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Compendio Biología Molecular Parte 2

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Compendio Biología Molecular Parte 2 Compendio Biología Molecular Parte 2 Document Transcript

  • Mapas de restricción y Electroforesis en gel de agarosa Los mapas de restricción muestran la distribución de pequeñas secuencias nucleotídocas a lo largo de un cromosoma. Se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa (un tipo de electroforesis que sigue los mismo principios, pero que utiliza la agarosa como matriz para el material genético ya que este es mucho más pequeño que las proteínas, y también debido a que presenta una carga negativa neta, no es necesario usar un detergente como el SDS) y de acuerdo a los resultados de esta técnica se constituye un mapa de restricción (huellas digitales). Secuenciación del ADN A finales de los 70’s se desarrollaron métodos para determinar de manera simple y rápida la secuencia nucleotídica de cualquier fragmento de ADN purificado. Gracias a ello se han obtenido secuencias completas de varios organismos. Existen 2 métodos para secuenciar el material genético: método químico y método enzimático. 1. Método químico: o Romper la cadena (marcar radioactivamente al ADN como 32P en el extremo 5´) o Se separan los fragmentos en un gel y se detectan por autorradiografía. El tamaño indica la distancia desde la marca con 32P hasta la base que se rompió o Se repite el procedimiento rompiendo cada vez en diferente base nucleotídica. 2. Método enzimático
  • o Con base en la síntesis in vitro del ADN: o La ADN polimerasa utiliza como molde el ADN a secuenciar o Se obtienen replicas parciales, se inicia en el mismo sitio, pero termina en diferentes puntos o La clave es el uso de di-dNTP’ “didesoxirribonucleosidos trifosfato terminadores”, sin desoxirribosa (3’-OH). Al unirse estos nucleótidos se bloquea la adición del siguiente. o Se genera una escalera de fragmentos de ADN Actualmente se utiliza este mismo método con una serie de mejoras. La secuenciación de ADN está completamente automatizada: aparatos robotizados mezclan los reactivos, cargan, corren y leen el orden de los nucleótidos en el gel, lo cual se ve facilitado por la utilización de nucleótidos terminadores de cadena, marcados con colorantes fluorescentes de diferente color. Tecnología del ADN recombinante Es una serie de técnicas que permiten la manipulación del material genético, además de proporcionar el medio para el estudio de diversas células y sus macromoléculas como sus funciones y mecanismos de regulación. Las técnicas recombinantes son: 1. Rotura específica del ADN (utilizando las endonucleasas de restricción). Facilita el aislamiento y manipulación de secciones específicas. 2. Secuenciación de fragmentos purificados (método químico y método enzimático). Permite identificar rápidamente si es el gen de interés, determina los límites del gen y su secuencia de aminoácidos. 3. Hibridación de los ácidos nucléicos (reconocimiento del material genético). Hace posible la localización de secuencias determinadas de ADN o ARN con exactitud y sensibilidad. Consiste en aprovechar la capacidad que tienen estas moléculas de unirse a secuencias complementarias de otros ácidos nucleicos. 9
  • 4. Clonación del ADN (plásmidos ó vectores). Se puede lograr que un fragmento de ADN se integre en un elemento génico autorreplicante (plásmido o vector viral) en una bacteria, para producir millones de copias idénticas. 5. Ingeniería genética (modificación de los genes). Alteración de secuencias de ADN, que se pueden insertar en células u organismos. Hibridación También llamado renaturalización, es el proceso mediante el cual 2 cadenas de ADN separadas se vuelven a unir generalmente a una temperatura de 65°C siguiente los principios de complementariedad. Esta técnica es utilizada para detectar y caracterizar secuencias nucleotídicas específicas de ADN o ARN y puede haber hibridación entre ADN y ADN, ARN y ARN o ambas. La velocidad de hibridación indica la concentración de las secuencias. También es utilizado para localizar genes específicos en los cromosomas o moléculas de ARN en células de tejidos. Las moléculas de ADN de cadena sencilla utilizada para la detección de secuencias complementarias se conocen como sondas; estas moléculas contienen marcadores radioactivos o químicos para facilitar su detección y pueden tener longitudes que van desde 15 hasta varios miles de nucleótidos. Estas reacciones son tan sensibles y selectivas que pueden usarse para detectar secuencias complementarias cuya concentración sea incluso de una sola molécula por célula La Hibridación in situ K es una técnicas en las que las sondas de ácidos nucléicos se utilizan, de forma similar a como se hace con los anticuerpos marcados, para localizar in situ secuencias determinadas de ácidos nucléicos, ya que la extracción del material genético puede causar una pérdida de información. Northern y Southern Blot A menudo las sondas del ADN se usan con la electroforesis en gel de nitrocelulosa para detectar moléculas de ácidos nucléicos con una secuencia complementaria a toda o a una parte de la sonda. Antes de llevar a cabo la hibridación, por electroforesis se separan las diversas moléculas de ADN o de ARN de una mezcla, según su tamaño; podremos estar seguros de que la hibridación ha sido específica si con la sonda se marcan moléculas de un solo o de muy pocos tamaños. Además conocer el tamaño puede ser muy valioso. 1. Northern Blot: técnica de transferencia que se utiliza para analizar ARN, mediante una sonda de ADN o RN complementario que reconoce un ARN específico 2. Southern Blot: Método análogo que se utiliza para detectar y caracterizar secuencias específicas de ADN 9
  • Western Blot El Western Blot es un método también análogo para la detección de proteínas. Implementa gel en la electroforesis para separar las proteínas desnaturalizadas de la masa. Las proteínas son transferidas desde el gel hacia la membrana de nitrocelulosa, donde son examinadas utilizando anticuerpos específicos para la proteína. Como resultado los investigadores pueden examinar la cantidad de proteínas en una muestra y comparar los niveles de presencia entre varios grupos. Clonación La clonación es la técnica que permite unir in vitro un fragmento de ADN que contiene un gen humano con el cromosoma de un virus bacteriano (bacteriófago), y de esa manera introducir la nueva molécula de ADN recombinante en una célula bacteriana (vector) Un vector de clonaje es un plásmido o virus que sirve para propagar el ADN que contiene el gen de interés. Su finalidad es proporcionar un elemento genético autorreplicante. Para clonar un gen se empieza construyendo una biblioteca de ADN (una colección de fragmentos de ADN clonados a partir de células, tejidos o organismos). Puede construirse tanto con vectores víricos como plasmídicos siendo estos últimos los más utilizados. Los vectores plasmídicos son pequeñas moléculas circulares de ADN de doble cadena, derivadas de grandes plásmidos que aparecen de forma natural en las bacterias. Una vez purificados se cortan con endonucleasas de restricción. El ADN que quiere ser clonado también se corta con estas mismas enzimas generando fragmentos cohesivos y posteriormente mediante ligasas se unen al plásmido para generar un ADN recombinante. 9
  • El siguiente paso es introducir a las moléculas circulares de ADN recombinante en bacterias que se han hecho temporalmente permeables al ADN; se dice que las células han sido transfectadas con el plásmido. A medida que la bacteria va creciendo va duplicando su material genético además del mismo ADN recombinante. Otros vectores de clonación: • YAC: cromosomas artificiales de levadura que pueden transportar fragmentos largos de ADN. • BAC: son vectores plasmídicos nuevos basados en E. Coli que aparecen en forma natural en esta bacteria para clonar fragmentos de ADN de entre 300 mil y 1 millón de pares de bases. Actualmente son lo más usados en el mercado. Bibliotecas de ADN y Síntesis de ADNc Es la colección completa de plásmidos que contienen un clon de ADN genómico cortado al azar en pequeños fragmentos. Sin embargo este material genético contiene intrones (secciones no codificantes) por lo cual se sintetiza ARNc (complementario) a partir de ARN. Esta reacción es 9
  • catalizada por la transcriptasa reversa de un retrovirus. Las moléculas de ADN de una sola cadena sintetizada por esta enzima se transforman en ADN de doble cadena mediante la ADN polimerasa, se insertan en vectores víricos o plasmídicos y se clonan. Cada uno de los clones obtenidos de esta forma se denomina clon ADNc, y la colección completa de clones derivados de una preparación de ARNm constituye una biblioteca de ADN. A este tipo de técnica se le conoce como PCR-RT (retrasada) Reacción en cadena de Polimerasa (PCR) Consiste en una clonación rápida. Esta técnica permite amplificar más de mil millones de veces el ADN obtenido de una región del genoma. Mediante métodos químicos se sintetizan oligonucleótidos para flanquear la secuencia de nucleótidos deseada. Se separa el ADN calentándolo y es entonces donde se utiliza una ADN polimerasa que es estable a temperaturas elevadas (aislada de una bacteria termófila). Se repite varias veces el proceso. Con cada ciclo de síntesis de ADN los nuevos fragmentos generados actúan a su vez de molde, y en pocos ciclos el producto predominante es el único tipo de fragmento de ADN cuya longitud corresponde a la distancia entre los 2 cebadores originales. Se requiere de unos 20 a 30 ciclos de reacción. Se debe de conocer al menos una parte de la secuencia de nucleótidos y sólo se utiliza la porción de la secuencia que se quiere amplificar. Sus ciclos requieren un breve calentamiento. 9
