Processos fermentativos
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Processos fermentativos

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  • 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁSETOR DE TECNOLOGIADEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA PROCESSOS FERMENTATIVOS Trabalho acadêmico apresentado à disciplina Processos Fermentativos Industriais da Universidade Federal do Paraná ministrada. CURITIBA 2008
  • 2. 1SUMÁRIO1- USO DE MICRORGANISMOS NA FERMENTAÇÃO.................................... 22- DEFINIÇÃO DE FERMENTAÇÃO.................................................................. 83- METABOLISMO MICROBIOLÓGICO............................................................ 10 3.1- FERMENTAÇÃO ETANÓLICA................................................................. 15 3.2- FERMENTAÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO................................................... 19 3.3- FERMENTAÇÃO DO GLICEROL............................................................ 20 3.4- FERMENTAÇÃO ACETONA-BUTANÓLICA........................................... 22 3.5- FERMENTAÇÃO BUTANOL-ISOPROPANÓLICA................................... 24 3.6- FERMENTAÇÃO ACETONA-ETANÓLICA.............................................. 25 3.7- FERMENTAÇÃO DO ÁCIDO PROPIÔNICO........................................... 26 3.8- FERMENTAÇÃO DO ÁCIDO CÍTRICO................................................... 274- CULTIVO DE CÉLULAS MICROBIANAS...................................................... 28 4.1- BACTÉRIAS............................................................................................. 28 4.2- FUNGOS.................................................................................................. 29 4.3- LEVEDURAS............................................................................................ 295- CULTIVO DE CÉLULAS ANIMAIS E VEGETAIS.......................................... 316- APLICAÇÕES DA FERMENTAÇÃO.............................................................. 35 6.1- PRODUÇÃO DE ALIMENTOS................................................................. 36 6.2- PRODUÇÃO DE ANTIBIÓTICOS............................................................ 39 6.3- PRODUÇÃO DE ENZIMAS...................................................................... 40 6.4- PRODUÇÃO DE ANTICORPOS.............................................................. 40 6.5- PRODUÇÃO DE INOCULANTES............................................................ 41 6.6- TRATAMENTO AMBIENTAL................................................................... 42 6.7- PRODUTOS RECOMBINANTES............................................................. 437- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................... 468- ANEXO............................................................................................................ 49
  • 3. 21- USO DE MICRORGANISMOS NA FERMENTAÇÃO A utilização de microrganismos na biotransformação da matéria vem desde aantiguidade. Através da observação do ambiente ao seu redor, o ser humanopassou a perceber que certos processos se desenvolviam devido à presença demicrorganismos no meio. A descoberta de microrganismos que podiam modificar umdeterminado substrato possivelmente foi feita ao acaso, como ao perceber que acarne seca resistia a deteriorização; ou que ao deixar o leite azedar era possívelretirar o líquido do coalho para fabricar queijo; ou ainda que ao secar os grão antesda estocagem era possível evitar o aparecimento de fungos. (TORTORA et al.,2006) A partir dessas observações, foi possível estudar mais a fundo e utilizar essesmicrorganismos de forma a atender da melhor forma as nossas necessidades. Os babilônios e os sumérios usavam leveduras na produção de álcool antesde 6000 AC (NAJAFPOUR, 2007). Já os egípcios, em 2000 AC, utilizavam leveduraspara a produção de pães. Na Ásia, antes do nascimento de Cristo, utilizava-sePenicillium rouquefortii na produção de queijos. A 2500 anos atrás, na China, ofungo Aspergillus oryzae era usado no processo de fabricação de koji, que foi levadotambém para o Japão no século VII (PANDEY et al., 2007). Na metade do século XIX, Luis Pasteur estudou a função de microrganismosna produção de vários produtos como alimentos fermentados, vinho, cervejas,queijo, leite, iogurte, combustíveis e química fina. Ele identificou muitos processosmicrobiológicos e descobriu um dos principais princípios da fermentação: a utilizaçãode substratos por microrganismos para a produção de metabólitos primários esecundários de interesse ao homem (NAJAFPOUR, 2007). Através do isolamento de alguns microrganismos e cultivo em meioadequado, Pasteur também conseguiu desvendar a base do que hoje recebe onome de biotecnologia. Para se conseguir um bom rendimento muitas vezes énecessária presença de um cultivo puro com somente um microrganismo isolado eevitar o aparecimento de microrganismos indesejados, que podem alterar oprocesso. Além disso, uma vez terminado o processo, é necessário que osmicrorganismos presentes também sejam “desativados”. Para isso, Pasteurdesenvolveu em 1864 o processo de pasteurização, que consiste em aquecer umdeterminado meio a uma temperatura de 60ºC por 30 minutos (SCHWARTZ, 2001).
  • 4. 3 Durante a Primeira Guerra Mundial começou-se a utilizar microrganismospara a produção de substâncias como etanol, acetona e ácido cítrico. Foi duranteesse período que foi feito pela primeira vez um cultivo microbiológico asséptico emlarga escala, quando Chaim Weizmann usou um fermentador líquido para aprodução de acetona por Clostridium acetobutylicum (STANBURY et al.,1995). Apartir da Segunda Guerra Mundial, os microrganismos tiveram importância naprodução em larga escala de antibióticos. (TORTORA et al., 2006) As usinas de bioprocessos são muito importantes na indústria de alimentos,química fina, e farmacêutica. Apesar de que a produção de produtos como cervejas,vinhos e queijos já vêm acontecendo desde a antiguidade, atualmente a produção émuito mais controlada e eficiente (NAJAFPOUR, 2007). Por exemplo, primeiramente,os pães eram fermentados com leveduras presentes no meio ambiente. Mais tardepassou-se a manter uma cultura própria de leveduras, guardando uma parte daprodução anterior para servir de inóculo para a próxima. Atualmente pode-secomprar o fermento produzido industrialmente de forma padronizada. (TORTORA etal., 2006) Processos como a produção de pães, vinhos e queijos, que antes eramrealizados em casa ou pequenas propriedades, passaram a ser realizados emgrades indústrias, evidenciando a grande vantagem que a microbiologia pode dar àindústria (PRESCOTT et al., 1959). Exemplificando, pode-se citar a ação de leveduras em extratos de frutas ougrãos, fazendo fermentação alcoólica, onde os carboidratos são reduzidos a piruvatoe então ocorre a reoxidação da forma reduzida da nicotinamida adeninadinucleotídeo (NADH) e a produção de moléculas de etanol. Outro tipo defermentação inclui o cultivo de bactérias acéticas na produção de vinagre. Bactériaslácteas são responsáveis pela preservação do leite, produção de iogurte e queijo.Num cultivo pode-se visar também à produção de biomassa, onde as células estãoem meio nutritivo que favorece a multiplicação, como na produção de fermento(NAJAFPOUR, 2007). A tabela 1 mostra alguns produtos de fermentação.
  • 5. 4Tabela 1- Produtos de origem fermentativaProduto da Microrganismo AplicaçãofermentaçãoEtanol (não utilizado Saccharomyces cerevisiae Química finaem bebidas)Ácido 2-cetoglucônico Pseudomonas sp. Intermediário para o ácido D- araboascórbicoPectinase, protease Aspergillus niger, A. aureus Agente clarificante em sucos de frutasAmilase bacteriana Bacillus subtilis Amido modificado, tratamento de papelProtease bacteriana B. subtillis Tratamento de fibras, removedor manchasDextrano Leuconostoc mesenteroides Estabilizante alimentícioSorbose Gluconobacter suboxydans Manufatura de ácido ascórbicoCobalamina (vitamina Streptomyces olivaceus Suplemento alimentarB12)Ácido Glutâmico Brevibacterium sp. Aditivo alimentarÁcido glucônico Aspergillus niger Produtos farmacêuticosÁcido Lático Rhizopus oryzae Alimentos e produtos farmacêuticosÁcido cítrico Aspergillus niger, A. wentii Alimentos, medicamentosAcetona-butanol Clostridium acetobutylicum Solventes, intermediários químicosInsulina, interferon E. coli recombinante Terapia humanaInício de cultura Levedura de pão, Produção de pães, queijo e Lactobacillus bulgaricus iogurteProteína microbiana Candida utilis Suplemento alimentarPenicilina Penicillium chrysogenum AntibióticosCefalosporina Cephalosparium Antibióticos ecremoniumEritromicina Streptomyces erythreus AntibióticosFonte: NAJAFPOUR, 2007 Os microrganismos utilizam uma fonte orgânica e produzem metabólitosprimários como o etanol, que são formados durante a fase de crescimentoexponencial, ao mesmo tempo em que as novas células são produzidas, e a curvade produção do metabólito segue a curva de crescimento celular quase que paralelo,como mostra o gráfico esquerdo da figura 1. Outros produtos como a penicilina epolissacarídeos são considerados metabólitos secundários, sendo produzidosdurante a fase estacionária. A fase de crescimento exponencial anterior a produçãode metabólitos secundários é camada de trofofase, e a etapa estacionária em quehá produção é chamada de idiofase, como mostra o gráfico da direita da figura 1.
