Studie beweist gefährlichkeit von aluminium in impfstoffen (neurotoxikologe chris shaw 2009)
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Studie beweist gefährlichkeit von aluminium in impfstoffen (neurotoxikologe chris shaw 2009) Document Transcript

  • 1. Aluminiumhydroxid-Injektionen fuhren zu moto- ¨rischen St¨rungen und Abbau von motorischen oNeuronenChristopher A. Shaw and Michael S. Petrik Zusammenfassung Das Golfkriegssyndrom (GWS) ist eine Multisystemerkrankung, das viele Veteranen der westlichen Armeen, die im Golfkrieg involviert waren von 1990-1991, betrifft. Etliche Betroffene zeigen neurologische St¨rungen o inklusive viele kognitive St¨rungen und einer Motoneuronenkrankheit, wo- o bei letztere ununterscheidbar ist von der klassischen Amyotrophen La- teralsklerose (ALS) ausser im Alter des Krankheitsausbruches. Dieses ALS “Cluster” stellt die zweite von solchen ALS Clustern dar, das bis jetzt in der Literatur beschrieben wurde. M¨gliche Gr¨ nde von GWS o u sind mehrere Hilfsmittel in Impfstoffen gegen Anthrax und anderes. Das meist verd¨chtigte scheint Aluminiumhydroxid zu sein. In einer ersten a Serie von Experimenten, haben wir die potentielle Giftigkeit von Alu- miniumhydroxid untersucht und es dazu in m¨nnlichen, ausgewachse- a nen CD-1 M¨usen unter die Haut injiziiert in zwei Dosen ¨quivalent f¨ r a a u Menschen. Nach der Opferung wurde das R¨ ckenmark und der Motor- u kortex immunohistochemisch untersucht. Aluminium behandelte M¨use a zeigten eine signifikant erh¨hte Apoptose der Motoneuronen und eine o Erh¨hung von reaktiven Astrozyten und Vermehrung der Mikrogliazellen o im R¨ ckenmark als auch im Kortex. Mit Hilfe der Morin-F¨rbung wur- u a de Aluminium im Cytoplasma der Motoneuronen festgestellt mit einigen davon positiv getestet f¨ r das hyperphosphorylierte tau Protein, einem u pathologischen Merkmal von vielen neurologischen Krankheiten inklusi- ve Alzheimer-Krankheit und Frontotemporaler Demenz. In einer zweiten Serie von Experimenten wurden M¨usen sechs Dosen von Aluminiumhy- a droxid injiziiert. Untersuchungen des Verhaltens der M¨use zeigten eine a Anzahl von St¨rungen der motorischen Funktionen als auch verringerte o Kapazit¨t des r¨umlichen Ged¨chtnisses. Die demonstrierte Giftigkeit von a a a Aluminiumhydroxid und dessen Allgegenw¨rtigkeit als Hilfmittel legt na- a he, dass eine gr¨ssere Untersuchung durch die wissenschaftliche Gemein- o schaft gerechtfertigt ist.1 Einfuhrung ¨Verschiedenste Studien haben eine Korrelation zwischen dem Golfkriegsein-satz (1990-1991) und der Multisystemkrankheit gew¨hnlich als Golfkriegssyn- odrom bezeichnet etabliert. Das GWS beinhaltet verschiedenste neurologischeSt¨rungen inklusive einem deutlichen Cluster von F¨llen der Amyotrophen La- o ateralsklerose (1-4). Haley (3) beschreibt bei Golfkriegsveteranen klassische ALSSymptome wie Muskelschw¨che und -schwund, beeintr¨chtigtes Sprechen und a aSchlucken, Atemschwierigkeiten und Faszikulation Jahre nachdem sie zuerst an- 1
