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Determinaciones de laboratorio cocaína-marihuana
 

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    Determinaciones de laboratorio cocaína-marihuana Determinaciones de laboratorio cocaína-marihuana Document Transcript

    • Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de ToxicologíaCapítulo 16Investigación de Drogas de Abuso y Productos deCorteDr. Luis Alberto FerrariPerito I del Cuerpo Químico Forense. Profesor de Química Forense en la Universidad deMorón.Esquema Analítico para la identificación de cocaína pura o adulteradaIntroducciónEl esquema analítico que se utiliza para la identificación de cocaína pura o adulterada se ajustaa determinar la composición cualitativa de una sustancia que, por su aspecto, puede serclorhidrato de cocaína pura o con otros componentes de uso común que actúan comoadulterantes. Este esquema de identificación sufre modificaciones periódicas para considerar laincorporación de nuevas sustancias utilizadas como adulterantes.En la actualidad no se registra el agregado de sustitutos atípicos del clorhidrato de cocaínacomo anestesina, novocaína, ácido bórico. Se comprueba usualmente la presencia de xilocaína(Lidocaína). En la práctica, los sustitutos o adulterantes no deben aumentar el precio delproducto destinado al consumo y lo frecuente es que sean mucho más baratos. Entonces, porrazones de competencia y a fin de retener o aumentar un grupo consumidor estable, seobserva una tendencia a reducir el precio del producto reemplazando los clásicos anestésicoslocales por azúcares (glucosa, lactosa) y ocasionalmente, sacarosa, en proporciones variables.En nuestro medio los Profesores Guatelli, M y García Fernández, JC han ofrecido un métodode análisis tal como se consigna a continuación.Ensayos para la determinación de cocaína:Ensayo de solubilidadEs importante que en este ensayo se disponga de una muestra homogénea. Con frecuencia seobserva un polvo blanco y fino, con grupo en número y tamaño variable por la presencia deporciones húmedas. En estos casos debe pulverizarse la muestra, fraccionarla – si essuficiente – en un mortero común de capacidad adecuada, separando con una espátula elmaterial que se adhiere al mortero. El producto pulverizado se tamiza para separar laspartículas más gruesas que se reducen a polvo fino nuevamente mediante mortero. Una vezobtenida la pulverización de toda la muestra, se la ubica en un recipiente plástico de tapa arosca y de boca ancha que se agita durante un tiempo según el volumen de polvo, hastadisponer de un producto homogéneo.Se realiza una observación a simple vista y con magnificación adecuada como una lupa comúny siempre que el producto sea homogéneo en su aspecto, se obtiene una fracción adecuada, lacual se coloca en un tubo de ensayo limpio y seco disolviéndola en 1 o 2 ml de agua destilada.Se agita y se observa si la muestra se disuelve total o parcialmente, pudiéndose agregar unnuevo volumen de agua destilada para certificar la presencia de un agregado de bajasolubilidad o insoluble.La solubilidad de la cocaína base en agua destilada, según Clarke (1969) es de 1:1300,mientras que la del clorhidrato de cocaína en agua destilada es de 1:0,5.Reacción de la solución acuosaDel ensayo anterior se toman unas gotas del sobrenadante en un vidrio reloj y se registra lareacción con papel de pH. Las soluciones de clorhidrato de cocaína pura o en mezclas conadulterantes neutros son ligeramente ácidas, mientras que el agregado de bicarbonato desodio confiere una reacción ligeramente alcalina (pH 8). Los preparados que contienen sulfato 255
    • Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de Toxicologíade cocaína, presentan un pH ácido neto, de acuerdo con el grado de hidrólisis de la sal. Lacocaína base en agua destilada presenta un pH entre 8 y 8,5.ComentariosEl ensayo de solubilidad y la reacción de la solución acuosa tienen importancia porquepermiten inferir la probable existencia de ciertos compuestos, poco o relativamente solubles,que resultan de utilidad cuando se tratan de sustancias que se utilizan para purificar la cocaínao agregarse a la misma para su desnaturalización. Por otra parte, la cocaína salificada puedecoexistir con ciertos adulterantes solubles que no inciden en el pH como azúcares reductores ysacarosa.El ácido bórico – que aparece asociado en ocasiones a otros adulterantes – es un ácido débil ysi bien el aspecto de los cristales (no del producto amorfo) es coincidente con el del la cocaínapor formar escamas blancas delgadas y de aspecto