  • 6. 5Um metabólito secundário pode ser a simples conversão de um metabólito primárioou também pode ser originado de outros compostos, mas pode necessitar umaquantidade suficiente de células ou metabólitos primários acumulados(NAJAFPOUR, 2007; TORTORA et al., 2006).Figura 1- Metabólito primário e secundário.Fonte: TORTORA et al., 2006. Os bioprocessos vêm substituindo uma série de processos que antigamentesó podiam ser feitos quimicamente. Eles apresentam algumas vantagens como apossibilidade de utilizar matéria-prima barata e disponível no mercado (como porexemplo, o bagaço de cana), o processo pode ser desenvolvido sob pressões etemperaturas normais (evitando sistemas pressurizados caros e perigosos), e nãohá a produção em quantidade de resíduos tóxicos (e quando há a produção, aindaexiste a possibilidade de utilizar um outro processo microbiológico no tratamento doresíduo). (TORTORA et al., 2006) Os processos desenvolvidos no cultivo de microrganismos se desenvolvemgeralmente em equipamentos denominados biorreatores. Eles consistem em umsistema aberto ou fechado, onde há a manipulação dos parâmetros físicos (pH,concentração de reagentes, transferência de calor e massa, aeração) de forma aregular a catálise, promovendo um melhor rendimento em biomassa e/ou produto,além de tentar minimizar os custos de produção (PURICH & ALLISON, 2000). Eles
  • 7. 6geralmente são tanques cilíndricos que apresentam ou não sistema de agitação,mas também podem ser um simples erlenmeyer. Novos modelos de biorreatoresaparecem constantemente, de forma a melhorar a qualidade do processodependendo do tipo de célula a ser cultivada (bactérias, fungos, tecidos animais ouvegetais, células ou enzimas imobilizadas, etc.) (DORAN, 1995). Ao se utilizar um biorreator, procura-se atender, se não todos, a maioria dosrequisitos listados abaixo:  O recipiente onde ocorrerá o cultivo deverá permanecer em condições assépticas durante um grande período de tempo.  Devem ser promovidas condições adequadas de agitação e areação para satisfazer as condições metabólicas dos microrganismos, mas sem haver danificação mecânica das células dos mesmos devido ao processo.  O consumo de energia deve ser minimizado.  Deve haver um controle de temperatura e pH.  Deve haver uma forma de retirar amostras do fermentado para o controle do processo.  Não deve haver perdas excessivas devido à evaporação.  Não deve haver a necessidade de uma grande quantidade de trabalhadores para a sua operação, limpeza e manutenção do tanque de fermentação, minimizando assim os custos com relação à mão-de-obra.  Materiais mais baratos, mas que ainda propiciam um rendimento desejado, devem ser utilizados. (STANBURY et al.,1995) O cultivo dos microrganismos pode ocorrer em diferentes tamanhos, como emescala de bancada, piloto ou de planta industrial. Biorreatores de escala laboratorialvariam de 2 à 100 litros, mas durante operações em larga escala na indústria elespodem chegar a 100000 litros. Inicialmente utiliza-se biorreatores menores para se investigar qual é o melhormicrorganismo a ser utilizado, qual meio de cultivo proporcionará um melhorcrescimento e quais condições operacionais são mais favoráveis para a formação doproduto desejado. São feitos estudos sobre parâmetros como: transferência demassa, agitação, taxa de cisalhamento, formação de espuma, energia necessária,taxa de diluição, forma e tamanho do biorreator, pH, temperatura, entre outros. Isso
  • 8. 7deve ser feito em pequena escala porque não seria vantajoso fazer esses testes emlarga escala, correndo o risco de perder grandes quantidades de material e ter umprejuízo econômico (NAJAFPOUR, 2007). O processo de mudança de escala está exemplificado esquematicamente nafigura 2. Após a fase de testes em frascos de 250mL a 1L e análise dos fatores deprodução, passa-se para um biorreator de bancada com capacidade de 1 a 2 litros, oqual é normalmente equipado com sensores de ajuste de temperatura, pH eaeração. Isso propicia uma análise mais cuidadosa de alguns parâmetros e umcontrole maior sobre o processo do que o cultivo em erlenmeyer. Nessa etapatambém deve-se observar se o processo se desenvolve melhor em batelada, semi-batelada ou contínuo. Próximo passo é o cultivo em um biorreator em escala pilotode 100 a 1000 litros. A cada processo de aumento de escala deve-se observar se háalguma alteração na resposta celular com relação ao rendimento do processo. Setudo estiver correto, a etapa final seria um biorreator de escala industrial (DORAN,1995).Figura 2- Processo de aumento de escalaFonte: Adaptada de DORAN, 1995 Mas ao mudar de escala laboratorial para escala industrial não ocorresomente a mudança do tamanho em proporção. Devem-se preservar algunsparâmetros de forma a continuar tendo um bom processo. Esses parâmetros seriam:  Número de Reynolds ou fatores de momento semelhantes.  Consumo de energia constante por unidade de volume de líquido.  Velocidade da pá de agitação constante.  Mistura do líquido e tempos de recirculação semelhantes.  Coeficiente volumétrico de transferência de massa constante.
  • 9. 8  Manter todos os fatores ambientais constantes para o microrganismo. (NAJAFPOUR, 2007) O cultivo de microrganismos pode ser feito utilizando substratos de baixovalor comercial, muitas vezes podendo ser resíduos de outros processos. Aprodução de álcool e solventes orgânicos muitas vezes utiliza resíduos como fontede carbono ou nitrogênio, sendo o bagaço de cana, por exemplo, bem importante naindústria alcooleira. Isso é bastante viável no cultivo de microrganismos, mas já nocultivo de células animais isso já não é possível devido ás várias exigências dacélula, o que geralmente encarece o processo de cultivo de células animais(NAJAFPOUR, 2007). O papel de um engenheiro de bioprocessos é entender o mecanismo deprodução e selecionar o melhor biocatlisador (microrganismo ou enzima) para tal.Após, deve-se estudar as melhores condições ambientais que propiciam um melhorcrescimento e uma melhor produção. Também cabe ao biotecnologista otimizar oprocesso procurando recursos mais econômicos, mas que ainda produzam umrendimento satisfatório (NAJAFPOUR, 2007). O artigo em anexo mostra a função deum engenheiro de bioprocessos e os conceitos básicos que um profissional dessaárea deve ter para o desenvolvimento de um bom trabalho.2- DEFINIÇÃO DE FERMENTAÇÃO Antes de se elucidar o papel dos microrganismos na fermentação, ela eradefinida de forma diferente do conceito aceito atualmente. Por exemplo, em 1839,Liebig definiu o termo fermentação como sendo “... a putrefação de substânciasvegetais que se realiza sem que haja a liberação de nenhum odor, ou pelo menosnenhum desagradável.”. Já Luis Pasteur tentou associar o processo de fermentação com odesenvolvimento de organismos: “... fermentação, longe de ser o fenômeno semvida, é um processo vivo... todo fenômeno de fermentação é correlacionado com odesenvolvimento de células micodérmicas e plantas, as quais eu preparei e estudeiem estado puro e isolado.” (SCHWARTZ, 2001) Atualmente, o termo “fermentação” pode apresentar diferentes significadosdependendo o setor do conhecimento que o utiliza. O sentido geral do termo
  • 10. 9significa qualquer processo de cultivo microbiológico que ocorre com ou sem ar. Osignificado bioquímico da fermentação é o processo metabólico onde o substratoorgânico atua como doador e como receptor final de elétrons, ocorrendo emcondições anaeróbias, mas sem a utilização de uma cadeia respiratória, comoacontece na respiração anaeróbia. (TORTORA et al., 2006) O termo “fermentador” também pode gerar alguma discordância devido aesses conceitos. Ele primeiramente foi utilizado para descrever os tanques ondeocorria o cultivo. Como a maioria dos cultivos realizados nesses tanques era deforma aeróbica, propôs-se um novo nome para não contradizer a definiçãobioquímica de fermentação. O termo “biorreator” então começou a ser usado paradescrever o local onde eram realizados cultivos de microrganismos em condiçõesaeróbicas e anaeróbicas (NAJAFPOUR, 2007). A fermentação ocorre como uma forma de reoxidar as coenzimas reduzidasNADH e NADPH que são formados durante a glicólise, de forma a manter o balançode redução-oxidação dentro da célula. Os elétrons são transferidos das coenzimaspara um composto orgânico, fornecendo NAD + e NADP+ suficientes para acontinuação da glicólise. (TORTORA et al., 2006) Durante uma fermentação, um mesmo composto orgânico pode sofrer umaoxidação ou outras a redução dependendo do microrganismo. Por exemplo, no casodo ácido pirúvico, ele pode sofrer uma oxidação formando ácido acético ou podesofrer uma redução e formar ácido láctico. (CROCOMO, 1967) O tipo de fermentação realizada vai depender da espécie de microrganismoutilizada, do substrato que está sendo fornecido e dos tipos de enzimas que elepossui e estão ativas. A análise do tipo de produto final formado na fermentaçãotambém pode ser utilizada como forma de identificação de microrganismos,realizando testes bioquímicos. A figura 3 mostra o tipo de fermentação que seguealguns microrganismos.
  • 11. 10Figura 3 – Produtos finais de fermentação dependendo do microrganismoFonte: TORTORA et al., 20063- METABOLISMO MICROBIOLÓGICO Antes do processo metabólico que inclui a fermentação, há as reações dequebra do substrato, que geralmente é a glucose. Essa via recebe o nome de“glicólise” ou via de Embden-Meyerhof, onde a glucose é catabolisada a piruvato e aenergia livre liberada é estocada na forma de ATP e NADH.
  • 12. 11Figura 4- GlicóliseFonte: LEHNINGER et al., 2006
  • 13. 12 Como mostra a Figura 4, a glicólise pode ser dividida em duas etapas, a fasepreparatória e a fase de pagamento. Na fase preparatória, inicialmente ocorre afosforilação da glucose em C-6 através da enzima hexoquinase. Para isso devehaver o gasto de uma molécula de ATP. Há então uma conversão entre glucose-6-fosfato em frutose-6-fosfato através da fosfoexose isomerase. Após, a moléculasofre outra fosforilação, mas agora em C-1, formando frutose-1,6-bifosfato. Essa molécula já está pronta para sofrer uma quebra em duas moléculas detrês carbonos, uma diidroxiacetona fosfato e um gliceraldeído-3-fosfato. É nessepasso que ocorre a lise da molécula, e por isso ela se chama glicólise. Adiidroxiacetona é isomerizada em outro gliceraldeído-3-fosfato. Aqui termina a etapade preparação, onde a molécula de glucose é preparada com o gasto de 2 ATP,para que depois essa energia armazenada possa gerar lucros energéticos. A fase de pagamento inicia-se com duas moléculas de gliceraldeído-3-fosfato,as quais são oxidadas e fosforiladas por fósforo inorgânico, formando 1,3-bifosfoglicerato. A partir desse ponto acontecerá a liberação de energia, onde o“pagamento” é feito na forma de produção de ATP através da fosforilação à nível desubstrato, diferentemente da fosforilação ligada a respiração que ocorre na cadeiarespiratória. Um dos fósforos do 1,3-bifosfoglicerato será transferido para umamolécula de ADP através da ação da enzima fosfoglicerato quinase, formando 3-fosfoglicerato. A enzima fosfoglicerato mutase irá então fazer uma transferênciareversível do grupo fosfato do C-3 para o C-2, sendo que a transferência ocorre emduas etapas. Primeiramente um grupo fosfato presente no sítio ativo da enzima seliga ao C-2 do substrato, e depois o grupo fosfato em C-3 é transferido para aenzima. Depois desse processo tem-se 2-fosfoglicerato. Essa molécula irá entãosofrer uma desidratação através da enolase, formando fosfoenolpiruvato (PEP). OPEP é uma molécula de alto potencial de transferência do grupo fosforila, e issoocorrerá com a ação da enzima piruvato quinase. Esta enzima requer a presença deíons K+ e Mg2+ ou Mn2+, e nesse ponto acontece mais uma fosforilação a nível desubstrato, com a formação de mais uma molécula de ATP por PEP. O resultado finalé a formação de piruvato. Considerando inicialmente uma molécula de glucose edesconsiderando desvios para outras vias, a cada molécula de glucosemetabolizada, tem-se no final duas moléculas de piruvato, dois ATP e dois NADHformados.
