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Pcr Y Electroforesis Biociencias 2010 Pdf
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Pcr Y Electroforesis Biociencias 2010 Pdf

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  • 1. REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Y ELECTROFORESIS ADRIANA MARIA GIL ZAPATA Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS BIOCIENCIAS II
  • 2. Síntesis de ácidos nucleicos • La hebra nueva de DNA o RNA se sintetiza en dirección 5’ 3’ • Las RNA polimerasas pueden iniciar la síntesis de una cadena nueva utilizando una hebra molde • Las DNA polimerasas además de la hebra molde, necesitan un iniciador (primer o cebador de extensión) • La Transcriptasa Reversa es una DNA polimerasa RNA- dependiente.
  • 3. Basta un primer Cadena líder (Leading Strand) Primer (riboNTPs) Fragmento de Okasaki Cadena rezagada (Lagging Strand) → LA SINTESIS DE LOS ACIDOS NUCLEICOS ES SIEMPRE DE 5´→ 3´.
  • 4. ELEMENTOS QUE SE REQUIEREN EN LA SINTESIS DEL DNA POR PCR • Hebra Templado • Iniciador (cebador, primer): secuencia corta de nucleótidos complementaria a la hebra templado. La enzima DNA polimerasa sólo puede iniciar la síntesis de una cadena de DNA a partir de un 3’OH libre. • dNTPs : desoxirribonucleótidos tri-fosfatados • DNA Polimerasa
  • 5. PCR Temperatura 100 Melting 94 oC 50 0 Tiempo 3’ 5’ DNA de 5’ 3’ cadena doble
  • 6. PCR Temperatura 100 Melting 94 oC 50 0 Tiempo 3’ 5’ DNA de cadena simple Calor 5’ 3’
  • 7. PCR Temperatura 100 Melting Melting 94 oC o Extension 94 C Annealing Primers 72 oC 50 50 oC 0 Tiempo 3’ 5’ 5’ Hibridación de primers 5’ 5’ 3’
  • 8. PCR Temperatura 100 Melting Melting 30 ciclos 94 oC o Extension 94 C Annealing Primers 72 oC 50 50 oC 0 Tiempo 3’ 5’ Calor 5’ 5’ Calor 5’ 5’ 3’
  • 9. PCR Temperatura 100 Melting Melting 30ciclos 94 oC o Extension 94 C Annealing Primers 72 oC 50 50 oC 0 Tiempo 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’
  • 10. PCR Temperatura 100 Melting Melting 30ciclos 94 oC o Extension 94 C Annealing Primers 72 oC 50 50 oC 0 3’ 5’ 5’ Tiempo 5’ 5’ 5’ 3’ Calor 5’ 5’ Calor 5’
  • 11. PCR Temperatura 100 Melting Melting 30ciclos 94 oC o Extension 94 C Annealing Primers 72 oC 50 50 oC 0 3’ 5’ 5’ Tiempo 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’
  • 12. PCR Temperatura 100 Melting Melting 30ciclos 94 oC o Extension 94 C Annealing Primers 72 oC 50 50 oC 0 3’ 5’ 5’ Tiempo 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 5’ 5’ Fragmentos de tamaño definido 5’ 5’ 5’ 5’
  • 13. El numero de copias del DNA delimitado por los primers se duplica en cada ciclo de PCR. Numero de copias 1 2 4 8 16 32 64 0 1 2 3 4 5 6 # ciclos
  • 14. VENTAJAS DE PCR SOBRE OTRAS TECNICAS ALTA SENSIBILIDAD ALTA ESPECIFICIDAD RAPIDEZ DESVENTAJA: PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA templado específico o productos amplificados previamente)
  • 15. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA PCR Proceso que semeja “in vitro” la replicación del ADN y que permite obtener millones de copias iguales de un fragmento de ADN, después de realizar 30 o más ciclos.
  • 16. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA 1. DENATURACIÓN 90 a 95 ° c CICLO 2. ANILLAMIENTO 55 a 65 ° c 3. EXTENSIÓN 72 ° c
  • 17. DENATURACION • El ADN sirve de molde para ser copiado. • Un aumento de la temperatura o un pH alcalino permite que la cadena se separe. • Es reversible
  • 18. HIBRIDACION • Los primers se unen a los extremos 3 prima de la cadena. • La nueva hebra tiene la direccion de 5 a 3 prima. • Le dan la especificidad a la PCR.