nacarado, no puede agregarse más decierta proporción por su baja solubilidad en frío (4 % a 18 C°) . Además, sus efectos nocivoslimitan su uso como sustituto del clorhidrato de cocaína. En muchos países el uso de ácidobórico está prohibido incluso como preservador de alimentos.Reactivo de Draggendorff:El ensayo se realiza agregando una o dos gotas de reactivo a 1 o 2 ml de la solución ainvestigar. En presencia de alcaloides se obtiene un precipitado de color rojo a rojo naranja.Este reactivo por dilución se altera y precipita aún en ausencia de alcaloides, si la dilución esmayor se separa triyoduro de bismuto de color negro. Este reactivo produce un precipitado conotros compuestos de estructura más simple. Para asignarle valor en los ensayos genéricosdeben obtenerse respuestas positivas también con los restantes reactivos.Reactivo pícrico:Es una solución saturada de ácido pícrico. Es el menos sensible de los reactivos que integranel grupo. Soluciones diluidas de los alcaloides suelen dar respuestas negativas de tal maneraque, mientras los tres restantes dan positivo, la solución pícrica no responde al ensayo. Tieneaplicación en microcristalografía ya que produce formas típicas con ciertos alcaloides ensoluciones puras o en presencia de sustancias no interferentes.Identificación del ión cloruroLa mayoría de los alcaloides se presentan en forma de clorhidrato, solubles en agua destiladafría. Este anión se identifica mediante el ensayo clásico con nitrato de plata en medio nítrico.Técnica:En tubo de ensayo limpio colocar una pequeña cantidad del producto y disolver en 2 o3 ml de agua destilada, acidificar con unas gotas de nítrico puro y agregar gota a gota unexceso de solución de nitrato de plata al 5 %, aparece precipitado blanco, caseoso. Si sequieren efectuar ensayos complementarios para certificar la naturaleza del precipitado (AgCl),deberá eliminarse el alcaloide porque de lo contrario interfiere (en caso de comprobar lasolubilidad del AgCl con amoníaco precipita el alcaloide en su forma básica).En ocasiones se ha observado, al agregar el ácido nítrico, un color azul que cambia deinmediato al rosado o violeta claro, imputable a la presencia de Dipirona.Identificación del ión sulfatoA un pequeño volumen de la solución del alcaloide agregar agregar 2-3 gotas de ácidoclorhídrico puro, calentar a ebullición y agregar gota a gota, un ligero exceso de soluciónacuosa de cloruro de bario al 10 %. Aparece precipitado blanco en presencia del ión sulfato.Identificación de derivados aril-amínicosEn esta denominación se incluyen los anestésicos locales (sustitutos de la cocaína) con grupoamino libre (Novocaína, Procaína, Benzocaína). La xilocaína o clorhidrato de Lidocaína noresponde al ensayo por tener uno de los hidrógenos sustituidos (-NH- en lugar de –NH2). Elgrupo amino libre se halla en posición para con respecto a los otros sustituyentes del núcleobencénico. El reactivo es una solución de p-dimetilaminobenzaldehido 1 % (1 g de PABA en100 ml de etanol 96°, acidificada con 20 gotas de ácido sulfúrico). El reactivo es estable y setolera hasta un débil color amarillo. Debe tomarse en cuenta que el agregado de ácido sulfúrico 256
    • Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de Toxicologíaintensifica el color amarillo del reactivo de tratarse de droga adulterada. Con todo, el contrastees neto en presencia de un sustituto con grupo amino libre.Técnica: En placa de toque colocar unos centigramos de la muestra y agregar una o dos gotasde reactivo. Aparece de inmediato un color amarillo intenso que adquiere color naranja segúnla proporción del sustituto. Como alternativa en lugar del reactivo indicado puede utilizarse unasolución acuosa reciente del ácido 1,2 naftoquinon-4-sulfúrico al 5 % con el cual se obtiene uncolor rojo. El reactivo es inestable por lo que debe prepararse en la cantidad necesaria para elmomento de la prueba.Investigación de azúcares reductoresEl agregado de azúcares reductores es una adulteración frecuente. Se emplean conpreferencia glucosa o lactosa.Técnica: en un tubo de ensayo colocar una pequeña fracción de la muestra homogénea y 4 a 5ml del reactivo de Benedict (17,3 g de sulfato de cobre penta hidratado, 173 g de citrato desodio, 100 g de carbonato de sodio anhidro completando a 1 Lt con agua destilada) calentar aebullición y mantener esa temperatura unos minutos. Una reacción positiva pone en evidenciaun color verde que de inmediato se transforma en color rojo ladrillo por precipitación de óxidode cobre (I).Comentarios: durante el calentamiento a