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Découvrez le vaccin contre le paludisme
 

Découvrez le vaccin contre le paludisme

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En suivant ce protocole, les jeunes participent à la recherche visant à mettre au point un vaccin contre le paludisme qui, associé aux mesures actuelles, pourrait contribuer de manière ...

En suivant ce protocole, les jeunes participent à la recherche visant à mettre au point un vaccin contre le paludisme qui, associé aux mesures actuelles, pourrait contribuer de manière significative à un meilleur contrôle de cette importante maladie due à un parasite. Les étudiants testeront différents candidats-vaccins en utilisant une technique appelée ELISA, puis décideront quel est le candidat le plus efficace. Le protocole expérimental est l’occasion, pour les centres scientifiques, les musées et les écoles, de reproduire une expérience réelle effectuée dans un laboratoire travaillant à la mise au point d’un vaccin contre le paludisme.

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    Découvrez le vaccin contre le paludisme Découvrez le vaccin contre le paludisme Document Transcript

    • Découvrez le vaccincontre le paludismeAtelier d’expérimentationPROTOCOLE
    • IntroductionLe paludisme est considéré comme la maladie ventions sont menées à bien sous la forme dela plus importante du monde due à un parasite différentes mesures combinées comprenantet est responsable du décès de près de l’utilisation de moustiquaires imprégnées800 000 personnes chaque année, en particulier d’insecticide, d’aérosols insecticides et de trai-d’enfants de moins de cinq ans et de femmes tements de prévention, ainsi que l’implantationenceintes. Selon l’Organisation mondiale de la de programmes éducatifs et d’interventionssanté (OMS), près de 3 000 millions de personnes environnementales, entre autres.risquent de contracter l’infection, et 225 millionsde cas de paludisme se sont produits dans le La communauté scientifique travaille inten-monde en 2010, dont 90 % ont eu lieu en Afrique. sément pour mettre au point un vaccin qui, associé aux mesures actuelles, pourrait contri-De nos jours, le paludisme est endémique dans buer de manière significative, selon les experts,plus de 100 pays localisés en Afrique subsa- à un meilleur contrôle du paludisme. Il existeharienne et dans les régions du sud de l’Asie, déjà actuellement un vaccin en phase d’étuded’Amérique latine et d’Océanie. Les derniers clinique, qui sera efficace dans 50 % des cas.rapports montrent que la moitié de la populationmondiale vit dans des zones présentant un risquede contracter la maladie et où le paludisme n’apas seulement des conséquences sur la santé dela population, mais contribue aussi à fragiliserdavantage la situation économique de la zone. Cet atelier vous permettra d’étudier différents candidats-vaccins afin de déciderAfin d’éradiquer la maladie dans les zones à quel candidat est le plus efficace.haut risque de transmission, plusieurs inter- Pays ou zones où a lieu la transmission du paludisme Pays ou zones à risque réduit de transmission du paludismeSource : Organisation mondiale de la santé (OMS). Données de 2009 2
    • Comment se transmet le paludisme ? Pourquoi un vaccin contre le paludisme est-il nécessaire ?Le paludisme est une maladie infectieusetransmise par la piqûre d’un moustique du Historiquement, les vaccins ont constitué l’ungenre Anopheles qui transmet des parasites des moyens les plus efficaces pour prévenirdu genre Plasmodium et agit par conséquent des maladies et sauver des vies, en particuliercomme un vecteur. Au sein de l’organisme dans le cas des maladies infectieuses. L’obten-humain, les parasites se multiplient dans le tion d’un vaccin partiellement efficace pourraitfoie pour infecter ensuite les globules rouges. représenter la possibilité