Cromatografia liquida

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Cromatografia liquida

  1. 1. Cromatografia Liquida – CLAECromatografia Liquida – CLAEprofessora ; adrianne mendonçaprofessora ; adrianne mendonça
  2. 2. O que é Cromatografia ?O que é Cromatografia ?Definição:A cromatografia é uma técnica de separaçãona qual os componentes a serem separadosde uma mistura migram entre duas fasessendo uma fase móvel e a outra estacionária.A natureza química e física dos componentesda mistura definem o grau de afinidade entreas duas fases, acontecendo o fenômeno demigração diferencial .
  3. 3. O que é Cromatografia a LíquidoO que é Cromatografia a LíquidoHPLC?HPLC?Definição:Na técnica de cromatografia a líquido afase móvel é um líquido e a faseestacionária é um sólido .O processo cromatográfico acontece nafase líquida , sendo que os componentes daamostras devem estar dissolvidos.
  4. 4. Instrumentação para HPLCInstrumentação para HPLC
  5. 5. CLAE -HPLCCLAE -HPLCFase móvel(amostra)Fase estacionária(Componentes retidos)Migrações diferenciaisAnalitomov ⇋ AnalitoestK = Analitoest / Analitomov= coeficiente departição
  6. 6. INSTRUMENTAÇÃOpumpinjectorcolumnovendetectorOne pump used tocontrol 4 reservoirs;mixing is donebefore pump.MIXERdataprocessorFase móvel
  7. 7. Instrumentação para HPLCInstrumentação para HPLCPURGAINJETORCOLUNAFMBOMBADETECTOR
  8. 8. Componentes de umComponentes de umCromatógrafo a Líquido HPLCCromatógrafo a Líquido HPLCUm cromatógrafo a líquido é composto de 3 partesprincipais : Injetor :É o dispositivo que tem a função de introduzir aamostra na fase móvel ; Coluna cromatografia :É o dispositivo que tem a função de separar oscomponentes da amostra ; Detector :É o dispositivo que tem a função de detectar oscomponentes eluídos da coluna cromatográficas
  9. 9. Componentes auxiliares deComponentes auxiliares deum HPLCum HPLCBomba :É o dispositivo que bombeia e controla ofluxo e a pressão da fase móvel ( solvente );É composta de um ou mais pistão acoplados aum sistema de válvulas.Fornece uma alta pressão.
  10. 10. BOMBA- Fluxo deve ser constante (0,01-10 mL/min)- Opções: Simples, gradiente binário, quaternário- Mede a pressão sobre o sistema- Manutenção preventiva (selos, pistões, check valves, etc.)
  11. 11. Componentes auxiliares de umComponentes auxiliares de umHPLCHPLCVálvula de purga:É o dispositivo que permite a troca rápida desolvente desviando o fluxo de solvente para odreno.Misturador:É o dispositivo que homogeneíza a mistura desolventes quando operando com gradiente deeluição .
  12. 12. Fase estacionáriaFase estacionária
  13. 13. Colunas CromatográficasColunas CromatográficasFases estacionárias : Sílica- C8 Sílica- C18 Sílica- C18 ( ODS) Sílica- NH2 Sílica- Diol Sílica Troca Iônica Resinas DVB-ST Sulfonadas Ca Resinas DVB-ST porosasPré-Coluna: É o uma pequena coluna instalada a montanteda coluna analítica . Tem como objetivo reter sólidos e em muitoscasos reter materiais que por reações químicaspodem precipitar sobre a fase estacionária.
  14. 14. SÍLICA (suporte + usado):- Resistência mecânica- Variedade de forma, tamanho de partículas eporos- Instabilidade frente a fases móveis ácidas oubásicas- Superfície não homogêneaCOLUNAS CROMATOGRÁFICAS
  15. 15. SiOHSiHO OHSiOHSiOHSÍLICA – GRUPOS SILANÓISLIVRES GEMINAL VICINAISinfluenciam no grau de acidez da sílica
  16. 16. Fase EstacionáriaFase EstacionáriaA fase estacionária mais utilizadaé composta de partículasmicroporosas de sílica.São permeáveis ao solvente epossuem uma área superficial devarias centenas de metros porgramas.Não deve ser utilizada emsistemas com pH acima de 8,0.
