Your SlideShare is downloading. ×

Mmc1

196
views

Published on


0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total Views
196
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
0
Actions
Shares
0
Downloads
0
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

Report content
Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
No notes for slide

Transcript

  • 1. Immunity, Volume 33 Supplemental Information Interferon-Regulatory Factor 4 Is Essential for the Developmental Program of T Helper 9 Cells Valérie Staudt, Evita Bothur, Matthias Klein, Karen Lingnau, Sebastian Reuter, Nadine Grebe, Bastian Gerlitzki, Markus Hoffmann, Alexander Ulges, Christian Taube, Nina Dehzad, Marc Becker, Michael Stassen, Andrea Steinborn, Michael Lohoff, Hansjörg Schild, Edgar Schmitt, and Tobias Bopp   Figure S1, related to Figure 1: IRF4­deficiency re­directs CD4+ T cells to T helper 1  phenotype    1
  • 2. (A)  Naïve  CD4+  T  cells  from  Irf4+/‐  or  Irf4‐/‐  mice  were  stimulated  under  Th9‐skewing  conditions. Messenger RNA was prepared 24 h and 72 h upon stimulation and analyzed  for the expression of the house keeping gene HGPRT and the transcription factor T‐bet  by  quantitative  RT‐PCR.  Shown  are  mean  values  of  two  independent  experiments  +/‐  SEM. (B) To assess IFN‐γ production, naïve CD4+ T cells from Irf4+/+ and Irf4‐/‐ mice were  stimulated under Th9‐promoting conditions. On day 6, cells were re‐stimulated and IFN‐ γ expression was analyzed by FACS analyses.    Figure S2, related to Figure 2: Th9 development is accompanied by a strong  expression of IRF4  Naïve  CD4+  T  cells  were  isolated  from  spleens  of  C57Bl/6  mice  and  subsequently  stimulated  in  vitro  under  Th1‐,  Th2‐  and  Th9‐promoting  conditions.  The  expression  of  IRF4 was analyzed by FACS analyses directly after preparation (0 h) and 24 h, 48 h and  72 h upon stimulation. Shown is one representative of three independent experiments  +/‐ SEM.    2
  • 3.   Figure  S3,  related  to  Figure  3:  Continuous  IRF4  expression  is  crucial  for  the  maintenance of a stable Th9 phenotype   Naïve  Irf4+/+  CD4+  T  cells  were  stimulated  under  Th9‐promoting  conditions  for  three  days  and  subsequently  transfected  with  a  specific  IRF4  siRNA  (IRF4‐siRNA)  or  the  respective  scrambled  control  (Scr‐siRNA).  (A)  Immunoblot  of  IRF4  expression  and  β‐   3
  • 4. actin as loading control. Upon re‐stimulation on day 5 for 24 h the ability to produce IL‐9  (B) and IFN‐γ (C) was assessed. Shown are mean values +/‐SEM. n.d. = not detectable.    Figure  S4,  related  to  Figure  6:  Experimental  design  of  the  adoptive  transfer  asthma model  Rag2‐/‐  Mice  were  adoptively  transferred  with  in  vitro  differentiated  Th9  cells  or  Th2  cells  on  day  one.  Thirty  minutes  prior  to  OVA  nebulization  on  days  1‐6  mice  were  treated intra nasally with 150µg of an IL‐9 antibody (229.4). Airway function, BAL and  histology were assessed 24 h after the last OVA provocation.       4
  • 5. Figure  S5,  related  to  Figure  7:  Experimental  design  of  the  primary  challenge  asthma model  C57Bl/6 Wild type, Irf4+/‐ and Irf4‐/‐ mice were sensitized by i.p. injection of Ovalbumin  emulsified in aluminium hydroxide (OVA/ Alum) on day 0 and day  14. On day 27 mice  received either PBS or Th9 cells derived from OT‐II mice  via i.v. injection. From day 28  onwards  mice  were  challenged  (20min)  by  Ovalbumin  nebulization  on  three  consecutive days and assays were performed 24 h after the last challenge.      5
  • 6. Figure S6, related to Figure 1: The peak of IL­9 mRNA production is accompanied  by a strong expression of IRF4.  Naïve  CD4+  T  cells  from  C57Bl/6  mice  were  stimulated  under  Th2‐  or  Th9‐skewing  conditions.  Messenger  RNA  was  prepared  prior  to  stimulation  or  24  h,  48  h  and  72  h  upon  stimulation  and  analyzed  for  the  expression  of  IL‐9  by  quantitative  RT‐PCR  (A).  Additionally,  IRF4  expression  was  determined  by  FACS  analyses  (B).  Shown  is  one  representative of four independent experiments +/‐ SEM.    6

×