  • PCR en tiempo real Es una variante cuya principal característica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original o para identificar muestras de ADN específicas a partir de su Tm (temperatura de fusión) Microarreglos El microrreglo constituye un arreglo grande de secuencias de fragmentos de DNA inmovilizadas y bien ordenadas y que están adheridas a una superficie sólida generalmente de cristal. Cada secuencia corresponde a un gene diferente. El material ordenado en el microarreglo es llamado probe. El ARNm es tomado de una célula o tejido particular combinado con algún tipo de marcador para generar una muestra etiquetada. Esta muestra es hibridizada sobre los probes del microarray. La muestra marcada será juntada con su secuencia complementaria. Luego para cada gen la cantidad del marcador es detectado y esto da un nivel de expresión del gen. Métodos de transferencia de genes Existen 4 maneras diferentes en el que el ADN foráneo o ajeno (portador de información) puede introducirse en una célula bacteriana: 1. Transformación: captación de fragmentos del ADN desde el medio circundante 2. Conjugación: transferencia directa de ADN de un célula a otra 3. Inyección viral: inyección de un material genético viral 4. Transducción: transferencia de material genético no viral de una célula a otra por medio de un virus. Todos los mecanismos involucrados en el intercambio de material genético entre distintas células se conoce como transferencia horizontal de genes (transgénesis). En cambio, las bacterias portadoras transmitirán el plásmido hacia las células hijas durante la división celular por transferencia vertical de genes (reproducción sexual). EL ADN incorporado a la célula puede integrarse al cromosoma por recombinación genética de la cual existen 2 tipos: • Recombinación homóloga: Intercambio entre segmentos homólogos de ADN, cuando estos se almacenan pueden ocurrir intercambios entre las moléculas de modo que los genes pueden ser transferidos de una molécula a otra, en células eucariontes se produce en meiosis mediante los cross overs. • Recombinación específica de sitio: implica inserción de elementos genéticos móviles (plásmidos, fagos). Estos pueden dejar el ADN de un cromosoma mediante fecundación. Esta recombinación involucra secuencias específicas de ADn del fago 9
  • o del plásmido y del ADN bacteriano, que incluyen una pequeña región homóloga y enzimas de recombinación específicas. Algunos otros métodos son: • Liposomas: pequeñas vesículas que transportan ADN al fusionarse con la membrana de las células receptoras y la liberan. • Electropodación: Se abren poros transitorios en membranas celulares haciéndolos mas permeables al ADN • Microinyección: Inyectando directamente el ADN en el núcleo celular Ventajas y desventajas de la tecnología transgénica Ventajas Desventajas Especificad Salud del animal Velocidad Transmisión viral Flexible Diseminación Económica Animales transgénicos Un animal puede incorporar información genética nueva por agregado de ADN extraño, a esto se le llama transgénico y al gen fecundado transgen. Por la técnica de micro inyección se hicieron experimentos en donde se insertó con éxito secuencias de ADN en óvulos fecundados de ratón. Los ratones desarrollados a partir de estos óvulos fecundados habían incorporado el gene extraño a su genoma y el gen fue transcrito a las generaciones siguientes tal como lo predijo Mendel. Cuando lo óvulos de ratón recibieron gen de globina B de conejo, los ratones que derivaron de estos óvulos fecundados contenían en sus glóbulos rojos la Globina B del conejo. Otro experimento, fue combinar el gen de la GH (Hormona de crecimiento) en la porción reguladora de un gen de ratón y los inyectaron en óvulos fecundados. El resultado fueron ratones transgénicos favorecidos con el doble de tamaño en los cuales el ADN inyectado aparecía en todas las células incluidas las germinales y así pudo ser transmitida de generación en generación. 9
  • Otro método fue introducir genes en embriones en desarrollo. Las células de un embrión en blastocito podrían proliferar en cultivos realizados in vitro (y pueden reintroducirse en un blastocito para su desarrollo). Aprovechando esta capacidad, se puede introducir en su genoma ADN extraño por medio de transfección. Estas células son inyectadas en un blastocito que es implantado en una hembra pseudopreñada, así se desarrolla un patrón quimerotrífico con tejidos derivados de células transfectadas y otras células de blastocito receptor. Las vacas y otro tipo de ganado utilizan microinyección de genes en el nucleo de ovulos fecundados. El desarrollo de animales transgénicos hizo posible: • Estudios en mamíferos de la expresión diferencial de genes en distintos tejidos durante el desarrollo. • Establecer modelos para el estudio de enfermedades. • Probar potenciales agentes terapéuticos. • Mejorar el ganado por introducción de trans genes. • Usar animales transgénicos como bio reactores para la producción de proteínas farmacológicamente importantes en el uso humano. • Posibilidad de obtener clones a partir de células en cultivo, facilita el desarrollo de animales transgénicos. La ventaja de esta técnica respecto a la inyección es la mayor eficiencia en la obtención de animales transgénicos y crear múltiples copias génicas de organismos portadores de la misma modificación genética. Genómica y Proteomica La genómica es la rama de la biología que se encarga del estudio de los genomas. Se considera a un genoma como el conjunto de información genética (ADN) de un organismo. Las ciencias genómicas han tenido un importante auge por sus técnicas de secuenciación, y a las técnicas cada vez más sofisticadas para realizar análisis de genomas completos. Algunas de las ramas de esta ciencia son la genómica forense y la medicina genómica. Los objetivos de la medicina genómica son: • Integrar la genética con la medicina tradicional • Identificar genes candidatos para enfermedades complejas con alta prevalencia en la población. • Relacionar las interacciones de estos genes entre sí y con modificadores ambientales. 9
  • • Desarrollar una medicina preventiva personalizada a través de exámenes médicos que orienten la modificación de comportamientos o hábitos a la medida de la persona. • Utilizar terapia farmacológica adecuada al genotipo de cada individuo (farmacogenética). • Desarrollar pruebas diagnósticas para identificar a los individuos en riesgo. La genética clásica a partir de un fenotipo, generalmente mutante, busca el o los genes responsables de dicho fenotipo. Por otro lado, la genómica tiene como objetivo predecir la función de los genes a partir de su secuencia. La Proteómica por otro lado es el conjunto de todas las proteínas de una célula. A diferencia del genoma que es relativamente fijo, el proteoma es dinámico y cambia de minuto en minuto en respuesta a las miles de señales del ambiente y del interior de la propia célula. Utilización de técnicas moleculares para el diagnostico de enfermedades 1) Se tienen 5 pacientes que acuden a consulta por presentar síntomas relacionados con influenza, de los cuales uno tenía 3 semanas de presentar los síntomas y otro solo 2 días. Para confirmar las sospechas se busca una secuencia de 380 pb para la cual se tienen oligonucleótidos específicos. a) ¿Qué tipo de pruebas se necesitan? b)¿Como interpretarías el siguientes resultado?(imagen anexa) Respuestas: a) PCR-Para amplificar la secuencia de 380 pb b) Western Blot. Para identificar la presencia de la proteína 2) Recién nacido, cuya madre es portadora del virus del VIH. Primigesta de 26 años. Parto distrófico, el recién nacido presento sufrimiento fetal agudo durante el parto, por desprendimiento de la placenta. Abgard de 6.8. Se desea saber si el recién nacido contrajo el virus de su madre durante el trabajo de parto, por posible mezcla de sangre. El virus tiene un periodo de incubación de 3-6 semanas. La prueba se le realiza a la 5ta semana, y 9
  • se disponen de oligonucleotidos específicos de 120 pb para el inicio de la secuencia del virus. 1. ¿Qué tipo de muestra se debe obtener para realizarle el estudio? a. Se debe obtener una muestra de sangre del a cual se extraerá el material genético de los leucocitos 2. ¿Qué tipo de estudio se debe hacer a dicha muestra para diagnosticar si el neonato presenta o no la carga viral? a. Se debe realizar un PCR Control Paciente 200 pb 3. Interpreter el resultado anterior a. La sonda hibrido con el material genético por lo que se llevo a cabo el PCR, es posible que se trate de una mutación del mismo virus o un virus parecido. 4. ¿Qué prueba confirmatoria se le puede realizar al neonato? a. Western blot (Prueba de Elisa) 3) Cuatro pacientes ingresan al hospital por una supuesta infección viral, sus síntomas son palidez fiebre muy alta y sudoración se realizaron estudios para verificar la presencia del virus sospechando de dengue, la secuencia del virus es de 800pb, la sonda marca 300pb que prueba realizarías: Respuesta: Enzimas de Restriccion. Southern blot Hibridacion. Explica el diagrama. C---- DNA viral C 1 2 3 4 1200 ----- 9
  • 1000 ---- 800 ----- ------- 600 ¿Qué tipo de muestra tomar? Sangre ¿Qué pacientes se infectaron? 1, 2, 4. 4) Se tienen muestras de 4 pacientes que posiblemente contengan una infección viral. ¿Que prueba realizarías para determinar que pacientes tienen la infección?, De acuerdo a esto determina cual de ellos tienen mas carga viral. (Hay oligos que flanquean una region de 55o pb). ¿que puedes deducir del resultado de tu tecnica? = 1.- Extracción del ADN de cada paciente. 2.-PCR 3.-Electroforesis El paciente 1,3 y 4 presentan la infección, siendo el paciente 4 el que presenta una mayor carga viral, lo que nos habla de una infección mas avanzada. El paciente 2 no presenta infección. 5) En un hospital llegan siete personas con los siguientes síntomas: diarrea, vomito y dolor abdominal. Dos de ellos presentaban estados febriles. Además, uno de los siete presenta salpullido en la zona del cuello. En su entrevista clínica todos coincidieron que habían ingerido alimentos en un puesto de tacos que no cumplía con la norma de salubridad. Como responsable de los síntomas se sospechaba de un adenovirus X del cual se conoce su secuencia de 1.3 Kb. Se uso una sonda que reconoce la secuencia del virus Se obtuvo los siguientes resultados: 9
