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Evolucion de las tecnicas de biología molecular
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Evolucion de las tecnicas de biología molecular

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  • 1. Evolución de las técnicas de estudio de los polimorfismos de ADN 2010 MODULO III GENETICA FORENSE – BREVE ENFOQUE HISTORICO- APLICACIÓN EN CASOS FORENSES. CURSO DE POSTGRADO DE MEDICINA LEGAL Y LABORAL FACULTAD DE DERECHO, CIENCIAS POLITICAS Y SOCIALES UNNE- CORRIENTESALUMNA. LIC. DANIELA ROSA INSAURRALDEPosadas – Misiones – danielainsa@hotmail.com 2006 1
  • 2. Evolución de las técnicas de estudio de los polimorfismos de ADN 2010INTRODUCCIONEvolución de las técnicas de estudio de los polimorfismos de ADNLa Hemogenética Forense nace a principios de siglo, cuando Karl Landsteiner describe elsistema ABO de los hematíes y Von Durgen y Hirschfeld descubren su transmisiónhereditaria. Esta ciencia surgió como una rama de la Criminalística cuyo objetivo era laidentificación genética tanto en casos de investigación criminal como en estudios biológicosde la paternidad. Inicialmente, las investigaciones se centraban en el estudio de antígenoseritrocitarios (sistema ABO, Rh, MN), proteínas séricas, enzimas eritrocitarias y sistemaHLA. Con el estudio de dichos marcadores podía incluirse o excluirse una persona comoposible sospechoso por poseer una combinación genética igual o diferente a la del vestigiobiológico hallado en el lugar de los hechos.Pero fue a mediados de siglo cuando gracias al descubrimiento del ADN y de su estructuray al posterior avance en las técnicas de análisis de dicha molécula la Hemogenética Forenseevolucionó considerablemente hasta el punto de que hoy en día puede hablarse de una nuevasubespecialidad dentro de la Medicina Forense: la Genética Forense. Dicha ciencia estudiabásicamente unas regiones del ADN que presentan variabilidad entre los distintosindividuos, es decir, estudia regiones polimórficas del ADN. Así, analizando un determinadonúmero de regiones polimórficas, la probabilidad de que dos individuos sean genéticamenteiguales es prácticamente nula (excepto en el caso de gemelos univitelinos).Aunque la Ciencia poseía las herramientas necesarias para el estudio del ADN, su aplicaciónen la resolución de casos judiciales no se produjo hasta 1985, cuando el Ministerio delInterior Británico solicitó la ayuda de Alec J. Jeffreys, profesor de Genética de laUniversidad de Leicester. Los primeros casos de Criminalística fueron resueltos gracias ala técnica de los RFLPs (Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica). Jeffreysdescubrió la existencia de unas regiones minisatélites hipervariables dispersas por elgenoma humano que al ser tratadas con enzimas de restricción generaban fragmentos delongitud variable. Estudios posteriores realizados el mismo Jeffreys demostraron que lasdiferencias en el tamaño de estos fragmentos se debían a que estas regiones consistían enun determinado número de repeticiones en tándem de una secuencia central, el cual variabade unos individuos a otros.El primer locus de ADN polimórfico fue descubierto por Wyman y White en 1980 usandouna sonda de ADN arbitraria. De esta manera observaron fragmentos de más de 15longitudes diferentes en una pequeña muestra de individuos. Posteriormente seencontraron otros loci hipervariables como en la secuencia del gen de la insulina humana, enel oncogen “ras”, en el pseudogen de la zeta-globina y en el gen de la mioglobina. Estos locihipervariables constaban de repeticiones en tándem de una secuencia de oligonucleótidos(11 a 60 pb), de manera que las diferentes longitudes de los fragmentos originadosdependían del número de dichas repeticiones y se les denominó VNTR (“Variable Number ofTandem Repeat”).Tras el descubrimiento de los primeros VNTRs se vio que éstos podían ser aplicados a lamedicina forense y sustituir a los marcadores clásicos.En un principio la manera de estudiar dichos marcadores se hizo por medio de la técnicallamada hibridación con sondas o Southern blot. Esta técnica consta básicamente de lassiguientes etapas:Digestión del ADN con enzimas de restricción tras conseguir extraer un ADN de altamolecularidad. 2
