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Funghi opportunisti
PATOGENI OPPORTUNISTI        Absidia corymbifera       Aspergillus fumigatus         Candida albicans     Crytococcus neof...
Candida albicansè un fungo dimorfico
CANDIDOSI• Provocate da Candida albicans e altre candida  spp. che costituiscono la normale flora nella  bocca, sulla pelle...
Infezioni sistemiche da     Candida si manifestano• In pazienti fortemente debilitati (es. cancro)• In diabetici• In pazie...
Terapia orale-fluconazolo etc
La transizione               lievito  ife             in vitro viene indotta da:•Aumento della temperatura (25° → 37°C)•Au...
IFE: pH 7.0 / 37°C
GERM TUBES
4-6 MICRONS
Pseudoifa            Clamidospore
DIAGNOSIdi Candida albicans
1. Osservazione macroscopica  • Candida: piastra dopo 24 oreColonie: inizialmente bianche, cremose, brillanti         poi ...
2. Osservazione microscopica• Forma:  rotondeggiante - ovale• Blastospore• Presenza di Pseudoife
3. Tests specifici• Test di blastèse:Mette in evidenza i tubi germinativi: filamenti che si formano  a partire dalle blastos...
3.1. Test di blastèse:                    Agitare                    Incubare 3h a                    37°CColtura   1 mlli...
3.2. Ricerca di clamidospore      Una goccia       Mettere un vetrino       di coltura                                    ...
Isolamento in Candida albicans    di geni differenzialmente espressi mediante DDRT-PCR
Isolamento di geni differenzialmente    espressi mediante DDRT-PCR
Omologia di CaGS con trasportatori            e sensori di glucosioIdentità     Similarità       Tipo di proteina         ...
Distruzione del gene mediante la     tecnica della cassetta
Reinserimento del gene CaGS nel locus di origine              null mutant   PstI    PstI          PstI                 ura...
Analisi per Southern                             CAI12   T1   T3   T5                       A                            ...
Analisi del fenotipo               su piastra               CAI12   T1      T3      T5                       etero   null ...
Infezione dei macrofagiCAI12      T1         T3
Aspergillusspecie (185), raccolte in ben 18 gruppimuffe ubiquitarie
Aspergillus fumigatusIfe settate di A. fumigatus     che si diramano  dicotomicamente in un   campione di tessuto
Aspergillus fumigatusPuò riprodursi fino a 50°C : uccelli infezionimortali (in particolare A. fumigatus).Nei rifiuti organ...
Aspergillosi
AspergillosiL’invasione del tessuto polmonare è limitata a soggetti immunodepressi.
Aspergillus fumigatus                  Fattori di Virulenza•dimensioni del tallo fungino maggiori di quelle dellecellule f...
MicotossineLe micotossine (un gruppo di circa 100 sostanze)metaboliti secondari di alcuni funghi filamentosi   Aspergillus...
Alimenti per lattanti e prima infanzia   Regolamento N. 683/2004aflatossina B1         0,10 µg/kgaflatossina M1         0,02...
AspergillosiTERAPIAIl trattamento con Amfotericina B è incoraggiante.
Una sostanza antifungina ottimale         dovrebbe avere...• Un ampio spettro di attività• Proprietà farmacocinetiche  ott...
Al momento esistono solo     Fungistatici Tossici      se somministrati      per lunghi periodi •   Amphotericin B •   Nys...
Candida è in grado di sopravvivereadattandosi agli ambienti più ostili,come quello all’interno dei macrofagi   •Regolazion...
    Isolamento di geni differenzialmente espressidurante l’infezione dei macrofagi    Studio della funzione dei geni iso...
Amphotericin BMeccanismo di Azione
Azoles   • Azoles    Imidazoles   Triazoles   • Causes Inhibition of     C-14 α demethylase,     (an enzyme required     f...
Imidazolo
Allyamines• Inhibits squalene  epoxidase, an enzyme  essential for synthesis  of ergosterol• Drug acculmulates in  nails, ...
Polyenes    • Amphotericin, nystatin    • Antifungal activity by      binding to membrane      sterols such as      ergost...
Amphotericin Bè in uso clinico dal 1960           • Un poliene macrolide           • Isolato dallo             Streptomyce...
Amphotericin B       é attiva in vitro contro• Candida spp.    (incluse le specie azolo-resistenti)•   Aspergillus spp.•  ...
