Extraccion Adn Qca Clinica Especializada 2009 Pdf

13,085 views

Published on

Published in: Travel, Business
0 Comments
8 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total views
13,085
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
43
Actions
Shares
0
Downloads
0
Comments
0
Likes
8
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Extraccion Adn Qca Clinica Especializada 2009 Pdf

  1. 1. Laboratorio de Genética EXTRACCION DEL ADN ADRIANA MARIA GIL Z. BIOCIENCIAS Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS LABORATORIO DE BIOCIENCIAS
  2. 2. La prueba de Laboratorio de Genética ADN Los avances de la Genética Molecular han puesto al servicio de la pericia en Medicina Forense y por tanto de la administración de justicia, un sistema de pruebas enormemente seguro, objetivo y eficaz.
  3. 3. La tecnología del Laboratorio de Genética ADN fue utilizada por primera vez como método de identificación genética en el campo forense hace aproximadamente 15 años y con los avances y desarrollo que ha tenido se ha convertido en una herramienta imprescindible en el análisis de los Indicios de interés criminal
  4. 4. EL MATERIAL Laboratorio de Genética GENÉTICO
  5. 5. CROMOSOMAS 46 CROMOSOMAS 23 PARES DIPLOIDES UN INDIVIDUO TIENE 23 CROMOSOMAS HEREDADOS DE LA MADRE Y 23 HEREDADOS DEL PADRE
  6. 6. EL MATERIAL Laboratorio de Genética GENÉTICO Es el responsable de transmitir los caracteres heredados de una generación a otra. Está conformado por millones de unidades de nucleótidos Cada nucleótido esta a su vez formado por: Base nitrogenada, Azúcar y grupo fosfato
  7. 7. EL MATERIAL Laboratorio de Genética GENETICO BN BASES P NITROGENADAS A BN BN ADENINA GUANINA P BN A BN BN CITOSINA P BN TIMINA A
  8. 8. REGIONES Laboratorio de Genética DEL ADN De secuencia única (genes) Medianamente repetitivas Altamente Repetitivas
  9. 9. Laboratorio CROMOSOMA de Genética ADN p HETEROCROMATINA REGIONES REPETIDAS EUCROMATINA GEN q
  10. 10. REGIONES ALTAMENTE REPETITIVAS Laboratorio de Genética SHORT TANDEM REPEATS (STRs) Miles distribuidas a lo largo del genoma Formadas por 2 a 7 nucleótidos Los nucleótidos se repiten varias veces uno tras otro Regiones muy variables (polimórficas)
  11. 11. SHORT TANDEM Laboratorio de Genética REPEATS
  12. 12. SHORT TANDEM Laboratorio de Genética REPEATS STRs Localización Secuencia Tamaño cromosómica ( pb ) D3S1358 3p (TCTA)n 114 - 142 vWA 12p (TCTG)n 152 - 197 FGA 4p (CTTT)n 219 - 167 DYS 391 Y (GCGT)n 210 - 264
  13. 13. D3S1358 Laboratorio de Genética TCTA TCTA TCTA TCTA Alelo 4 TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA Alelo 5 TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA Alelo 6 TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TATA … n Alelo n POLIMORFISMO: Múltiples alelos posibles en la población
  14. 14. Etapas de procedimiento para Laboratorio de Genética Extracción y Purificación de AN Disgregación o fragmentación del tejido Estas etapas Lisis celular deben ir Durante todo el acompañadas de procedimiento se medidas o agentes que debe usar Clarificación inactiven soluciones y nucleasas celulares material estéril, ademas Purificación de guantes Cuantitativo: Cualitativo: Análisis espectrofotometría electroforesis UV