  • STD C 1 2 3 4 5 6 7 Pb 5Kb __ 4.5Kb __ 4 Kb __ 3.5Kb __ 3 Kb __ 2.5 Kb __ 2 Kb __ 1.3Kb __ __ __ __ __ __ a) Qué tipo de prueba se realizó: Southern blot b) Interpreta los resultados para cada paciente Pacientes 1, 3, 4, 6 y 7 tienen el virus Pacientes 1 y 4 tienen mayor caga viral, probablemente sean los que presentan fiebre. Paciente 2 y 5 no tiene virus. Los síntomas puedan deberse a otra causa. Nota: cualquiera de los paciente 1, 3, 4 ,6 y 7, que tienen el virus, pueden presentar el salpullido como una reacción alérgica a esa sustancia 9
  • El salpullido no se sabe que paciente lo presenta debido a que este es una reacción alérgica a una sustancia extraña y no necesariamente se debe a un virus. 6) Se tiene un paciente con un cuadro clínico que sugiere 3 posibles enfermedades genéticas diferentes, que afectan específicamente al hígado. Se conocen las secuencias nucleotídicas alteradas en cada una de dichas enfermedades. a) Teniendo en cuenta que se tiene una muestra muy pequeña de material genético del paciente, ¿cómo solucionarías este problema? b) ¿Qué técnica aplicarías para determinar qué enfermedad presenta el paciente? c) En base a las siguientes electroforesis, determina cuál es la secuencia mutada: A T G C A T G C Electroforesis control Electroforesis del paciente RESPUESTAS: a) Usando la técnica de PCR o Clonación para obtener una cantidad mayor del material genético que se quiere analizar. 9
  • Para la PCR se necesita diseñar oligonucleótidos para comenzar la amplificación, mientras que en la clonación se necesitaría insertar el gen mutado en un vector de clonación, subclonarlo en una célula para después recuperar el material genético por medio de enzimas de restricción. b) Un método de hibridación como el Southern Blot, que identifique secuencias complementarias entre el gen del paciente y la sonda de cada una de las enfermedades. c) Secuencia mutada: ACGCCTAACT Secuencia normal: ACGTCCTAAC 7) En siete pacientes menores de un año se nota un comportamiento sumamente pasivo, presentan hipotonía y su desarrollo psicomotriz no es lo esperado de acuerdo a su edad. Se sospecha del síndrome relacionado con una deleción en la región terminal del gen. Conocemos que el gen involucrado tiene una longitud de 2,100 pb (2.1 Kb). Se ocupa una sonda de 500 pb. (Hibrida en la región terminal) a) Qué tipo de prueba realizarías para confirmar el síndrome. R= Southern b) De qué tejido tomarías la muestra? R=de sangre (leucocitos). c) Interpreta los resultados. • Pacientes 1, 2, 4, 6, 7 se reportaron normales • Paciente 5 presenta el síndrome por deleción en la parte final del gen por lo que no hibridó, por lo tanto no se observa en el gel. • Paciente 3 si hibrido la sonda, pero presenta un menor número de pb lo que nos indica que la deleción se encuentra en la parte inicial. No tiene el síndrome que se sospecha. Control 1 2 3 4 5 6 7 2200 2100 2000 1800 1500 1000 500 200 100 9
  • Genoma humano • Es la totalidad de todos los genes y estructuras de señalización génica, así como los ácidos nucleicos de funciones desconocidas de los virus y organismos uni- y multicelulares. • A principios de la década de los 20 Winkler acuñó el término "genoma" para definir a la totalidad de genes (de una célula haploide) de un organismo. Algunas estructuras no eran conocidas en ese momento y por lo tanto no fueron incluidas en la definición, éstas estructuras son conocidas hoy como: • Transposones : es una secuencia de ADN que capaz de replicarse e insertar una copia de si mismo en un nuevo lugar del genoma. Se han descubierto en bacterias y en células eucarióticas. • Pseudogenes : es una secuencia nucleótida similar a un gen normal pero que no da como resultado un producto funcional, es decir, que no se expresa. • Intrones : es una región del ADN que debe ser eliminada del transcrito primario de ARN; a diferencia de los exones que son regiones que codifican para una determinada proteína. En eucariotas existen dos categorías: Célula animal: • Genoma cromosómico (nuclear) • Genoma plasmático (mitocondrial) Célula vegetal • Genoma plastídico o plastoma Cromosomas Consiste de dos cromátides unidas por un centrómeroEl cromosoma se divide en dos brazos, el brazo corto denominado con la letra p y el brazo largo denominado con la letra q. 9
  • Clasificación del cromosoma:  Metacéntricos: en centro  Submetacéntricos: mas afuera del centro  Acrocéntricos: situado en un extremo  Telocéntricos: extremo solo con un brazo largo Los seres humanos poseemos 46 cromosomas, 22 pares homólogos y 1 par de cromosomas sexuales, XX en mujeres y XY en hombres El mapa genético es la determinación de los locus de todos los genes de un genoma. Alelos: genes diferentes, que comparten el mismo locus en el par de cromosomas homólogos. Clasificación de los cromosomas humanos GRUPO CROMOSOMAS CLASIFICACIÓN A 1, 2, 3 METACENTRICOS B 4, 5 SUBMETACENTRICOS C 6, 7, 8, 9,10, 11, 12 SUBMETACENTRICOS D 13, 14, 15 ACROCENTRICOS E 16, 17, 18 SUBMETACENTRICOS F 19, 20 SUBMETACENTRICOS G 21, 22 ACROCENTRICOS Genoma mitocondrial Mitorribosomas: ADN mitocondrial:  -Humanos: 50S a(ADNmt ó 33 S y 35 a 45S. mitocondria 60S, 25 a  mtADN) ARNmt: ARNm, ARNt, ARNr.  -Sonestructura materno. de origen - nucleoides - hebra pesada y liviana 9
  • Secuencias de DNA altamente repetidas. La fracción altamente repetida consta de secuencias presentes en cuando menos 105 copias por genoma y típicamente constituye casi 10% del DNA total de los vertebrados. DNA satélite. EL DNA satélite consta de secuencias cortas repetidas gran número de veces para formar grupos muy amplios que contienen hasta 100 millones de pares de bases de DNA. DNA minisatélite. Las secuencias minisatélites tienen en promedio alrededor de 15 pares de bases de longitud y se encuentran en grupos que contienen hasta 1000 o 3000 repeticiones. DNA microsatélite. Las secuencias microsatélite son mas más cortas de 2 a 5 pares de bases de longitud y se presentan en grupos de 100 o menos copias repetidas en promedio. Secuencias de DNA moderadamente repetidas. La fracción moderadamente repetida del DNA puede variar desde casi 20 hasta cerca de 80% del DNA total, según el organismo. Esta fracción incluye secuencias repetidas en cualquier parte del genoma, desde unas pocas veces hasta varios cientos de miles. DNA Procariota Material genético de una célula procariota se encuentra en un nucleoide, contiene una región nuclear que alberga el material genético de las células, rodeada de citoplasma, solo tiene uncromosoma y prácticamente solo contiene DNA “desnudo” 9
  • Regulación de la expresión génica Estructura del promotor • Elementos de respuesta a estrógenos y corticoides: Cajas CAAT, TATA y GC. • Dependientes del tejido. • Se pegan a factores inducibles de esta región promotora o fuera de ella. Puede haber otras cajas dependiendo del tipo de gen y de los genes especializados (como morfogenes o genes homeoticos o de diferenciación). Amplificador: Secuencia concenso, región amplificada del gen ubicua(puede estar dentro de intrones, pero no en exones). # Factores que inducen la expresión diferencial de genes: Ambientales (señales extracelulares( como nutrientes, mensajeros). Control de la Expresión Génica: Requiere proteínas para metilación y poliadenilacion, y exportinas. OPERON LAC Estructura de bacterias que comprende toda la unidad génica. Es un conjunto de genes que se activas por un mismo estimulo. Círculos reguladores. Los genes Z y A son estructuras conjugadas. El gen lac tiene su propio promotor y terminados. El final de la región lac esta junto al promotor P. El operador O ocupa las primeras 26 pb de la longitud del gen lac Z, luego lacY y lacA y un terminador. 9
  • Las secuencias que marcan el principio (promotor) y fin (terminador) son sitios que actúan en cis. El promotor sirve para iniciar la trascripción solo del gen o genes (en el mismo segmento de ADN). El terminador solo puede finalizar la trascripción en una ARN pol que haya atravesado al gen. En bacterias el represor proteínico evita que el gen se exprese. Un gen se exores por reconocimiento de su promotor por ARNpol. Cerca del promotor está el operador (que también actúa en cis), sitio diana para el represor proteico. Cuando el represor se une al operador impide a la ARNpol iniciar la trascripción. El modo positivo es común para eucariotas, requiere factor de trascripción para que ARNpol inicie en promotor. Los factores trans tienen sitios diana que permiten a ARNpol iniciar la trascripción. Punto de unión es el sitio donde las proteínas reguladoras son factores que actúan en trans y que reconocen elementos cis (en dirección 5’ del gen). La proteína reconoce una secuencia muy corta del ADN. La ARNpol cubre 70pb en la iniciación. Los genes estructurales de bacterias están en grupos, y en eucariotas son individuales. El agrupamiento de los genes estructurales permite que sean controlados por interacción en un promotor único. En un control negativo, un represor que actúa en trans se une al operador que actúa en actúa en cis para desactivar la transcripcion. Los genes estructurales son: • LAC Z> codifica la enzima Β-galactocidasa que divide el Β-galactósido en sus 2 azucares. • LAC Y> codifica Β-galactósido permeasa, proteína de unión a la membrana que constituye el sistema de transporte de Β-galactósidos al interior de la célula. • LAC A> codifica Β-galactósido transcetilasa, enzima que transfiere un grupo acetilo del acetil-CoA a Β-galactósidos. El genotipo lac indica pérdida de función. Un Sistema de genes estructurales + elementos que controlan su expresión es igual a OPERÓN y su actividad es controlada por un gen o genes reguladores cuyas proteínas interactúan con elementos de control de cis. Una mutación en gen estructural priva a la célula de una proteína particular codificada por el gen. Y una mutación en gen regular influye en expresión de todos los genes estructurales que él controla. P lacl PO lacZ lacY lac A ADN La trascripción de los genes lac Z y A es controlada por un regulador proteico sintetizado por el gen lacl (unidad de trascripción independiente con su propio promotor). Los genes lac son controlados por regulación negativa, son transcritos a menos que sean desactivados por la proteína reguladora . Una mutación que inactiva al regulado provoca que los genes estructurales queden en estado expresado. Lacl es represor de lac porque evita la trascripción de los genes estructurales. Es un tetrámero de subunidades 38kDa. Hay 10 en cada célula wild type. El gen regulador está en promotor (P lac) y los genes 9