ebullición se puede observar la separación de unlíquido oleoso que se proyecta por las paredes del tubo y que vuelve al seno del líquido alsuspender el tratamiento. Si se coloca una cantidad mayor de muestra, por enfriamiento sesepara un producto sólido blanco que generalmente se asienta sobre el reactivo. Dichoproducto es la cocaína separada por la alcalinidad del reactivo y el líquido oleoso que es lacocaína base en estado líquido (t.f: 97-98 C°). El clorhidrato de cocaína no funde a unatemperatura inferior a 197 C°.En la adulteración de la cocaína con azúcares reductores se realiza la identificación conespectrofotometría infrarroja.Investigación de ázucar comúnSe trata de un adulterante ocasional. El azúcar común cristalizado se observa a simple vista,finalmente pulverizado se adapta mejor como adulterante. Como la sacarosa no es reductora,se procede a una hidrólisis previa, para los ensayos del poder reductor de los azúcaresresultantes.Técnica: en un tubo de ensayo limpio colocar una fracción de la muestra junto con 5 ml deácido sulfúrico al 5 %, calentar suavemente a ebullición utilizando un broche de madera yconcentrar el líquido ácido hasta aproximadamente la mitad, dejar enfriar y agregar enpequeñas fracciones carbonato de sodio en polvo hasta obtener un precipitado blanco porprecipitación o separación de cocaína base no degradada (de reacción alcalina) e incorporar elreactivo de Benedict, procediendo como en la técnica para identificar azúcares reductores.Comentarios: la investigación de azúcar común se ha realizado en muy contadas ocasiones,otorgándose preferencias a las hexosas (glucosa o lactosa) en la adulteración de cocaína conazucares que aparecen en nuestro medio.Investigación de ácido bóricoEl ácido bórico cristalizado forma escamas incoloras de brillo perlado, solubles en agua en unaproporción del 4% a 15 – 18 C°. La solución acuosa presenta reacción levemente ácida. Elácido bórico cristalino se usa en la adulteración del clorhidrato de cocaína puro, cristalino, perocuando el producto fraccionado se ofrece en forma pulverulenta, se adultera con ácido bóricoamorfo. Existen varios procedimientos descriptos para la determinación de ácido bórico. Unprocedimiento práctico y simple se basa en la formación del éster metil bórico.Técnica: en una cápsula de porcelana de 5 a 6 cm de diámetro, escrupulosamente limpia yseca, colocar una fracción de la muestra y alrededor de 10 -15 ml de alcohol metílico p.aligeramente con ácido sulfúrico. Colocar la cápsula en un ambiente oscuro e inflamarla. Deinmediato se observa un color verde por formación del borato de metilo que generalmente,prevalece sobre el color azul de la llama producida por la combustión del metanol. No se hanregistrado interferencias en este ensayo. Pequeñas cantidades de ácido bórico originan uncolor nítidamente perceptible en la oscuridad. 257
    • Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de ToxicologíaEnsayos de identificación para cocaínaSe dispone de varios procedimientos para la identificación de cocaína. Se cuenta con el ensayode color en fase orgánica, ensayo de olor por formación de benzoato de metilo y cromatografíaen capa delgada (TLC).Ensayo de color:El ensayo de Scott aprovecha la formación de un complejo de color azulado con el tiocianatode cobalto. Son interferencias la xilocaína, butacaína, fenciclidina y metapireno. Si se agrega ala reacción anterior gotas de HCl concentrado y luego cloroformo, la fase orgánica adquirirá unintenso color azul, no reaccionando los interferentes. El mecanismo de la reacción esdesconocido.Ensayo de olor:Se basa en la hidrólisis de la cocaína por tratamiento con hidróxido de potasio en mediometanólico. Aprovecha la formación de benzoato de metilo de un olor característico detectablea concentraciones bajas. Tiene una sensibilidad y especificidad muy superiores a muchos delos ensayos indicados para cocaína.Cromatografía:La TLC es una técnica analítica ampliamente utilizada en cualquier laboratorio de toxicologíaanalítica. A través del tiempo se ha optimizado su utilización, destacándose su bajo costo,rapidez y confiabilidad.Se han propuesto diversos solventes para el desarrollo. Se ha propuesto un sistema queresuelve bien la lidocaína. En los sistemas tradicionales esta no se separa convenientemente yademás, debido a la falta de reactividad de los anestésicos arilamínicos, puede interpretarseerróneamente las manchas que se puedan visualizar.El solvente de corrida consiste en una mezcla de cloroformo: acetona: amoníaco 40:60:III.Como revelador se utiliza una solución