Genotipificación del Virus Papiloma Humano (HPV) por PCR-RFLP en alteraciones cervicales

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Genotipificación del Virus Papiloma Humano (HPV)
por PCR-RFLP en alteraciones cervicales

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  • 1. Genotipificación del Virus Papiloma Humano (HPV) por PCR-RFLP en alteraciones cervicales Deluca, Gerardo D. - Alonso, José M. - Lucero, Raúl H. Martín de Civetta, María T. - Zibelman de Gorodner, Ofelia L. Area de Biología Molecular - Instituto de Medicina Regional - UNNE. Av. Las Heras 727 - (3500) Resistencia - Chaco - Argentina. Tel./Fax: +54 (03722) 428213 / 422793 E-mail: rhlucero@bib.unne.edu.ar ANTECEDENTES Los virus papiloma humanos (HPV) son virus a ADN capaces de generar lesiones verrugosas mediante la inducción de la proliferación celular, durante el curso de una infección productiva . El cáncer de cérvix es la segunda o tercer causa más común de cáncer en las mujeres en todo el mundo. En Argentina no se cuenta con suficientes datos epidemiológicos para evaluar con exactitud la situación global de esta patología, pero los estudios regionales realizados hasta el momento muestran una amplia variación en la incidencia que va desde 1-3 casos por cada 100.000 mujeres residentes en áreas metropolitanas, hasta 4 casos por cada 1000 mujeres en la región Nordeste del país. Además, está perfectamente reconocida la asociación entre esta patología y la infección persistente por ciertos genotipos de HPV. El HPV infecta las células germinales de los epitelios, a las cuales llega a través de microlesiones o abrasiones, pudiendo la infección ser transitoria o persistente. Las primeras se caracterizan por ser autolimitadas y en un lapso de tiempo que depende de las condiciones inmunológicas del hospedador remiten espontáneamente; en tanto que en las segundas el sistema de control inmunológico no responde adecuadamente y el virus no es depurado del organismo, convirtiéndose en un factor favorecedor para el desarrollo de cáncer cervical, particularmente si la infección es causada por un genotipo de alto riesgo. Se ha podido observar que en todos los cánceres cervicales hay integración del genoma viral en células neoplásicas, por lo que se piensa que esto es una condición necesaria para su desarrollo. Se han identificado hasta el presente alrededor de 80 genotipos virales de HPV, de los cuales más de 30 infectan la región anogenital y al menos 10 de ellos están asociados con el cáncer cervical. De esto resulta que la asociación entre la infección por HPV y las lesiones anogenitales es un fenómeno más complicado de lo esperado. Los genotipos HPV-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59 y –68 son considerados de “alto riesgo” porque fueron identificados en pacientes que desarrollaron neoplasias cervicales; los genotipos HPV-6, -11, -40, -42, - 43, -44 y –55 son considerados de “bajo riesgo”2 y a los HPV –6, -11 y -42 se los relaciona a las verrugas genitales (condilomas). En el Nordeste Argentino, a pesar de ser una zona de alta prevalencia de cáncer cervical, se realizaron pocos estudios epidemiológicos y en la mayoría de ellos sólo se evaluó la presencia de los genotipos más comunes, es decir el 6, 11, 16 y 18. Sin embargo, es necesario estudiar la presencia de otros genotipos de HPV también asociados con el cáncer cervical, debido a que se han encontrado diferencias geográficas en la prevalencia de los distintos tipos virales. El objetivo del presente trabajo fue determinar los genotipos circulantes de HPV, presentes en mujeres con alteraciones ginecológicas compatibles con infección por este virus en el Nordeste de Argentina. MATERIAL Y METODOS La detección y tipificación del virus papiloma humano en células o tejidos se efectuó mediante amplificación por PCR de un fragmento genómico y posterior análisis por restricción enzimática (RFLP) Productos utilizados en la presente técnica: • Primers consenso My09 y My11. • Enzimas de restricción Bam HI, DdeI, Hae III, HinfI, PstI y RsaI • Control positivo: DNA de la línea celular CaSki que contiene integrado genoma de HPV-16 Material de muestra Los materiales de estudio consistieron en: • Células obtenidas por cepillado cervico-vaginal de las lesiones observadas en el tracto genital. • Tejido fresco de biopsia obtenido para estudios histológicos.