  • estructurales (lac Z y A). Cuando el represor se une al operador impide que la ARNpol inicie la transcripcion en promotor. EL promotor va de la posición 5’ al lado del punto de inicio ARNm hasta la posición +21 de la unidad de trascripción. • INDUCCION: Síntesis de enzimas en respuesta a la aparición de un sustrato especifico del ARNm síntesis de enzimas que retira al inductor. La adición de un inductor da lugar a una rápida inducción. • HOMEBOX: Secuencia que codifica un dominio de 60 aminoácidos en proteínas eucariotas. • Homeodominio: El único motivo de unión al ADN en u regulador transcripcional. Su región c-terminal muestra homologia con motivo hélice vuelta hélice de los represores procariotas. El represor λ tiene α-hélice 3 de reconocimiento que hace contacto con su marco mayor de ADN y la α-hélice 2 está en ángulo a través del ADN. La hélice que reconoce al ADN mide 17 aminoácidos en su homeodominio el represor λ tiene 9). La hélice 3 se une al surco mayor del ADN. En N-terminal se proyecta el surco menor. Las proteínas homeodominio pueden activar o reprimir la trascripción. • Proteinas hélice-bucle-hélice (HLH) : Secuencia de 40-50 aa con 2 α-hélices antipáticas separadas por bucle, para que las proteínas formen homo dímeros y heterodimeos. Las regiones helicoidales mide de 15 a 16aa Son las proteínas Bhlh que unen al ADN (son 2 grupos de proteínas : clase B(proteínas especificas como MYOD (para miogénesis) y clase A (proteína ubicua). Todas las proteínas HLH tienen región correspondiente a hélice 1 y 2 separada por bucle de 10/24 residuos . Los dimeros formados por proteínas Bhlh difieren en su capacidad de unión al ADN. Las proteínas que carecen de HLH carecen de región básica y/o contienen residuos de prolina. Hay 2 tipos de proteínas HLH: grupo da-A-S/emc y tipo Myo/id. El supresor emc codifica una proteína HLH; en su ausencia las proteínas da y Ac-S forman dimeros que activan la trascripción de los genes diana, pero la producción de emc forma heterodimeros que no pueden unirse al ADN (suprime Ac-Sda). • Cierres de Leucina: Secuencia de aminoácidos (leucina) que proporciona motivos de dimerizacion para que las proteínas reconozcan secuencias especificas de ADN. Una α-hélice 9
  • anfipática tiene grupos hidrofobicos que enrolla las 2 hélices cada 7 residuos. La leucina es básica. Las 2 cremallEras son las 2 regiones básicas que se biFurcan y Foman brazos de unión al ADN formando un motivo estructural (bzip). Las 3 proteínas Jun y Fos tienen cremallera de leucina. Fos no forma homodimeros , pero si hetero con Jun. Jun-Fos se une al ADN. RECOMBINACION: Intercambio físico de segmentos entre moléculas correspondientes de ADN que resulta en un ADN duplex con 2 regiones conectadas por ADN híbrido (heteroduplex). Conversión génica: Cuando una región extensa e ADN híbrido se forma por recombinación y se corrige con la secuencia de una sola banda. Se rompe la cadena de ADN y se forma un extremo de cadena sencilla (heteroduplex con secuencia alelica). FACTORES DE REGULACIÓN • Reconocimiento de secuencias promotoras (cuando el gen está activo o inactivo). • Factores basales (regulación de iniciación). • Factores inducibles (activan en tejidos específicos) Motivo> region corta (de 10-20) en secuencia proteica. Dedos deZinc> 23 aminoacidos unidos a zinc formando un dominio independiente en proteina de union al ADN. Su porcion c-terminal forma α-hélices que se unen al ADN. La n- terminal forma lamina-β. Cada dedo tiene 2 contactoas con ADN. MAPAS MOLECULARES DEL GENOMA GENOMA HUMANO El objetivo de los análisis del genoma es determinar la secuencia completa de nucleotidos del genoma humano (3 x 10(9) pares de bases de ADN) lo que equivale a 1 m de longitud. Lo que tendrá un impacto enorme en la medicina al descubrir las bases genéticas de muchas enfermedades humanas. MAPEO DE LOS GENES HUMANOS El genoma humano esta distribuido entre 24 cromosomas (22 autosomas y 2 cromosomas sexuales), cada uno de los cuales porta entre 5 y 26 x 10(4) kb de ADN. La primera etapa del mapeo de los genes es la asignación de los genes conocidos a un locus cromosómico llamada banda cromosómica de metafase. El primer método general de desarrollo para localizar genes humanos en cromosomas individuales fue la hibridación de las células somáticas. Las células en cultivo son inducidas 9
  • para fusionarse unas con otras mediante ciertos virus y agentes químicos; El núcleo se fusiona produciendo células híbridas que contienen cromosomas derivados de ambos progenitores. El locus cromosómico de un gen humano puede determinarse por visualización de un panel de células somáticas híbridas que contengan diferentes juegos de cromosomas humanos. La hibridación in situ de los cromosomas utiliza pruebas fluorescentes conocida como FISH (hibridación fluorescente in situ) que permite el mapeo de un gen clonado e un locus definido por una banda cromosómica con mayor resolución. Una mayor resolución también puede obtenerse por la hibridación de cromosomas humanos mas extendidos desde las células de prometafase o interfase, lo que permite un mapeo de regiones cortas de 100kb. Otro método es el análisis genético de ligamento que es usado para generar mapas genéticos de otros organismos; requiere el aislamiento de cientos de mutaciones de un solo gen, seguido de un intensivo análisis de su herencia en experimentos de reproducción controlados. Dos cromosomas que se diferencian por una mutación resultan distinguibles en base al polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción (RFLP) que surge debido a que un sitio de corte determinado esta presenta en una de las dos moléculas de ADN. Una mutación que da lugar a un RFLP representa un marcador genético que puede ser detectado por Southern Blot del ADN digerido con una endonucleasa de restricción y la sonda adecuada. RFLP puede usarse para construir mapas de ligamento para los estudios de un limitado numero de familias. El primer mapa de ligamento completo del genoma humano se obtuvo en 1987. Ademas, los RFLP resultan de gran utilidad como marcadores genéticos las repeticiones en tandem de secuencias cortas de nucleótidos, llamadas microsatélites, distribuidas a lo largo del genoma. PCR utiliza las secuencias de iniciación flanqueantes, facilitando el uso de microsatélites. La posición en el mapa de cualquier genoma humano puede ser determinada mediante el análisis de su ligamento con estas secuencias de ADN polimorficas. La aplicación mas importante de este avance ha sido el mapeo genético y la clonación de los genes responsables de enfermedades humanas hereditarias. El paso básico para el mapeo genético es analizar una serie de marcadores polimorficos en familias portadoras del gen de la enfermedad que interesa. El ligamento genético entre un RFLP y un gen de enfermedad aparece indicado por la herencia de la enfermedad y del marcador RFLP en los miembros afectados de una familia. Una vez determinada la posición del gen en el mapa se puede utilizar para aislar el gen como un clon molecular (clonación de posición). El aislamientos de genes de enfermedades humanas permite conocer la base molecular y celular de la enfermedad y su prevención y tratamiento por pruebas diagnosticas sensibles en la detección de mutaciones del gen, como la identificación de mutaciones por PCR. Estas pruebas pueden identificar a individuos con riesgo a padecer la enfermedad y proporcionar medidas preventivas antes de que la enfermedad se desarrolle. Además, la clonación de genes de enfermedades sugiere el uso potencial de la terapia génica para 9