  • 3. Evolución de las técnicas de estudio de los polimorfismos de ADN 2010Separación de los fragmentos obtenidos por medio de una electroforesis en gel de agarosa.Desnaturalización de los fragmentos separados y cortados.Transferencia de las cadenas simples a una membrana de nitrocelulosa o nylon y fijación delas mismas por medio de calor (80ºC).Prehibridación con sondas de ADN inespecífico para bloquear los lugares de unióninespecíficos que pudiera haber en la membrana.Marcaje de la sonda con nucleótidos radioactivos (32 P normalmente).Hibridación de la sonda marcada y desnaturalizada con los fragmentos de ADN fijados a lamembrana, y lavado de la membrana para eliminar el exceso de sonda o aquellas que hayanhibridado mal. Revelado en placa radiográfica e interpretación de los resultados. Una vez amplificado el ADN, los fragmentos resultantes son separados en función de su tamaño por medio de un proceso de electroforesis. Actualmente se utilizan dos tipos de electroforesis en los laboratorios de Genética Forense: Electroforesis en geles verticales de poliacrilamida Electroforesis capilarLa electroforesis capilar es una técnica relativamente novedosa en el campo de la GenéticaForense pero que está poco a poco sustituyendo a los sistemas de electroforesis vertical.En este caso el proceso electroforético es llevado a cabo en un capilar de silica de unas 50 m de diámetro, lo cual hace que la cantidad de calor generado sea menor y que puedanaplicarse voltajes mayores. Para que puedan ser analizados por electroforesis capilar losprimers o los dideoxinucleótidos (en el caso de la secuenciación) deben ser marcadosfluorescentemente con unas moléculas denominadas fluorocromos que emiten fluorescenciaa una determinada longitud de onda cuando son excitados por láser. El equipo en el que serealiza el proceso lleva acoplado un ordenador encargado de traducir los datos deemisiones fluorescentes en secuencias o fragmentos con sus correspondientes alelosasignados. La electroforesis capilar presenta una serie de ventajas frente a los sistemasde electroforesis vertical como son:Rapidez: ya que permite el análisis simultáneo de varios loci aunque éstos posean alelos contamaños solapantes.Sensibilidad: hace posible detectar cantidades muy pequeñas de ADN amplificado.Los resultados se obtienen de manera informatizada, lo que evita problemas deinterpretación de los resultados y facilita el análisis de los mismos a través de programasinformáticos. 3
  • 4. Evolución de las técnicas de estudio de los polimorfismos de ADN 2010 Ejemplo de un caso de criminalística resuelto utilizando electroforesis en gel vertical de acrilamida. Si se observan los patrones bandas podrá comprobarse como los perfiles obtenidos en las manchas de sangre encontradas en el sombrero (Hat) y pantalón (Jeans) del sospechoso (S) coinciden con el perfil genético de la víctima (V)Caso de estudio biológico de la paternidad realizado con electroforesis capilar. Cada picocorresponde a un alelo, el hijo (H) debe poseer un alelo de la madre (M) y otro del padre(P) para que la paternidad sea compatibleFuturas tecnologías: biochipsLas técnicas de análisis genético se encuentran hoy en día en continuo desarrollo yevolución. La necesidad de técnicas que permitan el aislamiento y análisis de los casi cienmil genes que componen el genoma humano justifica la existencia de líneas de investigacióndestinadas al descubrimiento de nuevos métodos que permitan monitorizar elevadosvolúmenes de información genética en paralelo y que reduzcan tanto el tiempo empleadocomo el coste por análisis.Desde el análisis de los primeros polimorfismos de ADN con fines identificativos, laGenética Forense ha sufrido una gran evolución. Los expertos en la materia han sidotestigos de cómo el descubrimiento de la PCR revolucionó las técnicas de identificacióngenética. Es probable que la próxima revolución la constituyan los llamados biochips omicroarrays.Los biochips surgen como consecuencia de una combinación