, compuestos de bioconversiones y expresión de nuevas proteínas; Nos espera un futuro brillante en la biotecnología de microorganismos. </li></ul>

    ×