  • 2. dere Symptome des GWS entwickelt haben. 17 von den 20 Dienstm¨nnern dia- agnostiziert mit Golfkriegssyndrom und eindeutiger ALS waren weniger als 45Jahre alt, wobei der J¨ngste von ihnen 20 Jahre alt war. Alle 20 Patienten uzeigten einen Abbau der oberen (Motorkortex oder bulbren Region) und un-teren (R¨ckenmark) Motoneuronen. Keiner der Patienten hatte eine Familien- uvorgeschichte mit ALS oder anderen neurodegenerative Erkrankungen. Horneru.a. (2) f¨hrte eine landesweite Fallstudie durch um die Neuerkrankungen an uALS f¨r das Jahrzehnt nach August 1990 unter aktiven Diensthabenden der uArmee festzustellen. 107 F¨lle von ALS wurden unter dem ungef¨hr 2,5 Millio- a anen z¨hlenden Milit¨rpersonal identifiziert. Wenn standardisiert f¨r die Durch- a a uschnittsbev¨lkerung der USA im Jahre 1990, betr¨gt die j¨hrliche Neuerkran- o a akung durch ALS unter nicht-eingesetztem Milit¨rpersonal 1,4 pro 100000 Per- asonen pro Jahr im Vergleich zu der generell akzeptierten Neuerkrankungsrateder Gesamtbev¨lkerung von 1,5 F¨llen pro 100000 Personen. Die Neuerkran- o akungsrate durch ALS unter der im Milit¨r eingesetzten Population war 3,6 pro a100000 Personen/Jahr. Weisskopf u.a. (4) beobachteten einen generellen Anstiegvon ALS in der US Milit¨rpopulation das f¨r mehrere Jahrzehnte auftaucht. a u ALS-GWS ist ein von nur zwei ALS Krankheitscluster, das gegenw¨rtig als aCluster akzeptiert wird. Der andere ist eine guamanische Variante von ALSerstmals beschrieben nach dem zweiten Weltkrieg genannt Amyotropische Late-ralsklerose Parkinsonsches Demenzkomplex (ALS-PDC). Dieses Spektrum vomSt¨rungen mit einer Neuerkrankungsrate 100 Mal h¨her als in der kontinentalen o oUSA (s. Kurland, 1988), erschien in zwei Formen. Die erste war fast wie die klas-sische Form der ALS; die zweite war eine Form von Parkinson verbunden miteiner Alzheimer-Krankheit ahnlichen Demenz (PDC). Ungef¨hr 10% der Opfer ¨ aentwickelten beide St¨rungen, wobei typischerweise der ALS Phenotyp zuerst oerschien. Studien uber die potentielle Krankheitsursache konzentrierten sich auf ¨Umweltfaktoren mit dem gr¨ssten Schwerpunkt auf den Konsum von giftigen oSamen der lokalen Palmfarnen (6) und dem hohen Aluminiumgehalt der Erdein S¨d-Guam (7). u In Bezug auf dem GWS-ALS AVA Impfstoff, wurde die Aufmerksamkeit aufden angelagerten Anthrax Impfstoff (AVA) und verschiedenste Inhaltsstoffe vonImpfstoffen gelenkt, im Besonderen wurden Hilfsstoffe, Aluminiumhydroxid undSqualen verd¨chtigt (8). Ein Hilfsstoff ist eine Substanz, das w¨hrend der Impf- a astoffproduktion hinzugef¨gt wird um unspezifisch die Immunantwort auf ein uAntigen zu erh¨hen (9). Aluminiumverbindungen wurden vor uber 90 Jahren o ¨als Hilfsmittel identifiziert . Gegenw¨rtig ist Aluminium, in verschiedenen For- amen (Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Aluminiumsulfat) das meistzugelassene Hilfsmittel, dessen Benutzung im Allgemeinen durch die Pharma-industrie als auch durch verschiedene staatliche Aufsichtsbeh¨rden als sicher oeingesch¨tzt wird (10). Verschiedene Studien haben keinen ung¨nstigen oder a uLangzeit-Gesundheitseffekte durch Aluminiumhilfsmittel gefunden (11-13) unddie Food and Drug Administration (FDA) hat ihre langj¨hrige Bewilligung f¨r a uden Nutzen von Aluminium in dieser Art weitergef¨hrt. u 2
