Enzimas De Restriccion Medicina Gbm 2009 Pdf

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Enzimas De Restriccion Medicina Gbm 2009 Pdf

  1. 1. ENZIMAS DEENZIMAS DE RESTRICCIRESTRICCIÓÓNN ADRIANA MARIA GIL ZAPATA MscMsc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS
  2. 2. ENZIMAS DE RESTRICCIENZIMAS DE RESTRICCIÓÓNN Historia: 1953 Luria y Human (Restricción bacteriófagos) 1968, Werner Arber, en Basilea (Enzimas de restricción) 1969 Hamilton Smith, en Baltimore (tipo II) 1972 Mertz y Davis (ADN ligasa) Enzimas Bacterianas Reconocen secuencias especificas: 4-8pb. Endonucleasas. Término: Restricción.
  3. 3. ENZIMAS DE RESTRICCIÒN
  4. 4. SECUENCIASSECUENCIAS PALINDRPALINDRÓÓMICASMICAS EcoRI 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5 ’ hidroliza los enlaces fosfodiéster que unen las bases G y A de cada hebra, de este modo los cortes que crea son escalonados y dan lugar a la formación de fragmentos de ADN cuyos extremos tienen una corta región monocatenaria que resultará complementaria a las de los otros fragmentos.
  5. 5. ENZIMAS ADNENZIMAS ADN RECOMBINANTERECOMBINANTE
  6. 6. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
  7. 7. APLICACIONES DE LA GENAPLICACIONES DE LA GENÉÉTICATICA MOLECULARMOLECULAR TIPOS DE ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
  8. 8. Polimorfismos de longitud dePolimorfismos de longitud de Fragmentos deFragmentos de RestriccionRestriccion (RFLP(RFLP‘‘s)s)
  9. 9. ENZIMAS DE RESTRICCIONENZIMAS DE RESTRICCION TIPO ITIPO I Una sola enzima (multimérica que posee 3 subunidades) reconoce la secuencia específica de ADN, metila y restringe. Pero la restricción no ocurre en el sitio de reconocimiento, sino que es al azar y en sitios distantes al de reconocimiento.
  10. 10. ENZIMAS DE RESTRICCIONENZIMAS DE RESTRICCION TIPO II La restricción ocurre en el sitio de reconocimiento. Estas enzimas tipo II son las utilizadas en genética molecular puesto que permiten romper el ADN en sitios específicos, y así, recuperar secuencias conocidas.
  11. 11. ENZIMAS DE RESTRICCION TIPO II
  12. 12. ENZIMAS DE RESTRICCION TIPO III Es similar al sistema tipo I, utilizan una enzima oligomérica que realiza todas las actividades enzimáticas, y rompen el DNA 25-27 bp, más allá del sitio de reconocimiento.
  13. 13. ENZIMAS DE RESTRICCION Una unidad de enzima se define como la cantidad de la misma que se necesita para cortar 1 g de DNA en 1 hora. Se han identificado más de 200 endonucleasas de restricción. http://www.neb.com/nebecomm/products/category 1.asp
  14. 14. ENZIMAS DE RESTRICCION Las enzimas tipo II, dependiendo de su especificidad, al romper el ADN provocan 2 tipos de cortes: A. Cortes pegajosos, dejando productos con extremos complementarios (cohesivos) Ej: Eco RI y Pst I. B. Cortes Romos (Desoxinucleotidil transferasa terminal).
  15. 15. FRAGMENTOS ORIGINADOS POR LAS ENZIMAS DE RESTRICCION
  16. 16. ENZIMAS DE RESTRICCION
  17. 17. EXTREMOS PEGAJOSOS O COHESIVOS
  18. 18. EXTREMOS ROMOS
  19. 19. CORTES ENZIMAS DE RESTRICCION
  20. 20. SITIOS DESITIOS DE RECONOCIMIENTORECONOCIMIENTO Lambda PhiX174 M13mp18/19 pBR322 pUC18/19 pUC57 pTZ19R/Up BluescriptIIKS
  21. 21. PLASMIDOPLASMIDO pBR322pBR322
