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la Culture cellulaire

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  • 1. Université farhat abbes. Faculté science de la nature et de la vie. Département de biologie et physiologie animale. Spécialité de Parasitologie médicale et vétérinaire(Master 1). la culture cellulaire
  • 2. Plan : 1-Définition 2-Types de cellules 3- Les types de culture cellulaire 4- Les conditions de culture 5- Origine et obtention des cellules 6-La culture des cellules 7- Les milieux de culture 8- Les matériels 9- Les contaminants 10- Conservation des cellules 11-Les avantages et les inconvénients 12- L’utilisation des cellules en culture
  • 3. Culture cellulaire 1-Définition: • En biologie, la culture cellulaire désigne un ensemble de techniques utilisées pour faire croître des cellules hors de leur organisme (ex-vivo) ou de leur milieu d'origine, dans un but d'expérimentation scientifique ou de fécondation in vitro.
  • 4. 2-Types de cellules Les cellules cultivées sont généralement décrites d'après leur morphologie (forme et apparence) ou leurs caractéristiques fonctionnelles. Il existe trois morphologies de base: 1. type épithélial: ces cellules sont attachées à un substrat et apparaissent plates et de forme polygonale.
  • 5. 2-Types de cellules 2. type lymphoblaste: ces cellules ne se fixent pas normalement à un substrat mais restent en suspension avec une forme sphérique. 3. type fibroblaste: ces cellules sont attachées à un substrat et apparaissent allongées et bipolaires.
  • 6. 3-Les types de culture cellulaire 1 •Culture primaire 2 •Culture secondaire 3 •Lignée cellulaire
  • 7.  La culture primaire • Les cellules des tissus sont dispersées par hydrolyse enzymatique des protéine constituant la matrice extracellulaire. La multiplication des cellules s’arrête quand un élément du milieu nutritif est épuisé. Quand elles sont cultivées sur support, leur croissance s’arrête par inhibition de contact. (c.à.d. quand elles forment un tapis confluent de monocouche cellulaire.)
  • 8.  La culture secondaire • Ce sont les cellules de la culture primaire qui sont utilisées pour ensemencer d’autres cultures et ainsi de suite : ce sont donc les cultures secondaires. Ces cellules ainsi obtenues conservent les caractéristiques du tissu d’origine mais leur nombre de divisions est limité comme dans l’organisme.
  • 9.  Culture secondaire repiquage Origine de cellule Culture primaire Culture secondaire
  • 10.  Les lignées cellulaires • ( durée de vie indéfinie ) : les cellule qui ont subi des modification génétique qui permettent leur croissance indéfini , elles proviennent de tumeurs spontanées ou de cellule transformées par immortalisation.
  • 11. 4-Les conditions de culture : • • Oxygène : Les cellules animales sont aérobies strictes, l’apport d’oxygène est donc indispensable. • • Température : Les cellules doivent être placées à la température qui correspond à celle de l’organisme (généralement à 37°C). • • pH : Les cellules doivent être placées au pH qui correspond à celle de l’organisme dont elles sont issues. • • Osmolarité : Afin de prévenir l’augmentation de l’osmolarité du milieu due à l’évaporation, l’atmosphère de l’incubateur doit être saturée en vapeur d’eau (humidité à 84-85%).
  • 12. 5-Origine et obtention des cellules On distingue 2 types de cellules dans l'organisme : les cellules circulantes ou libres, telles que les cellules sanguines, les cellules des tissus solides.
  • 13. 5-Origine et obtention des cellules Les premières sont récupérées facilement par centrifugation différentielle, alors que les secondes peuvent être récupérées selon 2 procédés : -migration cellulaires à partir d'explant -dissociation du tissu avec libération des cellules
  • 14. 6-La culture des cellules • Il existe deux types de cultures des cellules: • La culture en suspension. • La culture adhérentes. de cellules
  • 15. Culture en suspension (lymphocytes, moelle osseuse, certains types de tumeurs comme les tumeurs à petites cellules rondes…) : les cellules flottent dans le milieu et prolifèrent en suspension.
  • 16. La culture de cellules adhérentes Culture sur support: adhésion des cellules sur la paroi au fond du flacon ou de la boîte de culture.
