Les technique de protozoaires
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Les technique de protozoaires Presentation Transcript

  • 1. République Algérienne Démocratique et PopulaireUniversité farhat abbes. SetifFaculté science de la nature et de la vie.Département de biologie et physiologie animale. Spécialité de: Parasitologie médicale et vétérinaire(Master 1). Les techniques de récoltes les protozoaires intestinaux dans les selles
  • 2. Techniques de laboratoire en parasitologie Colorations Techniques de concentration•Lugol•MIF•Coloration de Ziehl-Neelsen modifiée •Technique de Ritchie•Coloration de Weber •MIF concentration•Coloration de Van Gool•coloration de baillenger : Autres  recherche d’antigène parasitaire figuré   techniques de biologie moléculaire
  • 3. introductionle protozoaire est un être unique par son caractère unicellulaire et sa place en parasitologie , il est aussi unique par la violence des attaques de certains d’entre eux , meurtriers pour l’homme ou pour les animaux ou ils sont responsables desmaladies parasitaires les plus répandues et les plus sévères surtout en milieu tropical
  • 4. par exemple il y a :les flagellés (Giardia intestinalis) responsables de giardiose,les sporozoaires(Cryptosporidium parvum)qui est responsables de cryptosporidiase les microsporidiesles toxoplasmales amibes…….etc.
  • 5. Giardia intestinalis 4. Dieu ne demandera pas quel était ton salaire le plus élevé.Il demandera si tu as fait des compromis pour l’obtenir.
  • 6. parmi toutes les protozoaires, la majorité provoquent des protozooses intestinales chez l’homme qui sont retrouves sous une forme de résistance appelé kyste, oocyste, spore.ils se répandent souvent-par manque d’hygiène liée aux selles(péril fécal)- par contact avec des animaux(anthropozoonose)- ou par manque de cuisson de nourriture contenantdes parasites alors quel est le meilleur prélèvement adapté pour étudier ces protozoaires ? -et comment pouvant les détecter ?
  • 7. les protozoaires sont actuellement lesparasites les plus fréquemment rencontrés aucours des examens parasociologiques desselles dans les laboratoires d’analysesmédicales.leur recherche nécessite souvent l’utilisationdes techniques de colorations appropriées etde concentrations. leur identification, aisée pour certains, plus délicate pour la plupart est basée sur leur observation au microscope mais aussi il existe des différentes techniques pour mettre en évidence ces protozoaires.
  • 8. l’examen coprologique  : •prélèvement de selles : •préparation - éliminer certains médicaments (charbon, laxatifs, baryte….) - éliminer certains aliments (féculents, certains fruits…)matériel Pots transparents, propre fermeture hermétique acheminemen t - Idéal.Selles fraîches prélevées au laboratoire - Si différé conservateur. froid,formol, mif……
  • 9. •examen direct microscopique : principe :seul examen à l’état frais permettant demettre en évidence les formes végétativesde protozoaires et d’étudier leur mobilité. soit -directement à partir du prélèvement des selles, entre lame et lamelle soit plus souvent après coloration d’un frottis de selles : par exemple coloration de ziehl-Nielsen modifiée pour les coccidies des (cryptospridium), coloration de weber pour les microsporidies,… soit enfin après des techniques de concentration pour ce qui concerne les parasites des selles.
  • 10. technique  :-déposer une goutte d’eau sur une lameport_objet propre-prélever un fragment des selle en plusieursendroits-réaliser un mélange homogène et recouvrird’une lamelle -observer au microscope au G 100 puis 400
  • 11. •techniques decoloration : 1. la coloration au lugol : elle est utilisée pour identifier des formes kystique de protozoaire dans les selles, elle permet de mieux visualiser certains éléments, d’identification vacuole, noyau, caryosome qui sont colorés en jaune brun.
  • 12. 2.coloration au MIF  : I) Réalisation  Réaliser un examen direct classique (une goutte deau sur une lame porte objet + un fragment des selles) ou utiliser le culot de centrifugation dune technique de concentration. Rajouter une goutte de MIF (Merthiolate, Iode, Formol)  II) Intérêt elle permet de mieux visualiser certains élément d’identification, le cytoplasme est coloré en rouge et les structures nucléaire en rouge sombre ou noire
  • 13. 3.coloration de ziehl_neelsenmodifié :elle se fait par faire un étalement mince dematière fécale sur un porte-objet(délayer les selles si elles sont trop solides)puis sécher a l’air puis ensuite le fixer auméthanol pendant 5 minutes cette coloration permet d’observer les oocytes de cryptosporidies qui sont coloré en rose sur fong vert.