de sauver des cen-Parmi les symptômes du paludisme, les plus taines de milliers de vies.significatifs sont la fièvre, les maux de têteet les vomissements, survenant 10 à 15 jours L’obtention d’un vaccin impliquera une avan-après la piqûre du moustique. cée majeure. Il pourra être ajouté à l’arsenal actuel de mesures utilisées pour la prévention du paludisme, telles que les moustiquaires imprégnées d’insecticide ainsi que le traitement opportun et adéquat des cas diagnostiqués deQuelles sont les interventions paludisme.mises en place pour contrôler lepaludisme ? Comme son efficacité à court terme seraLes principales interventions pour contrôler le partielle, il ne remplacera pas ces mesures,paludisme sont réparties en plusieurs groupes : mais les complètera, constituant ensemble une réponse complète pour la prévention du palu- disme.1 Des stratégies contre le moustique ou vecteur, telles que la fumigation des espaces fermés à l’aide d’insecticides. d’2 Des stratégies permettant d’éviter le contact vecteur- hôte, comme l’utilisation de moustiquaires imprégnées d’insecticide.3 Des stratégies contre le parasite. Ce dernier groupe comprend le traitement à base d’une association de médicaments mis au point à partir d’une moléculeappelée artémisinine, qui est rapide et efficace.Un vaccin serait aussi une stratégie de contrôledu parasite qui, en combinaison avec d’autresstratégies, pourrait contribuer de manièresignificative à l’éradication du paludisme. 3
    • Que faisons-nous à l’ISGLOBAL, l’Institut de santé globale de Barcelone ?L’Institut de santé globale de Barcelone 1. Étude des bases moléculaires de la mala-(ISGlobal) est une organisation à but non die, ainsi que des différentes réponseslucratif, dont l’objectif est d’améliorer la santé immunitaires.et le développement des populations les plusvulnérables par la génération, la gestion, la 2. Mise au point de nouveaux médicamentstransmission et l’application de connaissances. et évaluation de leur sécurité, efficacité etSa vision est un monde où nous puissions tous effectivité.être en bonne santé et il compte avec le soutiende l’œuvre sociale « la Caixa », entre autres 3. Évaluation des caractéristiques épidémio-institutions. logiques du paludisme au sein de différents environnements et des aspects sociocultu-L’un des piliers essentiels de l’ISGlobal est la rels qui l’entourent.recherche centrée sur les problèmes de santéaffectant les populations les plus vulnérables 4. Analyse de l’efficacité de différents outils deet elle se déroule au Centre de recherche sur la prévention, ainsi que du rapport coût/efficacitésanté internationale de Barcelone (CRESIB). La des interventions.recherche sur le paludisme effectuée au CRESIBest consacrée aux travaux suivants : Dans le cadre du point (4), le CRESIB réalise des études cliniques de sécurité, d’efficacité et d’effectivité des vaccins. Il participe actuelle- ment à la mise au point du vaccin RTS,S contre le paludisme, qui est efficace chez plus de 50 % des enfants infectés. Parallèlement, le travail des chercheurs du CRESIB porte sur l’identifi- cation de nouveaux candidats-vaccins. 4
    • Objectifs de l’atelier 1Dans le cadre de cet atelier, nous vousproposons de travailler sur différentscandidats-vaccins contre le paludisme en coursd’étude au CRESIB, pour identifier le meilleurcandidat. Les candidats-vaccins du CRESIB ontété obtenus à partir de protéines du parasitepréalablement purifiées.Afin de procéder à leur étude, vous disposerezde plusieurs échantillons de sang de personnesrésidant dans des zones affectées par lepaludisme, qui ont déjà souffert de la maladie àplusieurs reprises et sont immunisées.Pour confirmer l’efficacité de nos candidats-vaccins, nous devons vérifier si les personnesimmunisées ont développé une réponse contreces candidats. Si une activation de la réponseimmunitaire contre les protéines candidates 2est observée, cela signifie qu’elles pourraientconstituer de bons candidats-vaccins carelles pourraient aussi déclencher la réponsenécessaire à la protection contre de futuresinfections. 3 5