Ridotta suscettibilità    (resistenza) all’ amphotericin B•   C. lusitaniae                      •   S. apiospermum•   C. ...
Resistenza all’ Amphotericin B• Resistenza all’ amphotericin B è  frequentemente osservata in vivo• Generalmente è dovuta ...
Amphotericin B    Amphotericin B è tossicaEffetti collaterali dell’ AmBNefrotossicitàDisfunzioni epaticheAnemia,..
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  1. 1. Funghi opportunisti
  2. 2. PATOGENI OPPORTUNISTI Absidia corymbifera Aspergillus fumigatus Candida albicans Crytococcus neoformans Pneumocystis carinii Rhizomucor pusillus Rhizopus oryzae (R.arrhizus)
  3. 3. Candida albicansè un fungo dimorfico
  4. 4. CANDIDOSI• Provocate da Candida albicans e altre candida spp. che costituiscono la normale flora nella bocca, sulla pelle, nella vagina e nell’intestino• Può manifestarsi in seguito a trattamenti con antibiotici che sopprimono la normale flora batterica e ne permettono una crescita maggiore
  5. 5. Infezioni sistemiche da Candida si manifestano• In pazienti fortemente debilitati (es. cancro)• In diabetici• In pazienti sottoposti a chemioterapia• Soggetti sottoposti a trapianto (immunosoppressi)• Nei leucemici• Nei malati di AIDS
  6. 6. Terapia orale-fluconazolo etc
  7. 7. La transizione lievito ife in vitro viene indotta da:•Aumento della temperatura (25° → 37°C)•Aumento del pH del mezzo (acido → basico)•Limitazione dei nutrienti (es. glucosio)•Siero
  8. 8. IFE: pH 7.0 / 37°C
  9. 9. GERM TUBES
  10. 10. 4-6 MICRONS
  11. 11. Pseudoifa Clamidospore
  12. 12. DIAGNOSIdi Candida albicans
  13. 13. 1. Osservazione macroscopica • Candida: piastra dopo 24 oreColonie: inizialmente bianche, cremose, brillanti poi diventano rugose
  14. 14. 2. Osservazione microscopica• Forma: rotondeggiante - ovale• Blastospore• Presenza di Pseudoife
  15. 15. 3. Tests specifici• Test di blastèse:Mette in evidenza i tubi germinativi: filamenti che si formano a partire dalle blastospore (nessun restringimento alla base)• Ricerca di clamidospore:Spore (endosporulazione) sferiche o ovali prodotte in condizioni avverse.
  16. 16. 3.1. Test di blastèse: Agitare Incubare 3h a 37°CColtura 1 mlliquida siero
  17. 17. 3.2. Ricerca di clamidospore Una goccia Mettere un vetrino di coltura Incubare 24 - 48h a 28°C Guardare al Terreno a microscopiobase di mais
  18. 18. Isolamento in Candida albicans di geni differenzialmente espressi mediante DDRT-PCR
  19. 19. Isolamento di geni differenzialmente espressi mediante DDRT-PCR
  20. 20. Omologia di CaGS con trasportatori e sensori di glucosioIdentità Similarità Tipo di proteina Organismo 47% 67% Snf3p S.cerevisiae 46% 67% Rgt2p “ 47% 65% Rag4 K.lactis 44% 61% Rco3 N.crassa 35% 59% Hxt2 S.cerevisiae 33% 60% CaHgt1 C.albicansE’ presente la sequenza consensus tipica dei trasportatori e sensoriper il glucosio: 334-[-G-I-i-l-V-E-t-W-G-R-R-p-l-l-m-a-g-S-]-351
  21. 21. Distruzione del gene mediante la tecnica della cassetta
  22. 22. Reinserimento del gene CaGS nel locus di origine null mutant PstI PstI PstI ura -/- HisG Afl III ATG TAA Afl II CaGS URA3 PCR2
  23. 23. Analisi per Southern  CAI12 T1 T3 T5 A CaGS 1600 ntAnalisi per Northern B rRNA
  24. 24. Analisi del fenotipo su piastra CAI12 T1 T3 T5 etero null revertYNB/2% gl.+ 10% sieroYNB/0.1%gl.+ 10% siero H2O + 10% siero M0199 pH 7.5
  25. 25. Infezione dei macrofagiCAI12 T1 T3
  26. 26. Aspergillusspecie (185), raccolte in ben 18 gruppimuffe ubiquitarie
  27. 27. Aspergillus fumigatusIfe settate di A. fumigatus che si diramano dicotomicamente in un campione di tessuto
  28. 28. Aspergillus fumigatusPuò riprodursi fino a 50°C : uccelli infezionimortali (in particolare A. fumigatus).Nei rifiuti organici quando la T ↑, gliaspergilli coltura pura.miceli simili a polvere verde-bluastro:fumigatus (latino fumoso).I conidiofori lunghezza di 500um, conidiformano catene parallele verdastri(Aspergillus in latino significa spazzola)
  29. 29. Aspergillosi
  30. 30. AspergillosiL’invasione del tessuto polmonare è limitata a soggetti immunodepressi.