  • 19. EXTENSION • Actua la Taq (Termophilus aquaticus) polimerasa. • Polimerisa los dNTP‘s.
  • 20. PCR MIX • Buffer • Primers •ADN molde • dNTP’s (dATP, dGTP, dTTP y dCTP) •ADN Polimerasa (Taq polimerasa) • Cloruro de Magnesio (MgCl2) cofactor de la Taq.
  • 21. Usos de la PCR • Pruebas de identificación (STRs) • Detección de enfermedades hereditarias • Detección de enfermedad viral • Clonación de genes • Mutagénesis dirigida • Genotipificación de mutaciones especificas (SNPs)
  • 22. CLASES DE PCR • PCR MISMATCH • RT PCR • PCR TIEMPO REAL • PCR MULTIPLEX • PCR NESTED
  • 23. Consiste en dos pasos: • Transcripción reversa RT-PCR • PCR mRNA OBJETIVO: Detección de la expresión de cDNA (simple cadena) un gen – por presencia de mRNA cDNA (doble cadena) PCR
  • 24. Transcripción Reversa 1. Purificación de RNA mensajero 2. Transcripción reversa a cDNA (DNA copia)
  • 25. MUESTRAS QUE PUEDEN PATOGENOS QUE PUEDEN SER SER EVALUADAS POR PCR DETECTADOS POR PCR •Sangre - Bacterias •Mucosa - Hongos •Tejido - Parásitos •Orina - Virus •Heces - Mutaciones en Genes •Líquido cefalorraquídeo - Ausencia /Deleción de genes
  • 26. USOS DE LA TECNOLOGIA MOLECULAR EN LA SOCIEDAD • Medicina : Diagnóstico Molecular: Enfermedades genéticas Enfermedades infecciosas • Identificación genética y filiación (Pruebas de paternidad, medicina forense, pedigree de animales, etc...) • Mejoramiento genético en animales y plantas • Productos biomédicos • Terapia génica
  • 27. REAL TIME PCR - PCR Cuantitativo (end point analysis) - PCR en tiempo real (análisis de la cinética de reacción) - ventajas - desventajas - aplicaciones
  • 28. REAL TIME PCR - PCR EN TIEMPO REAL •Cuantificación del número de copias de DNA presentes en la muestra (diagnóstico, monitoreo de carga viral, comparación entre número de copias en diferentes subespecies, etc.) •Cuantificación del mRNA por RT-PCR en tiempo real (análisis de la expresión de genes en diferentes tejidos o en diferentes condiciones normales vs patológicas, efecto de drogas, etc) •Análisis de la cinética de la reacción
  • 29. PCR en tiempo real • Detección y cuantificación de reporteros fluorescentes. • La fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de producto formado en cada ciclo de PCR. • Reporteros fluorescentes: TaqMan, Beacons moleculares, SYBR Green
  • 30. TaqMan PCR Sonda específica
  • 31. CYCLE NUMBER DNA copy number 0 1 1 2 Copies of DNA=2N 2 4 1.8E+09 3 8 1.6E+09 4 16 5 32 1.4E+09 6 64 1.2E+09 DNA copy number 7 128 1.0E+09 8 256 9 512 8.0E+08 10 1,024 6.0E+08 11 2,048 4.0E+08 12 4,096 13 8,192 2.0E+08 14 16,384 0.0E+00 15 32,768 0 5 10 15 20 25 30 35 16 65,536 PCR cycle 17 131,072 10 18 262,144 9 19 524,288 8 20 1,048,576 7 21 2,097,152 DNA copy number (log) 22 4,194,304 6 23 8,388,608 5 24 16,777,216 4 25 33,554,432 3 26 67,108,864 2 27 134,217,728 1 28 268,435,456 0 29 536,870,912 0 5 10 15 20 25 30 35 30 1,073,741,824 PCR cycle 31 1,400,000,000 32 1,500,000,000 33 1,550,000,000 PCR reagent is the limiting factor!! 34 1,580,000,000
  • 32. CANTIDAD DE DNA (escala logaritmica) vs NUMERO DE CICLOS Se observa diferencias en los ciclos iniciales. Relación como línea recta al utilizar logaritmos, porque la amplificación por PCR es una reacción logarítmica.