    • Cet atelier a pour vocation de vous familiariser contre les candidats indique la capacité àavec l’une des techniques les plus utilisées dans déclencher une bonne réponse immunitaire etles laboratoires de biomédecine, la technique qu’il peut donc s’agir d’un bon candidat.ELISA (« Enzima Linked Immuno Sorbent Assay »). Grâce à cette technique, nous découvrirons enIl s’agit d’une analyse permettant de détecter particulier lequel des antigènes disponiblesla présence d’anticorps dans les échantillons dans le laboratoire est un bon candidat-vaccinde sang. La présence d’anticorps spécifiques contre le paludisme. Principes fondamentaux de la technique ELISALe principe fondamental de cette technique Pour mener à bien l’identification, nous utili-repose sur l’interaction du candidat-vaccin, ou sons des anticorps liés à une molécule appeléeantigène (1), avec l’anticorps (2). Un anticorps enzyme (3) ayant la capacité de réagir avec unespécifique se lie à un antigène spécifique pour substance appelée substrat (4) que nous ajou-former un complexe antigène-anticorps exclusif. tons, et de produire une couleur.La technique ELISA nous permet de mettre Ainsi, si l’échantillon contient l’anticorps que nousen évidence la présence des anticorps et, par voulons détecter, celui-ci se lie à celui que nousconséquent, la formation de complexes anti- ajoutons lié à une enzyme, ce qui fait apparaîtregène-anticorps lors du contact des échantillons un changement de couleur du substrat, nous indi-de sang avec les candidats-vaccins. quant de cette manière un résultat positif. Substrat Enzyme Anticorps Antigène1. Antigène : toute substance étrangère susceptible de se lier de manière spécifique aux anticorps ou lymphocytes spé- cifiques et de déclencher une réponse immunitaire. En général, les antigènes ont un poids moléculaire élevé et sont normalement des protéines ou des polysaccharides.2. Anticorps : protéines (immunoglobulines - Ig) du sérum générées en réponse à l’invasion de molécules étrangères dans l’organisme, soit par exposition naturelle à un antigène, soit par immunisation au moyen de vaccins. Ils ont la forme d’un Y et sont constitués de quatre chaînes polypeptidiques liées grâce à des liaisons disulfures intercaténaires. Les anticorps possèdent une région constante et une région variable.3. Enzyme : protéine contribuant aux réactions spécifiques du métabolisme.4. Substrat : solution contenant un composé sur lequel agira une enzyme. 6
    • Organisation de l’atelierAfin de découvrir lequel des candidats-vac- des anticorps contre ceux-ci.cins ou antigènes est le plus efficace, nous Pour ce faire, l’expérience est divisée enanalysons si les échantillons de sang de per- 3 étapes principales.sonnes immunisées contre le paludisme ont1. LIAISON DES PROTÉINES CANDIDATES (OU ANTIGÈNES) À LA SURFACE DES PUITSLa première étape consiste à fixer les protéines candidates faisant l’objet de l’étude sur un support solide.2. FORMATION DE COMPLEXES ANTIGÈNE-ANTICORPSNous ajoutons ensuite les échantillons de sang, plus précisément le sérum (correspondant auxéchantillons de sang après extraction des cellules et des facteurs de la coagulation), et un anticorpsmarqué par une enzyme que nous appelons anticorps secondaire. Les échantillons de sang conte-nant l’anticorps à étudier présentent la formation de complexes antigène-anticorps, qui se lient àleur tour à l’anticorps marqué par l’enzyme. Sérum Anticorps des patients secondaire marqué par une enzyme3. LECTURE DE LA RÉACTIONEnfin, nous ajoutons le substrat de l’enzyme, qui, en présence du complexe antigène-anticorps,change de couleur. Nous pouvons ainsi savoir si les échantillons de sang contiennent l’anticorps àétudier et la quantité d’anticorps. Substrat de l’enzyme Résultats et conclusionsLes résultats obtenus permettent de décider immunitaire plus intense et peut donc être lequel candidat-vaccin déclenche une réponse meilleur candidat. 7