entre técnicasmicroelectrónicas empleadas para la fabricación de microprocesadores informáticos ymateriales biológicos. En general puede decirse que la principal característica de los chipses su capacidad para generar información en muy poco espacio, ya que posibilitan elprocesamiento de multitud de ensayos simultáneamente. Esta característica es la que haceque los biochips sean probablemente la tecnología del futuro en el campo de lasinvestigaciones biomédicas.La fabricación de los biochips es similar a la de los chips informáticos: por medio de latécnica denominada fotolitografía se depositan circuitos microscópicos sobre láminas desilicio. En el caso concreto de los biochips, estas láminas son de vidrio y lo que se depositaen dichas láminas son cadenas de ADN. 4
  • 5. Evolución de las técnicas de estudio de los polimorfismos de ADN 2010Hay compañías comerciales que han desarrollado otras estrategias para la fabricación debiochips. No obstante, los más usados actualmente y con mayor número de aplicaciones sonlos basados en técnicas fotolitográficas.DEFINICIONCon la denominación de genética forense se define el uso de ciertas técnicas empleadas engenética para la identificación de los individuos en base al análisis de los polimorfismos delDNA. Básicamente se centra en tres áreas:Identificación de personas desaparecidas a partir del cadáver. Este test también haayudado al forense a identificar cadáveres o restos no identificables, como un brazo u otrotrozo del cuerpo. El patrón genético de estos cadáveres puede comparase con el de losparientes, lo que en definitiva puede llevar a una ulterior identificación.Investigación de la paternidad, tanto desde el punto de vista de la reclamación como de laimpugnación.Criminología, análisis de restos orgánicos como pelos, semen, saliva, sangre, etc. Que hanquedado en la escena de un crimen o de un delito sexual.TIPOS DE ADNLa genética forense analiza el DNA genómico, también llamado cromosómico.El ADN mitocondrial.Y los polimorfismos del cromosoma Y.Del DNA genómico se estudian las secuencias repetidas en tandem o VNTR (VariableNumber of Tandem Repeats) de las que hay dos tipos, MVR (minisatellite variant repeats) osecuencias minisatélite de hasta 60 pb y microsatélite o STR (short tandem repeats) quetienen una cadencia de hasta 6 pb, por ejemplo ATTC se repetiría 2 veces comoATTCATTC. También se estudian marcadores como HLA-Clase I y Clase ll, que tienendocenas de locis hipervariables que están estrechamente ligados y RPFLs.El DNA mitocondrial tiene como característica que su herencia es siempre materna. Seanalizan dos regiones hipervariables del llamado lazo Z.Los polimorfismos del cromosoma Y se analizan microsatélites (STRs) y el polimorfismo denucleótidos simples (SNPs). Sirve para analizar también la patrilínea.El valor informativo de las secuencias de DNA que se emplean en la genética forense sebasa en el grado de polimorfismo y en la frecuencia de los alelos en la población. Lasventajas del uso del DNA en la medicina legal son, entre otras, que bastan unos indiciosmínimos ya que se utiliza PCR para amplificar la muestra, la calidad de la muestra no se veespecialmente comprometida ya que pueden emplearse los STR’s cuando se trata de tejidosen putrefacción o muestras milenarias y, finalmente, que el DNA está presente en lamayoría de los indicios que pueden recogerse de la escena de un crimen como el pelo, la piel,el semen, sangre, etc.IDENTIDAD GENÉTICA: EN AYUDA DE LA MEDICINA FORENSECASOS:Fuente: ( Publicado en Revista Creces, Abril 1992 )Desde que en 1988 una corte de Florida culpó a un individuo acusado de violación utilizandocomo elemento de prueba su "huella digi ( Publicado en Revista Creces, Abril 1992 )Desde que en 1988 una corte de Florida culpó a un individuo acusado de violación utilizandocomo elemento de prueba su "huella digital genética", este revolucionario métododiagnóstico ha sido objeto de gran atención no sólo en el ambiente científico, sino tambiénen el campo médico y judicial. 5