  31. 31. Aspergillus fumigatus Fattori di Virulenza•dimensioni del tallo fungino maggiori di quelle dellecellule fagocitarie•dimensioni della spora 2 a 3 µm•l’energia meccanica del conidio in germinazione•Micotossine
  32. 32. MicotossineLe micotossine (un gruppo di circa 100 sostanze)metaboliti secondari di alcuni funghi filamentosi Aspergillus sp Penicillium sp Fusarium sp
  33. 33. Alimenti per lattanti e prima infanzia Regolamento N. 683/2004aflatossina B1 0,10 µg/kgaflatossina M1 0,025 µg/kgocratossina A 0,50 µg/kg
  34. 34. AspergillosiTERAPIAIl trattamento con Amfotericina B è incoraggiante.
  35. 35. Una sostanza antifungina ottimale dovrebbe avere...• Un ampio spettro di attività• Proprietà farmacocinetiche ottimali HOST FUNGUS• Adeguata efficacia in vivo• Bassa tossicità• Basso costo DRUG
  36. 36. Al momento esistono solo Fungistatici Tossici se somministrati per lunghi periodi • Amphotericin B • Nystatin • Ketoconazole • Fluconazole • Itraconazole
  37. 37. Candida è in grado di sopravvivereadattandosi agli ambienti più ostili,come quello all’interno dei macrofagi •Regolazione dell’espressione genica •Secrezione di proteinasi (SAP) •Produzione di ife
  38. 38.  Isolamento di geni differenzialmente espressidurante l’infezione dei macrofagi Studio della funzione dei geni isolati, perpoter individuare potenziali antifungini sui prodottiproteici
  39. 39. Amphotericin BMeccanismo di Azione
  40. 40. Azoles • Azoles Imidazoles Triazoles • Causes Inhibition of C-14 α demethylase, (an enzyme required for the synthesis of ergosterol) by binding to cytochrome P450
  41. 41. Imidazolo
  42. 42. Allyamines• Inhibits squalene epoxidase, an enzyme essential for synthesis of ergosterol• Drug acculmulates in nails, skin and fat• Very useful for nail infections
  43. 43. Polyenes • Amphotericin, nystatin • Antifungal activity by binding to membrane sterols such as ergosterol and they increase membrane permeability and leads to cell death
  44. 44. Amphotericin Bè in uso clinico dal 1960 • Un poliene macrolide • Isolato dallo Streptomyces nodosus • Insolubile in acqua • Solubilizzato in sodio deossicolato
  45. 45. Amphotericin B é attiva in vitro contro• Candida spp. (incluse le specie azolo-resistenti)• Aspergillus spp.• Cryptococcus neoformans• Mucor spp.• Blastomyces dermatitidis• Coccidioides immitis• Histoplasma capsulatum• Paracoccidioides brasiliensis
  46. 46. Ridotta suscettibilità (resistenza) all’ amphotericin B• C. lusitaniae • S. apiospermum• C. krusei • Fusarium spp.• C. neoformans • C. carrionii• Trichosporon spp. • F. pedrosoi• A. terreus • ... Walsh et al. JCM 1990; 28: 1616 Sutton et al. JCM 1999; 37: 2343 Arikan et al. JCM 1999; 37: 3946 Arikan et al. JCM 2002; 40: 1406
  47. 47. Resistenza all’ Amphotericin B• Resistenza all’ amphotericin B è frequentemente osservata in vivo• Generalmente è dovuta ad una riduzione dell’attività del sistema immunitario
  48. 48. Amphotericin B  Amphotericin B è tossicaEffetti collaterali dell’ AmBNefrotossicitàDisfunzioni epaticheAnemia,..
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