  • 33. Real Time PCR
  • 34. 3. intensifier 5. ccd detector 1. halogen 350,000 tungsten lamp 2b. emission pixels filters 2a. excitation filters 4. sample plate
  • 35. Amplification Plot of real-time PCR DNA copy number (log) Log phase Level off/ plateau 2 4 8 16 32 PCR cycle (Ct)
  • 36. PROBLEMAS PRODUCTOS NO ESPECIFICOS (artefactos) : que pueden incrementar el valor de fluorescencia obtenida durante la reacción. Esto es mas frecuente cuando se utiliza SYBR-green. ARTEFACTOS - PRODUCTOS NO ESPECIFICOS: • Unión inespecífica de primers (mispriming): por unión de los primers a secuencias parcialmente complementarias presentes en el DNA o cDNAs de la muestra • Dímeros : los primers pueden hibridarse entre ellos creando productos pequeños
  • 37. CURVA DE DENATURACION Muesta el perfil de denaturación de los productos amplificados. Si un producto presenta un perfil de denaturación diferente (valores de Tm diferentes), significa que es otro producto (no específico) de amplificación, pueden ser dímeros.
  • 38. CURVA DE DENATURACION DE DILUCIONES (se observan dímeros, de menor temperatura de fusión) dímeros
  • 39. DISEÑO EN PLACA
  • 40. Ventajas del PCR en tiempo real • Simple y rápida (semi-automatizada). • No hay manipulación post-PCR. • Eliminación de contaminación por amplicones. • Cuantificación del DNA o RNA molde inicial. • Muy sensible. • Detección de productos inespecíficos con la opción “curva de desnaturalización” (Melt-Curve). • Detección de más de un producto específico en una misma reacción. • Extraordinariamente específico.
  • 41. REGIONES DEL ADN De secuencia única (genes) Medianamente repetitivas Altamente Repetitivas
  • 42. CROMOSOMA ADN p HETEROCROMATINA REGIONES REPETIDAS EUCROMATINA GEN q
  • 43. REGIONES ALTAMENTE REPETITIVAS SHORT TANDEM REPEATS (STRs) Miles distribuidas a lo largo del genoma Formadas por 2 a 7 nucleótidos Los nucleótidos se repiten varias veces uno tras otro Regiones muy variables (polimórficas)
  • 44. SHORT TANDEM REPEATS
  • 45. SHORT TANDEM REPEATS STRs Localización Secuencia Tamaño cromosómica ( pb ) D3S1358 3p (TCTA)n 114 - 142 vWA 12p (TCTG)n 152 - 197 FGA 4p (CTTT)n 219 - 167 DYS 391 Y (GCGT)n 210 - 264
  • 46. METODOLOGIA DE ANÁLISIS DEL ADN EXTRACCION DE ADN: Salting Out, Chelex Autosómicos: D3S1358, VWA, FGA, THO1, TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, PCR D7S820, D8S1179, D21S11, D18S51, D16S539. STR’s Cromosoma Y: DYS19, DYS385, DYS389 I, DYS389 II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393. Cromosoma X: DXS8378, DXS9898,DXS8377 HPRTB ELECTROFORESIS CAPILAR: ABI PRISM 310
  • 47. D3S1358 TCTA TCTA TCTA TCTA Alelo 4 TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA Alelo 5 TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA Alelo 6 TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TATA … n Alelo n POLIMORFISMO: Múltiples alelos posibles en la población
  • 48. METODOLOGIA DE ANÁLISIS DEL ADN Autosómicos: D3S1358, VWA, FGA, THO1, TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D7S820, PCR D8S1179, D21S11, D18S51, D16S539. STR’s Cromosoma Y: DYS19, DYS385, DYS389 I, DYS389 II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393.
  • 49. KIT COFILER
  • 50. ELECTROFORESIS
  • 51. METODOLOGIA DE ANÁLISIS DEL ADN ELECTROFORESIS CONVENCIONAL CAMARA DE ELECTROFORESIS GEL DE AGAROSA ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS CAPILAR EQUIPO ABI PRISM 310
  • 52. ELECTROFORESIS Técnica en la cual una partícula cargada se hace desplazar a través de un medio aplicando un campo eléctrico. La velocidad de migración es función de la densidad de carga y ésta a su vez es función de una serie de parámetros que marcan las condiciones experimentales como: pH, fuerza iónica, voltaje, interacciones con el soporte.