    • Équipement et matérielnécessaireInstruments et ustensiles de laboratoire Agitateur magnétique (1) Noyau magnétique et Micropipette (pour préparer le PBS-Tween) « extracteur de noyaux » de 20 à 200 µl (2) Éprouvette Flacon en verre de Chronomètre Entonnoir de 100 ml 250 mlConsommables Barrettes de 12 puits Pipettes Pasteur en Pointes pour micropipette d’ELISA et portoirs plastique graduées Papier absorbant Feutre permanent Gants, lunettes et blouse1. Si vous ne disposez pas d’agitateurs magnétiques, vous pouvez acheter le PBS liquide2. Si vous ne disposez pas de micropipettes, vous pouvez utiliser des pipettes Pasteur de petit volume 8
    • Réactifs et échantillons Solution tampon PBS (3) Détergent Tween-20 (4) Eau distillée Anticorps secondaire A B C+ C- Candidats-vaccins Contrôles positifs Anticorps secondaire (antigènes) et négatifs (5) lié à une enzyme (peroxydase) Substrat 1 2 3 4 Substrat ou solution Échantillons de sérum de quatre personnes résidant révélatrice dans des zones où le paludisme est endémique, qui sont immunisées contre la maladie3. Permet de maintenir le pH de la solution grâce aux phosphates de sodium et de potassium.4. Permet de prévenir des liaisons d’anticorps non spécifiques.5. C+ : contient un mélange de sérums de personnes résidant dans des zones où le paludisme est endémique, qui sontimmunisées contre la maladie. C- : mélange de sérums de personnes n’ayant jamais été exposées au paludisme. 9
    • ProcéduresPour déterminer la présence ou l’absence d’an- résidant dans des zones où le paludisme estticorps spécifiques contre les deux antigènes endémique avec ces antigènes afin d’observercandidats-vaccins disponibles dans le labora- si des anticorps spécifiques contre nos anti-toire, nous mettons en contact le sang (plus gènes sont présents dans ces sérums.précisément le sérum) de différents patients 1 Liaison des antigènes à la surface des puitsLes barrettes de micropuits sont recouvertes de La liaison de ces antigènes à la surface descandidats-vaccins (antigènes) à analyser pour puits se produit facilement car ces derniersdécouvrir s’il s’agit de bons candidats-vaccins sont constitués d’un plastique traité ayant unecontre le paludisme. grande affinité pour lier des protéines.PROTOCOLE POUR LA LIAISON DES ANTIGÈNES À LA SURFACE DES PUITS1 Annotez ensuite le contenu de chaque puits (contrôles, échantillons de sang et nom des antigènes à étudier).2 Étiquetez les puits en marquant le lieu de dépôt de chaque échantillon. 10
    • 3 Préparez une solution de lavage (PBS-Tween à 0,05 %).A B Mesurez 200 ml d’eau distillée à l’aide de l’éprouvette et complétez au volume avec Introduisez le noyau magnétique dans le la pipette Pasteur. Versez les 200 ml d’eau flacon et diluez dans l’eau une pastille de distillée dans le flacon à l’aide de l’entonnoir. PBS à l’aide de l’agitateur magnétique.C D Après dissolution de la pastille, procédez à l’extraction du noyau magnétique et ajoutez 100 µl de Tween-20 à l’aide d’une pipette Agitez bien le contenu du flacon en le Pasteur en plastique. retournant plusieurs fois.Remarque : La solution de lavage contient du PBS (phosphate buffer saline) permettant de maintenir les anticorps dans unenvironnement stable qui aide à la conservation de leur structure. Le Tween-20 est un détergent permettant d’éliminer les pro-téines liées de manière non spécifique. Il se lie aux parties du puits non recouvertes d’antigène, réduisant ainsi le bruit de fond. 11