  • 6. Evolución de las técnicas de estudio de los polimorfismos de ADN 2010En julio de 1977, Mónica Lemos de Lavalle, embarazada de ocho meses, fue secuestrada porlos servicios de seguridad argentinos en la provincia de Buenos Aires, junto a su marido ysu hija María de 14 meses. Cinco días después, sus captores dejaron a la niña abandonadacerca de la casa de su abuela materna. Del paradero del matrimonio, así como de la criaturaque Mónica gestaba nunca se tuvieron noticias. Algún tiempo más tarde, un hombre liberadode un campo secreto de concentración en Argentina visitó a la abuela y le informó queMónica había permanecido en su mismo recinto de detención.En 1985 las autoridades del nuevo gobierno democrático argentino detuvieron a una mujerpolicía que había trabajado en ese campo. La mujer tenia una hija que, aseguraba, lepertenecía. Dos años más tarde, una prueba genética desarrollada por un organismogubernamental demostró, con un 99,9 por ciento de certeza, que la niña era efectivamentehija de Mónica Lemos. La niña vive actualmente con su hermana y su abuela materna. Lospadres no aparecieron y se presume que están muertos.Este nuevo test genético, conocido como huella digital genética (genetic fingerprinting),resulta de gran utilidad en Argentina para reunir a niños cuyos padres desaparecierondurante el gobierno militar entre los años 1976 y 1983 con sus familias. Dado que losabuelos de estos niños secuestrados son personas de avanzada edad, y muchos de los niñosaún no han sido localizados, el gobierno argentino ha establecido desde mayo de 1987 unabase de datos genéticos en la que se guardan muestras de sangre de los abuelos y de otrosparientes de los niños perdidos, para poder comprobar su identidad genética si ellosaparecieran después del fallecimiento de sus familiares. En 1984, los jueces devolvieronotra niña a sus abuelos. Se trata de Paula Logares Gripson.PRECAUCIONES A TENER EN CUENTA:Aun cuando esta técnica ya es una práctica generalizada en los laboratorios de biologíamolecular, deben tomarse muchas precauciones para no inducir a error, especialmente en latoma de la muestra.Generalmente las muestras, especialmente en casos forenses, no son puras. En casos deviolaciones, por ejemplo, la muestra vaginal no solo contiene espermatozoides sino tambiéncélulas vaginales de la propia víctima, por lo que es necesario estudiar por separado elpatrón de migración del DNA de las células de la víctima, así como también el del supuestoatacante. Un inconveniente que a menudo debe superarse es el hecho que el DNA decaemuy rápidamente, especialmente a la temperatura ambiente. Si esto ha ocurrido, algunostrozos de DNA que contienen los puntos específicos a ser atacados por las enzimas derestricción pueden perderse, y como resultado pueden aparecer muchos o muy pocosfragmentos de DNA.CONTAMINACIÓN DE LA MUESTRAOtras veces, contaminantes como los colorantes de los blue jeans, se pueden combinar conlas enzimas de restricción, lo que es causa de que esta enzima corte el DNA en lugaresequivocados. Otras veces el DNA se puede mezclar con iones que también tienen cargaeléctrica y pueden hacerlo migrar en el gel a distancias no predecibles. También proteínasdel ambiente pueden tener algún efecto, uniéndose a fragmentos del DNA y alterando sumovilidad, ya que le agregan mayor peso.Si el DNA está contaminado, aun el DNA de una misma persona, pueden producirse bandasen que los extremos no se alineen, aun cuando sus posiciones relativas permanezcan iguales(un problema conocido como corrimiento de bandas). En la etapa final, cuando se utilizan lassondas, éstas pueden unirse al DNA contaminante en lugar de hacerlo a las muestras 6