  17. 17. MODIFICAÇÃO SUPERFICIAL- QUIMICAMENTE LIGADAS- HÍBRIDAS- RECOBERTAS COM POLÍMEROS ORGÂNICOS
  18. 18. Fases Quimicamente LigadasC18 (ODS)forteC8amostraamostraamostraC4médiafraca
  19. 19. POLIMÉRICASPré-hidrólise do agente silanizante- Rede tridimensional mais espessa- Maior estabilidade- Dificuldade de controlar reações entrecruzamento
  20. 20. FASES ESTACIONÁRIAS HÍBRIDASMatriz orgânica-inorgânica- Mais estáveis do que as quim. ligadas convencionais- Menor quantidade de grupos de silanóis- Ultra-fast cromatografiaTetraalcoxissilano alquiltrialcoxissilano(RO)4Si + n(RO)3SiR’ + (1,5n+2)H2O → SiO2 (R’SiO1,5)0,5 + (3n+4)ROH
  21. 21. RECOBRIMENTO COM POLÍMEROS-RESISTÊNCIA MECÂNICA DA MATRIZINORGÂNICA- SELETIVIDADE E INÉRCIA QUÍMICA DOSPOLÍMEROS ORGÂNICOS
  22. 22. - Maior recobrimento dos sítios ativos do suporte- Maior seletividade (natureza e quantidade dos gruposfuncionais nas cadeias dos polímeros, espessura dosfilmes, área superficial e estrutura de poros do suporte)• Poli(etileno)• Poli(butadieno)• Poli(estireno)• Poli(dimetilsiloxano)• Poli(metiloctilsiloxano)• Poli(metiloctadecilsiloxano)• Poliéteres• Polissacarídeos• Poliaminas• Polinucleotídeos• Poliamidas• ProteínasSílicaZircôniaTitâniaAlumina
  23. 23. PRINCÍPIOS DE SEPARAÇÃOINTERAÇÃO DO SOLUTO NAS 2 FASES (EQUILÍBRIO)INTERAÇÕES DE VAN DER VALLSLIGAÇÕES DE HIDROGÊNIOINTERAÇÕES DIPOLO-DIPOLOATRAÇÃO ELETROSTÁTICA
  24. 24. Fases estacionárias InteraçõesC8PHC2van der Waalsvan der Waalsvan der WaalsSiSiSi
  25. 25. Fases estacionárias InteraçõesCNNH22OHDipolo/DipoloOHSi NHHOSiOHOOHHSiNOHCLigação dehidrogênioLigação dehidrogênioFase Estacionária
  26. 26. PRSCBASAXEletrostáticaEletrostáticaEletrostáticaH3+NSO3-SiSiH3+NO-ON+(CH3)3Si-O3SFases estacionárias InteraçõesFase Estacionária
  27. 27. Processo de EluiçãoProcesso de EluiçãoDefinição:Pode ser descrita como deslocamento do soluto nafase estacionária.Série eluotrópica Ordena os solventes de acordo com suas habilidadesrelativas de deslocar soluto de um dado adsorvente.
  28. 28. Força eluente: É uma medida da energia de adsorção do solventeCromatografia com fase normal: Utiliza uma fase estacionária polar e um solventemenos polar.Cromatografia com fase reversa: Utiliza uma fase estacionária apolar ou fracamentepolar e um solvente polar.
  29. 29. DETECTORES - ClassificaçãoUNIVERSAIS:Geram sinal para qualquersubstância eluída.SELETIVOS:Detectam apenas substânciascom determinada propriedadefísico-química.Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à quantidadeeluída de um analito
  30. 30. DETECTORESUVFLUORESCÊNCIAMSELETROQUÍMICOIRPOLARÍMETRO
  31. 31. É mais comum, usado naCLAE. Porque muitos solutosabsorvem a luz ultravioleta. São bons para a eluiçãopor gradiente comsolventes não-absorventes.DetectoresDetectores Ultra violeta:Ultra violeta:
  32. 32. Princípio: Absorção de luz ultravioleta ou visível pelaamostra, quando nela passa radiação eletromagnética.- Seletivo (moléculas com cromóforos)- Comprimento de onda (λ) fixo- λ pode ser selecionado (190 – 600 nm)- Varredura (DAD)- Solventes também absorvemUltra violeta (UV-visível):ÁguaMeOHACNAcetonaHexanoClorofórmioTHF190210200330200245215λ nmSolvente
  33. 33. Princípio: Emissão de energia fluorescente de umsoluto que foi excitado por radiação UV- Seletivo (moléculas que fluorescem)- Exemplo: Aromáticos policíclicos e duplas ligações conjugadas- Mais sensível que UV por ser emissão- Podem ser feitas reações de derivação pré ou pós-coluna paraque o analito se torne fluorescente.- Reagentes de derivatização comuns: fluorescamina e cloreto dedansilaFluorescência:
  34. 34. Detectores por Índice de RefraçãoDetectores por Índice de Refração::
  35. 35. Princípio: Mede a diferença no índice de refração dafase móvel e do eluente vindo da coluna- Não- seletivo- Sensível a variações de:- Temperatura- Pressão- Fluxo- Composição fase móvel- Baixa sensibilidade e difícil de estabilizar- Muito usado em cromatografia preparativaIndice de refração:
  36. 36. Princípio: Determinação da massa de solutos através daionização e determinação da relação massa-carga (m/z)- Destrutivo- Pode ser extremamente seletivo (SIM e massas tandem MS/MS)- Interfaces de ionização mais comuns: ESI, ApCI- Análise de micro e macromoléculas.- Alta sensibilidadeEspectrometria de massas:
  37. 37. MODOS DE SEPARAÇÃOMODOS DE SEPARAÇÃONORMALREVERSOTROCA IÔNICA
  38. 38. MODO NORMALMECANISMO DE INTERAÇÃO:ADSORÇÃOFase estacionária: + POLAR que a fase móvelFase móvel: mistura de solventes orgânicosColunas: Sílica, Ciano, fenil, amino
  39. 39. MODO REVERSOINTERAÇÃO DA PARTE NÃO POLAR DOSOLUTO E A FASE ESTACIONÁRIAHIDROFOBICIDADEFase estacionária: APOLARFase móvel: H2O, MeOH, CH3CNÁREA DE C SOLUTO RETENÇÃO
  40. 40. Tempo de Retenção eHidrofobicidadeOHOHC18 (ODS)forteInteraçãofraca
  41. 41. HidrofobicidadeHidrofobicidade Se a amostra possui CH3CH2CH2--- : cadeia carbônica : grupo aromático Se a amostra possui -COOH : grupo carboxílico -NH2 : grupo amino -OH : grupo hidróxiAhidrofobicidadeserá forteAhidrofobicidadeserá fraca
  42. 42. TROCA IÔNICAMECANISMO DE INTERAÇÃO :ATRAÇÃO ELETROSTÁTICAFase estacionária: Resinas trocadoras de íons (catiônicas / aniônicas)Fase móvel: Tampão (pH, , força iônica, temperatura)Aniônicas: amônio quaternário, aminasCatiônicas: ácido sulfônico, ácido carboxílico
  43. 43. Microsseringas para InjeçãoLÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 µL, 5 µL e 10 µLêmbolocorpo (pirex)agulha (inox 316)Obs: Seringa de HPLC
  44. 44. SeqüênciaSeqüênciaLavagem da coluna -MeOH por30 minutosCondicionamento da coluna comfase móvelMonitoramento da linha de baseInjeção das amostras
  45. 45. PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOSFATOR DE RETENÇÃO (k)FATOR DE SEPARAÇÃO (α)NÚMERO DE PRATOS (N)
  46. 46. CromatogramatRtMTEMPOSINALtR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico)tM (tempo morto) = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para umcomposto que não interaja com a FE atravesse a coluna)
  47. 47. A migração de um analito pelacoluna provoca inevitavelmenteo alargamento da sua banda:TEMPOEfeitos do alargamento excessivo de picos:EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.
  48. 48. w2 na linha de baseBANDA CROMATOGRÁFICA
  49. 49. Representa a capacidade de distribuição do soluto nas fasesNão leva em conta o tempo morto da colunaFATOR DE RETENÇÃO (k)tr – tok =totr = tempo retenção analitoto = tempo morto da coluna
  50. 50. tr ook =t tSe:t0 = 1,5 mint1 = 3,5 mint2 = 4,2 mink1 = 1,3k2 = 1,8
  51. 51. FATOR DE SEPARAÇÃO (α)αk2=k1AVALIA A SELETIVIDADE
  52. 52. Se:k1 = 1,3k2 = 1,8α = 1,38k1 = 1,3k2 = 1,8αk2=k1α = 1 não houve separação
  53. 53. NÚMERO DE PRATOS (N)Mede a eficiência do sistemaDepende da coluna, da amostra e do fluxo da fase móveltrN= 5,54w0,52
  54. 54. ResoluçãoResoluçãoé função daSeletividade (α)Eficiência da coluna (N)Fator de retenção (k)
  55. 55. ResoluçãoResoluçãoRs = 0.8 Rs = 1.25Rs = 1.05
  56. 56. FASE MÓVEL- Solvente grau HPLC (alta pureza)- Filtração (membrana 0.45 μm)- Degaseificação do solvente (ultrassom, borbulhamentode He ou automático)- Purgar os solventes
  57. 57. MODOS DE ELUIÇÃOMODOS DE ELUIÇÃOISOCRÁTICO:Uma única composição de fase móvel ao longo dacorrida; a composição ds FM é CONSTANTE.GRADIENTE:- Variação da composição da fase móvel (FM) ao longoda corrida.- Amostras com ampla faixa de k (0,5 < k < 20)
  58. 58. Mudança no modificador orgânicoMudança no modificador orgânicoabcdabcd[ MeOH/H2O ]par crítico : c,d[ THF/H2O ]par crítico : a,babcd[ MeOH/THF/H2O ]
  59. 59. 1) COLETA/OBTENÇÃO (QUANTIDADE, LUGAR, ETC..)2) ESTOCAGEM E PREPARAÇÃO (ESTABILIDADE)3) EXTRAÇÃO:- LÍQUIDO-LÍQUIDO- LÍQUIDO-SÓLIDO- SOXHLET- FLUÍDO SUPER CRÍTICO- EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (EFS / SPE)PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
  60. 60. FiltraçãoFiltraçãoÉ necessária, previamente à injeção,usualmente com membranas de 0.45 µmmesh para a remoção do material insolúvel.