  • 14. 13 Essa é a via pela qual a maioria dos organismos realiza a quebra da glucose.No entanto, alguns microrganismos procariotos utilizam a via de Entner-Doudoroff,pois não apresentam fosfofrutoquinase-1 e não pode converter frutose-6-fosfato emfrutose-1,6-bifosfato. No entanto, a via das pentoses-fosfato (ou ciclo da hexosemonofosfato) pode ser feita ou não por esses organismos (RATLEDGE &KRISTIANSEN, 2001). Inicialmente, a glucose-6-fosfato é então transformada em ácido 6-fosfoglucônico por uma enzima desidrogenase. Esse ácido é então transformado empiruvato através de duas reações: -HOH 6-P-gluconato  2-ceto-3-desoxi-6-P-gluconato (CDGP) CDGP  piruvato + gliceraldeído-3-fosfato (CROCOMO, 1967) A gliceraldeído-3-fosfato irá seguir o resto da via glicolítica normal até chegara piruvato. A Figura 5 mostra a via Entner-Doudoroff. Essa via é geralmenterealizada por organismos como Pseudomonas, Azotobacter, Rhizobium,Enterococcus faecalis e Zymomonas mobilis.(TORTORA et al., 2006) Figura 5: Via de Entner-Doudoroff H+ + NADP+ NADPH ATP ADP Glucose Glucose-6-P Ácido 6-fosfoglucônico H2O Etapas 6 a 10 da glicólise Ácido Pirúvico GA-3P CDGPFonte: Adaptada de TORTORA et al., 2006
  • 15. 14 Depois de ocorrida a transformação de glucose até piruvato, em condiçõesaeróbias ocorrerá o ciclo de Krebs, como mostra a Figura 6. Mas como se podeobservar, esse ciclo de reações gera muitos NADH os quais seguem para a cadeiarespiratória e há a transferência de elétrons, onde o aceptor final é o oxigênio. Noentanto, em condições de anaerobiose, a célula não conseguirá manter o balançoadequado de NAD+/NADH, pois não poderá utilizar essa cadeia.Figura 6: Ciclo de Krebs (ou ciclo do ácido cítrico)Fonte: LEHNINGER et al., 2006
  • 16. 15 Portanto, em condições anaeróbias evita-se o ciclo do ácido cítrico (excetonos casos de produção de metabólitos para biossíntese), e utiliza-se as viasfermentativas, as quais, apesar de não gerar tantas moléculas de ATP como o ciclode ácido cítrico, conseguem reoxidar NADH suficientemente para manter ofuncionamento celular. A Figura 7 mostra algumas das possíveis vias defermentação.Figura 7- Vias Fermentativas* Reações em que há reoxidação de NADHFonte: RATLEDGE & KRISTIANSEN, 2001 A seguir serão discutidas em maiores detalhes algumas dessasfermentações.3.1- FERMENTAÇÃO ETANÓLICA É possível obter etanol de três formas: por via destilatória, por via sintética (apartir de hidrocarbonetos não saturados e de gases de petróleo e da hulha) e por viafermentativa. A forma fermentativa é uma das mais vantajosas aqui no Brasil, poishá uma grande disponibilidade de matéria-prima (LIMA et al., 2001).
  • 17. 16 O processo reacional do etanol já começou a ser descrito em 1815 por GayLussac através da equação: C6H12O6  2 CH3CH2OH + 2 CO2 ∆G=-56000 cal/mol (CROCOMO, 1967) O francês Luis Pasteur provou que a natureza dessa reação é microbiana, ese realiza através de uma fermentação em condições anaeróbias (LIMA et al., 2001).Ele observou que a presença de O2 no meio inibia a formação de etanol, diminuindoo consumo de açúcar pela levedura e aumentando o crescimento celular. Essapropriedade foi chamada de Efeito Pasteur. (CROCOCOMO, 1967) No entanto, oefeito Pasteur é somente observado em culturas quimioestáticas quando aconcentração de substrato limita o crescimento ou quando o cultivo é feito naausência de fontes de nitrogênio (LAGUNAS et al., 1982). Lagunas e colaboradores fizeram experimentos aeróbicos e observaram queS. cerevisiae cultivada na presença de fonte de nitrogênio usava somente 3 a 20%do açúcar metabolizado para respiração, o restante ia para a via fermentativa doetanol. Já leveduras cultivadas em meios sem nitrogênio utilizavam 25 a 100% dosaçúcares metabolizados para respiração. No entanto, isso não significava que ouveum aumento da respiração, mas sim uma perda da função fermentativa devido àinativação dos sistemas de transporte de açúcares (LAGUNAS et al., 1982). Com o avanço dos estudos, foram elucidados os mecanismos reacionaisintermediários da produção de etanol a partir de glucose. Até a formação de piruvatoa reação segue exatamente igual a glicólise. O ácido pirúvico formado édescarboxilado a acetaldeído e dióxido de carbono. Essa etapa da reação é umprocesso irreversível que exige a presença da enzima carboxilase, da coenzimadifosfato de tiamina e de íons magnésio. O acetaldeído é então reduzido a etanolatravés da ação da enzima desidrogenase alcoólica, ocorrendo também nessa etapaa reoxidação de um NADH (Figura 8). O conjunto de reações que resultam na formação de álcool etílico e CO 2 àpartir de um carboidrato recebe o nome de via de Embden-Meyer-Parnas. Essa viametabólica foi demonstrada in vitro pela primeira vez em 1950 por Koshland eWestheimer, utilizando glucose com carbono marcado radiativamente em C1, e apóso seu consumo por leveduras, verificou-se que havia carbono radioativo na moléculade etanol, mais especificamente nodo grupo metil (CROCOMO, 1967).
  • 18. 17Figura 8 – Transformação de piruvato a etanol Fonte: LEHNINGER et al., 2006 Nesse tipo de fermentação há um rendimento de 2 ATP por molécula deglucose consumida, pois são gastos dois ATP na reação da hexoquinase, mas sãoformados quatro ATP (na reação de formação de ácido 3-fosfoglicérico e naformação de piruvato). As leveduras podem consumir além da glucose outros açúcares, comomanose e galactose. A manose sofre uma fosforilação através da hexoquinase,formando manose-6-fosfato, que por sua vez é transformada em frutose-6-fosfatopela isomerase de manosefosfato, possibilitando assim a sua entrada na glicólise. Jáa galactose sofre uma transfosforilação, formando galactose-1-fosfato (CROCOMO,1967). Também podem ser utilizados açúcares exógenos como maltose e sacarose,e endógenos como glicogênio e trealose, como mostra a figura 9. Durante o cultivo, pode ocorrer também a formação de produtos secundáriosatravés de outras vias metabólicas realizadas para a o crescimento celular eprodução de biomassa. Estima-se que 95% dos açúcares metabolizados tem comodestino a produção de etanol e CO2. Os outros 5% são desviados para a formaçãode glicerol, ácidos orgânicos (como ácido succínico, acético e pirúvico), álcooissuperiores, acetaldeído, acetoína, butilenoglicol, entre outros (LIMA et al., 2001). A fermentação alcoólica é realizada normalmente por leveduras comoSaccharomyces cerevisiae, S. ellipsoideus, S. carlbergensis e S. warum, e bactériascomo Zymomonas mobilis, sendo que as leveduras são os microrganismos maisutilizados na indústria.
  • 19. 18Figura 9- Utilização de outros carboidratos na fermentação por SaccharomycesFonte: LIMA et al., 2001
  • 20. 193.2- FERMENTAÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO O ácido lático foi isolado pela primeira vez a partir do leite azedo por Scheele.Pasteur também realizou estudos com relação à fermentação láctica. Ele observouque assim como é sempre encontrada levedura na produção de cerveja, onde ofermento promove a conversão de açúcares em álcool e dióxido de carbono, devehaver um fermento que produza ácido láctico - a levedura láctica - convertendoaçúcares em lactato. Ele também verificou que nessa fermentação o produtoprincipal é o ácido láctico, mas também é possível encontrar no caldo fermentadooutros produtos como ácido butírico, álcool e manitol, sendo que suas proporçõespodem variar (PASTEUR, 1857). Evitar essas outras vias e direcionar os compostosde carbono somente para a produção de lactato é uma forma de otimizar a suaprodução.Figura 10- L-lactato a partir de piruvato Fonte: LEHNINGER et al., 2006 O ácido lático pode ser produzido através da fermentação de bactérias comoos bactérias homofermentativos (Lactobacillus delbrueckii, L. bulgaricus, L.pentosus, L. casei, L. leichmannii, Streptococcus lactis), de fungos como leveduras eficomicetos, e também de algumas algas. Ele também pode ser produzido de formasintética, através da hidrólise da lactonitrila (LIMA et al., 2001). O ácido lático pode apresentar duas formas esterioquímicas, devido aocarbono quiral presente. Durante a fermentação são formadas as duas formas,formando uma mistura racêmica (PRESCOTT et al, 1959). A fermentação ocorre em temperaturas relativamente altas e dependerá domicrorganismo utilizado. Lactobacillus delbrueckii cresce bem à temperatura de45ºC; L. bulgaricus, pode ser incubado em 45-50ºC; já L. pentosus, L. casei, eStreptococcus lactis podem ser cultivados em 30ºC (PRESCOTT et al, 1959).
  • 21. 20 O ácido lático é bastante utilizado na indústria de alimentos como acidulante econservante de refrigerantes, geléias, xaropes e sucos de frutas (LIMA et al., 2001).3.3- FERMENTAÇÃO DO GLICEROL O glicerol é usado amplamente como solvente, adoçante, constituinte deloções, anti-sépticos, adesivos, tintas, agente anti-congelante. Ele também éutilizado na preparação de meios nutritivos biológicos e na produção denitroglicerina, borracha sintética e massa de modelar (PRESCOTT et al., 1959). Ao estudar vinhos e cervejas, Luis Pasteur observou que levedurasregularmente formavam glicerol. Um pouco antes da Primeira Guerra Mundial,Neuberg, ao tentar elucidar a fermentação alcoólica através da suplementação domeio de cultivo com sulfito de sódio, acabou descobrindo que dessa forma havia umincremento na produção de glicerol por leveduras (PRESCOTT et al., 1959).Normalmente, produz-se cerca de 3% de glicerol durante a fermentação alcoólica,mas, ao se alterar o pH através da adição de sais alcalinos (carbonato de amônio,bicarbonato de sódio, acetato de sódio ou fosfato dissódico), é possível obter de 9 a16% de glicerol (CROCOMO, 1967). Segundo os trabalhos de Neuberg, a produção de glicerol pode ser feita dequatro maneiras: fermentação alcoólica normal, presença de sulfito, soluçõesalcalinas ou soluções neutras. No primeiro caso (Figura 11), durante a fermentaçãoalcoólica, pode ser desviado um pouco de gliceraldeído 3-fosfato, transformado emdiidroxiacetona fosfato. Esta, por sua vez, sofre a ação de desidrogenase deglicerofosfato, reduzindo um NADH e formando glicerol 3-fosfato. A enzima fosfataseretira o fosfato desse composto e forma o glicerol. (CROCOCOMO, 1967)Figura 11- Produção de glicerol durante a fermentação alcoólicaFonte: Adaptado de CROCOMO, 1967.