  • 2. Fuentes del material estudiado • Material recibido del Servicio de Ginecología del Hospital Vidal de la ciudad de Corrientes. • Material cedido por distintos centros ginecológicos privados de las ciudades de Resistencia y Corrientes. Pacientes Se estudiaron un total de 60 mujeres, con edades comprendidas entre los 18 y 60 años de edad y distribuidas de la siguiente manera: 39 que presentaban lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado (LG-SIL), 6 de alto grado (HG- SIL), 3 que presentaban células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASCUS), y 12 mujeres que presentaban cáncer cervical en distintos estadíos, de acuerdo a la clasificación de Bethesda. RESULTADOS En las 60 mujeres estudiadas, se encontró en 37 la presencia de ADN viral (62%), con una distribución según el tipo de alteración citológica que se presenta en la Tabla 1. Los distintos genotipos de HPV identificados y su distribución según los patrones histopatológicos se presenta en la Tabla 2. Se encontraron 5 casos de infecciones virales producidas por más de un genotipo viral. Tabla 3 Tabla 1: Resultados de detección del virus papiloma humano (HPV) en función del diagnóstico citohistológico. ASCUS LSIL HSIL CANCER TOTALES Positivos 2 (66%) 20 (51%) 5 (83%) 10 (83%) 37 (62%) Negativos 1 (34%) 19 (49%) 1 (17) 2 (17%) 23 (38%) TOTALES 3 39 6 12 60 Tabla 2: Genotipos de HPV identificados y su relación con los patrones histopatológicos Genotipos ASCUS LSIL HSIL CANCER Totales (%) N = 37 6 2 2 (5,4) 16 3 3 6 12 (32,4) 18 2 2 (5,4) 33 1 1 (2,7) 45 1 1 2 (5,4) 52 1 1 (2,7) 53 1 1 (2,7) 54 1 1 (2,7) 56 1 1 (2,7) 58 2 1 2 5 (13,5) 66 1 1 (2,7) MM4 1 1 (2,7) LVX100 1 1 (2,7) No determinados* 1 3 1 1 6 (16,2) Indeterminados 3 1 4 (10,8) * RFLP no realizada
  • 3. Tabla 3: Genotipos de virus papiloma humano (HPV) identificados y patrones histopatológicos correspondientes a casos de infecciones mixtas. Genotipos LSIL HSIL 58 – 45 1 6 – 33 1 16 – 58 1 16 – 66 1 Indeterminado 1 DISCUSION La alta frecuencia de infección por HPV reportada en el Norte Argentino en publicaciones previas, es comparable con la importante prevalencia de casos de cáncer de cérvix que se presentan en la región. En este trabajo se analizaron muestras provenientes de pacientes con evidentes alteraciones citológicas que hacían prever la posible infección por HPV, hallándose efectivamente una alta incidencia, particularmente entre los HSIL y entre los casos de cáncer, mientras que en los LSIL la presencia del ADN viral fue confirmada sólo en el 51% de los casos. Presumimos que esto puede estar directamente relacionado con el número de casos estudiados por lo que se podría tener una mejor estimación si se considerase un mayor número de pacientes con LSIL. La técnica de PCR-RFLP tiene la característica de poder determinar más de 30 genotipos virales anogenitales con una única reacción de amplificación y ésta es su mayor ventaja frente las metodologías que emplean primers específicos, pero su mayor desventaja es justamente no poder definir en ciertos casos los genotipos asociados cuando se presentan infecciones mixtas que frecuentemente producen patrones de restricción confusos. En estos casos se puede optar por otras metodologías moleculares de identificación como son la PCR con posterior hibridación por dot blot, PCR con primers específicos, o la secuenciación. En este estudio se presentaron 5 muestras con infecciones virales mixtas y en 4 de ellas se pudieron identificar los virus coinfectantes en base a la restricción enzimática. En la muestra restante se deberá optar por otra metodología de identificación molecular según lo dicho en el párrafo anterior. Seis muestras positivas no pudieron someterse a la restricción enzimática debido a la escasa cantidad de material amplificado, insuficiente para generar un patrón de bandas claro para ser analizado. Suponemos que estos casos pueden corresponder a aquellos en los que la cantidad inicial de material genómico viral en la muestra obtenida se encuentra en el límite de la sensibilidad de la técnica. También pudo verse que 4 muestras presentaron patrones que no pudieron ser asociados con ninguno de los HPVs identificables por la metodología empleada. Será entonces necesario realizar la secuenciación de estos DNAs virales amplificados para verificar si se trata de variantes intratípicas, subtipos o nuevos genotipos de HPV. En esta serie el HPV-16 fue el genotipo más frecuente. Sin embargo, resulta importante la presencia del HPV-58 como segundo genotipo de mayor frecuencia, debido a que gran parte de las referencias bibliográficas describen al –18, al – 45, al –31 y al -33 como los genotipos más prevalentes, luego del HPV-16. No obstante, la existencia de divergencias epidemiológicas en cuanto a la frecuencia de los HPVs circulantes en distintas regiones del mundo es ya un hecho conocido. CONCLUSIONES Podemos concluir que en el Nordeste Argentino están presentes los genotipos virales epidemiológicamente más importantes y los resultados del presente estudio demuestran que además de los HPV-16 y –18, que son los de mayor prevalencia a nivel mundial, se debe prestar atención a otros genotipos que pudieran ser de importancia epidemiológica local, como ser el HPV-58. BIBLIOGRAFIA 1. Villa L. Human papillomaviruses and cervical cancer. Adv Cancer Res 1997; 71: 321-41. 2. Cervical Cancer. NHI Consens Statement 1996, April 1-3;14 (1):1-38. 3. IARC Working Group. Human Papillomaviruses. IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risk to human. 1996; 64: 277-82.