de iodoplatinato de potasio (45 ml de ioduro de potasioal 5%, 5 ml de cloruro de platino 5 % y 100 ml de agua destilada).La Comisión de Expertos de las Naciones Unidas ha establecido que el criterio de identidadpara las drogas de abuso es la elección mínima de dos parámetros analíticos independientes ydice textualmente: “En cualquier caso concreto, al seleccionar estos dos parámetros deberátenerse en cuenta la droga en cuestión y los recursos de laboratorio de que disponga elanalista. Por ejemplo dos sistemas no correlacionados de TLC se contarían como dosparámetros. En este contexto, dos sistemas no correlacionados de TLC significan que lossistemas de solventes o la fase estacionaria son completamente distintas”.La cromatografía gaseosa y la HPLC también son técnicas que se adaptan bien al análisis deuna muestra de cocaína.Aislamiento, purificación e identificación de cocaína proveniente de materialesbiológicos (sangre, orina, vísceras y saliva)El aislamiento de cocaína a partir de tejidos humanos pueden efectuarse mediante los métodostradicionales basados en la desecación con sulfato de sodio anhidro de las vísceraspreviamente desmenuzadas y posterior extracción etérea y clorofórmica; precipitación proteicacon sulfato de amonio, etc. Debe tenerse especial cuidado con la temperatura (mayores a 45C°) ya que la cocaína es termolábil.Actualmente, estos métodos de aislamiento están siendo reemplazados por la extracción enfase sólida (SPE), que consiste en la retención del analito de interés en un relleno basado enpartículas de sílica modificada dentro de una columna plástica. Son muy utilizadas las de C-2,C-4, C-8, C-18 o mezclas de rellenos no polares, medianamente polares o polares. La ventajaen el uso de esta metodología radica en los altos porcentajes de recuperación, obtención deeluatos puros, disminución del tiempo de trabajo y ahorro de reactivos.Investigación en bebidas analcohólicas:Técnica: En cápsula de porcelana colocar 50 a 100 ml de la bebida en estudio, calentar a bañoMaría con agitación periódica para eliminar el CO2, enfriar y trasvasar a una ampolla de 258
    • Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de Toxicologíadecantación controlando la reacción que debe ser ácida (incorporar HCl si fuera necesario). Acontinuación, extraer con cloroformo (20 ml) agitando enérgicamente unos minutos, dejarseparar las fases, decantar y proseguir con la fase acuosa ácida. Tratar dicha fase concantidad suficiente de NH3 puro hasta reacción alcalina y luego extraer la cocaína base con 15ml de cloroformo. Dejar separar las fases, filtrar la fase clorofórmica por sulfato se sodioanhidro y concentrar a menos de 45 C°. Utilizar este extracto redisuelto en cloroformo para suanálisis cromatográfico o en HCl al 1 % para reacciones de precipitación.Estudios en sangre y orina:La sangre, orina y saliva pueden ser procesadas por los métodos SPE de fase unida o biencolumnas con rellenos hidrofílicos del tipo Extrelut (Merck). La técnica es sumamente sencilla ylos resultados satisfactorios.En el caso de orina existen en la actualidad placas o tiras reactivas comerciales basadas enmétodos inmunológicos y que no requieren del aislamiento del analito.Este método es rápido, requiere de poco muestra y posee muy buena sensibilidad. Sinembargo está sujeto a reacciones cruzadas y los resultados positivos deben ser confirmadosmediante un método analítico instrumental de óptima sensibilidad para detectar niveles bajosde la droga madre y sus metabolitos.Algunos estudios que se han efectuado en humanos indican que si una muestra de orina esrecolectada luego de un lapso superior a 12 hs desde el momento de consumo, muy pocacantidad o nada de cocaína será detectada. Es decir, si la cocaína es detectada en orina, seadmite que su administración se produjo hasta 12 hs antes de la recolección de la muestra.Este período se toma sólo como referencia ya que depende de numerosos factores, muchos deellos individuales. La benzoilecgonina – principal metabolito – puede ser detectada hasta 36 hsdespués de la administración de cocaína y permanece en concentraciones muy bajas hasta las60 hs. En orina, se puede encontrar entre el 1-9 % como cocaína sin metabolizar y entre 35 al54 % como benzoilecgonina.En cuanto a la sangre, se debe considerar la acción de enzimas sobre la cocaína que ladegradan y la ventana corta de detección de solo algunas horas en muchos casos. Lapreservación de la muestra es importante ya que se ha informado que cocaína intacta enmuestras hemáticas deficientemente resguardadas pueden transformarse