  • 22. 21 Já na presença de sulfito, haverá acúmulo maior de glicerol. Isso ocorredevido a fixação do acetaldeído pelo sulfito de sódio, através da reação:CH3-CHO + Na2SO3 + H2O  CH3-CHO-HSO3Na + NaOH (PRESCOTT et al, 1959) Normalmente o acetaldeído é transformado em etanol, mas como ele estásendo fixado e a redução a etanol não acontece, uma outra molécula faz o papel deaceptor de hidrogênio do NADH. Isso faz com que a via de formação de glicerol sejafavorecida (PRESCOTT et al, 1959). A fermentação utilizando sulfito foi utilizadapelos alemães durante a Primeira Guerra Mundial. Outros agentes que impeçam atransformação de aldeído a álcool também podem ser utilizados, como carvão,hidrazidas e oxalato de fenilhidrazina, desde que não haja impedimento de outrasreações in vivo (CROCOMO, 1967). Quando a fermentação ocorre em meio alcalino, há uma alteração no cursonormal da fermentação, gerando a produção de etanol, ácido acético, glicerol e CO 2.Nessas condições, o acetaldeído não é reduzido a etanol, mas sim sofre a ação damutase aldeídica, formando ácido acético e etanol (Figura 12). Como não ocorreu areoxidação do NADH, a formação do glicerol a partir de diidroxiacetona fosfato éfavorecida (CROCOMO, 1967).Figura 12- Ação da mutase aldeídicaFonte: CROCOMO, 1967. A última forma de fermentação seria em meio neutro. Nesse caso não haveráprodução de etanol nem CO2, sendo acumulados glicerol e ácido pirúvico. Essareação ainda não está muito bem elucidada, mas é representada como:C6H12O6  CH3-CO-COOH + CH2OH-CH2OH-CH2OH (CROCOMO, 1967)
  • 23. 223.4- FERMENTAÇÃO ACETONA-BUTANÓLICA Pasteur foi o primeiro pesquisador a mostrar que o álcool butílico era umproduto direto da fermentação, através dos seus experimentos da fermentaçãobutírica do ácido lático e do lactato de cálcio em 1861: “M. Pasteur... croit pouvoiraffirmer que l’alcool butylique est um produit ordinaire de la fermentation butyrique.”(PRESCOTT et al., 1959). No entanto, foi somente em 1905 que Schardingernotificou a produção de acetona através da fermentação (JONES & WOODS, 1986). A partir de 1910, o químico Chaim Weizmann trabalhou junto com outrospesquisadores no processo de fabricação de borracha sintética. Para isso seriamnecessários compostos como butanol e isoamil, que seriam produzidos através demicrorganismos. Em 1910 eles acharam um microrganismo capaz de produzirbutanol quando cultivado em batatas. Entre 1912 e 1914 Weizmann isolou váriasculturas, as quais ele chamou de BY (e que atualmente são classificadas comobactérias da espécie Clostridium acetobutylicum). Durante a Primeira GuerraMundial a Inglaterra precisou de grandes quantidades de acetona, e foi omicrorganismo isolado por Weizmann que propiciou um aumento na produção.Como durante esse período não houve necessidade de butanol, ele foi estocado emgrandes quantidade, sendo ele posteriormente a guerra muito utilizado comosolvente na indústria automobilística (JONES & WOODS, 1986). A produção desses solventes em escala industrial era feita antigamente naforma de batelada, usando fermentadores sem agitação mecânica e comcapacidade de 50000 a 200000 galões. Os fermentadores eram enchidos de 90 a95% de sua capacidade e o restante era preenchido com uma camada gasosa dedióxido de carbono estéril. O dióxido de carbono também era borbulhado antes edepois da inoculação para facilitar a mistura (JONES & WOODS, 1986). As bactérias freqüentemente utilizadas para a fermentação acetona-butanolsão do gênero Clostridium. Esses microrganismos são esporulados, apresentamuma forma de bastão e são sacarolíticos (fermentam açúcares). Devido a essesfatores o isolamento dessas bactérias é relativamente fácil. Elas são geralmenteencontradas em associação com plantas como batatas, raízes de legumes e cereais.(JONES & WOODS, 1986). Cada empresa que produz esses solventes pode possuir uma cepa debactérias diferente. A maioria dessas culturas é utilizada em processos já
  • 24. 23patentiados (BEESCH, 1952). As diferenças que as cepas de Clostridium podemapresentar podem ser com relação à proporção de solventes que produzem, como,por exemplo: C. beijeirinckii (C. butylicum) produz solventes na mesma proporçãoque C. acetobutylicum, mas ao invés de acetona produz isopropanol; C.aurantibutyricum produz tanto acetona quanto isopropanol junto com butanol; já C.tetanomorphum produz quantidades equimolares de butanol e etanol (JONES &WOODS, 1986). A temperatura ótima para a fermentação aceto-butanólica é em torno de30,6ºC, podendo variar de 28,9 até 33,3ºC tomando as devidas precauções decontrole do processo. Os microrganismos são estritamente anaeróbios e tem ummaior rendimento em condições anaeróbias. O pH pode variar de 5 a 7, dependendoda cepa. Usualmente utiliza-se um pH inicial de 5,5-6,5 e final de 5,2-6,2 (BEESCH,1952). A maioria das bactérias desse gênero necessita de nitrogênio de proteínasdegradadas no meio nutritivo para otimizar o processo fermentativo. Essa fonte denitrogênio inclui produtos intermediários de degradação de proteínas, comopolipeptídeos e aminoácidos, e também produtos finais de degradação como amôniae seus sais. Os sais de amônia e a própria amônia dão resultados satisfatórios, masé preferível utilizar a amônia acompanhada de outros compostos nitrogenados maiscomplexos. Elas também precisam de uma fonte de fosfato, caso as fontes decarbono utilizadas (como melaço ou bagaço) não contenham quantidades mínimasnecessárias (BEESCH, 1952). A via metabólica de produção de acetona e butanol está presente na figura13. Durante a fase inicial de crescimento (também chamada de fase acidogênica), abactéria produz hidrogênio, dióxido de carbono, acetato e butirato, resultando nadiminuição do pH do meio. Quando o cultivo entra em fase estacionária (chamadatambém de fase solventogênica), o metabolismo passa a produzir solventes comoacetona e butanol, e também ocorre a reassimilação dos ácidos produzidos naprimeira fase, ocasionando a elevação do pH (JONES & WOODS, 1986).
  • 25. 24Figura 13- Produção de Acetona-ButanolFonte: RHEM & REED, 1981.3.5- FERMENTAÇÃO BUTANOL-ISOPROPANÓLICA A formação de butanol e isopropanol como produtos principais ocorre atravésdo microrganismo Clostridium butyricum, que é uma bactéria anaeróbia formadorade esporos, com temperatura ótima de 37ºC, flagelada e Gram-positiva em culturasjovens (podendo ser Gram-negativa em culturas mais velhas). Durante a SegundaGuerra Mundial utilizava-se Clostridium toanum para esse processo. Em 1926,Morikawa também isolou um microrganismo que produzia isopropanol e butanoldenominado Bacillus technicus (PRESCOTT et al, 1959). Os produtos finais da fermentação incluem butanol, isopropanol, dióxido decarbono, hidrogênio, pequenas quantidades de ácido acético e butírico, epossivelmente traços de acetona e ácido fórmico (PRESCOTT et al, 1959). Orendimento da fermentação é de aproximadamente 53-65% de butanol, 19-44% deisopropanol, 1-24% de acetona e 3% de etanol (LIMA et al., 2001). O caminhometabólico seguido até a formação de isopropanol e butanol está exemplificado nafigura 14.
  • 26. 25 A fermentação é otimizada quando o suprimento de nitrogênio é feito atravésde proteínas parcialmente hidrolisadas (como no caso anterior) e a adição de malte,extrato de leveduras, peptonas, água de maceração de milho ou glúten. A adição deacetona ou de outros aceptores de hidrogênio aumentam o teor de isopropanol nomeio fermentado (LIMA et al, 2001). Certas substâncias podem inibir a formação de alguns produtos. A adição debicarbonato de sódio durante a fermentação pode inibir a formação de solventes,principalmente o isopropanol, formando mais sais de ácidos acético, lático, pirúvico efórmico (LIMA et al, 2001)Figura 14- Fermentação Butanol-isopropanólicaFonte: Adaptada de RHEM & REED, 1981.3.6- FERMENTAÇÃO ACETONA-ETANÓLICA A produção de acetona e etanol em conjunto acontece por microrganismoscomo Bacillus macerans e Bacillus acetoethylicus. No final da fermentação pode-seter como produtos a acetona, o etanol, o ácido acético e o ácido fórmico (LIMA et al.,2001). Schardinger em 1905 foi o primeiro a descobrir a acetona como produto deuma fermentação bacteriana. O microrganismo por ele isolado era o Bacillus
  • 27. 26macerans. Essa é uma bactéria móvel, esporulada, Gram-negativa e anaeróbiafacultativa (PRESCOTT et al, 1959). A temperatura ideal para a fermentação varia entre 40 e 43ºC e afermentação dura aproximadamente 6 dias. O pH do meio influencia o produtoformado. Em pH elevado há a formação de mais ácidos voláteis e menos etanol,enquanto em pH 5,8-6,0 há estímulo da produção de solventes (LIMA et al., 2001).No entanto, o pH ótimo de crescimento para B. aceoethylicus é 8-9. (PRESCOTT etal, 1959). Ao meio de cultura é geralmente adicionado carbonato de cálcio paraneutralizar os ácidos formados.3.7- FERMENTAÇÃO DO ÁCIDO PROPIÔNICO Bactérias produtoras de ácido propiônico, em geral, podem ser caracterizadascomo Gram-positivas, catalase positivas, não-esporuladas, imóveis, e aeróbicasfacultativas. Alguns exemplos são: Propionibacterium freudenreichii, P. jensenii, P.peterssonii, P. shermanii, P. pentosaceum, P. rubrum, P. technicum, P. thoenii, P.raffinosaceum, P. arabinosum e P. zeae. Elas podem ser isoladas de fontes comoleite, queijo, solo, silagem, e excreta de gado (PRESCOTT et al., 1959). Micrococcuslactilycus (Veillonella gazogenes) e Clostridium propionicum também fazem esse tipode fermentação (CROCOMO, 1967). As bactérias que produzem ácido propiônico podem fermentar um grandenúmero de carboidratos, polióis e ácidos orgânicos, como pentose, 2-cetogluconato,lactato, piruvato, glucose, galactose, lactose, maltose, malato, sorbitol, manitol,glicerol, entre outros. Abaixo há a estequiometria de algumas dessas fermentaçõesa partir de diferentes substratos: 3 ½ glucose  2 propionato + acetato + CO2 + HOH 3 lactato  2 propionato + acetato + CO2 + HOH 3 piruvato + HOH  propionato + 2 acetato +2 CO2 glicerol  propionato + HOH (CROCOMO, 1967) A figura 15 mostra a formação de propionato a partir de glicerol ou glucose. Jáa figura 16 mostra em mais detalhe a formação de propionato e acetato a partir deácido lático.