  • 14.  Coloration de Weber I) Réalisation Faire une suspension de selles fraîches (et vortexer) Filtrer à laide dun porte filtre fixé sur un tube Falcon Etaler 10µL sur une lame Laisser sécher à lair Fixer le frottis dans du méthanol pendant 5 min Colorer au trichrome modifié pendant 90 min Rincer 10 secondes avec de lacide-alcool (4,5 mL dacide acétique + 995,5 mL dalcool à 90%) puis rincer brièvement avec de lalcool à 95% Déshydrater le frottis successivement dans de lalcool à 95% pendant 5 min puis dans de lalcool absolu pendant 10min et dans du xylène pendant 10 min Laisser sécher à lair Lire pendant 10 min au microscope optique (grossissement x1000, objectif 100 à limmersion) II) Intérêt Coloration utilisée pour mettre en évidence des spores de Microsporidies : - 1-5µm, coloration rose bipolaire sur fond bleu
  • 15. coloration de van gool : I) Réalisation Faire une suspension de selles fraîches (et vortexer) Filtrer à laide dun porte filtre fixé sur un tube Falcon Déposer une goutte sur une lame Laisser sécher à lair libre Fixer les lames dans du méthanol pendant 2 min Laisser sécher à lair libre Verser sur les lames une goutte de fluorochrome et laisser agir 10 min en protégeant les lames de la lumière Rincer dans du PBS pendant 2 à 5 sec Contre colorer avec une solution de bleu Evans dilué à 0,5% pendant 30 sec Rincer avec du PBS Laisser sécher à lair libreObserver au microscope à fluorescence au grossissement x400 (objectif 40) ou au ( grossissement x1000 (objectif 100 à limmersion II) Intérêt Alternative à la coloration de Weber pour la recherche de spores de Microsporidies.  Lutilisation dun fluorochrome permet daugmenter la sensibilité de lexamen . direct
  • 16. 6.coloration debaillenger :il colore chez les protozoaires intestinaux(kyste et trophozoites) le cytoplasme et lesbâtonnets cristalloïdes en rouge, lesstructures nucléaires en noire.
  • 17. •techniques deconcentration : 1.méthodes diphasiques ou physico- -chimiquePrincipe : mettre les selles en présence de 2 phases non miscibles : une aqueuse et une organique (éther)En plus de l’action dissolvante de l’éther, la mise enjeu de réalise pour chaque élément fécal uncoefficient de partage dont la valeur dépend de sabalance hydrophile / lipophile permettant ainsi deconcentrer les éléments fécaux dans le culot.
  • 18. thechnique de ritchie : Reactifs solution de formol à 10% et solution déther éthylique. intérêt  cette technique permet : d’augmenter la sensibilité de la recherche de formes kystiques les formes végétatives ne peuvent plus être en évidence après concentration.MIF concentration : intérêt  : C’est le même intérêt que Ritchie
  • 19. recherche d’antigène parasitairefiguré : la recherche des parasites au microscope peut faire par une réaction d’immunofluorescence.un frottis de selles dont lequel on recherche lesprotozoaires intestinaux est recouvert dans unpremier temps, d’un anticorps monoclonal spécifiquede l’antigène parasitaire recherché ;et dans undeuxième temps, un conjugué fluorescent spécifiquede l’Ig monoclonal. la lecture de frottis se fait au microscope. en lumière ultraviolette, les parasites sont brillants sur un fond sombre.
  • 20. sédimentation-flottation ausaccharose pour protozoaires :Cette technique est bien exécutée permet detrouver de rares formes végétatives de protozoairesalors que les kystes sont inexistants. Elle estd’exécution rapide et surtout recommandée quandl’examen direct a prouvé la présence de raresformes végétatives et qu’aucun kyste n’a étéretrouve pour pouvoir affirmer le diagnostic. Elle estutilisable sur des selles fixées au M.I.F.
  • 21. •ces méthodes sont longues et fastidieuses,présentent l’inconvénient majeur de ne pasdétecter spécifiquement les espèces et lesgénotypes des parasites présents dans leséchantillons analysés.
  • 22. techniques de biologie moléculaire Les techniques de biologie moléculaire connaissent actuellement un Essor considérable dans l’analyse d’échantillons environnementaux en autorisant une détection spécifique des microorganismes, basée sur leur génome La PCR (ou polymérase Chain réaction) peut ainsi détecter de façon rapide, spécifique et sensible les différentes espèces mais aussi les génotypes qui ne sont pas différenciables sur la base de critères morphologiques
  • 23. la PCR conventionnelle est basée sur l’analysedes résultats après amplification de l’ADN(d’une partie du génome), en revanche la PCRen temps réel développée plus récemmentpermet d’évaluer la quantité d’ADN initialementcontenue dans un échantillon l’utilisation d’une gamme étalon amplifiée de façon simultanée avec les échantillons à analyser, permet de connaître leur concentration initiale en microorganismes.
  • 24. conclusion  :Les troubles digestifs persistant sont des plainesfréquemment associées à une infection par lesprotozoaires. donc on a déjà vu que les techniquesclassiques de concentrations et de colorations sontbasés sur les critères morphologiques des parasites alors que le développement de techniques comme la PCR autorisant une détection spécifique au niveau des génotypes apporterait des données essentielles concernant l’étude des voies de transmission entre les différents hôtes et leur rôle dans la contamination de l’environnement.
  • 25. ces données permettraient notamment de mieuxévaluer la place de l’homme et des autresmammifères en tant que réservoirpour les différents génotypes de plusieursprotozoaires intestinaux.
  • 26. Fin