  • 17. Milieu de culture –        Exigences cellulaire minimales -eau -ion minéraux (osmolarité) -source de carbone et d’énergie (glucose) -source d’azote acide aminés Source d’acide gras pH constant 7.4 Solution tampon (PBS)
  • 18. Milieu de culture Complément variable selon les milieux – Acide aminés – Vitamines et cofacteurs – Base azotées ribose et désoxyribose Mélange d’antibiotiques à 1% – pénicilline G – Streptomycine – antifongique
  • 19. Milieu de culture Glutamine à 1% Sérum de veau fœtale (SVF) – EGF (facteur de croissance épidermidique) – FGF (facteur de croissance fibroblastique) – Facteur d’adhésion – Inhibiteur à antitrypsine
  • 20. les matériels
  • 21. Les locaux (PSM)
  • 22. La culture cellulaire nécessite des conditions de stérilité absolues, toute contamination microbienne entraîne la lyse des cellules. De plus lorsque l'on fait de la production, le produit obtenu doit être stérile. C'est pourquoi on manipule dans des sales réservées à cet effet, On utilise de hottes à flux laminaires équipées de système de filtration d'air (PSM) et permet d'obtenir une zone de manipulation stérile.
  • 23. Le support
  • 24. • On utilise des supports pour les cellules adhérentes : • Boîte stériles en polystyrène : elles ne présentent pas de toxicité pour les cellules et permettent d'observer parfaitement les cellules en microscopie optique. On peut aussi utiliser des lames de verre ou des microplaques. Figure5
  • 25. Figure 5 : boites de culture des cellules adhérentes.
  • 26. • Les cellules non adhérentes sont cultivées dans les mêmes conditions mais se développent en suspension. Figure 6
  • 27. Figure 6 : les flacons de culture des cellules en suspension.
  • 28. Les étuves d’incubation Les cellules sont cultivées dans des étuves thermostatées (37°C pour les cellules de mammifères), avec 5% de CO2 sous forme gazeuse. Ces étuves doivent être décontaminées régulièrement.
  • 29. Les contaminants  Contaminants biologiques • Bactéries, levures, virus mycoplasmes  Contaminants chimiques • Endotoxines qualité de plastique  Contaminants croisé • Autres cellules
  • 30. La stérilisation
  • 31. La conservation des cellules
  • 32. 1. Congélation en présence • Agents cryo-protecteurs DMSO (diméthylsulfoxyde) • Glycérol Le DMSO protège les membranes lysosomiales et empêche le relargage des protéines
  • 33. 1. décongélation rapide à 37°C suivie d'un lavage et d'un contrôle de viabilité
  • 34.  Contrôle de viabilité • Dénombrement en présence d’un colorant pour estimation de viabilité cellulaire. • Bleu de Funk ou (Trypan) exclus dans des cellules vivantes et pénétrant dans des cellules mortes sous le microscope inversé.
  • 35. Les avantages et les inconvénients
  • 36. Les avantages - la plus part des tissus animaux et végétaux sont constitué de différent type de cellules, alors que des cellules de type spécifique avec des propriétés homogène peuvent être cultivé. -les conditions expérimentales, peuvent être nettement mieux contrôlées en culture que dans un organisme intacts.
  • 37. Les avantages -dans de nombreux cas, une cellule unique peut rapidement se développer en une colonie constituée de nombreuses cellules identiques, un processus appelé clonage cellulaire. Cette technique simple, permet d’isolé facilement des clones distincts de cellules.
  • 38. les inconvénients -Un des principaux inconvénients des cellules en culture est le fait qu’elles ne sont pas dans leur environnement normal et que, par conséquent, leurs activités ne sont pas régulées par les autres cellules comme dans le cas d’un organisme intact.
  • 39. les inconvénients -L’environnement immédiat des cellules en culture radicalement de leur environnement « normal », par conséquent, leurs propriétés peuvent être affectées de plusieurs façons.
  • 40. L’utilisation des cellules en culture L’étude des mécanismes de la physiologie cellulaire : contrôle de cycle cellulaire, métabolisme, régulation de l’expression du gènes, études des mouvements et des jonctions cellulaires. La culture cellulaire permet d’étudier la cellule eucaryote et ses relations avec son environnement.
  • 41. -En médecine humaine, la culture cellulaire est utilisée pour la réalisation de greffes et d’autogreffes (cellules souches sanguines), le dépistage des maladies génétiques (caryotype), la thérapie génique.
  • 42. L’industrie pharmaceutique est une grande utilisatrice de ces culture : étude pharmacologique et toxicologique de nouvelles molécules médicamenteuses, production des substances a usage thérapeutique (hormones de croissance, insuline, interférons et cytokines, anticorps monoclonaux) et production de vaccins.

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