  22. 22. APLICACIONES ENZIMAS DEAPLICACIONES ENZIMAS DE RESTRICCIONRESTRICCION Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago. Fragmentar DNA genómico para separación de electroforesis y “Southern Blot”. Generación de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en “Southern”y “Northern” blotting. Generación de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creación de DNA recombinante.
  23. 23. APLICACIONES ENZIMAS DEAPLICACIONES ENZIMAS DE RESTRICCIONRESTRICCION Desarrollo ADN Recombinante y biotecnologia. Mecanismos de regulación y expresión génica. Mapeo y cartografía de genes. Diagnostico enfermedades geneticas con cambio en la secuencia de ADN. Desarrollo proteínas recombinantes.
  24. 24. APLICACIONES DE LA GENÉTICA MOLECULAR ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
  25. 25. APLICACIONES DE LA GENÉTICA MOLECULAR ENFERMEDAD GÉNICA: SITIOS DE RESTRICCIÓN
  26. 26. APLICACIONES DE LA GENÉTICA MOLECULAR ENFERMEDAD GÉNICA GANANCIA O PÉRDIDA DE SITIOS DE RESTRICCIÓN
  27. 27. PCRPCR
  28. 28. PCRPCR ALTA SENSIBILIDAD ALTA ESPECIFICIDAD RAPIDEZ DESVENTAJA: PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA templado específico o productos amplificados previamente)
  29. 29. REACCIREACCIÓÓN EN CADENA DE LAN EN CADENA DE LA POLIMERASAPOLIMERASA CICLOCICLO 1. DENATURACIDENATURACIÓÓNN 90 a 9590 a 95 °° cc 2.2. ANILLAMIENTOANILLAMIENTO 55 a 6555 a 65 °° cc 3.3. EXTENSIEXTENSIÓÓNN 72 ° c
  30. 30. TERMOCICLADORTERMOCICLADOR
  31. 31. Usos de la PCRUsos de la PCR Pruebas de identificaciPruebas de identificacióón (n (STRsSTRs)) DetecciDeteccióón de enfermedades hereditariasn de enfermedades hereditarias DetecciDeteccióón de enfermedad viraln de enfermedad viral ClonaciClonacióón de genesn de genes MutagMutagéénesisnesis dirigidadirigida GenotipificaciGenotipificacióónn de mutaciones especificasde mutaciones especificas ((SNPsSNPs))
  32. 32. PCR ANGIOTENSINOGENOPCR ANGIOTENSINOGENO AGTAGT H20: 1 0 ul Buffer: 5.0 ul MgCl2 : 6.0 ul dNTPs: 4.0 ul Primers: 6.4/6.4ul Taq: 0.2 ul _________ 38 ul + 12 ul ADN.
  33. 33. Buffer D. 37°C.Incubatin Conditions Nocardia corallina.Source 10mM Tris-HCl (pH 7.4), 300mM NaCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.5mg/ml BSA, 50% glycerol. Storage Buffer Store at –20°C.Storage Conditions Restriction Enzyme Usage Information.Protocol •Blue/White Cloning Qualified: Promega's blue/white cloning assay provides a higher level of quality control for enzymes used in cloning applications. Features C▼CATG G G GTAC▲C Descriptin DIGESTICON CON LADIGESTICON CON LA ENZIMAENZIMA NcoINcoI
  34. 34. For site-specific methylation information, consult McClelland, M., Nelson, M. and Raschke, E. (1994) Nucl. Acids Res. 22, 3640–59. Notes Frequency of Cutting Percent Activity in 4-CORE® Buffer System 75–100%100%75–100%75–100%50–75% MULTI-CORE™DCBA 0000204 pBR322M13mp18pUC18ΦX174Ad-2λ
  35. 35. PROTOCOLO DIGESTIONPROTOCOLO DIGESTION NcoINcoI Enzima: 0,2 ul Bufffer : 0,5 ul H20 : 4,3 ul ________ 5,0 ul + 15ul Amplificado
  36. 36. Fragmentos obtenidos de laFragmentos obtenidos de la digestidigestióón de AGT con la enziman de AGT con la enzima NcoINcoI El fragmento del amplificado de AGT sin digerir pesa: 303 pb T: 303 pb M: 211 pb + 92pb El polimorfismo: T174M Resultado de la electroforesis: TT 0.83, TM 0.15, MM 0.02

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