  15. 15. Métodos fragmentación, lisis Laboratorio de Genética celular para extracción de ADN El procedimiento ideal de lisis debe tener la fuerza necesaria para romper el material de inicio (células o tejido) y la delicadeza requerida para preservar las moléculas de interés (ADN o ARN). • Métodos físicos – Homogenización mecánica, •Métodos químicos – Homogenización en solución – Detergentes – Molienda manual en mortero – Bolitas de vidrio – Sonicación •Métodos enzimáticos – Lysozima: rompe enlaces β-1.4- entre N-acetil murámico y N- acetil glucosamina de peptidoglicán de la pared celular de bacterias – Lyticasa: rompe enlaces β-1.3 de glucano de levaduras – Proteasas: rompe enlaces peptídicos de prot. de pared y membrana plasmática e interacciones célula-célula.
  16. 16. Etilen diamino tetracetico (EDTA). •Quelante de iones Mg2+, baja la concentación efectiva de este ión. •Por lo tanto, EDTA inhibe nucleasas y minimiza la degradacion de AN durante la extración/purificación. Amortiguador de pH (7-8). SDS Triton
  17. 17. Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza de Laboratorio de Genética ADN purificado. • Cantidad de material de partida – Número de copias de las moléculas de AN – Cantidad de tejido • Condiciones en las que se encuentra el material de inicio (fresco, congelado, fijado) • Contaminantes e interferentes en el material biológico • Hay un compromiso entre rendimiento/calidad/pureza
  18. 18. APLICACIONES EN GENÉTICA FORENSE Laboratorio de Genética Casos de Filiación Mezcla de Fluidos Agresiones sexuales Violación en serie
  19. 19. AGRESIONES Laboratorio de Genética SEXUALES Se denomina agresión sexual a todo acto que atente contra la libertad sexual de una persona, cometido sin que medie su consentimiento; sea éste con o sin violencia o intimidación.
  20. 20. LA RECOLECCIÓN DE Laboratorio de Genética LA MUESTRA Formulario de envío de muestras Datos de la víctima Datos de la agresión Listado de las muestras de referencia indicios. Cadena de custodia
  21. 21. RECOLECCIÓN Laboratorio de Genética DE LA MUESTRA Datos de la agresión Lugar de los hechos Fecha y hora Tiempo transcurrido entre los hechos y la toma de la muestra Tipo de agresión: vaginal, anal, bucal Número de agresores
  22. 22. MUESTRAS Laboratorio de Genética AGRESIÓN SEXUAL La selección de los indicios biológicos se realizará teniendo en cuenta los antecedentes y datos aportados por la víctima. Es fundamental numerar los hisopos para iniciar el análisis con el primero que se haya recogido.
  23. 23. RECOGIDA DE INDICIOS BIOLÓGICOS Dos tomas bucales Superficie corporal (semen o saliva mordeduras) Peinado de vello púbico (recogida de pelos) Dos tomas cervicales, dos vaginales y una de genitales externos Lavado vaginal
  24. 24. RECOGIDA DE MUESTRAS INDUBITADAS Laboratorio de Genética MUESTRAS INDUBITADAS DE LA VÍCTIMA Sangre Células epiteliales bucales (saliva) Pelos con raíz 10 a 15 vellos púbicos MUESTRAS INDUBITADAS DELSOSPECHOSO Sangre Células epiteliales bucales (saliva) Pelos con raíz
  25. 25. MUESTRAS Laboratorio de Genética EXTRACCION DEL ADN • Sangre • Semen •Diente • Saliva •Tejido • Cabello • Hueso
  26. 26. MUESTRAS PARA Laboratorio de Genética EXTRACCION DEL ADN • Sangre: derivados porfirinicos de la Hemoglobina. • Manchas: secado. • Residuo metanolico: Chelex. • Soportes: Absorbente o no.
  27. 27. REMISION PARA ANALISIS DE POLIMORFISMO MOLECULAR Laboratorio de Genética • La posibilidad de extraer el material genético en cualquier indicio biológico. • Analisis por medio de técnicas como la PCR ,ha permitido obtener ADN a partir de indicios biologicos en cantidades escasas
  28. 28. REMISION DE LAS MUESTRAS PARA ANALISIS DEL ADN • NORMAS DE BIOSEGURIDAD. • CADENA DE CUSTODIA. • FORMATOS EN CASOS ESPECIFICOS.
  29. 29. PROTECCION DEL Laboratorio de Genética PERSONAL • Prevenir contacto directo • Prohibir consumo de comidas y bebidas. • Condiciones de asepsia y material desechable. • Vacunación.