  • 28. 27Figura 15- Produção de Propionato Figura 16- Produção de PropionatoFonte: CROCOMO, 1967. Fonte: RHEM & REED, 1981. Além da produção de propionato, podem aparecer como subprodutos defermentação o acetato e o dióxido de carbono.3.8- FERMENTAÇÃO DO ÁCIDO CÍTRICO O ácido cítrico é normalmente encontrado em frutas cítricas, abacaxis, pêras,figos e pêssegos. Wehmer em 1893 demonstrou a ocorrência de ácido cítrico comometabólito microbiano de Citromyces pfefferianus e C. glaber em meio contendosacarose e carbonato de cálcio (PRESCOTT et al, 1959). Em 1922, Mollinarddescobriu culturas de Aspergillus niger que produziam ácido cítrico em condições dedeficiência de fosfato. Até 1953, o ácido cítrico era obtido a partir de citrato de cálcio. Com adescoberta de microrganismos capazes de produzi-lo, passou-se a utilizar a viafermentativa. Há três processos fermentativos que podem ser utilizados: o processoKoji (em substrato sólido utilizando uma cepa específica de Aspergillus niger), a
  • 29. 28fermentação em superfície (o micélio de A. niger cresce sobre um meio de culturaestático, sendo o produto recolhido do meio) e a fermentação submersa (meio decultura líquido sob agitação) (LIMA et al., 2001). As espécies Aspergillus niger, A. clavatus, Penicillium luteum, P. citrinum,Paecilomyces divacatum, Mucor piriformis e Ustilina vulagris são usadas emlaboratório ou comercialmente para a produção desse ácido, mas a importânciamaior cabe ao A. niger. O pH influencia fortemente a produção de ácido cítrico. A partir do controle dopH com sais inorgânicos é possível variar a proporção de ácido cítrico e oxálicoformados. Um pH mais baixo favorece a formação de citrato e suprime a formaçãooxalato, além de minimizar as chances de contaminação (PRESCOTT et al., 1959).4- CULTIVO DE CÉLULAS MICROBIANAS4.1- BACTÉRIAS Bactérias são organismos unicelulares e sem compartimentalização internapor um sistema de membranas, ou seja, são procarióticos. Elas são envolvidas poruma parede celular peptidioglicana, sendo que elas podem apresentar váriasformas, como bacilos, cocos ou espirilos. O crescimento bacteriano ocorre com o aumento do número de células, e nãocom o aumento do volume de uma célula. Elas se reproduzem normalmente pordivisão binária, mas algumas podem fazer brotamento. Outras podem ainda sefragmentar e a partir de cada fragmento se inicia uma nova célula (TORTORA et al.,2006). Uma cultura bacteriana apresenta inicialmente uma fase lag, quando asbactérias ainda não se multiplicam e sofrem somente pequenas variações para seadaptar ao novo meio de cultivo. Elas se encontram em um estado de latência. Apósdeterminado tempo, podendo levar de horas a dias, a cultura passa para a fase log,ou crescimento exponencial. Nesse período os mecanismos de reproduçãoencontram-se amplamente ativos e são bastante sensíveis a mudanças ambientais.Depois de um longo período de crescimento ocorre a fase estacionária, e a taxa dedivisão se torna equivalente a taxa de mortalidade. Isso pode ocorrer devido aotérmino de nutrientes, ao acúmulo de produtos de degradação ou a mudanças no pH
  • 30. 29danosas à célula. Em determinado momento, a população microbiana entra em fasede morte celular (ou declínio), quando o número de mortes excede a produção denovas células (TORTORA et al., 2006). A maioria das bactérias cresce em pH perto da neutralidade (6,5-7,5), sendoque poucas delas (as acidófilas) conseguem crescer em pH 4. Elas podem sercultivadas tanto em meio sólido quanto em meio líquido (TORTORA et al., 2006).4.2- FUNGOS Os fungos pertencem ao reino Fungi e são organismos eucarióticos, quimio-heterotróficos, multicelulares (exceto leveduras), e com parede celular formada deglicanas, mananas e quitina. Os fungos multicelulares são classificados com relaçãoa sua morfologia da colônia e dos esporos reprodutivos (TORTORA et al. 2006). No seu ciclo de vida pode acontecer a reprodução assexuada, através dafragmentação de suas hifas ou pela formação de esporos assexuais, e também areprodução sexuada, através de esporos sexuais. Os fungos filamentosos suportam ambientes que poderiam ser hostis abactérias. Eles conseguem suportar uma variação de pH maior que as bactérias,mas os valores ótimos se encontram geralmente em pH 5-6. Eles são maisresistentes à pressão osmótica, sendo que alguns podem crescer em concentraçõesrelativamente altas de sais e açúcares. Substratos com atividade de água muitobaixa também podem favorecer o crescimento de fungos. A maioria deles possuimetabolismo aeróbico. Eles também conseguem metabolizar carboidratos maiscomplexos que as bactérias já não têm capacidade, como, por exemplo, degradar alignina (TORTORA et al., 2006).4.3- LEVEDURAS Leveduras são organismos eucarióticos, unicelulares, não filamentosos, e deforma oval que pertencem ao reino dos fungos. Esses organismos estariam entre asbactérias e os macro-fungos (PRESCOTT et al., 1959). Assim como as bactérias, aidentificação de leveduras pode ser feita através de testes bioquímicos. (TORTORAet al., 2006)
  • 31. 30 Elas podem apresentam como forma de propagação vegetativa o brotamento(gemulação), sendo que algumas podem sofrer fissão binária, comoSchizosaccharonyces (PRESCOTT et al., 1959). Em algumas espécies, comoCandida albicans, o broto pode não se separar da célula mãe, formando o que podeser chamado de pseudo-hifa. (TORTORA et al., 2006) As células de levedura são capazes de realizar metabolismo anaeróbicofacultativo, podendo utilizar tanto o oxigênio quanto outros compostos orgânicoscomo aceptor final de elétrons. Elas vêm sendo bastante estudadas por serem organismos eucarióticosrelativamente fáceis de manipular, sendo então consideradas como modelometabólico, molecular e genético para os eucariotos assim como a bactériaEscherichia coli é considerada como modelo para os procariotos (BADOTTI et al.,2008). Leveduras como Saccharomyces cerevisiae são utilizadas em váriosprocessos, como a produção de fermento de pão, extrato de levedura, cerveja,aditivos alimentícios (vitaminas, proteínas, enzimas), proteínas heterólogas (vacinase outros componentes terapêuticos), e produtos de interesse farmacêutico atravésda manipulação de novas vias metabólicas e do aumento da produção com aengenharia genética, uma vez que o genoma de leveduras já foi inteiramenteseqüenciado (BADOTTI et al., 2008). Para se cultivar leveduras pode-se utilizar vários meios de cultivo. Em meiosólido, as células de levedura formam colônias semelhantes às de bactérias(TORTORA et al., 2006). A maioria deles consiste em uma formulação que dispõedos nutrientes necessários para o crescimento de leveduras e ingredientes queinibem o desenvolvimento de bactérias e bolores. Um dos meios bastante indicadospara o isolamento de leveduras é o YM (yeast malt extract medium). Sendo organismo saprófitos, as leveduras exigem a presença de uma fontede carbono elaborada para conseguir energia. Também pode ser necessária aadição de vitaminas (tiamina e ácido pantotênico), de nitrogênio, fósforo, enxofre,potássio, magnésio, cálcio, zinco, manganês, cobre, ferro, cobalto, iodo e outroselementos traço (LIMA et al., 2001). As leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae utilizam nitrogênio naforma amoniacal (NH4+), amídica (uréia) ou amínica (na forma de aminoácidos), não
  • 32. 31conseguindo metabolizar nitrato ou proteínas do meio. O fósforo é absorvido naforma de H2PO4-, e o enxofre na forma de sulfato, sulfito ou tiosulfato. Elas são microrganismos mesófilos, com temperatura ótima emaproximadamente 26 a 35ºC, e com pH ótimo por volta de 4 a 5. A manutençãodessas condições evita a contaminação do cultivo por outros microrganismos (LIMAet al., 2001).5- CULTIVO DE CÉLULAS ANIMAIS E VEGETAIS Apesar da utilização de proteínas recombinantes em bactérias comoEscherichia coli, algumas modificações estruturais pós-traducionais só podem serfeitas eficientemente em outros tipos de célula, como de mamíferos e insetos. Ocultivo de células de mamífero tem grande importância na produção de estruturasespecíficas como anticorpos, que atualmente apresenta uma demanda bastanteelevada. (SCHEPER et al., 2006) Também é de grande importância na produção devacinas virais, citocinas, bioinseticidas (como o baculovírus), enzimas (asparaginase,colagenase, citocromo P450, fatores sangüíneos VII, VIII e IX, pepsina, renina,tripsina, uroquinase), hormônios de cadeia longa (luteinizante, coriônico, folículoestimulante) e de células para testes toxológicos, bioensaios ou fabricação detecidos artificiais (LIMA et al., 2001). A Tabela 2 mostra o desenvolvimento deprocessos que utilizam células animais.Tabela 2- Histórico de cultivo de células animaisAno Evento1949 Crescimento de vírus em cultura de células. (Enders e col.)1954 Vacina inativada Salk contra poliomielite (com células de rim de macaco)1955 Vacina atenuada Sabin contra poliomielite (com células de rim de macaco)1962 Estabelecimento de uma linhagem de células diplóides humanas – WI-38 (Hayflick)1963 Vacina contra sarampo (com células de embrião de galinha)1964 Vacina contra raiva (com células WI-38)1967 Vacina contra caxumba (com células WI-38)1969 Vacina contra rubéola (com células WI-38)1970- a)Vacinas humanas experimentais (varicela, citomegalovírus, e outros);1974 b)Várias vacinas veterinárias.
