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Diagnostico Molecular De Las Enfermedades Pdf Diagnostico Molecular De Las Enfermedades Pdf Presentation Transcript

  • DIAGNOSTICO MOLECULAR DE LAS ENFERMEDADES ADRIANA MARIA GIL ZAPATA Msc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS
  • VENTAJAS DE LAS TECNICAS DEL ADN • La identificacion por ADN no es muy conocida por los delincuentes. • El ADN esta presente en todas las celulas vivas, y es el mismo independiente de la celula que se trate. • Marcadores geneticos siguen las leyes de Mendel, es posible establecer relaciones de parentesco. • Determinar el sexo de la persona.
  • SNP Databases Database Total SNPs Nº Validados Comentarios Nuevas entradas de SNPs: approx. 11.170.620 2.034.130 NCBI dbSNP 100.000 / mes (Humanos) “Allele Frequency Project“ 1.255.326 55.018 The SNP publicado en Genomics Agosto (Allele frequency (Allele frequency 2005 Consortium project) project) Todos los SNPs han pasado a Celera CDS 4.802.233 3.388.791 dbSNP en septiembre 2005 36 Africanos, Europeaos & ABI Assays on 2.000.000 1.500.000 Asiáticos (validación) Demand 45-60 Africanos, Europeos & Chinos & Japoneses usados en Phase I 500.000 Hapmap Todos validados validación. Phase II 4.600.000 Sequenom Parte del “online assay design 400.000 220.000 RealSNP service”
  • MARCADORES ASOCIADOS A ENFERMEDADES • Signos y síntomas, historia clinica • Análisis clínicos • Análisis molecular - Análisis geonómico y proteomico Origen de diversas enfermedades, cáncer, diabetes, hipertension y patologias cardiovasculares.
  • DOGMA DE LA BIOLOGIA MOLECULAR Flujo de la información puede ir DNA al RNA y de regreso. Información puede ir de una molécula del DNA a otra sin relacionarse con reproduccion sexual. La Biotecnología manipula DNA y RNA y desarrolla los principios en que se basan las tecnicas de biologia molecular.
  • DIAGNOSTICO MOLECULAR • La biología molecular estudia al DNA y RNA: - Estructura - Función. Diagnostico molecular: determina las alteraciones en la estructura o secuencia de los ácidos nucleicos.
  • PROBLEMA DIAGNOSTICO MOLECULAR • Definir cual es la secuencia de ADN que representa la población sana, debido a que existe un gran numero de variantes de la secuencia normal, que no tiene consecuencias patológicas o fenotipicas y solo habla del origen étnico y se les denomina Polimorfismos.
  • CODIGO GENETICO • Es degenerado. • El codon AUG: metionina. • Codones de parada: UUA,UAG,UGA. • Isoleucina: AUU,AUC.
  • SECUENCIACION • La técnica mas importante del diagnostico molecular. • Es el estándar con el que se compara las demás tecnicas. • Tiene un marcaje fluorocromo.
  • SECUENCIACIÓN • Identificación de la secuencia de bases de un determinado fragmento de ADN. • Confirma mutaciones detectadas con otras técnicas (RFLPs)
  • SECUENCIACIÓN
  • CRITERIOS PARA EL DIAGNOSTICO MOLECULAR • Distinguir entre cambios de secuencia con consecuencias funcionales y las que no las tienen. • El cambio en la secuencia será claro cuando la alteración sea homocigota. • Los heterocigotos presentarán mezcla 1:1 • En muestras de tejido la frecuencia con que se encontrara la variante es proporcional a la cantidad de células portadoras que se hallan tomado
  • TECNICAS PARA ESTUDIO DE CROMOSOMAS Obtención de cromosomas en metafase a partir de una célula a los cuales se les realiza tinción con diversos colorantes para generar patrones de bandeo cuya intensidad y distribución son únicas para cada cromosoma
  • FISH • Hibridación con sondas marcadas fluorescentes (fluoresceína, Yoduro de propidio) • Determinar la posición física d un gen o de un marcador genetico a lo largo del cromosoma.