  • 4. 4. Tonon SA, Picconi MA, Zinovich JB, Liotta DJ, Bos PD, Galuppo JA, et al. Human papillomavirus cervical infection and associated risk factors in a region of Argentina with a high incidence of cervical carcinoma. Infect Dis Obstet Gynecol 1999; 7 (5): 237-43. 5. Jantus Lewintre E, Martín de Civetta MT, Picconi MA, et al. Cáncer de cuello uterino en Corrientes (Argentina): tipificación de virus papiloma humano en lesiones cervicales por PCR-hibridación. Nuevas tendencias en Oncología. Rev Lat de la European School of Oncology 1998; 7:134-9. 6. Muñoz N. Human papillomaviruses and cancer: the epidemiological evidence. Journal of Clinical Virology 2000, 19: 1-5. 7. Slattery MI, Overall JC, Abbott TM, French TK, Robison JM, Gardner J. Sexual activity, contraception, genital infections, and cervical cancer: support for a sexually transmitted disease hypothesis. Am J Epidemiol 1989; 130(2):248-58. 8. Chua KL, Hjerpe A. Persistence of human papillomavirus (HPV) infections preceding cervical carcinoma. Cancer 1996; 77: 121-127. 9. Stern PL, Brown M, Tacey SN, Stacey SN, Kitchener HC, Hampson I, et al. Natural HPV immunity and vaccination strategies. Journal of Clinical Virology 2000; 19: 57-66. 10. Ponten J, Guo Z. Precancer of the human cervix. Cancer Surv. 1998; 32:201-29. 11. Koopman LA, Szuhai K, van Eendenburg JD, Bezrookove V, Kenter GG, Schuuring E. Recurrent integration of human papillomaviruses 16, 45, and 67 near translocation breackpoints in new cervical cancer cell lines. Cancer Res 1999; 59(21):5615-24. 12. Kjellberg L, Wang A, Wiklund F, Edlun K, Ångström T, Lenner P, et al. Sexual behaviour and papillomavirus exposure in cervical intraepithelial neoplasia: a population-based case-control. Journal of General Virology 1999; 80: 391-398. 13. Sasagawa T, Basha W, Yamazaki H, Inoue M. High-Risk and multiple human papillomavirus infections associated with cervical abnormalities in japanese women. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention 2001; 10: 45-52. 14. Bernard HU, Chan SY, Mannos MM, Ong CK et al. Identification and assessment of known and novel human papillomaviruses by PCR amplification, restriction fragment length polymorphism, nucleotide sequence, and phylogenetic algorithms. J Infect Dis 1994; 170: 10077-85. 15. Mannos M, Ting Y, Wright D et al. Use of polymerase chain reaction amplification for the detection of genital human papillomaviruses. Cancer Cells 1989; (7):209-14. 16. Husnjak K, Grce M, Magdic L, Pavelic K. Comparison of five different chain reaction methods for detection of human papillomavirus in cervical cell specimen. Journal of Virological Methods 2000; 88: 125-134. 17. Scott DR, Hagmar B, Maddox P. Use of human papillomavirus DNA testing DNA testing to compare equivocal cervical cytologic interpretations in the United States, Scandinavia, and the United Kingdom. Cancer 2002; 96 (1); 14-20. 18. Picconi MA, Gronda J, Alonio LV . Human papillomavirus (HPV) in Quechua women from Jujuy (Argentina), with high frequency of cancer of the cervix: viral types and HPV-16 variants. Medicina 2002; 62 . En prensa. 19. Hwang T. Detection and typing of human papillomavirus DNA by PCR using consensus primers in various cervical lesions of Korean women. J Korean Med Sci 1999; 14: 593-9. 20. Reguera M, San Miguel P, Gómez C, Canal C, Anton I, Ortiz-Rey JA, Alvarez C et al. Correlación diagnóstica entre las displasias de cérvix y detección por PCR del papiloma virus humano. Actas on-line IV-CVHAP, 2001 POSTER-E-026 (fecha publicación 02/05/2001), disponible en URL: http://conganat.uninet.edu/Comunicación- E/026/. 21. Astori G, Arzese A, Pipan C, Michele de Villiers E, Botta GA. Characterization of a putative new HPV genomic sequence from a cervical lesion using L1 consensus primers and restriction fragmente length polymorphism. Virus Research 1997; 50: 57-63. 22. Fernandez Contreras ME, Sarriá C, Nieto S, Lazo P. Amplification of human genomic sequences by human papillomaviruses universal consensus primers. Journal of Virological Methods 2000; 87: 171-175. 23. Markert-Hahn C.; Berding C.; Kuhn C. Critical level and detection limit: performance measures for PCR-based assays. Journal of Virological Methods 1998; 74: 139-148.