  61. 61. DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOFixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustadode um analito é uma constanteAMOSTRAPADRÃOComparação decromatogramas daamostra e de umasolução padrão doanalito suspeito
  62. 62. ANÁLISE QUANTITATIVAANÁLISE QUANTITATIVAA área do pico é proporcional a massa quepassa pelo detectorCálculo de área:
  63. 63. ANÁLISE QUANTITATIVAANÁLISE QUANTITATIVASe ambos os compostosrespondessem igualmente aodetector poderíamos usar a relação:Massa A Área AMassa B Área BNo entanto, a mesma massa de compostos diferentes nos dááreas diferentes, em função da resposta ao detector.
  64. 64. PADRONIZAÇÃO EXTERNAPADRONIZAÇÃO EXTERNAEste método baseia-se na comparação de uma certasubstância presente na amostra com seu respectivo padrão.Primeiramente deve-se construir um gráfico de (área xconcentração) da substância padrão:
  65. 65. PADRONIZAÇÃO EXTERNAPADRONIZAÇÃO EXTERNAEm seguida, injeta-se a amostra, e a partir da área obtida nocromatograma tira-se do gráfico traçado a concentraçãodessa substância na amostra.É importante salientar que o gráfico deve ser construído comconcentrações próximas da concentração esperada naamostra. Outro fator muito importante é que o volumeinjetado do padrão tem de ser exatamente igual ao volumeinjetado de amostra. Por esta razão este tipo depadronização é mais conveniente quando se utiliza válvulaspara injeção da amostra, que reproduzem fielmente o volumeinjetado.Neste método não são usados fatores de correção paracorrigir as áreas, por haver comparação da mesma substância
  66. 66. PADRONIZAÇÃO INTERNAPADRONIZAÇÃO INTERNAUma quantidade de amostra é pesada juntamentecom um padrão de massa conhecida. Estamistura é injetada e, a partir dos dados obtidosno cromatograma, compara-se a área corrigidade cada componente que se deseja determinarcom a área corrigida do padrão adicionado, doqual se conhece a concentração.Mx = massa do componente xMa = massa da amostraMp = massa do padrãoAp = área do padrãoAx = área corrigida do componente x
  67. 67. PADRONIZAÇÃO INTERNAPADRONIZAÇÃO INTERNAA escolha do padrão deve ser feita, sempre quepossível, entre compostos semelhantes aos queexistem na amostra, não devendo coincidir comnenhum composto da mesma, e estar próximo ouentre os picos da amostra. Deve ser também umasubstância pura para que apresente apenas um picono cromatograma, e para que esse pico possa serrelacionado à massa pesadaEste método possibilita a determinação deapenas um dos componentes de uma mistura, semhaver necessidade de conhecer os outroscomponentes.
  68. 68. APLICAÇÕESAPLICAÇÕES
  69. 69. APLICAÇÕES cont…APLICAÇÕES cont…
  70. 70. APLICAÇÕES cont…APLICAÇÕES cont…
  71. 71. ReferênciasReferências TRINDADE, Magno Aparecido Gonçalves; RINALDO, Daniel;VILEGAS, Wagner  and  ZANONI, Maria Valnice Boldrin.Determinação de corantes marcadores do tipo azo eantraquinona em combustíveis por cromatografia líquidacom detecção eletroquímica. Quím. Nova [online]. 2010,vol.33, n.1, pp. 146-150. ISSN 0100-4042.AFLATOXINAS EM ALIMENTOS DESTINADOS ABOVINOS E EM AMOSTRAS DE LEITE DA REGIÃO DELAVRAS, MINAS GERAIS – BRASIL - Maria MarluciaGomes Pereira1, Eliana Pinheiro de Carvalho2, GuilhermePrado3, Carlos Alberto da Rocha Rosa4, Thaís Veloso5,Leandro Augusto Ferreira de Souza5,Jéssika Mara MartinsRibeiro6
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