    • 4 5 Ajoutez les deux antigènes à étudier aux puits correspondants à l’aide de la micropipette (50 µl par puits). Il est important d’utiliser une pointe propre pour déposer les antigènes, afin d’éviter des contaminations. Laissez incuber pendant 5 minutes à température ambiante.6 7 Lavez pour éliminer l’excès d’antigène non Éliminez les résidus d’antigène en lié à la barrette. Pour ce faire, remplissez retournant la barrette sur un papier les puits avec la solution de lavage à l’aide absorbant. d’une pipette Pasteur en plastique.8 9Éliminez la solution de lavage en retournantla barrette sur un papier absorbant. Répétez une fois les étapes 7 et 8. 12
    • 2 Formation de complexes antigène-anticorpsAu cours de cette étape, nous préparons par une enzyme appelée peroxydase. Commed’abord le sérum des patients pour détecter la chaque anticorps primaire peut être lié à plusprésence d’anticorps contre le candidat-vaccin. d’un anticorps secondaire, nous observeronsNous appelons anticorps primaires ces anti- une augmentation de la quantité de couleurcorps que nous voulons analyser. Nous ajou- obtenue lors de l’étape trois. La technique seratons ensuite un anticorps secondaire marqué ainsi plus sensible. Anticorps Sérum secondaire marqué des patients par une enzymePROTOCOLE DE FORMATION DE COMPLEXES ANTIGÈNE-ANTICORPS1 2 Ajoutez les contrôles positifs et négatifs Ajoutez les différents échantillons aux puits correspondants à l’aide de la de sérums de quatre personnes micropipette (50 µl par puits). résidant dans des zones où le Le contrôle positif (C+) contient un paludisme est endémique aux mélange de sérums de personnes résidant puits correspondants à l’aide de la dans des zones où le paludisme est micropipette (50 µl par puits). endémique, qui sont immunisées contre la maladie. Le contrôle négatif (C-) contient un mélange de sérums de personnes n’ayant jamais été exposées au paludisme. 13
    • 3 4 Laissez incuber pendant 5 minutes à Éliminez l’excès d’échantillon par retournement température ambiante. de la barrette sur un papier absorbant.5 6 Lavez tous les puits afin d’éliminer les anticorps n’ayant pas réagi avec les antigènes, qui sont par conséquent non spécifiques. Remplissez les puits avec la Éliminez la solution de lavage par solution de lavage à l’aide d’une pipette retournement de la barrette sur un Pasteur en plastique. papier absorbant.7 8 Ajoutez l’anticorps secondaire lié à une enzyme à tous les puits à l’aide de la Répétez deux fois les étapes 5 et 6. micropipette (50 µl par puits). 14
    • 9 10 Éliminez l’excès d’anticorps secondaire Laissez incuber pendant 5 minutes à par retournement de la barrette sur un température ambiante. papier absorbant.11 12 Lavez les puits en les remplissant avec Éliminez la solution de lavage par la solution de lavage à l’aide d’une retournement de la barrette sur un pipette Pasteur en plastique. papier absorbant.13 Répétez trois fois les deux étapes précédentes. 15
    • 3 Lecture de la réactionÀ la fin du lavage pour éliminer toutes lesmolécules marquées non liées sous la formede complexes antigène-anticorps, ajoutez lesubstrat enzymatique en solution, qui faciliterale changement de couleur. Substrat de l’enzymePROTOCOLE DE LA LECTURE DE LA RÉACTION1 2 Ajoutez le substrat de l’enzyme à Laissez incuber pendant 5 minutes au l’ensemble des puits à l’aide de la cours desquelles le substrat se lie à micropipette (50 µl par puits). l’enzyme pour faire apparaître la couleur à température ambiante. 16
    • 3 Annotez les résultats sous la forme d’un graphique à barres.ANTIGÈNE 1maximum Intensitéminimum Échantillons C+ C- M1 M2 M3 M4ANTIGÈNE 2maximum Intensitéminimum Échantillons C+ C- M1 M2 M3 M4 17
    • Résultats et conclusions Interprétez et notez les résultats 1. Quel antigène parmi ceux que vous avez analysés est, selon vous, le meilleur candidat-vaccin ? Pensez-vous que les antigènes que vous avez analysés sont des bons candidats-vaccins ? Pourquoi ? 2. Quand une réaction est-elle positive ou négative ? Pourquoi ? 3. Pourquoi, selon vous, faut-il utiliser les contrôles ? 18