  • 7. Evolución de las técnicas de estudio de los polimorfismos de ADN 2010humanas, causando bandas espurias. El contaminante incluso puede interferir con las sondasy no unirse a los fragmentos esperados, dando la impresión de que faltan bandas.PROBLEMAS CON LOS PARIENTESEstas pruebas genéticas suponen que los habitantes de un determinado país procrean demodo tal que sus rasgos hereditarios se distribuyen al azar y que, por lo tanto, las bandasobservables en la prueba de fingerprint también se distribuyen homogéneamente en lapoblación. Algunos estudios realizados en EE.UU. ponen en duda esta afirmación.En muchos países occidentales existen pequeños grupos étnicos y religiosos en los queciertas características genéticas pueden ser más comunes. Los miembros de dichos gruposse unen frecuentemente con individuos de la misma comunidad, por lo que genéticamenteestán más estrechamente relacionados.Esta suerte de "inbreeding" aumenta las posibilidades de que un niño herede las mismassecuencias repetidas que ambos padres y así sea homocigoto para esa secuencia. Elhomocigoto lleva entonces dos bandas iguales de una determinada movilidad, ya que recibela misma secuencia de DNA de ambos padres. Por esa razón, y para esa secuencia enparticular, el individuo no tendrá dos bandas simples sino más bien una sola de mayorintensidad, lo que puede complicar la interpretación de los resultados.Los expertos están de acuerdo en que las técnicas han progresado y que prometen mucho,siempre y cuando se tomen las adecuadas precauciones.IDENTIFICACIÓN DE VIOLADORESEn el caso de violaciones, se puede tornar una muestra de la vagina de la víctima y tambiéndel presumible violador. El pattern genético resultante se compara con el de la víctimatomado de una muestra de sangre. Cualquier banda derivada de la muestra de DNA vaginalque no esté presente en la sangre de la víctima, se puede asumir que pertenece alvictimario. Esto significa que la prueba genética no sólo permite identificar el victimariosino además descartar a sospechosos inocentes.Otros criminales, como asesinos y ladrones, pueden también identificarse si han dejado unapequeña gota de sangre o algunos pocos pelos en la escena del crimen.El test genético puede realizarse a partir de muestras tan pequeñas como cincuentamicrolitros de sangre, 0.5 microlitros de semen o 10 raíces de pelos. Muestras tanpequeñas de DNA pueden amplificarse usando la técnica de la polimerasa en cadena, quepermite fabricar muchas copias de DNA a partir de Infimas cantidades. También se hanutilizado células descamativas de la mucosa de la boca, tejido muscular o material fetal yen general cualquier tejido de cadáveres.Jeffreys ha extraído el DNA de huesos que se supone pertenecían a Josef Mengele, elcriminal. de guerra nazi, y al mismo tiempo está tratando de obtener muestras de sangrede los parientes que aún viven, con el objeto de determinar silos restos encontrados enBrasil realmente pertenecen a Mengele.TOMA DE MUESTRASCONSENTIMIENTO APROBADOSANGRE: punción venosa (5ml. EDTA). Punción dactilar (papel secante y secar atemperatura ambiente) ¡OJO PERSONAS TRANSFUNDIDAS!CELULAS EPITELIALES BUCALES: Hisopos- dejarlos secar y enfundar, sobre de papel.PELOS CON RAIZ: 15 mínimo de diferentes zonas de la cabeza, con raíz. En sobre depapel, rotulados. 7
  • 8. Evolución de las técnicas de estudio de los polimorfismos de ADN 2010CADÁVERFRESCO: sangre, punción cardíaca.Músculo esquelético (10 gr. en recipiente plástica y tapa a rosca SIN conservante.CUADRICEPS O CARDIACO. (MEJORES).DIENTES: 4 Premolares o Molares: se puede dejar en reserva para evitar exhumación. LASPULPAS DENTALES TIENEN RESTOS DE ADN.AVANZADO ESTADO O ESQUELETIZADO: Hueso largos FEMUR – HUMERO- se puedelijar con lija previamente para sacar todo el resto de carne.Pulpas dentales (4 premolares o molares) no dañados externamente.CADAVER CARBONIZADO:Cuando no es total: MUSCULO ESQUELETICO – ZONA PROFUNDA.HUESOS – PIEZAS DENTALES.MUESTRAS INDUBITADAS:HOSPITALES: muestras de sangre- Biopsias en parafina.PEINES – MAQUINITAS DE AFEITAR – SALIVA – SELLOS O SOBRES.OTRO TIPO DE MUESTRAS:MANCHAS SECAS (COLILLAS – ARMAS BLANCAS – LLAVES – ROPAS – VASOS – ETC.)VIDRIO: Hisopo con H20 destilada ***SECAR***ENFUNDAR***sobre de papel madera. Oraspar con bisturí en sobre papel y guardar.“NO SE PUEDE APLICAR NI HACER CIENCIA SIN LOS PASOS DEL METODOCIENTIFICO”EL MÉTODO CIENTÍFICOES LA SISTEMATIZACION PARA LLEGAR A LA OBTENCION DE UNA DEDUCCIONVALIDA ACERCA DE ALGO.PASOS:1. OBSERVACIÓN. La observación consiste en fijar la atención en una porción del Universo.Mediante la observación nosotros identificamos realidades o acontecimientos específicosdel cosmos a través de nuestros sentidos.