  • 33. 321975 Produção de anticorpos monoclonais. (Kohler e Milstein)1979 Primeira linhagem de células recombinantes1980 Ampliação da escala de produção para 8000L (vacina contra a febre aftosa e interferon)1981 Primeiro kit de diagnóstico com anticorpo monoclonal1982 Primeiro produto farmacêutico resultado da tecnologia do DNA recombinante (insulina)1986 a)Licença para a produção de γ-Interferon linfoblastóide; b)Testes clínicos com vários produtos resultantes da tecnologia do DNA recombinante; c)Vacinas contra poliomielite e raiva produzidas com células VERO.1987 Licença para produção de OKT3 – anticorpo envolvido na imunologia de transplantes1988 Licença para a produção de tPA recombinante (ativador de plasminogênio)1989 Testes clínicos de eritropoetina1990- Testes clínicos de diversos produtos oriundos da tecnologia de recombinação do1995 DNA (antígeno da hepatite B, fatores sangüíneos VIII e IX, anticorpos monoclonais, anticorpos envolvidos na imunologia de transplantes, diversas citocinas, e outros).Fonte: LIMA et al., 2001 Os processos de manipulação, esterilização, quantificação, controle dequalidade, ampliação de escala e formação do produto são semelhantes aos debactérias, fungos e leveduras. No entanto, alguns cuidados especiais devem sertomados, pois células animais apresentam um crescimento mais lento, são maisfrágeis (não suportando grandes taxas de agitação), apresentam necessidadesnutricionais mais complexas, e, em muitos casos, necessitam de um suporte deadesão para o crescimento. Devido a essas peculiaridades, muitas vezes o cultivode células animais pode ser muito mais caro (LIMA et al., 2001). Originalmente, as células animais não conseguem crescer livres no meio decultivo assim como os microrganismos. Por isso são feitos cultivos primários, nosquais células vindas diretamente de tecidos animais são cultivadas em meio edissociadas cuidadosamente em células individualizadas. Isso é realizado através dafragmentação do tecido em pedaços suficientemente pequenos. Quando ocrescimento in vitro acontece e as células formam uma monocamada aderida aosuporte, ocorre o descolamento das mesmas com o auxílio de enzimas e as célulassão diluídas em meio de cultivo fresco para originar novas culturas (LIMA et al.,2001). Os meios de cultivo utilizados para o cultivo de células animais eramoriginalmente oriundos em fluidos biológicos. Devido à falta de uniformidade,
  • 34. 33começou-se a formulação de meios semi-sintéticos. Cada tipo de linhagem celularrequer um tipo diferente de meio, mas a maioria deles apresenta característicacomo:  Glucose e glutamina como fontes de carbono para o catabolismo.  Sais que garantem a isotonicidade do meio, evitando a desregulação osmótica.  Sistemas de tampão bicarbonato/CO 2, succinato de sódio/ácido succínico, e de tampões orgânicos do tipo HERPES (ácido 4-(2 hidroxietil)-1-piperazina-N’-2 etanossulfônico) e do tipo TRIS (2-amino- 2-hidroximetil-1,3 propanodiol).  Suplementação com soro sangüíneo (complexo de proteínas para a nutrição, adesão e crescimento celular, para a proteção biológica – antioxidantes e antitoxinas – e para proteção mecânica durante a agitação e aeração). Como os soros utilizados são geralmente de origem bovina ou eqüina, ele também pode ser fonte de contaminação por parasitas, bactérias, fungos ou vírus. Para evitar isso, tenta-se substituí-lo por outras composições, o que pode encarecer o processo.  Antibióticos como penicilina (100UI/mL), estreptomicina (50 μg/mL) e anfotericina B (25 μg/mL).  Água desmineralizada, destilada e isenta de pirogênio. (LIMA et al., 2001) A maioria das células animais se desenvolve bem entre 35 e 37ºC, podendotolerar temperaturas mais baixas, mas morrem em temperaturas mais altas. O pHótimo se encontra entre 7,2 e 7,4, sendo que algumas linhagem podem suportarextremos como 6,8 e 7,8 (LIMA et al., 2001). Já as cultivo de células vegetais tem como objetivo a produção de metabólitossecundários em processos em biorreatores ou a produção de mudas padronizadasatravés das técnicas de micropropagação. Através da manipulação genética tambémpode-se fazer um melhoramento de plantas, protoplastos (células sem parede)podem ser fusionadas de forma a produzir novos híbridos, e células transgênicaspodem ser desenvolvidas a plantas inteiras (WALKER & GINGOLD, 1997). A figura17 mostra algumas das utilidades do cultivo de células vegetais.
  • 35. 34 Com plantas, podem ser realizados cultivos com plantas inteiras, parte delas,tecidos, ou células únicas. O cultivo é feito em meios estéreis, contendo sais,vitaminas, fontes de carbono e reguladores de crescimento vegetal. Quando há ocultivo de tecidos organizados, permitindo posteriormente a obtenção de plantasinteiras, é possível obter um cultivo sem alteração do material genético. Já umcultivo de células desorganizadas ou que passaram por um processo demanipulação, é possível regenerar uma planta inteira modificada através dabiotecnologia (WALKER & GINGOLD, 1997). Figura 17- Utilidades do cultivo vegetal Fonte: VOGEL & TODARO, 1997. Através do cultivo in vitro de plantas é possível obter condições ambientaisespecíficas, as quais são livres de enfermidades e pragas, e o cultivo pode serrealizado continuamente. A produção pode ocorrer em fermentadores, onde ocrescimento celular ocorre até a fase estacionária, e depois ocorre extração doproduto; ou ainda em biorreatores de leito fixo, onde as células são imobilizadas naforma de agregados celulares em matrizes inertes como géis, espumas ou fibrasocas, e o produto é coletado de forma contínua ou semicontínua (WALKER &GINGOLD, 1997).
  • 36. 35 Células vegetais, tecidos e cultura de órgãos podem ser cultivadas tanto emmeio sólido quanto em meio líquido, sendo que a cultura em meio líquido facilita oaumento de escala de laboratório para a indústria. Recentemente, biorreatores decultivo vegetal em escala piloto no Japão tinham capacidade de 20 000L (VOGEL &TODARO, 1997). Os metabólitos secundários que podem ser produzidos por plantas podem serdivididos em fármacos, essências, perfumes, pigmentos e agentes químicos deutilidade na agricultura. No entanto, a maioria desses compostos é produzida embaixas concentrações, devido, entre outros fatores, a instabilidade de expressãogênica durante o cultivo (WALKER & GINGOLD, 1997).6- APLICAÇÕES DA FERMENTAÇÃO Os produtos biotecnológicos estão presentes em vários setores da economia,como na área química, farmacêutica, energética, alimentícia e agricultural. Os tiposde serviços que uma indústria de bioprocessos pode oferecer podem serclassificados em:  Produção de biomassa: onde o objetivo é a produção em grande quantidade de biomassa de bactérias, leveduras ou fungos. A biomassa de levedura pode ser utilizada no processo de panificação; já a biomassa da microalga Spirulina pode ser utilizada no enriquecimento de alimentos.  Produção de metabólitos celulares: visa à produção em larga escala de produtos de metabolismo celular. Eles podem ser intra ou extracelulares.  Produção de proteínas recombinantes: através da engenharia genética é possível manipular genes e introduzi-los em microrganismos de forma a chegar a produtos que antes eram produzidos em outras células ou ainda melhorar a especificidade de uma enzima.  Produção de enzimas: são os produtos celulares mais usados na indústria. Elas podem ser extraídas de animais ou plantas, mas a produção por microrganismos pode fornecer uma maior rendimento.  Biotransformação de compostos: há a transformação de substâncias do meio em outras. Esse recurso é bastante útil principalmente na área ambiental,
  • 37. 36 onde é possível fazer com que microrganismos retirem substâncias tóxicas do meio e convertam a produtos de toxicidade menor.6.1- PRODUÇÃO DE ALIMENTOS Os microrganismos são amplamente utilizados na produção de alimentos,tanto para consumo humano como animal. Aqui serão discutidos alguns exemplosde produtos de fermentação na indústria alimentícia. Antigamente, a produção de pães era feita guardando-se um pouco dassobras da última formada para servir como inóculo para a próxima. Atualmente,encontra-se levedura (fermento) comercialmente, sendo selecionadas as cepas maisprodutivas para tal atividade. A produção de biomassa de levedura para apanificação é feita em meio líquido contendo melaço ou licor de milho, com pH 4-5 eaeração. Ao final do cultivo as células são recuperadas por centrifugação e filtração.É adicionado um pouco de óleo vegetal para agir como plastificante, e a biomassa émoldada na forma de blocos e embalada para comercialização (NAJAFPOUR,2007). Na produção de queijos é necessária a formação do coalho, que é causadapela ação da renina sobre a caseína do leite. O tipo de bactéria lática inoculadatambém pode fornecer um sabor e odor característico. Queijos como o Cheddar e osuíço são maturados através do crescimento anaeróbico de bactérias láticas em seuinterior. Já queijos como o Limburger são maturados por bactérias e outrosmicrorganismos contaminantes que crescem na superfície. Queijos como o blue e oRoquefort são maturados pelos fungos Penicillium inoculados no queijo. Derivadosdo leite como a manteiga, o iogurte, o kefir e o kumiss também são produzidosatravés da fermentação (TORTORA et al., 2006). Pode ocorrer também de o próprio microrganismo ser o alimento. No entantoum pré-requisito básico para utilização de biomassa de microrganismos comoalimento e medicamento é a aprovação de sua segurança toxicológica. Algunsmicrorganismos podem produzir toxinas que podem fazer mal ao organismo dequem a ingerir (SILVA et al., 2007). Cogumelos são um dos tipos de organismos utilizados na alimentação. Seuuso é bastante difundido em vários países, principalmente asiáticos, onde eles sãoconsumidos na forma de chá, extratos ou em conjunto com outras ervas. Seu uso se