  • corregir el defecto, por introducción de un alelo de ADNc normal en las células afectadas de los pacientes. Proyecto del Genoma Humano Consiste en determinar las posiciones relativas de todos los nucleótidos (o pares de bases) e identificar los 20.000 a 25.000 genes presentes en él. Fue fundado en 1990 por el Departamento de Energía y los Institutos de la Salud de los Estados Unidos, con un plazo de realización de 15 años. Debido a la amplia colaboración internacional, a los avances en el campo de la genómica (especialmente, en el análisis de secuenciación), así como los avances en la tecnología informática, un borrador inicial del genoma fue terminado en el año 2003, dos años antes de lo planeado. El Genoma Humano es la secuencia completa de ADN de un ser humano. Está dividido en 24 fragmentos, cuya condensación altamente organizada conforma los 23 cromosomas distintos de la especie humana (22 autosomas + 1 par de cromosomas sexuales: X e Y, en los hombres, ó X y X, en las mujeres). El genoma humano está compuesto por aproximadamente entre 25000 y 30000 genes distintos, unos son genes reguladores, otros genes codifican proteínas; si bien la secuencia codificante de proteínas supone menos de un 1,5% de la secuencia. Cada uno de estos genes contiene codificada la información necesaria para la síntesis de una o varias proteínas (o ARN funcionales, en el caso de los genes ARN). El conocimiento de la secuencia completa del genoma humano es una potente herramienta para la investigación en biomedicina y genética clínica, conduciendo a tratamientos o curas de cáncer, Enfermedad de Alzheimer entre otras. En consecuencia, en la actualidad la ciencia de la genómica está aun bastante lejos de poder plantear seriamente los problemas éticos, sociales y jurídicos que sin embargo están siendo ya ampliamente debatidos. Por ejemplo, hipotéticamente el conocimiento del genoma humano podría facilitar la realización de prácticas eugenésicas, de selección sistemática de embriones, la discriminación laboral o en la suscripción de seguros de vida, basada en la diferente predisposición a padecer ciertas enfermedades, etc. MUTACIONES MUTACIÓN: Cualquier cambio en la secuencia de nucleótidos o en la ordenación del ADN va producir un cambio de características, que se presenta súbita y espontáneamente, y que se puede transmitir o heredar a la descendencia. Factores por los que se puede producir una mutación: • Factores físicos: Las radiaciones electromagnéticas como los rayos X y los rayos gamma. ultrasonidos, los choque térmicos, la centrifugación, etc. • Factores químicos: Los análogos de las bases nitrogenadas. o El ácido nitroso (HNO2), porque desamina ciertas bases nitrogenadas. o Los alcaloides como la cafeína, la nicotina, etc. o El gas mostaza, el agua oxigenada (H2O2), el ciclamato, etc. • 9
  • CLASE DE MECANISMO EJEMPLOS MUTACIÓN Mutación Segregación cromosómica Aneuploidía, genómica errónea, son las observadas con mayor frecuencia. Mutación Reordenación cromosómica, Translocaciones cromosómica son incompatibles con la vida. Mutación génica Mutación en 1 par de bases Mutaciones Se originan mediante errores puntuales producidos durante el proceso normal de replicación del ADN o fallos en la reparación de los errores del ADN. Origen de las mutaciones: • Genómicas: errores en la segregación de un par de cromosomas durante la meiosis. Las mutaciones genómicas producen aneuploidía cromosómica y son las mutaciones observadas con más frecuencia en humanos. • Cromosómicas: más raras, incompatibles con la vida • Génicas: Se originan mediante errores producidos durante el proceso normal de replicación del ADN o fallos en la reparación de los errores del ADN. Tipos de mutaciones: • Mutación nula: elimina por completo la función de un gen, • Mutación somática: se produce en una célula somática y por lo tanto afecta a sus células hijas. No se hereda en los descendientes del organismo. • Mutaciones anterógradas: inactivan un gen de tipo salvaje. • Mutaciones constitutivas: hacen que los genes que habitualmente son regulados puedan expresarse sin regulación. • Mutaciones espontáneas • Mutaciones inducidas: resultantes de la adición de un mutágeno. • Mutaciones puntuales: cambios que afectan pares de bases únicos. Mutaciones génicas o puntuales:Afecta a un lugar del genoma que corresponde a un par de nucleótidos o a una parte muy pequeña de un gen. Existen varios tipos: • Sustituciones: Un par de bases es cambiado a otro • Transiciones: Es el cambio de un nucleótido. púrina a púrina o pirimídina a pirimídina 9
  • • Transverciones: Es el cambio de un nucleòtido. Púrina → pirimídina o pirimìdina → pùrina • Supresión (deleción) • Inserción (adición) Otros tipos de mutación: Mutaciones silenciosas: Donde el cambio del nucleótido determina el mismo aminoácido Mutaciones de cambio de sentido: La mutación cambia de 1 codón por otro que determina un aminoácido distinto. Mutaciones sin sentido: Donde el cambio del nucleótido determina un codón de terminación. Inversiones: Un segmento cromosómico de un cromosoma se encuentra situado en posición invertida. Translocaciones: Es cuando existe rotura de un cromosoma, parte de un cromosoma se une a otro existiendo así modificaciones en la ubicación de determinado material cromosómico. • Balanceadas rotura y reunión entre 2 cromosomas. No hay pérdida de material genético esencial, individuos son normales. • No Balanceadas se pierde parte de un cromosoma con producción de un fenotipo alterado. P ej. Síndrome de Down Estimación de la tasa de mutación génica de la línea germinal en humanos La tasa se suele expresar como el número de mutaciones nuevas por locus por generación. La manera más directa de estimar esta tasa es medir la incidencia de los casos esporádicos de una enfermedad genética autosomica dominante o ligada al X, completamente penetrante y con un fenotipo reconocible con claridad en el momento del nacimiento o poco después. Genes Supresores de Tumor Los genes supresores de tumor son aquellos genes cuyos productos proteicos están relacionados directamente con la regulación negativa del ciclo celular. Dado que los productos de los genes supresores de tumor inhiben la proliferación celular su pérdida funcional da lugar a que la célula se replique con libertad. A diferencia de los protooncogenes, en los genes supresores de tumor es necesario que se inactiven los dos alelos para que la célula cambie su comportamiento. Es decir, son necesarias dos mutaciones sucesivas en cada alelo del gen respectivamente para que una célula normal se transforme en una célula tumoral. El clásico ejemplo de genes supresor es de tumor son pRB y p53. 9
  • En la célula normal, pRB se encuentra unida a E2F, un factor de transcripción fundamental para avanzar de la fase G1 a S en el ciclo celular. Existen productos proteicos de algunos virus p ej. Papiloma virus (E7) se unen a pRB, secuestrándola y evitando que ésta última se una a E2F, de esta manera no hay control sobre la proliferación y se generan tumores. La p53 es una proteína de unión al ADN que responde a la presencia de mutaciones genéticas espontaneas. La p53 se expresa en células sometidas a estrés, por ejemplo cuando el ADN está deteriorado. Las alteraciones en el ADN provocan la acumulación de esta proteína, que detiene el ciclo celular en la fase G1 para permitir la reparación de ADN antes de la fase de Síntesis (S). Cuando el daño al DNA es irreparable, p53 induce la transcripción de proteínas involucradas en la muerte celular programada (apoptosis). • La inactivación de p53 da como resultado la continuidad del ciclo celular y la división de la célula. • Normalmente MDM2 se encarga de su ubiquitinación y posterior degradación en los proteosomas. • Una mutación directa al gen p53 da como resultado una proliferación descontrolada. Protooncogenes y oncogenes. Protooncogenes Genes normales responsables de la codificación de proteínas nucleares, citoplasmáticas y de membrana, que intervienen en la proliferación diferenciación celular. Sin embargo cuando estos genes normales se encuentran mutados son llamados oncogenes y dan lugar a productos malignos que anarquizan la proliferación celular y favorecen el desarrollo de tumores. Los oncogenes están relacionados con 9
  • los genes normales. El crecimiento y la división celular son controlados por la proteína: Factor de crecimiento, se une a receptores en la superficie de la célula. Oncogenes Los oncogenes se asemejan a los protooncogenes en el sentido que codifican la producción de proteínas involucradas en el control del crecimiento, versiones alteradas y modifican la proliferación celular. Ejemplos de Protooncogenes y Oncogenes: • Factores de crecimiento, por ejemplo sis, int-2 y hst, que estimulan la proliferación celular. • Receptores de factores de crecimiento, por ejemplo src, erb B y fms, mas. • Protooncogenes asociados a proteínas de membrana, por ejemplo los productos de la familia ras unen GTP, se asocian a GTPasas y actúan como transductores de señales para receptores de factores de crecimiento en la superficie celular. Oncogen Neoplasia EGFR Carcinoma espinocelular H-RAS Cáncer de colon, pulmón y páncreas Leucemia mieloide aguda, cáncer de K-RAS tiroides, melanoma L-MYC Cáncer de pulmón Neuroblastoma, cáncer de mama la formación de múltiples copias está NEU relacionada directamente con el grado de agresividad del cáncer N-MYC Neuroblastoma RET Cáncer de tiroides SRC Cáncer de colon v-fos Osteosarcoma v-jun Sarcoma Ciclo celular Conjunto de procesos que una célula lleva a cabo para producir células hijas genéticamente iguales. Es el mecanismo esencial mediante el cual todos los seres vivos se reproducen. 9