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA: la pregunta debe ser congruente con la realidad oel fenómeno observado, y ser lógica. El investigador debe tener en cuenta que las preguntas“POR QUE”, son difíciles, pero no imposibles.EL INVESTIGADOR OBJETIVO DEBE COMENZAR SUS PREGUNTAS CON “QUE”,“COMO”, “DONDE”, “CUANDO”, o “PARA QUE”.3. RAZONAMIENTO INDUCTIVO: trata de dar una o más respuestas lógicas a laspreguntas. Cada respuesta es una introducción tentativa que puede servir como una guíapara el resto de la investigación. Estas soluciones preliminares a un problema son lasHIPÓTESIS.4. PLANTEAMIENTOS DE HIPOTESIS: Hipótesis es una declaración que puede ser falsao verdadera, y que debe ser sometida a comprobación (experimentación). Cada hipótesisdebe ser sometida a una prueba exhaustiva llamada experimentación. Los resultados de laexperimentación determinarán el carácter final (falso o verdadero) de la hipótesis.5. RAZONAMIENTO DEDUCTIVO: sirve para darle consistencia a las observaciones ehipótesis, se las puede llamar predicciones.6. RECOLECCION DE DATOS: Incluye todo el trabajo de inteligencia, de campo, laspericias científicas, etc. 8
  • 9. Evolución de las técnicas de estudio de los polimorfismos de ADN 20107. TEORIA: es la declaracion parcial o totalmente verdadera verificada por medio de laexperimentación o recoleccion de datos, de las evidencias y que son válidas sólo para untiempo y un lugar determinado. Por ejemplo un hecho en particularINTERPRETACION DE DOS CASOSEjemplo de caso de Paternidad. Al leer las bandas queda claro que el padre es el Nº 1Ejemplo de caso de violación, con dos sospechosos, donde por la presencia de las bandas, sedetermina que el verdadero autor del hecho es el sospechoso Nº 1, en ambas evidenciastomadas de la víctima.CONCLUSION: El presente trabajo es un pequeño compendio de artículos extraídos de diferentesFuentes, donde se trató de reflejar simplemente la importancia de la Genética Forense enlos casos de hechos de índole penal o civil, como los casos de paternidad o maternidad,violaciones u homicidios. 9
  • 10. Evolución de las técnicas de estudio de los polimorfismos de ADN 2010Si bien los datos técnicos y el protocolo del procedimiento en laboratorio estánestandarizados a nivel internacional, al igual que su aplicación en la Justicia Penal y Civil, elcriterio ético suele ser uno de los determinantes fundamentales al momento del análisis, einterpretación, a los fines de la seguridad del resultado final.Otro punto es La Toma de Muestra, fundamental la capacitación del personal encargado opresente en un Hecho delíctivo, por el simple hecho de que si la muestra fue malpreservada, nada se podrá hacer al respecto.Otro factor en esta cadena de procedimientos para llevar a cabo la pericia de genéticamolecular es la CADENA DE CUSTODIA, que garantiza la seguridad desde la Toma deMuestra, pasando por el laboratorio, hasta las manos del Juez.La Genética por si misma es una Ciencia, y pasa a ser auxiliar de la Medicina Legal en elmomento de tenerla en cuenta para casos forenses. No es una subespecialidad de laMedicina como catalogan algunos autores.Durante la Inspección de una Escena de un Crimen, donde comienza “todo”, el jefe quedirige la investigación debe tener conocimientos sobre las distintas disciplinas que puedenactuar en el hecho, Uno de los mayores errores que se cometen es el desconocimiento deQUE, COMO, DONDE, CUAL? Elemento relevar, conservar, y para que sirve y a donderemitir.BIBLIOGRAFIA CARMEN ESTRALA. TESIS DOCTORAL. Laboratorio de ADN forense, Depto. de Medicina Legal, Universidad de Granada, España. Extractado de un articulo original de Pauline Lowrie y Susan Wells publicado en New Scientist, 16 de noviembre de 1991. PRIMAROSA CHIERI- ZANNONI, EDUARDO. Prueba del ADN. 2da. Edic. Edit. Astrea. (2005) JEFFREYS, A.J.; WILSON, V.; THEIN, S.L. 1985 b. Individual specific “fingerprints” of human DNA. Nature, 316:76-79 JEFFREYS, A.J.; WILSON, V.; THEIN, S.L. 1985 a. Hypervariable minisatellite regions in human DNA. Nature, 314:67-73 10