    • 4. Quelle partie de l’anticorps primaire est reconnue par l’anticorps secondaire : la régionconstante ou la région variable ? Justifiez la réponse.5. Que se passerait-il si les lavages n’étaient pas effectués avant l’ajout du substrat révélateur ?6. Du sang des collègues de votre classe peut-il être utilisé pour déterminer si nos antigènesde laboratoire sont de bons candidats pour mettre au point un vaccin contre le paludisme ?Justifiez la réponse.7. Pensez-vous que cette expérience ait démontré que le candidat sélectionné déclenche laréponse immunitaire ? Faut-il effectuer un autre type d’expérience en vue d’évaluer s’il estaussi capable de déclencher un autre type de réponse ? 19
    • Annexe I PORT DES LUNETTES PORT DE LA BLOUSE PORT DES GANTS OBLIGATOIRE OBLIGATOIRE OBLIGATOIREConsignes de sécuritéINFORMEZ-VOUS et lavez-vous souvent les mains si vous utilisezLocalisez les éléments de sécurité du labora- des produits toxiques ou corrosifs. N’approcheztoire ou de l’espace prévu pour effectuer des pas des récipients contenant des réactifs d’uneexpériences (extincteurs, douches ou bain, flamme. Ne chauffez pas des liquides inflam-sorties, etc.). Veuillez lire attentivement les ins- mables. Transportez les flacons en les tenanttructions avant de commencer une expérience. par le fond, en aucun cas par l’ouverture.N’oubliez pas de lire les étiquettes de sécuritédes réactifs et des appareils. ÉLIMINATION DES DÉCHETS Déposez dans des conteneurs prévus à cet effetUTILISEZ DES VÊTEMENTS ADÉQUATS et dûment identifiés le verre cassé, les réactifsGants, blouse et lunettes de protection. toxiques, nocifs ou néfastes pour l’environ- nement et les déchets biologiques. Ne jetezRÈGLES GÉNÉRALES jamais des résidus solides dans l’évier.Il est interdit de fumer, de manger ou de boiredans le laboratoire ou l’espace prévu pour En cas d’accident, prévenez immédiatementeffectuer des expériences. l’éducateur. Rappel : en cas de doute, veuillezLavez-vous les mains avant de sortir du labora- consulter l’éducateur.toire. Travaillez de manière ordonnée, propre-ment et calmement. Si un produit se répand sur PRÉCAUTIONS SPÉCIFIQUESle sol ou sur la paillasse, nettoyez-le immédia- À PRENDRE LORS DE CET ATELIERtement. Nettoyez et rangez le matériel. N’utili- Au cours de cette pratique, vous devez manipulersez jamais un équipement ou un appareil sans les réactifs en respectant les précautions cou-connaître parfaitement son fonctionnement. rantes prévues pour la manipulation des produits chimiques. Seuls les produits présentant les degrésMANIPULATION DU VERRE de danger suivants sont indiqués ci-dessous :Protégez-vous les mains lorsque vous manipulez du  matériel en verre. N’utilisez pas du verre fissuré. • PBS : toxique par ingestion, inhalation et contactPRODUITS CHIMIQUES avec la peau.  N’utilisez jamais un flacon de réactifs sans    étiquette. Ne sentez, n’inhalez, ne goûtez et • Tween 20 :ne touchez jamais les produits chimiques. Ne toxique par ingestion, inhalation et contactpipetez jamais avec la bouche. Mettez des gants avec la peau. Irritant.Annexe IIRéférences des réactifsNOM RÉFÉRENCE SOCIÉTÉ COMMERCIALEPBS P4417-50TAB SigmaTween-20 P1379-100ML SigmaCHK IGY, bagged (= ANTIGÈNE) 1662406EDU BioRadRB ANTI-CHK, bagged (= PLASMA) 1662407EDU BioRadGAR-HRP, bagged (= ANTICORPS SECONDAIRE) 1662408EDU BioRadSUBSTRAT RÉVÉLATEUR 1662402EDU BioRad 20
    • Continuez vos recherches sur Xplore Health !Chercheurs ayant collaboré avec les contenus : Laura Puyol, chercheuse au CRESIB, ISGlobal. MIS AU POINT PAR Cet ouvrage est sous une licence Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported de Creative Commons. Pour voir une copie de la licence, consultez le lien suivant : http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/