  • FISH
  • DIAGNOSTICO DE ENFERMEDAD GENETICA Mutaciones puntuales Cambio en la secuencia de nucleótidos del ADN original, que no se corrige y por tanto queda incorporado de forma permanente
  • ENZIMAS DE RESTRICCIÓN También conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del ADN a partir de una secuencia que reconocen (palindrómica). Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la célula.
  • ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Tipo I: • Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan). • Cortan lejos de la secuencia de reconocimiento. • Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte. Tipo II: • Sólo tienen actividad de restricción. • Cortan dentro de la secuencia que reconocen. • No necesitan ATP. •
  • ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Tipo III • Tienen actividad de restricción y metilación. • Cortan de 5-8 bases antes o despúes de la secuencia que reconocen. • Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.
  • DIGESTIÓN ENZIMATICA • EXTREMOS PEGAJOSOS
  • POLIMORFISMO DE CADENA SENCILLA DE ADN (SSCP) • Diferencias de secuencia en un fragmento de ADN. 1. PCR con dNTP α radiactivo (33P) 2. Desnaturalización por altas temperaturas 3. Electroforesis de poliacrilamida. 4. Plegamiento de cadenas sencillas (uniones AT y GC)
  • ESTUDIO DE REGIONES PROMOTORAS. • Ensayos de expresión con genes reporteros: La función de la región promotora se mide valorando • La cantidad de mRNA recién transcrito. • La cantidad de proteína codificada. 1. Clonar la región reguladora de interés frente a región estructural de genes proteínas fácilmente detectables
  • ESTUDIO DE REGIONES PROMOTORAS. PROTEINAS REPORTERAS: • Β-galactosidasa. • Cloranfenicol-acil-transferasa • Luciferasa • Proteina verde fluorescente. 2. Cultivo celular 3. Medición de proteina. 4. Técnica SSCP
  • ADN RECOMBINANTE • Permite modificar segmentos de ADN e introducirlos en organismos utilizando vectores.
  • ADN RECOMBINANTE
  • HETERODUPLEX • Mezcla de ADN control y de ADN estudio • Desnatluralización por calor y a reacoplamiento (reannealing) 1. Si no existe mutación sólo se producen homodúplex (cadenas que emparejan todos sus nucleótidos) 2. Si existe la mutación se producen tanto homodúplex como heterodúplex (cadenas que no emparejan 100% puesto que algunos de sus nucleótidos son distintos). • Los homodúplex y los heterodúplex tendrán distintas movilidades electroforéticas. • Se realiza en geles no desnatluralizantes
  • MÉTODO DE LA ROTURA ENZIMÁTICA. (EMC) • Los heterodúplex ADN:ADN se exponen a una endonucleasa tras lo cual los fragmentos se analizan por electroforesis en gel. • Nucleasas de la haba mung y S1, pero este método es muy dependiente de la secuencia y no detecta muchas mutaciones.
  • MÉTODO DE LA ROTURA QUÍMICA. (CCM) • Los nucleótidos desemparejados en los heterodúplex ADN:ADN o ADN:ARN son modificados por agentes químicos (hidroxilamina y tetróxido de osmio ,carbodiimida) que no afectan a los nucleótidos emparejados. • Luego los heterodúplex son expuestos a piperidina que los rompe en los sitios donde hay modificación química. • La localización de la mutación puede deducirse del tamaño de los fragmentos obtenidos. • Se puede detectar mutaciones en fragmentos de ADN de hasta 1499 bp de longitud, con un 90 a 95% de eficiencia.
  • HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS –DNA/DNA –RNA/RNA –DNA/RNA
  • GENERACION DE UNA SONDA TIPOS DE MARCAJE 1. Radioactiva: • dNTPs marcados en posición g con 32P/33P • muy sensible • contaminante • vida media del isotopo 2. No radioactiva: • dNTPs marcados con biotina o digoxigenina menor sensibilidad menor razón señal/ruido • dNTPs marcados con compuestos fluorescentes
  • SOUTHERN BLOT • Transferencia de un DNA denaturado desde un gel a un soporte de filtro donde puede ser hibridizado con una sonda de ADN complementaria • Identificar genes o fragmentos genéticos de un tamaño anormal o ausentes • Identificar mutaciones puntuales
  • SOUTHERN BLOT – Restricción para generar diferentes fragmentos – Electroforesis en geles de agarosa – Denaturación para permitir la union a la membrana nitrocelulosa ( UV, NaOH). – Transferencia al papel de filtro por capilaridad – Hibridización con sonda especifica – Lavados – Visualización de la sonda
  • MICROARRAYS Analiza varios SNPs al tiempo 1. Microarrays de cDNAs: DNAs (cDNA o productos de PCR 0,6-2,4 Kb) son inmovilizados en una superficie solida (nylon o vidrio). Contienen cientos-miles de sondas. Baja densidad de las sondas inmovilizadas. La muestra a hibridar es marcada con radioactividad. 2. . Microarrays de oligonucleotidos: Oligonucleotidos (20-80 pb) son sintetizados sobre una matriz de vidrio o plástico. Contienen 40.000-60.000 sondas. Alta densidad de sondas inmovilizadas (107 copias/punto de siembra).
  • MICROARRAYS
  • MICROARRAYS 1. Aislar RNA (total o mRNA) a partir de una muestra biológica. 2. Convertir el RNA en cDNA utilizando una transcriptasa reversa. 3. Marcar el cDNA con nucleotidos radioactivos o fluorescentes 4. Hibridar el cDNA marcado en el array. 5. Detectar y cuantificar la fluorescencia o la radioactividad. utilizando un confocal laser scanner o un phosphoimager. 6. Analizar los resultados.
  • Rojo (Cy5) MICROARRAYS Verde (Cy3)
  • ESTUDIO DE RNA Cambios en la secuencia genética influye: Capacidad de transcripción de un gen. Disminución de la vida media del mRNA mRNA mas cortos (defecto de splicing) Permite detectar la presencia de un transcrito. Proporciona información de NORTHERN BLOT su tamaño y procesamiento.
  • NORTHERN BLOT 1. Extracción del RNA 4. Generación de una sonda cDNA dATP dGTP dTTP dCTP pGEM-T 2. Electroforesis del RNAs 5. Hibridación 6. Visualización mRNA silvestre 3. Transferencia a membrana Luz UV, calor
  • NORTHERN BLOT ELECTROFORESIS DEL RNA En geles de agarosa En condiciones desnaturalizantes(formaldehido/formamida) 28S 4,8 Kb 18S 1,8 Kb • El gel es teñido con bromuro de etidio y el RNA visualizado en un transiluminador UV • Integridad del RNA: presencia y proporcion de los RNA (28 y 18S) • Concentración del RNA: A260 x dilución x 40 = mg/mL
  • ENFERMEDAD MULTIFACTORIAL • Busqueda de genes de suceptibilidad • Asociación a polimorfismos genéticos
  • LIGAMIENTO GENETICO • Permite identificar el sitio cromosómico donde reside el gen causal de la enfermedad. • Seguir la segregación de un marcador (microsatélites) con localización conocida e identifica la cosegregación de determinado alelo con el padecimiento. • Definir si un gen conocido es el causante de la enfermedad genética.
  • INESTABILIDAD DE MICROSATELITES • Tamizaje de individuos con cáncer • Evalúa la variación de tamaño de secuencias microsatélites • utiliza muy poca cantidad de ADN • Tiene una alta resolución • Es muy reproducible
  • MUTAGÉNESIS DIRIGIDA • La manipulación genética de proteínas implica la manipulación de DNA • En general, podemos modificar genéticamente una proteína: • i)cortándole un trozo, ii)añadiéndole un trozo, • iii)fusionándola con otra • proteína, • iv) cambiándole específicamente unos cuantos residuos aminoacídicos.
  • Daría todo lo que sé, por la mitad de lo que ignoro. René Descartes