in situ encompuestos como los producidos por biotransformación endógena, tal comoecgoninametilester o benzoilecgonina.La preservación de la muestra a baja temperatura, pH 5 y agregado de 2% de fluoruro de sodioestabiliza la cocaína en sangre pudiendo permanecer hasta 200 días sin transformaciónquímica dentro del reservorio (Insenschmid, 2004).Cromatografía gaseosa (GC-FID)(Técnica utilizada para el entrenamiento de Naciones Unidas, 1989)Técnica:Columna 2m, d.i. 2 –4 mm, SE – 30, OV –17.Gas portador nitrógeno 30 ml / minuto.Detector FID (detector de ionización por llama) Hidrógeno a 30 ml/min, aire 450 ml/min.Condiciones de trabajo Temperatura del inyector: 220 C°. Temperatura del horno: 220 C°. Temperatura del detector: 300 C°.Patrón interno: n- tetracosano o tetrafeniletileno.Agente derivatizante: N-O bis- trimetilsililacetamida o N-metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida(MSTFA).Cromatografía líquida de alta presión (HPLC):Técnica:Columna: 160 mm, d-i: 5 mm.Material de relleno: Octadecil-Si, diámetro de partícula 5 m.Fase móvil 259
    • Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de ToxicologíaEluyente A: Metanol (300 ml), agua (700ml), 1 % ácido fosfórico (v/v), n-hexilamina (10,71 g/ 14ml pH 2,5).Eluyente B: Metanol (1000ml), 1 % ácido fosfórico (v/v) n-hexilamina (10,71 g/ 14 ml pH 2,8).Detector UV 230 nm.Cannabis y sus componentesAnálisis físico de los productos de Cannabis.Los características microscópicas de Cannabis sp., permiten reconocer por técnicasmicrográficas el material que puede estar finamente particulado o en grandes trozos. Losabundantes tricomas presentes en los distintos componentes de la planta (hoka, subunidadesfloridas y frutos) son los elementos histológicos más importantes para distinguir la Cannabissativa. Se reconocen también pelos cistolíticos unicelulares y tricomas o pelos glandulares. Lospelos glandulares pueden observarse como glándulas sésiles, pequeños tricomas glandularespluricelulares (con pie y cabezuela).Ensayos presuntivosSe trata de reacciones presuntivas adecuadas para realizarse en terreno, de manera de poderdescartar “a priori” el estar en presencia de material proveniente de Cannabis.Reacción con Fast Blue:La reacción se fundamenta en la reacción de copulación de los canabinoides con Fast Blue Bformando un compuesto de color púrpura intenso. Se utilizan dos papeles de filtro de manerade retener en el primero compuestos fenólicos que se encuentran en Cannabis y que interfierencon la reacción produciendo falsos positivos.Con dos papeles de filtro se forma un embudo realizando cuatro dobleces en forma adecuada.Se coloca una pequeña cantidad pulverizada de la planta o resina en el centro del papel. Seañaden dos gotas de éter de petróleo de modo que penetren en el papel de filtro inferior,dejando secar el papel de filtro inferior. Se deposita una pequeña cantidad de Fast Blue Bsólido en el centro del papel inferior. Se añaden dos gotas de agua al reactivo y se extiende lamezcla sobre el papel con una espátula.Si aparece un color púrpura, se está en presencia de canabinoides. Se recomienda no usar elreactivo en exceso para evitar el amarronamiento de la mancha.Ensayo de Duquenois-Levine:La prueba puede realizarse sobre material pulverizado o sobre su extracto. Este se obtiene dela siguiente forma: 100 mg de muestra se extraen con éter de petróleo. Filtrar y evaporar encápsula hasta sequedad.Se coloca una pequeña cantidad del material sospechoso o su extracto. Se agregan 2 ml delreactivo preparado con acetaldehído y vainillina en etanol al 95 % agitando 1 minuto. Seañaden luego 2 ml de HCl conc por los bordes del tubo, dejando en reposo durante 10 minutos.En presencia de cannabinoides aparece en la interfase una gama de colores: verde, azul yvioleta. Puede extraerse en fase clorofórmica observándose color violeta.Cromatografía en capa delgadaTiene por objeto poner de manifiesto los componentes canabinoides más importantes: CBD,THC y CBN. La siembra se hace a partir de un extracto obtenido con el contacto de una horadel material con acetato de etilo que luego se concentra por calentamiento en baño maría.Como fase estacionaria se utiliza Sílica Gel G con indicador de fluorescencia a 254 nm.Respecto a la fase móvil se han propuesto muchas mezclas de las cuales dos que ofrecenresultados satisfactorios son éter de petróleo: éter etílico 80:20 y benceno: n-hexano:dietilamina (75:30:5). Como fase móvil se utilizará una mezcla acetato de etilo: metanol:amoníaco 90:10:II. El agente revelador es Fast Blue B en agua destilada al 1 % y posteriorexposición a vapores de amoníaco. Este revelador tiene un límite de detección deaproximadamente 0,5 g. 260
    • Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de ToxicologíaDetección de productos canábicos en sangreAlgunos investigadores han informado la dificultad de obtener muestras de sangre de sujetosfumadores ya que los mismos evitan ser identificados. En los casos en que esto es posible seprocede de la siguiente manera:Técnica: A 5,0 ml de sangre total se adiciona 1,0 ml de ácido tricloroacético al 10 % luego seagrega 10 ml de n-hexano y después de agitación durante varios minutos se calienta a reflujodurante 30 minutos.Dejar enfriar, centrifugar, separar y reservar la capa orgánica. Con el resto se realiza unasegunda extracción utilizando el mismo volumen de solvente. Las dos fracciones orgánicasreunidas se lavan con 10 ml de solución acuosa saturada de NaCl, se secan con sulfato desodio anhidro, se concentran a presión reducida hasta obtener un volumen aproximado de 0,5ml. La concentración debe realizarse a temperatura ambiente para reducir la pérdida decompuestos volátiles. Sobre el extracto final se efectúan ensayos cromatográficos en capadelgada o CGL.Cromatografía gaseosa (CG-FID)Es utilizada fundamentalmente con fines cuantitativos. Las condiciones de trabajo puedenresumirse a continuación:Detector FID (ionización de llama) H2: 30 ml/min, aire 300 – 450 ml/minColumna 2 m, d.i. (2 – 4) mRelleno 3 % OV – 17, SE – 30, OV –1Gas portador N2 a 30 ml/min.Condiciones de trabajo: Temperatura inyector: 270 C° Temp. Horno: isotérmica 240 – 260 C°Patrón interno: n-tetradecano, tetracosano.Canabinoides en salivaHasta hoy no se ha encontrado una correlación entre la concentración plasmática de THC ensangre y saliva. Pese a ello, se han observado niveles similares o superiores de THC en salivarespecto al plasma de individuos fumadores de marihuana. Se sugiere que las concentracionesde THC informadas en saliva provienen de un alojamiento o secuestro de la misma en lacavidad bucal durante el fumado.El resultado positivo en este fluido permite detectar la droga psicoactiva por un tiempo másprolongado que en sangre. Si bien no se tiene gran información acerca de los metabolitos decanabinoides en saliva, se estima que el derivado carboxilado puede provenir del mismo actode fumado o bien del metabolismo bucal. Por otra parte, se ha observado que la ingestión dealimentos y bebidas comunes no interfieren en la detección de canabinoides en saliva.Canabinoides en orinaEs el medio que permite detectar estos compuestos por un tiempo más prolongado (5 a 20dias) dependiendo de la dosis y frecuencia de uso. Como resultado de la biotransformaciónoperada en el hígado, el THC es convertido, a través de varios intermediarios, en 11-nor- 9- -THC carboxílico en orina.Actualmente se utilizan tiras reactivas o placas comerciales basadas en técnica inmunológica.El resultado positivo debe ser confirmado mediante un método analítico independiente.Debe tenerse en cuenta que los valores de corte para estas estructuras se hallan en el ordende los nanogramos, por lo que se deben extremar los cuidados en la fase de aislamientocuando se debe confirmar el resultado obtenido por la vía del ensayo preliminar.Técnica: colocar 5,0 ml de orina en tubo de centrífuga de 15 ml. Adicionar 0,5 ml de solución deHONa 1 N. Incubar en baño de agua a 50 – 60 C° durante 15 minutos. Enfriar y acidificar conHCl 1N. Agregar 5 ml de n-hexano agitando suavemente durante 20 minutos. Centrifugar a1000 g durante 5 minutos. Transferir la fase orgánica con la ayuda de una pipeta Pasteur a otrotubo y evaporar a temperatura ambiente mediante corriente de aire seco. 261
    • Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de ToxicologíaResuspender el residuo con 3-4 gotas de una mezcla de cloroformo-metanol (3:1) y sembrar enplacas cromatográficas de alta resolución (HPTLC) conjuntamente con los respectivospatrones. Desarrollar con el sistema n-heptano:n-butanol: ácido acético glacial 90:9:1 en unacuba saturada durante 15 minutos. O bien el sistema Eter Etílico: eter de petroleo (2:8) Secar laplaca a temperatura ambiente y revelar rociando con dietilamina seguido del reactivo Fast BlueBB al 0,1 % en agua-metanol (9:1). Esperar 10 minutos, observar y rociar nuevamente condietilamina.GHB (Gamma hidroxi butirato)Es un eficaz agente depresor del sistema nervioso central e hipnótico, no obstante su bajapotencia. A pesar de su escasa aplicación en terapeútica, se lo está utilizando en la actualidadcomo droga objeto de