  • Para producir 2 células hijas genéticamente idénticas, el ADN de cada cromosoma ha de ser replicado fielmente generando 2 copias completas y luego los cromosomas replicados tienen que ser distribuidos (segregados) con exactitud a las 2 células hijas nuevas, de manera que cada célula reciba una copia del genoma completo. El sistema de control del ciclo celular se efectúa mediante la retroalimentación de proteínas altamente conservadas a lo largo de la evolución. El núcleo de este sistema es una serie ordenada de interruptores bioquímicos que controlan los principales acontecimientos del ciclo incluyendo la replicación de ADN y la segregación de los cromosomas replicados. Este sistema de control controla tanto las condiciones interiores como las exteriores de la célula para regular el proceso. Este sistema es muy sensible a las señales de otra célula, estimulando la división celular cuando se necesitan mas células y bloquéanoslo cuando no se necesitan. Cuando un sistema funciona de forma incorrecta, un exceso de divisiones celulares puede producir cáncer. La duplicación del ADN sucede en la fase S (síntesis), la cual requiere de 10 a 12 horas y ocupa alrededor de la mitad del tiempo que dura el ciclo celular en una célula de mamífero típica. Después de la fase S, la segregación de los cromosomas y la división celular ocurren en la fase M (mitosis), la cual ocupa mucho menos tiempo (1 hora). La fase M implica una serie de acontecimientos espectaculares que comienzan con la división celular o mitosis. La mitosis empieza con una condensación de los cromosomas: las cadenas de ADN duplicadas, empaquetados en cromosomas alargados, se condensan en cromosomas mucho mas compactos, lo cual es necesario para que se puedan separar. Después, la envoltura nuclear se desorganiza y los cromosomas replicados, cada uno constituido por 2 pares de cromátides hermanas, se unen a los microtúbulos del uso mitótico. EN la mitosis, la célula se detiene brevemente en la metafase, cuando los cromosomas están alineados en el ecuador del uso mitótico, preparados para la segregación. La separación súbita de las cromátides señala el comienzo de la anafase, durante la cual los cromosomas se trasladan a los polos opuestos del huso, donde se des condensan y se vuelve a formar el núcleo. A continuación, a célula se escinde en dos mediante la división citoplasmática o citocinesis, y la división celular finaliza. En la mayoría de los ciclos celulares se intercalan fases de descanso que le permiten a las células disponer de más tiempo para crecer: la fase G1, entre la fase M y la fase S, y la fase G2 entre la dase M y la mitosis. De esa manera al ciclo celular se le divide en 4 fases. Al conjunto de las fases G1, S y G2 se les conoce como interfase. 9
  • La fase G0, es un estado en el cual las células pueden permanecer durante días o semanas sin proliferar. Varias células se mantienen esta fase a lo largo de toda la vida (neuronas). Si las condiciones externas son favorables y hay señales para crecer y dividirse, las células en G1 o G0 progresan a través de un punto de determinación próximo al final de G1, denominado inicio (en levaduras) o punto de restricción (en eucariontes). El sistema de control del ciclo celular se puede diseccionar genéticamente en levaduras • Levadura de Fisión: Se trata de una célula en forma de bastón que crece por alargamiento en sus extremos, la división celular tiene lugar mediante la formación de un septo o placa celular en el centro del bastón. • Levadura de gemación: Se trata de una célula ovalada que se divide formando una yema, la cual comienza a aparecer durante G1 y crece despacio hasta que se separa de la célula madre después de la mitosis. Gracias a estas celulares se han descubierto mutaciones en los genes del ciclo de división celular o cdc. Que son mutaciones sensibles a temperatura. Comportamiento de un mutante cdc sensible a temperatura A la temperatura permisiva (baja), las células se dividen normalmente y se encuentran en cualquiera de las fases del ciclo. Si se eleva la temperatura hasta que sea restrictiva (alta), aquella temperatura a la que el producto del gen mutado deja de funcionar normalmente, las células mutantes continúan progresando a través del ciclo celular hasta que alcanzan un punto determinado que no pueden separar. El sistema de control del ciclo celular puede analizarse bioquímicamente en animales El ovulo de rana Xenopus mide un poco mas de 1 mm de diámetro y contiene 100.000 veces más citoplasma que una célula de tamaño medio del cuerpo humano, en estos óvulos podemos analizar la bioquímica del ciclo. Su fecundación desencadena una secuencia muy rápida de divisiones celulares denominadas divisiones de segmentación, en las cuales las células gigantes se dividen sin crecer. 9
  • El sistema de control del ciclo celular de mamíferos puede estudiarse en cultivo En un mamífero intacto no es fácil observar a las células individualizadas. Por eso, en los estudios se usan células que se han aislados de tejidos normales o de tumores y que se hacen crecer en placas de cultivo. Sin embargo existe la complicación de que las células dejen de proliferar (proceso llamado senescencia celular) Componentes del sistema de control del ciclo celular 1. Un reloj o continuador de encendido, que active el proceso en el momento adecuado 2. Un mecanismo que inicie los procesos en el orden correcto 3. Un mecanismo que asegure que cada proceso solo se desarrolle una vez 4. Interruptores binarios (encendido o apagado) que pongan en marcha acontesimientos en forma completa o irreversible 5. Robustez: mecanismos auxiliares que aseguren que el ciclo pueda funcionar correctamente 6. Adaptailidad, de modo que el compartimiento del sistema pueda modificarse para adapatptarse a ciclos celulars específicos o a las condiciones ambientales. Puntos de control: Puntos en los que el ciclo celular puede detenerse si los acontacimientos previos no se han completado. También se trata de puntos en los que el sistema de control puede ser regulado por señales extracelulares provenientes de otras células. Puntos de control del daño en el ADN: proporciona tiempo para que el ADN dañado sea reparado, después de lo cual el ciclo celular se libera y la progresión se reaunuda. Estos puntos actúan generalmente a través de señales negativas, es decir (detienen el ciclo celular) Contoles de la mitosis 1. Factores de retraso (ambiente). Actúan en puntos de control crucial, en G1 antes de la fase S y en G2 antes de la mitosis. 2. Proteínas cinasas dependientes de ciclina: Cdk 3. Ciclinas (ciclo de síntesis y degradación) que se unen a Cdk, como las ciclinas mitóticas o las ciclinas G1 4. Genes: cdc2. Cdc25, wee1 En el núcleo de sistema de control celular se halla una familia de proteínas quinasa (cinasa) demonidas cinasas dependientes de ciclina (Cdk). Su actividad aumenta y disminuye a medida que la célula progresa en el ciclo . Las oscilaciones conducen directamente a cambios cíclicos 9
  • en la fosforilación de proteínas intracelulares que inician o regulan os principales acontecimientos del ciclo celular. Los reguladores mas importantes de las Cdk son las ciclinas. Ya que a no ser que las Cdk estén unidas a ciclinas, no tienen actividad proteína cinasa. Los cambios ciclicos en los niveles de las ciclinas producen variaciones cíclicas en el ensamblaje y la activación de los complejos Cdk- ciclinas. Tipos de ciclinas: • Ciclinas G1/S (E): se unen a Cdk al final de G1 y determina que la célula replique el ADN • Ciclinas S (A): se uenen a Cdk durante la fase Sy son necesarias para iniciar la replicación • Ciclinas M (B): estimula los acontecimientos de la mitosis • Ciclinas G1 (D): ayudan a realizar el paso a través del inicio o del punto de restricción en las postrimerías de G1. En las levaduras una sola Cdk une todas las clases de ciclinas y dirige todos los acontecimientos. Por el contrario en las células de vertebrados existe 4 Cdk. La G2 (ciclina mitótica) se une al factor promotor de la fase M (MPF) Por lo regular el sitio activo de la Cdk se encuentra parcialmente tapado por una región de la proteína. La unión de la ciclina hace que esa región se aparte del ciclo activo, provocando la activación parcial de la enzima Cdk. La activación total del complejo Cdk-ciclina sucede después, cuando una cinasa distinta, la cinasa activadora de Cdk (CAK), fosforila un aminoácido próximo a la entrada del sitio activo de la Cdk. Esta fosforilación induce un pequeño cambio conformacional que aumenta la actividad de la Cdk, permitiendo que la cinasa fosoforile eficazmente su proteínas diana , desencadenando acontecimientos específicos del ciclo celular. La actividad del complejo Cdk-ciclina puede inhibirse en la fosforilación de 2 aminoácidos situados sobre el sitio activo. Esta fosforilación por la proteína cina Wee1 inhibe la actividad de Cdk, mientras que la desfosforilación por la fosfatasa Cdc25 aumenta la actividad de Cdk. También existe una regulación por la unión de proteínas inhibidoras de Cdk (CK1) de la cual existe una gran variedad que participan en el control de las fases G1 y S. En ciertas etapas del ciclo celular, los complejos Cdk ciclinas se inactivan como conseciencia de la proteolisis regulada por las ciclinas. Este proceso se produce mediante un mecanismo dependiente de ubiquitina. El paso limitante de la degradación de la ciclina es la reacción de transferencia de ubiquitina catalizada por las enzimas denominadas ubiquitinas ligasas: • En las fases G1/S: el complejo enzimático SCF es responsable de la ubiquitinación y la destrucción de las ciclinas G1/S o ciclinas E. • En la fase M: el complejo promotor de anafase (APC) es el responsable de la ubiquitinación y la destrucción de las ciclinas M o ciclinas B El retraso de la división depende de: • Linaje celular • Circunstancias externas • Falta de nutrientes y factores de crecimiento 9
  • • Especialización o diferenciación celular Estimulan proliferación en células de mamíferos: • PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas) • EGF (factor de crecimiento epidérmico) • FGF (factor de crecimiento de los fibroblastos) • Hormonas esteroideas • Eritropoyetina Visión en conjunto del sistema de control del ciclo celular Regulación de p53, p21, pRb En caso de daño al ADN, el gen supresor p53 es activado regulando la transcripción de p21 el cual inactiva al complejos Cdk-ciclina. Por su parte el pRb (retinoblastoma) una vez activado el complejo Cdk- ciclina, reconoce por retroalimentación negativa que esta activo el ciclo celular con la cual se une a E2F inactivandolo y evitando la regulación transcripcional para síntesis de ADN Muerte Celular (Apoptosis) Aquellas células que ya no son necesarias en el organismo se autoeliminan activando un programa intracelular de muerte. Este proceso se llama muerte celular preogramada aunque suele denominarse apoptosis (a partir de un término griego que significa caer). Este proceso lo sufren las células no deseadas y controla el numero de estas en el organismo celular. Una falla en la apoptosis puede proovocar sobrevivencia de células tumorales (cáncer) y ciertas enfermedades neurodegenerativas. Una célula que sufre apoptosis muere sin dañar a células adyacentes, ya que la célula se encoge y condensa, el citoesqueleto se colapsa, la envoltura nuclear se desensambla y el ADN nuclear se fragmenta. La superficie celular se altera presentado presentando propiedades que provocan que la célula moribunda sea fagocitada rápidamente por una célula adyacente o un macrófago. 9