  • 38. 37dá principalmente devido a propriedades antibacterianas, antifúngicas, antivirais,imunomoduladoras, antialergênicas, antiinflamatórias, antiaterogênico e antitumoral,hipolipidemica e hipoglicemica. (LIMA et al., 2007) Existem aproximadamente duas mil espécies de cogumelos que podem serconsumidas por humanos, mas somente 25 delas são as normalmente usadas naalimentação. Daqueles que apresentam atividade biológica comprovada então oGanoderma lucidum (Reishi), Lentinus edodes (Shiitake), Agaricus brasiliensis(Cogumelo do Sol), Inonotus obliquus (Chagas), G. frondosa (Maitake). Compostosque apresentam atividade biológica estão presentes na biomassa desses fungos ouentão são excretados. Esses compostos incluem argenina, esteróides, lipídeos,lectina e polissacarídeos, sendo esse último importante na ação antitumoral eimunomoduladora. (LIMA et al., 2007) Outra biomassa de poder nutritivo e terapêutico é das cianobactérias como aSpirulina sp. podem produzir importantes compostos bioativos como metabólitossecundários que podem ser constituintes de complementos alimentares ou ainda abiomassa ser utilizada como um novo alimento. Compostos por elas produzidospodem apresentar ação anticancerígena, antioxidante, antibacteriana, antiviral eantifúngica (SILVA et al., 2007). As tabelas 3 e 4 mostram alguns dos principais alimentos e bebidas queutilizam a fermentação.Tabela 3- Alimentos fermentadosAlimentos e Produtos Ingredientes Crus Microrganismos FermentadoresLaticíniosQueijos (maturados) Coalho de leite Streptococcus spp., Leuconostoc spp.Kefir Leite Streptococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus, Candida spp.Kumis Leite de água L. bulgaricus, L. leichmannii, Candida spp.Iogurte Leite, sólidos do leite S. thermophilus, L. bulgaricusProdutos de Carne e PeixePresuntos curados Presunto de porco Aspergillus, Penicillium spp.Salsichas Porco, carne de gado Pedicoccus cerevisiaeMolho de peixe Pequenos peixes Bacillus spp halofílicos
  • 39. 38Produtos de PlantasCacau (chocolate) Fruto do cacau Candida krusei, Geotrichum spp.Grão de café Fruto do café Erwinia dissolvens, Saccharomyces spp.Kimchi Repolho e outros Bactérias lácticas vegetaisMissô Grãos de soja Aspergillus oryzae, Zygosaccharomyces rouxiiAzeitonas Azeitonas verdes Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarumPoi Raízes de taioba Bactérias lácticasRepolho azedo Repolho Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus plantarumMolho de soja Grãos de soja A. oryzae, A. soyae, Z. rouxii, Lactobacillus delbrueckiiPãesBolos, pães e outros Farinha de trigo Saccharomyces cerevisiaePão azedo de São Farinha de trigo S. exiguus, LactobacillusFrancisco sanfranciscoFonte: TORTORA et al., 2006Tabela 4- Bebidas fermentadas Bebida Levedura Função da leveduraCerveja e vinhoCerveja, cerveja lager Saccharomyces Converter açúcar em álcool e CO 2. A cerevisiae levedura cresce no fundo do recipiente.Cerveja, ale S. cerevisiae Converter açúcar em álcool e CO 2. A levedura cresce no topo do recipiente.Saquê S. cerevisiae Converter açúcar em álcool.Vinho, natural S. cerevisiae Converter açúcar da uva em álcool.Vinho, espumante S. cerevisiae Na fermentação secundária produz CO 2. A(champanhe) levedura assenta rapidamente.Bebidas destiladasRum Levedura selvagem Converte açúcar em álcool.Conhaque S. cerevisiae Converte açúcar em álcool.Uísque S. cerevisiae Converte açúcar em álcool.Fonte: TORTORA et al., 2006
  • 40. 396.2- PRODUÇÃO DE ANTIBIÓTICOS Antibióticos são produtos secundários do metabolismo que, em contato comoutros microrganismos, podem inibir o crescimento do mesmo. No ramo dos antibióticos, um dos principais é a penicilina, onde há aprodução de praticamente 33 milhões de toneladas métricas anuais movimentandopraticamente US$ 400 milhões. A venda mundial dos três principais grupos deantibióticos (penicilina, cefalosporina, tetraciclina e eritromicina) gera US$ 4,2bilhões por ano (NAJAFPOUR, 2007). No início dos anos 40, Alexander Fleming notou a produção de penicilina pelofungo Penicillium notatum, a qual inviabilizou a cultura de Staphylococcus aureus.Atualmente, a produção desse antibiótico é feita por uma outra espécie, Penicilliumchrysogenum, pois assim há a formação de uma maior quantidade de produto(aproximadamente 1000 vezes mais). Já antibióticos como a estreptomicina sãoproduzidos por Actinomicetos. O cultivo submerso também favoreceu a produção deantibióticos em larga escala (NAJAFPOUR, 2007). Para a produção de penicilina, podem ser utilizados resíduos industriais comomelaço. As etapas de produção consistem basicamente em: 1. Preparação do inóculo. 2. Preparação e esterilização do meio. 3. Inoculação do meio no fermentador. 4. Aeração forçada com ar estéril durante a incubação. 5. Após a fermentação há a remoção do micélio formado. 6. Extração e purificação da penicilina. A penicilina é produzida a partir da L-cisteína e L-valina. A produção se dá deforma não ribossomal, por meio de um dipeptídeo composto de L-α-aminoadípico (L-α-AAA) e L-cisteína ou um produto de degradação da cistationina. Após, ela seconecta a L-valina através de uma epimerização. O produto da ciclização dotripeptídeo é a isopenicilina N. A benzilpenicilina é produzida no intercâmbio de L- α-AAA com ácido fenilacético ativado. (LIMA et al., 2001) Dos antibióticos de origem microbiana, somente 123 são produzidos porfermentação, o resto é produzido de forma sintética ou semi-sintética. As bactérias
  • 41. 40produzem um número de 950 antibióticos, já os actinomicetos pruduzem 4600antibióticos, e os fungos 1600 (LIMA et al., 2001).6.3- PRODUÇÃO DE ENZIMAS As enzimas são amplamente utilizadas na indústria. Como exemplo pode-secitar o uso de amilases para a produção de xaropes do amido de milho, na produçãode papéis e na produção de glicose de amidos. No entanto, pode-se utilizar omicrorganismo inteiro para o processo ou somente a enzima. Percebendo isso,indústrias resolveram se especializar somente na produção de enzimas (TORTORAet al, 2006). Vários fungos sintetizam e excretam grandes quantidades de enzimas nomeio de cultivo. Culturas como a de Aspergillus, Penicillium, Mucor e Rhizopus sãobastante utilizadas na indústria (NAJAFPOUR, 2007). A produção de enzimas em larga escala se dá principalmente através dafermentação submersa, embora em países orientais chega-se a utilizar fermentaçãosemi-sólida (LIMA et al., 2001). Elas podem ser separadas do meio de cultivo após afermentação através de solventes como etanol ou adição de sais inorgânicos comosulfato de amônio (NAJAFPOUR, 2007).6.4- PRODUÇÃO DE ANTICORPOS Anticorpos são proteínas da família das imunoglobulinas, que são sintetizadasnormalmente pelo corpo de animais de forma a responder a moléculas estranhas. Énecessário haver uma grande produção de anticorpos, pois sua demanda é bastanteelevada. E para isso, as plantas de produção têm aumentado em tamanho equantidade nas últimas décadas. Também nessa época houve o desenvolvimentode anticorpos recombinantes que são produzidos in vitro em grande quantidadecomo se fossem produzidos por células in vivo. Isso foi obtido através da procura decélulas com alto coeficiente de produtividade (SCHEPER & HU, 2006). O cultivo em batelada é raramente utilizado nesse caso, exceto em escalalaboratorial. É mais freqüente o uso de batelada alimentada ou cultivo contínuo comretenção de células (SCHEPER & HU, 2006).
  • 42. 41 A produção de anticorpos monoclonais tem sido bastante estudada,principalmente a potencialidade de seu uso como uma droga terapêutica devido asua especificidade de ligação. Dentro da farmacoterapia, anticorpos monoclonaistem sido utilizados no tratamento de doenças infecciosas (Synagis TM), câncer(HerceptinTM) e doenças autoimunes (RemicadeTM). No entanto, esses tratamentosainda continuam sendo muito caros devido ao processo de produção. Eles eramprduzidos antigamente em camundongos, mas atualmente é possível produziralguns tipos em Escherichia coli através de técnicas de DNA recombinante(SCHEPER & HU, 2006).6.5- PRODUÇÃO DE INOCULANTES A biotecnologia não é utilizada na agricultura somente através de organismosvegetais geneticamente modificados. É também bastante importante a técnica deprodução de inoculantes agrícolas. Ela consiste na utilização de microrganismospara melhorar o solo em que ocorrerá o cultivo, propiciando a fertilização natural dosolo, reduzindo os danos causados por doenças, estimulando o crescimento vegetale reduzindo a carga de inseticidas que podem eventualmente permanecer no solo. É bastante utilizado nessa área o fato de que algumas bactérias e fungospodem fazer simbiose com vegetais. Bactérias como Bradyrhizobium e Rhizobiumsão importantes na simbiose com leguminosas como soja e feijão, auxiliando nafixação do nitrogênio atmosférico. Fungos são utilizados na micorrização das raízesde Pinus sp. e Eucaliptus sp., auxiliando na fixação e crescimento de mudas noambiente (LIMA et al., 2001). Para a fixação de nitrogênio, são utilizadas culturas isoladas de bactérias(usualmente Rhizobium) que consigam formar nódulos de fixação nas raízes deleguminosas. As características do solo onde ocorrerá o plantio também éimportante para selecionar uma cepa que seja adequada para aquelas condições detemperatura e pH. Pode ocorrer também uma competição entre bactérias do inóculoe bactérias naturais do solo, inviabilizando o seu desenvolvimento. Outra característica importante da linhagem a ser usada é que as célulasmicrobianas devem suportar as condições de produção industrial, se multiplicandode forma significativa nos tanques cultivo.