uso indebido.Como droga de abuso es asequible en forma sólida o líquida. A principio de 2000 la comunidad científica comenzó a prestar atención en esta droga, que se ha popularizado rápidamente, principalmente en Europa y Estados Unidos. Hasta hoy en nuestro país su consumo ha sido escaso. El GHB es usado por fìsico-culturistas como alternativa a los esteroides anabólicos con el objeto de aumentar la masa muscular. Otros lo utilizan en circunstancias recreacionales por los comprobados efectos de euforia, deshinibición y sedación. El mecanismo de acción no ha sido dilucidado completamente hasta hoy, si embargo sesabe que atraviesa rápidamente la barrera hematoencefálica. Algunos investigadores seencuentran estudiando en la actualidad su posible acción neurotransmisora y/oneuromoduladora. Se acepta que altera la actividad dopaminérgica, dependiendo de la dosisincorporada. La toxicidad del GHB se caracteriza por nauseas, vómitos, sudoración profusa,incontinencia, disturbios visuales, ataxia, bradicardia, hipotensión; respondiendo así a losclásicos efectos colinérgicos. La depresión respiratoria puede ser severa al igual que el gradode inconciencia; esto dependera de la respuesta particular del individuo. Las respuestas deletereas varían según la susceptibilidad del individuo. Hay quienescon dosis de 10 mg/Kg presentan amnesia e hipotonía; otros requieren mayores dosis. Engeneral la euforia se adquiere con dosis aproximadas a los 25 mg/Kg. Se ha informado que laincorporación de 60 mg/Kg o más ha provocado coma e inconciencia permanente que aparecea los 30-40 minutos de incorporada la droga. Los efectos del GHB aparecen en general a los 10 minutos y el pico máximo en plasmaaparaece entre 20-45 minutos. Los efectos duran entre 2-5 horas aunque dependen de ladosis. Incorporación de concentraciones altas pueden llevar el efecto a 6 horas de duración. Generalmente provocan tolerancia con el uso consuetudinario.Eliminación de GHB Luego de una dosis intravenosa el GHB sigue una eliminación de orden “0, por lo queno tiene en realidad una vida media y por tanto el tiempo requerido para eliminar la mitad deuna dosis se incrementa con la dosis consumida. Generalmente se eleimina rápidamente, haciendose indetectable en plasma a las 8horas y en orina a las 12 horas (Hoes et al, 1980). A continuación pueden observarse los resultados hallados por Kintz, 2005. Aquínotamos que el autor detecta hasta las 6 horas GHB en sangre, mientras que en orinaencuentra valores considerables hasta las tres horas y prácticamente indetectable a partir delas 6 horas. 262
    • Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de ToxicologíaExcreción de GHB en sangre (Kintz, 2005)Excreción de GHB en orina (Kintz, 2005)Analítica toxicológicaEl GHB es una molécula polar de muy difícil aislamiento desde los tejidos o humores. Algunosautores prefieren extraerla como butirolactona (GBL) ajustando el pH y posteriormentederivatizándola para el análisis mediante GC-FID o GC-MS.El método que exponemos a continuación no requiere la conversión a GBL y se derivatizaquímicamente por sililación.Extracción de GHB en orina mediante técnica SPE (Telepchak et al, 2004) 1. Se toman 200 l de orina, agregando el estándar interno (GHB-d6) y 100 l de buffer fosfato 0.1 M; pH 6.0. Mezclar y aplicar en Vortex. 2. Utilizar columna SPE con sorbente CLEAN SCREEN ZSGHB020, conteniendo 200 mg de partículas de sílica de fase unida. 3. A continuación se aplica 3 ml de metanol p.a, seguido de 3 ml de agua deionizada y o.5 ml de buffer fosfato. 4. Introducir la muestra en el cartucho plástico del sorbente y comenzar la aspiración bajo el sistema de cámara de presión. Tomar la muestra filtrada en tubos adecuados dentro de la cámara. 5. Lavar la columna con una mezcla de metanol-amoníaco(99:1) 6. Evaporar a 60°C o con corriente de nitrógeno. 263
    • Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de Toxicología 7. Agregar 200 l de dimetilformamida y 1 ml de hexano saturado con dimetilformamida, mezclar por inversión durante 5 min. Centrifugar a 3000 rpm Transferir la capa inferior de dimetilformamida a un tubo limpio. 8. Evaporar a 50°C utilizando corriente de aire o nitrógeno. 9. Agregar 100 l de acetato de etilo + 100 l de BSTFA (con 1% TMCS). Mezclar o agitar en vortex. No se requiere calor. 