  • Las caspasas son una familia de proteasas que contienen una cisteína en su sitio activo y que escinden sus proteínas diana sobre residuos específicos de ácido aspártico. Se sintetizan en la célula como precursores inactivos, las procaspasas. Una vez activadas las caspasas escinden y activan otras procaspasas generando una cascada proteolítica amplificadora “cascada de caspasas”. La activación de la apoptosis se desencadena a través de un mecanismo de todo o nada, además de destructiva y autoamplificante es irreversible. Las proteínas adaptadoras mantienen varias copias de determinadas procaspasas llamadas procaspasas iniciadoras formando un complejo o agregado. A veces las procaspasas iniciadoras tienen cierta actividad proteasa y que estén juntas formando un complejo origina que se escindan una a otra. En otras ocaciones, la agregación induce un cambio conformacional que activa la procaspasa. La activación de procaspasas puede inducirse desde el exterior a través de la activación de los receptores de señales de muerte de la superficie celular. Por ejemplo los linfocitos citotóxicos pueden inducir apoptosis expresando una proteína llamada ligando Fas, la cual se une al receptor de señales de muerte Fas de la superficie de la célula diana. Los receptores de los ligandos Fas agregados reclutan proteínas adaptadoras intracelulares que se unen y agregan a moléculas de procaspasa 8. Algunas otras células pueden producir tanto el ligando Fas como su receptor desencadenando así una casacada intracelular. A veces las células pueden auto eliminarse induciendo la activación de procaspasas desde el interior de la célula. Un ejemplo de este proceso ocurre en las mitocondrias pues son inducidas a liberar la proteínas transportadora de electrones citocromo C al citosol donde se une y activa una proteína adaptadora llamada Apaf-1. En un daño al ADN se puede desencadenar apoptosis ya que p53, que puede activar la transcripción de genes que codifican proteínas que estimulan la liberación del citocromo C de las mitocondrias, estas proteínas pertenecen a la familia Bcl-2. Reguladores intracelulares de la apoptosis • Familia Bcl-2: son activadores de la apoptosis: o Bad (inactiva a los inhibidores de la apoptosis) o Bax y Bak (estimulan la liberación de citocromo C) 9
  • o Bid (activan a Bax y Bak) • Familia IAP (inhibidor de la apoptosis) o Se unen a procaspasas inhibiendo su actividad o Se unen a caspasas inhibiendo su actividad Necrosis Significa muerte. Es la muerte patológica de un conjunto de células o de cualquier tejido del organismo, provocada por un agente nocivo que ha provocado una lesión tan grave que no se puede reparar o curar como por ejemplo el aporte insuficiente de sangre al tejido o isquemia, un traumatismo, la exposición a la radiación ionizante, por la acción de sustancias químicas o tóxicos, por una infección, o por el desarrollo de una enfermedad autoinmune o de otro tipo. Una vez que se ha producido y desarrollado la necrosis, es irreversible. Causa inflamación Oncosis Derivado de la palabra oncos que significa inflamación. Causa inflamación, y se basa en la falla de canales iónicos en la membrana (bombas de Na K). Las posibles causas para este proceso de oncosis son la isquemia y la falta de ATP a la célula. El procedimiento requiere de la cariolisis (destrucción del núcleo) y ocurre aproximadamente en 24 horas Control extracelular de la expresión celular Los factores que estimulan el crecimiento de un órgano o de un organismo pueden dividirse en 3 clases principales: 1. Mitógenos: estimulan la división celular, principalmente eliminando controles intracelulares negativos que de otra manera bloquearían la progresión a través del ciclo celular. 2. Factores de crecimiento: estimulan el crecimiento celular induciendo la síntesis de proteínas e inhibiendo su degradación. 3. Factores de supervivencia: Estimulan la supervivencia celular inhibiendo la apoptosis. Cáncer Es una enfermedad en la cual los clones de células mutantes empiezan a proliferar a expensas de unas células vecinas, destruyendo finalmente toda la sociedad celular. Las células cancerosas se caracterizan por2 propiedades hereditarias: las mismas células y su progenie, ya que se reproducen a pensar de las restricciones normales, e invaden y colonizan territorios normalmente reservados para otras células. Si la proliferación está fuera de control se produce un tumor o neoplasma. Mientas que las células neoplásicas permanecen agrupadas en una masa única se dice que el tumor es benigno. Un tumor se considera canceroso si es maligno, es decir, si sus células tienen la capacidad de invadir un tejido circundante (metástasis). 9
  • Los canceres se clasifican de acuerdo al tejido y con el tipo celular a partir del cual se originan, como los carcinomas (epitelios), sarcomas (músculo), o leucemia (sangre). En el cáncer los genes de proliferación incrementan el crecimiento celular lo cual permite a la célula avanzar más allá del punto G1. Su mutación es causa de una proliferación excesiva. Por otro lado los genes de anti proliferación detienen el sistema de control celular. La mayoría de los genes se origina de una sola célula normal. Normalmente puede determinarse el origen del cáncer a partir de un único tumor primario que procede de un órgano determinado y probablemente derivado de una sola célula que ha sufrido algún hereditario y que le permite crecer mas que sus vecinas. La carcinogénesis (generación del cáncer) parece estar relacionada con la mutagénesis (producción de un cambio en la secuencia de ADN). Esta correlación es clara para 3 clases de agentes: 1. Carcinógenos químicos (causan simples cambios locales en la secuencia de nucleótidos) 2. Radiaciones ionizantes como rayos UV (causan rotura de los cromosomas y translocaciones) 3. Virus (introducen el ADN ajeno al interior de las células. En la mayoría de los tipos de cáncer la incidencia se incrementa abruptamente con la edad. Pues generalmente una célula maligna acumula varias mutaciones. El concepto de que el desarrollo de un cáncer requiere la presencia de mutaciones en varios genes encaja con la gran cantidad de información de que dispones, recogida a lo largo de muchos años, relacionada con el fenómeno de la progresión tumoral, que indica que un trastorno inicial benigno del compartimiento celular evoluciona gradualmente en un cáncer. Lamentablemente el cáncer se diagnostica en periodos tardíos de la enfermedad ya que para que pueda ser visualizado es necesario que una 9
  • gran cantidad de células se encuentren mutadas (generando un tumor). En el periodo temprano de la neoplasia existen mutaciones que pueden durar hasta varios años sin generar problemas a la salud, y este periodo depende del tipo de cáncer. Las células cancerosas crecen a empujones: Un tumor se desarrolla a través de sucesivas rondas de mutación y proliferación, originando un clon de células cancerosas totalmente malignas. En cada etapa, una de las células sufre una mutación que incrementa su capacidad de proliferación, de forma que sus descendientes se convierten en el clon dominante del tumor. La proliferación de este clon acelera el paso siguiente en la progresión tumoral incrementando el tamaño de la población. La inmensa mayoría de los cánceres humanos presentan tasas de mutación son sumamente elevadas: se dice que las células son genéticamente inestables. Algunas células presentan deficiencias en la reparación del ADN o en el sistema de corrección de errores de la replicación. Otras células tumorales tienen problemas en mantener la integridad de sus cromosomas, lo cual se comporta anomalías en su cariotipo. • Las mutaciones que hacen que las células no respondan a los controles normales de la división celular son una característica importante en el desarrollo de cáncer. • La pérdida de la capacidad de suicidarse (apoptosis) es otra característica importante. • Las mutaciones también pueden aumentar el tamaño de un clon de células mutantes alterando su capacidad de diferenciación. 9
  • Control normal y alterad de la producción de células a partir de células madre Las células madres pueden fracasar en la producción de una sola célula que no sea célula madre en cada división, por lo que proliferan formando un tumor o bien, las células hijas no se diferencian normalmente por lo que también proliferan formando un tumor. Las células cancerosas eluden la autolimitación de la proliferación celular ya que sus mecanismos de acción evitan procesos de senescencia celular e inclusive en estudios que se han hecho con células cancerosas en cultivo, éstas se comportan a menudo como si estuvieran inmortalizadas y continúan dividiéndose indefinidamente. Algunos otros estudios recientes sugieren un punto de vista donde la mayoría de las células de los tejidos normales sufren senescencia replicativa y disminuyen o detienen su proliferación a menudo que la persona envejece, lo cual paradójicamente crean circunstancias en las que las células cancerosas puedan progresar mejor dividiéndose en forma continuada a gran velocidad. Metástasis Es un proceso multi secuencial: 1. Las células escapan del tumor primario: (se requiere de una alteración de los mecanismos adhesivos que hacen que las células normales se mantengan unidas). 2. Invaden el tejido normal y los vasos sanguíneos: (proceso lento y que sólo algunas células tumorales tienen, pues penetran en un vaso sanguíneo o vaso linfático, atraviesan la lámina basal y a las células endoteliales entrando a la circulación, después salen y sobreviven en otro lugar para proliferar) 3. Establecen colonias en tejidos distantes. *Un requerimiento para que un tumor pueda crecer ampliamente ha de poder conseguir su propio riego sanguíneo (Angiogénesis). 6 propiedades clave capacitan a las células para el crecimiento canceroso 1. Ignorar las señales internas y externas que regulan la proliferación celular 2. Evitar el suicidio por apoptosis 3. Sortear las limitaciones programadas para la proliferación, eludiendo la senescencia replicativa y evitando la proliferación 9