  • 53. MOVIMIENTO DE LA PARTICULA EN EL CAMPO ELECTRICO Catión ( carga + ) Migra al polo negativo. CATODO Anión ( carga - ) Migra al polo positivo. ANODO La fuerza que ejerce el campo eléctrico sobre la partícula cargada, es proporcional a la carga de la partícula y al voltaje del campo eléctrico aplicado. F = Q X V
  • 54. MOVIMIENTO DE LA PARTICULA EN EL CAMPO ELECTRICO Otra fuerza se opone al movimiento de la partícula y es proporcional al tamaño y la forma de ella y a la viscosidad del buffer. Fr = F X V Estas dos fuerzas se equilibran cuando la partícula empieza a migrar y hace que alcance una velocidad constante.
  • 55. FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULAS Carga neta de la partícula: Efecto del pH del tampón. Cuando las partículas se colocan en un campo eléctrico, estas migrarán hacia el ánodo o el cátodo en función de la carga neta que posean y ésta depende del pH de la solución en que se encuentran.
  • 56. FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULAS Tamaño y Forma de la partícula: Según el tipo de electroforesis, el tamaño y la forma de la partícula pueden tener mayor o menor importancia. Cuando se emplean soportes que permiten el paso selectivo de moléculas, según el tamaño, retienen las grandes y dejan pasar las más pequeñas.
  • 57. FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULAS Fuerza iónica del tampón: En la electroforesis, la corriente es llevada por los iones presentes, tanto del tampón como de las partículas en solución, por tanto cuanto más concentrado es el tampón, mayor la proporción de corriente que transportan, menor la migración de las partículas y peor la separación.
  • 58. FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULAS Potencial del campo eléctrico: A mayor potencial del campo eléctrico mayor velocidad de la partícula. Según el método electroforético se elige trabajar manteniendo constante el V o A. Si aumenta el voltaje, aumenta velocidad de separación, pero también la temperatura aparecen efectos indeseables como: desnaturalización de pr, evaporación del buffer, aumento de la fuerza iónica.
  • 59. TIPOS DE SOPORTES El procedimiento electroforético se lleva a cabo sobre dos soportes:: 1. Soportes No Restrictivos: Las partículas colocadas sobre ellos, se separan únicamente en función de su carga eléctrica. Los principales soportes son: Papel – Acetato de Celulosa – Agarosa
  • 60. TIPOS DE SOPORTES 2. Soportes Restrictivos: El soporte ejerce algún tipo de resistencia al desplazamiento de las moléculas de la muestra. La resistencia estará dada por el tamaño del poro del soporte y por el tamaño y características de las moléculas que deben desplazarse sobre el soporte. Los principales tipos de soportes son: Geles de Almidón – Geles de Poliacrilamida
  • 61. ELECTROFORESIS CONVENCIONAL AGAROSA: Es uno de los componentes del agar. Se prepara como un gel de concentración entre 0.5 – 2 gr %. El tamaño del poro es grande y permite el paso de moléculas de peso molecular relativamente alto, por lo cual migran tan solo en función de su carga. Su aspecto claro y transparente facilita la cuantificación por densitometría.
  • 62. ELECTROFORESIS CONVENCIONAL POLIACRILAMIDA Se forman por polimerización de la acrilamida con un agente enlazante. El tamaño del poro varía, según la concentración de la acrilamida y las moléculas puedan ser separadas por diferencias en sus cargas y tamaños. Soporte ideal para obtener mayor y mejor número de separaciones electroforéticas. Se puede leer por densitometría. Permite introducir al gel: SDS, urea y etc.
  • 63. ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
  • 64. ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
  • 65. ELECTROFORESIS CAPILAR POLIMERO POP 4 Soporte restrictivo que permite la separación de moléculas de ADN desde un par de bases en adelante. Se deposita en un capilar de 1 mm de diámetro y este se introduce en un equipo automatizado que posee una placa de calentamiento y un laser que detecta la señal de los fluorocromos.
  • 66. ABI PRISM 310
  • 67. ABI PRISM 310
  • 68. FLUOROCROMOS
  • 69. REALIZACION DE LA ELECTROFORESIS Obtención de la Montaje de la Muestra jeringa Montaje de la muestra Electroforesis capilar Detección por el laser Lectura de electroferogramas
  • 70. ELECTROFEROGRAMA
  • 71. MARCADOR DE PESO MOLECULAR
  • 72. LADDER ALÉLICO
  • 73. PERFIL GENÉTICO