10. Inyectar 1-2 l de muestra en el instrumental GC.Iones monitoreados GHB-diTMS 233, 234, 235 GHB-D6-diTMS: 239, 240, 241Couper & Marinetti, 2002, consignan otras metodologías mediante cromatografía líquida dealta presión (HPLC), además de otras técnicas en cromatografía gaseosa.Interpretación de resultados:Debe tenerse gran precaución en la interpretación de los hallazgos de laboratorio, ya que estees producido en forma endógena postmortem; más aún si existió sobrevida luego de la ingestade GHB que pueden arrojar concentraciones similares a las producidas luego del óbito. En estecaso la diversidad de matrices biológicas recolectadas puede ayudar a la interpretación (porejemplo: humor vítreo, líquido cefalorraquideo y orina).Datos aportados por investigadores sobre niveles de GHB en organos o humores de individuosno expuestos a GHB pueden facilitar la interpretación (ejemplo: en humor vítreo se hainformado niveles de 1-6 mg/L en ocho casos postmortem).Por último hacemos hincapié en la preservación del espcimen a temperaturas menores a los0ºC y el envío urgente del material al laboratorio en caso de sospecha de consumo de GHB.DETERMINACIÓN DE ANFETAMINAS Y DERIVADOS ANFETAMINICOS DE ANILLOSUSTITUÍDOEn nuestro medio los compuestos anfetamínicos no constituyen las drogas de abuso de mayorconsumo. Sin embargo se ha informado un incremento de volumenes incautados a partir de losaños 90.Dentro de los diversos compuestos de la familia, los derivados anfetamínicos de anillosustituído son los que más se utilizan, por ejemplo el éxtasis (metilendioximetanfetamina).Dada la entrada en vigencia de la ley de desfederalización de drogas hacia fines de 2005, espresumible que los laboratorios o gabinetes policiales y/o judiciales de las provincias queadhirieron a la ley se vean exigidos a imponer una metodología de rastreo para este tipo desustancias.La siguiente técnica ha sido ensayada con éxito por los autores.Cromatografía en placa delgada (TLC)Muestras: sangre, orina y tejidosMétodo de aislamiento: Extracción en fase sólida (SPE) con sílica de fase unida C-18 ocopoliméricas mix o extracción con columnas rellenas de tipo Extrelut.Fase estacionaria: Silicagel G con indicador de fluorescencia F 254.Fase Móvil: Acetato de etilo-metanol-amoníaco (85:10:5)Estándares: de diversos anfetamínicos en concentraciones de 5 ug/uLRevelado: Secuencial del siguiente modo: a) Fast Black K ( 10 mg/100ml, disuelto en agua destilada) b) Solución de ácido clorhídrico al 30%(v/v). c) Iodoplatinato de potasio acidificadoAsperjar con la solución a) observando la coloración de las máculas. Luego calientese la placaen estufa a 80°C unos 5 minutos. A continuación se asperja con solución de HCl al 30%.Observar el cambio de coloración y/o desaparición de la mácula.Colocar la placa en estufa oplancha calefactora a 80°C por 5 minutos. Finalmente se rocía con solución de Iodoplatinato depotasio, observando la coloración de las máculas.El resultado se resume en la siguiente tabla: 264
    • Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de ToxicologíaDroga de abuso Rf Fast Black K HCl 30% Iodoplat.de potasioAnfetamina 0.52 Rojo Naranja Rojizo s/fondo azulMetanfetamina 0.46 Naranja Desaparece color Gris s/ fondo azulMescalina 0.30 Rojo Naranja Gris azuladoMetilfenidato 0.77 Naranja Desaparece color GrisMDMA (éxtasis) 0.40 Púrpura Atenuado GrisFenmetracina 0.55 Naranja Desaparece color Sin colorBibliografía Ferrari, Luis A, Informe sobre Identificación y análisis de drogas de uso indebido, División Narcóticos, Naciones Unidas, pp. 10-354, 1989. Forensic and clinical applications of solid phase extraction. M.Telepchak, T.F.August and G Chaney (Eds.) Humana press, pp.91-97, 2004. Kintz, P. Testing for a nightmare or GHB. Proceedings First Southamerican Regional TIAFT meeting. La Plata, Argentina, 2005. Spinelli E., Silva O. A., Rev. Brasileira de Toxicología 8 (2), 21-28, 1995. Clarke’s analysis of drugs and poisons. Widdop, Moffat, Osselton Eds. The Pharmaceutical Press, 2004. Scheurer, C. et al, SPE of Drugs from biological tissues. A Review. J. Anal. Toxicology, 1993. Cardona P.S, Chaturvedi A.K, Soper J.W and Canfield, D.V Simultaneous analyses of cocaine, cocaethylene and their possible metabolic and pyrolytic products. Forensic Sci. Int. 157 (1) 46-56, 2006 Kuzmack, J. The use of copolimeric phases to enhance recovery and selectivity in SPE. World Wide Monitoring, 1998. SPE Choosing the best sorbents. The separation Times. Vol. 3 N° 3, 1987. Extrelut, Nuevo procedimiento para la extracción de sustancias lipófilas. Diagnóstica Merck.1992 Couper, F.J & Marinetti, L.J. Gamma Hydroxybutirate- Effects on human performance and behaviour. Forensic Sci. Rev. 14, 101-119, 2002 Baselt, R. Disposition of toxic drugs and chemicals in man. 6 Th. Ed. Biomed. Publish, Foster City, 2002. 265