  • 4. Ser genéticamente inestables 5. Escapar de sus tejidos de origen (es decir, tener capacidad invasiva) 6. Sobrevivir y proliferar en entornos ajenos (poder realizar metástasis) Biología molecular del cáncer Agentse carcinógenos: incluyen carcinógenos químicos, algunos virus y diversos tipos de radiación como los rayos UV, radiaciones ionizantes, rayos gamma o las partículas alfa de las desintegraciones radioactivas. Algunos de estos agentes actúan directamente sobre el ADN, pero los más potentes suelen ser relativamente inertes químicamente pero se convierten en dañinos tras ser transformados por los propios procesos metabólicos del organismo en una forma mas reactiva a través del complejo enzimático citocromo p-450 oxidasa. Estas enzimas ayudan a eliminar las toxinas ingeridas, sin embargo su actividad sobre ciertas sustancias genera productos que son muy mutagénicos. Iniciador tumoral: Es un carcinógeno que causa alteraciones genéticas latentes, lo cual se puede detectar en una mayor incidencia de cáncer cuando las células están expuestas a tratamientos posteriores con la misma sustancia o a otro tipo de agresiones distintas. Promotores tumorales: pueden causar cáncer si se aplican después de un iniciador tumoral. Expande la población de células mutantes incrementado además la probabilidad de progresión tumoral mediante cambios genéticos posteriores. Algunos programas posibles de exposición a un iniciador tumoral (mutagénico) y a un promotor tumoral (no mutagénico) y sus consecuencias. Tan sólo aparece cáncer si la exposición al promotor sigue a la exposición del iniciador, y sólo si la intensidad de la exposición al promotor excede un cierto umbral. También puede producirse cáncer como resultado de la exposición repetida solamente al iniciador. Los virus y el cáncer Sólo alrededor del 15% de los cánceres en todo el mundo pueden ser causados por virus, ya que estos pueden alterar el ADN celular por si solos o también actuar como promotores tumorales. Quizás el ejemplo mas característico de este apartado es el Virus del papiloma humano causante de cáncer cervico-uterino, el virus de la hepatitis B que puede causar cáncer hepático y por supuesto el VIH estimulando el desarrollo del sarcoma de Kaposi. 9
  • Incidencia de cáncer en USA y el cáncer de mama Genes críticos del cáncer Es un término que incluye todos los genes cuyas mutaciones contribuyen a provocar la enfermedad. Estos genes se agrupan en 2 categorías facilemente diferenciables: • Dominantes: Los oncogenes actúan de forma dominante, una mutación que provoca un incremento de función en una sola copia de un gen critico del cancer puede conducir a la célula hacia el cáncer. • Recesivos: Los genes supresores de tumores actúan generalemente en forma recesiva. Para conducir a la célula hacia el cáncer se ha de perder la función de los 2 alelos del gen. Método para localizar un oncogen La mayoría de las células normales dejan de crecer cuando han formado una monocapa que recubre toda la superficie de cultivo (Inhibición por contacto celular). Las células cancerosas por el contrario, normalmente superan estas restricciones, cotinuan creciendo y se apilan unas a otras. 9
  • Los genes supresores de tumores pueden ser identificados mediante estudios de síndromes cancerosos hereditarios poco frecuentes En la forma hereditaria del retinoblastomas (un tipo de cáncer), todas las células del cuerpo carecen de una o 2 copias funcionales de un gen supresor de tumoroes Rb y, en aquellas células en las que la otra copia se pierde o se inactiva debido a una mutación somática se producen tumores. En la forma no hereditaria de la enfermedad que es mas rara, todas las células contienen inicialemente 2 copias funcionales del gen y el tumor surge porque se pierden o se inactivan ambas copias a traves de las coincidencias de 2 mutaciones somáticas en una célula. 3 vías por las cuales un proto oncogen puede ser transformado en un oncogen: 1. Delección o mutación puntual en la secuencia codificante 2. Amplificación génica 3. Reordenamiento de cromosomas 6 vías por las cuales se puede perder la copia correcta conservada de una gen supresor de tumor: 1. Sin desunión (perdida de cromosomas) 1. Sin desunión y con duplicaición 2. Recombinación mitótica 3. Conversión génica 4. Deleción 5. Mutuación puntual Mecanismo de acción del virus del papiloma humano Esotos virus tienen cromosomas de ADN circulares de doble cadena. En una verruga o en una infección beigna estos cromosomas se mantienen de forma estable en las células basales del epitelio como plasmidos cuya replicación esta controlada manteniendose en el mismo estadio que los cromosomas del huesped. Sin embargo, accidentes poco frecuentes pueden causar la interacción de un fragmento del plasmido en el cromosoma alternando el entorno de los genes víricos. Esto desorganiza el control de la expresión del gen vírico. 9
  • El virus del papiloma humano utiliza sus proteínas E6 y E7 para secuestrar las proteínas del huespeb Rb y p53 respectivamente. La unión de la proteína E6 comporta la ubiquitinación de su pareja p53 induciendo la proteolisis de p53. El acortamiento de los telómeros puede conducir a una inestibilidad cromosómica y cancer Cuando las células que no poseen telomerasa se dividen, sus telomeros se acortan. Los cromosomas sin estos extremos producen una señal intracelular parecida a la rotura de la doble cadena de ADN. En células con p53 sanas existe sensescencia celular y se evita la proliferación. Sin embargo, en células que han sufrido unamutación en p53 se ignora esta sñal y se provoca el cáncer. Las barreras de las metástasis 1. Entrada en un vaso sanguíneo linfático (dificl) 2. Supervivencia en la circulación (fácil) 3. Parada en un capilar o en un vaso pequeño (fácil) 4. Salida a un tejido u organo distante (fácil) 5. Supervivencia en las células en el tejido extraño (dificil) 6. Crecimiento inicial de las células en el tejido extraño (dificil) 7. Mantenimiento del crecimiento (dificil) SENESCENCIA CELULAR La senescencia celular se refiere a la respuesta de las células, mitóticamente competentes (células no diferenciadas terminalmente y que por lo tanto tienen l capacidad de dividirse) frente a estímulos que tienen la potencialidad de causar transformaciones neoplásicas y está representada entre otros aspectos en el arresto del crecimiento celular. 9
  • Teoría de acortamiento de telómeros: Los telómeros en mamíferos, al igual que en todos los vertebrados, están constituidos por la secuencia 5'-TTAGGG-3' repetida cientos y miles de veces al final de cada cromosoma. Tanto ellos como sus proteínas especializadas asociadas (TRF1, TRF2, POT1, TIN2, hRAP1) son esenciales para la integridad de los cromosomas. Por mecanismos bioquímicos propios de la replicación del ADN, de 50 a 200 pares de bases del ADN telomérico dejan de ser replicados durante cada fase S. Debido a esto y a que la enzima responsable de la síntesis de novo del ADN telomérico no se expresa en la mayoría de las células humanas, los telómeros se acortan en cada ciclo celular. Sólidas evidencias demuestran que las células expresan el fenotipo senescente cuando uno o más de sus telómeros alcanzan una longitud crítica. Así por ejemplo, en células humanas donde la longitud del fragmento telomérico de restricción terminal promedia de 15 a 200 000 pares de bases, la senescencia replicativa se produce cuando dicho fragmento adquiere una longitud promedio de 5 a 7 000 pares de bases.6 La erosión telomérica inevitablemente conduce a una inestabilidad genómica y por tanto a una hipermutabilidad. De esta misma forma, el daño al ADN puede originar mutaciones (en oncogenes o genes supresores de tumores), aberraciones cromosómicas e inestabilidad genómica. Teoría de los radicales libres (Harmon, 1956): Los radicales libres son átomos o moléculas con uno o más electrones sin neutralizar, por lo tanto tienen una tendencia a ceder o aceptar electrones lo cual los hace extremadamente reactivos. La fuente principal de radicales libres está asociada con la reducción de oxígeno y la formación de agua durante la respiración mitocondrial. Las especies de oxígeno reactivo son producidas continuamente en una alta proporción como resultado del metabolismo aeróbico. Dentro de los oxidantes se encuentran: superóxido (O2-), peróxido de hidrógeno H2O2, oxígeno aislado O2 y radicales hidroxilo (OH). Los radicales hidroxilo son originados principalmente durante la reducción química y enzimática de moléculas de oxígeno en la célula. La principal lesión causada por los oxidantes es la transformación de las bases normales del ADN en bases modificadas. Hoy en día han sido identificados más de veinte productos resultantes de las lesiones causadas por radicales de oxígeno, entre ellos podemos mencionar: 8-oxoadenina, 8- oxoguanina (OG), 4,6-diamino-5-formamidopirimidina, 2,6-diamino-4-hidroxi-5- formamidopirimidina, 5-hidroxicitosina, 5-hidroxiuracil y Timina glicol La acumulación de daños incluye el aumento de una pobre reparación de las lesiones del ADN, efecto que se acentúa notoriamente con la edad, hasta llegar a la dramática confirmación del cese de las funciones vitales. 9