  30. 30. PROTECCION DE LA Laboratorio de Genética MUESTRA • CONTAMINACION POR MATERIAL BIOLOGICO HUMANO. • CONTAMINACION MICROBIOLOGICA. • CONTAMINACION QUIMICA. • TRANSFERENCIA DE INDICIOS BIOLOGICOS.
  31. 31. CONTAMINACION POR MATERIAL BIOLOGICO Laboratorio de Genética HUMANO Depósito de material biológico humano sobre las muestras, con posterioridad a la toma de las mismas.
  32. 32. CONTAMINACION Laboratorio de Genética MICROBIOLOGICA Este tipo de contaminación tiene lugar por el desarrollo de microorganismos y suele estar favorecida por la humedad y las altas temperaturas.
  33. 33. CONTAMINACION Laboratorio de Genética QUIMICA Presencia de productos químicos que dificultan procesos del análisis genético, como PCR y extracción del ADN
  34. 34. TRANSFERENCIA DE INDICIOS BIOLOGICOS. Debido al traslado de los indicios de una localización a otra puede dar lugar a una contaminación o puede ocasionar la pérdida de la prueba.
  35. 35. DEGRADACION DE LAS Laboratorio de Genética MUESTRAS • Humedad ambiental. • Fenómenos meteorológicos, acción de insectos, entre otros. • Recogida y envió al laboratorio de estas evidencias de una manera adecuada para evitar la proliferación bacteriana y por consiguiente la degradación del material genético
  36. 36. DEGRADACION DE Laboratorio de Genética LAS MUESTRAS • Exponer por mucho tiempo las muestras a los rayos ultravioleta provoca daños sobre la estructura del ADN, o aplicar ciertos conservantes que puedan provocar efectos sobre la cadena del ADN.
  37. 37. DOCUMENTOS Laboratorio de Genética NECESARIOS • Formulario de envio de muestras. • Identificacion de Muestras. • Cadena de Custodia.
  38. 38. FORMULARIO ENVIO DE MUESTRAS • Investigacion solicitada: Investigacion restos de sangre. • Antecedentes y datos sobre el caso: Causa de los hechos, lugar, fecha. • Datos de la victima: Edad, sexo, Grupo poblacional, causa de la muerte, relacion con el sospechoso. • Datos del sospechoso:
  39. 39. IDENTIFICACION DE LAS Laboratorio MUESTRAS de Genética • Listado de muestras de referencia: Numero, tipo de muestra, Nombre de la persona, relación con el caso. • Listado de indicios biologicos: numero de referencia, tipo de muestra (toma vaginal), a quien pertenece y localizacion, tipo de indicio a estudiar.
  40. 40. CADENA DE Laboratorio CUSTODIA de Genética • Nombre o identificación, firma. • Fecha y hora de la recogida. • Condiciones de almacenaje de las muestras hasta su envio.
  41. 41. METODOS DE EXTRACCION DE ADN • SALTING – OUT • CHELEX • FENOL - CLOROFORMO
  42. 42. FENOL Laboratorio CLOROFORMO de Genética • Técnica Orgánica (Solventes) • ADN de muy buena calidad y cantidad. • Peptidos y proteinas son extraidas en la fase organica (Fenol), después se realiza digestión con proteinasa K. El cloroformo permite que todo el fenol pueda ser lavado. DESVENTAJAS: - Reactivos altamente tóxicos - Perdidas significativas de ADN y mucho mas si esta degradado.
  43. 43. CHELEX • Resina que previene la degradación del ADN por quelacion de los iones metalicos durante la ebullicion a una concentracion 5%. • La resina de chelex tiene una alta afinidad por iones metalicos polivalentes y esta compuesta de copolimeros de estireno dibenzeno con inones iminodiacetato, los reactivos no son toxicos y no se pierde ADN. DESVENTAJAS: • El ADN aislado es de cadena sencilla, utilizado en PCR pero no en RFLPS.
  44. 44. SALTING OUT Laboratorio de Genética 1. Lisis Celular 2. Extracción 3. Precipitación 4. Resuspensión
  45. 45. Laboratorio de Genética

×