  • 43. 42 Sobre os inoculantes a base de fungos, são utilizados microrganismos deação mutualística, formando associações com raízes de vegetais superiores.Dependendo do tipo de colônias formadas nas raízes, os fungos podem serclassificados como endomicorrizas (quando há penetração na raiz) ouectomicorrizas. A seleção de microrganismos pode ocorrer de espécies naturais, a fim de seencontrar o organismo que propicia uma melhor associação. A produção em grandequantidade na indústria ocorre através de cultivos em estado sólido ou submerso. Oprimeiro tipo apresenta problemas quanto ao controle de pH, temperatura edisponibilidade de oxigênio e substrato. Essas condições já podem ser melhorajustadas durante o cultivo submerso (LIMA et al., 2001).6.6- TRATAMENTO AMBIENTAL Um processo industrial geralmente apresenta a produção de alguns produtosindesejáveis, e esses resíduos devem ser descartados de uma forma apropriadapara não danificar o ambiente. Um modelo de industria ideal seria aquele em quenão haveria nenhum resíduo e ocorreria uma integração de todos os processos (oresíduo de um processo poderia servir de substrato pra outro). ZANETE, 2007,utilizou esse princípio para modelar uma biorrefinaria integrada, onde, por exemplo,um resíduo como bagaço de cana poderia ser utilizado tanto na produção de energiaquanto no cultivo de microorganismos para a produção de etanol. Com a constante preocupação da população com relação à preservação domeio ambiente, deve-se prestar muita atenção aos resíduos industriais aprovidenciar tratamento adequado para cada tipo. Para compostos biodegradáveis pode-se fazer uso da biodegradação, ondemicrorganismos fazem a decomposição de compostos, desde que eles tenham amaquinaria enzimática necessária (LIMA et al., 2001). Outra utilização é o fenômenode absorção de metais tóxicos do ambiente por microrganismos (por exemplo,algas), pois podem suportar quantidades um pouco mais elevadas. A utilização debiofiltros no tratamento de gases tóxicos também tem sido bastante estudada (MOO-YOUNG & CHISTI, 1994). A diferença do tratamento biológico de efluentes líquidos, sólidos e gasososcom relação aos outros processos discutidos anteriormente é que a escala de
  • 44. 43operação é geralmente muito maior e os microrganismos são utilizados em culturasmistas, muitas vezes sem esterilização (MOO-YOUNG & CHISTI, 1994).6.7- PRODUTOS RECOMBINANTES Através da tecnologia do DNA recombinante foi possível aumentar aquantidade de produtos resultantes da fermentação realizada por microrganismos.Por essa técnica consegue-se induzir em um microrganismo a produção de umaproteína heteróloga que originalmente pertencia a outro organismo. Algunsexemplos bem sucedidos são a produção de insulina humana, de hormônio docrescimento e de interferon pela bactéria Escherichia coli (WALKER & GINGOLD,1997). Um exemplo de processo recombinante está na figura 18, onde os genes deorigem externa, como, por exemplo, tecido animal, são inseridos em microrganismosatravés de técnicas de biologia molecular.Figura 18- Produção de plasmídio recombinanteFonte: Adaptado de DORAN, 1995 Os organismos mais utilizados nesse processo são Escherichia coli, Bacillussubtilis, leveduras, células cultiváveis de eucariotas superiores, como de inseto e demamíferos. As bactérias da espécie E. coli são amplamente utilizadas devido àfacilidade de crescimento e produção. Existem alguns fatores importantes duranteuma fermentação que utiliza um gene recombinante, como:  Modificações pós-traducionais.  Modo de secreção do produto.  Minimização da degradação do produto.
  • 45. 44  Proteção da expressão do gene estrangeiro.  Controle do início de sua síntese durante a fermentação. (WALKER & GINGOLD, 1997) Para conseguir a expressão de genes eucarióticos em bactérias, deve-selevar em conta que esses genes possuem seqüências de exons e introns. Portantodeve-se modificar a seqüência de modo a ter somente os códons que devem sercodificados em aminoácidos. Proteínas originárias de organismos eucarióticospodem não ter sua produção exata em microrganismos também devido à presençade algumas modificações pós-traducionais, como glicosilação, o que não é feito pormuitas bactérias. Outros fatores a serem observados são a freqüência de códonsutilizados pelo organismo (codon usage bias), pois, como o código genético édegenerado (apresentando mais de um códon codificando o mesmo aminoácido),cada organismo utiliza um códon preferencialmente em relação a outro. Para que o gene de interesse seja inserido na bactéria de interesse, énecessária a utilização de vetores genéticos. Existe um vetor mais recomendadodependendo do objetivo desejado. Plasmídios são pequenos segmentos de DNAcirculares que apresentam replicação autônoma, dentro dos quais podem serinseridas seqüências gênicas pequenas (até 10kb). Bacteriófagos já aceitamseqüências maiores (de 20 a 40 kb). Existem também os cosmídios, fosmídios ecromossomos de levedura artificiais (YAC). A inserção de material genético exógeno por meio de vetores de clonagem émuito importante na metagenômica, que é a análise genômica de comunidadesmicrobianas independentes de cultivo. Muitos microrganismos não conseguem sedesenvolver bem em meios de cultivo artificiais, mas ao mesmo tempo podem conterseqüências gênicas importantes para o desenvolvimento de alguns processos. Parase fazer uso delas pode-se fazer uma extração do DNA ambiental, ou seja, coleta-seuma porção do meio ambiente e extrai-se o DNA de todos os microrganismos alipresentes. Em seguida contrói-se uma biblioteca genômica de todos os segmentosde DNA obtidos, fazendo uma fragmentação das seqüências, inserindo os pedaçosem E. coli através de plasmídios eselecinando aquelas bactérias que sofreramtransformação. Através de um “screening” seletivo das bactérias recombinantes, épossível achar bactérias que realizam processos metabólicos de interesse que são
  • 46. 45realizados de forma mais eficiente ou que antes só podiam ser realizados no meionatural. A figura 19 mostra de forma esquematizada esse processo:Figura 19- Montagem de uma biblioteca genômica através de DNA do ambiente Fonte: Figura montada pelo autor. A utilização de microrganismos é bem controlada, e existem regras como aGILSP (Good Industrial Large-Scale Practice) que estipula que o organismo que iráreceber a seqüência gênica exógena deverá ser não patogênico, não deve conterelementos patogênicos como vírus, fagos e plasmídios, deve ter uma longa históriade uso seguro na indústria ou ter limitações ambientais de crescimento (ou seja, elenecessita de uma condição ambiental controlada industrialmente para crescer, casocontrário ele morrerá). No caso de ser um organismo patogênico ele deve sermanuseado com muita cautela e deve ser conhecido um tratamento eficiente para adoença caso haja algum escape (VOGEL & TODARO, 1997). O local de manipulação desses microrganismos também deve ser observadode acordo com as características por ele apresentadas. Equipamentos, técnicas deoperação e local adequado para manipulação de determinados microrganismosestão presentes em “Guideline for Industrial Application of Recombinant DNATechnology”, que foi publicado pelo ministério de troca internacional e indústria doJapão (VOGEL & TODARO, 1997).
  • 47. 467- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICASBADOTTI, F.; DÁRIO, M. G.; ALVES-JR, S. L.; CORDIOLI, M. L. A.; MILETTI, L. C.;ARAUJO, P. S.; STAMBUK, B. U. Switching the mode of sucrose utilization bySaccharomyces cerevisiae. Microbial Cell Factories 2008, 7:4.BEESCH, S. C. Acetone-Butanol Fermentation of Sugars. Engineering andProcess development, Industrial and Engineering Chemistry, Vol. 44, No 7. p.1677-1682, 1952.CROCOMO, O. J. Transformações metabólicas em microrganismos. Instituto deBioquímica da Universidade Federal do Paraná, Curitiba, 1967. 165 páginas.DORAN, P. M. Bioprocess Engineering Principles. London: Academic PressLimited, 1995, 439 p.JONES, D. T.; WOODS, D. R. Acetone-Butanol Fermentation Revisited. AmericanSociety for Microbiology, Microbiological Reviews, Vol. 50, No. 4, p. 484-524, Dec.1986.KRISTIANSEN, B.; RATLEDGE, C. Basic Biotechnology. Second Edition.Cambrige University Press, 2001, 568 p.LAGUNAS, R.; DOMINGUEZ, C.; BUSTURIA, A.; SÁEZ, M. J. Mechanisms ofAppearance of the Pasteur Effect in Saccharomyces cerevisiae: Inactivation ofsugar transport systems. Journal of Bacteriology, vol. 152, No. 1, p. 19-25, Oct.1982.LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger - Princípios deBioquímica. Editora Sarvier, 4ª edição, São Paulo, 2006. 1202 páginas.LIEBIG, M. J. Sur les phénomènes de la fermentation et de la putréfaction, etsur les causes qui les provoquent. Annales de Chimie et de Physique. 2e SerieLXXI, p.147-195. 1839
  • 48. 47LIMA, L. F. O.; NASCIMENTO, B. M.; HABU, S.; PARADA, J. L.; SOCCOL, C. R.Produção de Biomassa e de Exopolissacarídeos por Agaricus brasiliensis emFermentação Submersa. Anais do XVI Sinaferm, 2007.LIMA, U. A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W.; SCHMIDELL, W. BiotecnologiaIndustrial – Volume 3 – Processos Fermentativos e Enzimáticos. Editora EdgardBlücher, São Paulo, 2001.MOO-YOUNG, M.; CHISTI, Y. Biochemical Engineering in Biotechnology. Pure &Applied Chemistry, Vol. 66, No. 1, p. 117-136, 1994.NAJAFPOUR, G. D. Biochemical Engineering and Biotechnology. First Edition,Elsevier, 2007. 421 p.PANDEY, A. SOCCOL, C. R.; LARROCHE, C. Current developments in solid-state fermentation. Asiatech Publishers, Inc. New Delhi, 2007.PASTEUR, L. Mémoire sur la fermentation appelée lactique (Extrat par l’auteur)- 1857. Molecular Medicine, Volume 1, Number 6, September 1995.PRESCOTT, S. C.; DUNN, C. G. Industrial Microbiology. Third edition, McGraw-Hill Book Company, Inc. Nova Iorque, 1959, 943 páginas.PURICH, D. L.; ALLISON, R. D. Handbook of Biochemical Kinetics. AcademicPress, London, 2000, 788 p.RHEM, H.-J.; REED, G. Biotechnology: a comprehensive treatise in 8 vol. -Volume 1: Microbial Fundaments. Weinheim; Deerfield Beach, Florida; Basel:Verlag Chemie, 1981.SCHEPER, T.; HU, W. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology -Cell culture engineering. Volume 101, Springer, 2006.
  • 49. 48SCHWARTZ, M. Life and works of Luis Pasteur. Journal of Applied Microbiology,91, 597-601, 2001.SILVA, C. A.; NERY, I. A.; BOBEDA, C. R. R.; TEIXEIRA, R. C., OLIVEIRA, M. A. C.L. Estudo da Produção de Cultura Mista de Spirulina platensis e Spirulinamaxima em Batelada. Anais do XVI Sinaferm, 2007.STANBURY, P. F.; WHITAKER, A.; HALL, S. J. Principles of FermentationTechnology. Second Edition. Butterworth Heinemann, Elsevier Science, 1995, 357p.TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, A. L. Microbiologia. 8ª edição, 1ªreimpressão, Artmed, Porto Alegre, 2006.VOGEL, H. C.; TODARO, C. L. Fermentation and Biochemical EngineeringHandbook: Principles, Process Design, and Equipment. Second edition, NoyesPublications, 1997. 799p.WALKER, J. M.; GINGOLD, E. B. Biología Molecular y Biotecnología. 2ª edición.Editorial ACRIBIA, S.A. Zaragoza, 1997, 475 p.ZANETTE, A. L. Balanço material e energético de uma biorrefinaria integrada.Anais do XVI SINAFERM, 2007.
  • 50. 498- ANEXO BIOCHEMICAL ENGINNERING IN BIOTECHNOLOGY (Technical Report) M. MOO-YOUNG and Y. CHISTI