  • 3. Trotz langer Entwicklung des weitverbreiteten Nutzens, sind die physikalisch-chemischen Interaktionen zwischen den Aluminiumverbindungen und dem Anti-gen relativ schlecht verstanden und deren zugrunde liegenden Mechanismen sindkaum untersucht worden (14). Es scheint, dass keine rigorosen Tierversuche zurpotentiellen Giftigkeit von Aluminiumverbindungen durchgef¨hrt worden sind. uDas Fehlen von solchen Studien ist seltsam, da Beobachtungen, das Aluminiumim Allgemeinen neurotoxisch sein kann unter einer Anzahl von Konditionen be-kannt ist (15,16) und vorallem Hilfsmittel mit neurologischen Erkrankungen inVerbindung gebracht worden sind (17-19). Tabelle 1 zeigt die Resultate von bis-herigen Studien, in denen Tiere mit Aluminiumhydroxid behandelt worden sind,mit der resultierenden Auswirkung auf das Nervensystem. Im Zusammenhangmit der Nutzung von Aluminium in Impfstoffen, sind LD50 Werte f¨r Alumini- uumhydroxid bisher noch nicht publiziert worden nach unserem besten Wissen(J.T. Baker Material Safety Data Sheets). Die M¨glichkeit, dass Aluminiuminjektionen makrophagische Myofasciitis oausl¨st, wurde in der Literatur beobachtet (20-22). o Eine fr¨here Publikation untersuchte die potentielle Neurotoxizit¨t von meh- u areren bekannten oder verd¨chtigten Impfstoffhilfsmitteln. In dieser Studie, wer- aden wir uns ausschliesslich auf die Auswirkung von Aluminiumhydroxid-Injektionenauf das motorische und kognitive Verhalten untersuchen und auf das Erscheinenvon verschiedenen Formen von Neuropathologie im in vivo Mausmodell.2 Versuchsvorg¨nge a2.1 VersuchstiereIn unserer Erststudie (8), wurden junge erwachsene (3 Monate alt), m¨nnliche aCD-1 M¨use benutzt (ungef¨hr 35 g zu Beginn des Experiments). J¨ngere Tiere a a uwurden absichtlich gew¨hlt um das typische Einsatzalter w¨hrend dem Golfkrieg a a(3) zu imitieren. Vier subkutane Injektionsbl¨cke (zwei Injektionen im Abstand ovon 2 Wochen) wurden benutzt: Kontrolle Salz/Phosphat gebufferte L¨sung o(PBS)(n = 10); Aluminiumhydroxid (n = 11); Squalen (n = 10); und Alumini-umhydroxid und Squalen (n = 10). Diese Studie wird nur von der Aluminiumbehandelten und der Kontrollgruppe von dieser Versuchsreihe berichten. Einezweite Versuchsreihe wurde an 9 Monate alten CD-1 M¨nnchen durchgef¨hrt, a udas sechs Aluminiumhydroxid-Injektionen erhielten uber einen Zeitraum von 2 ¨Wochen. Diese M¨use, mit der Kontroll- und anders behandelter Gruppe (wird aandernorts Bericht erstattet), wurden einem strikten Verhaltens-Testsystem un-terzogen, das unten beschrieben wird. Histologische Analysen des R¨ckenmarks uund des Gehirns dieser M¨use sind im Gange. a Alle Tiere in beiden Experimenten wurden einzeln eingesperrt in der Tierbe- 3
  • 4. treuungseinrichtung des Jack Bell Forschungszentrums in Vancouver, B.C., Ka-nada. Das ganze Experiment hindurch wurde eine Raumtemperatur von 22 Cund einem 12/12h Lichtzyklus beibehalten. Alle M¨use wurden mit Purina aMausfutter gef¨ttert und Zugang zu Futter und Wasser war gegeben ad libitum. u ¨ M¨use von beiden Studien wurden mit einer Uberdosis an Halothan und amit transkardialer k¨nstlicher Durchblutung mit 4% Paraformaldehyd (PFA) ugeopfert. Das Gewebe vom Zentralnervensystem wurde f¨r histologische Unter- usuchungen gesammelt. Fixiertes Gehirn und R¨ckenmark von allen M¨usen wur- u aden uber Nacht in eine 30% Saccharose/PBS-L¨sung eingelegt und dann einge- ¨ ofroren und gelagert bei -80 C bis zur Sektionierung. Alles Gehirn-/Markgewebewurde in Tissue-Tek optimaler Schneidetemperatur (O.C.T) Verbindung (Sa-kura, Zoeterwoude, Niederlanden) befestigt und dann durch Kryostat in 30 µmkoronale Scheiben geschnitten. Das R¨ckenmark wurde zu 25 µm in der Quere- ubene geschnitten. Die Schnitte wurden kryogesch¨tzt in 30% Ethylenglycol-20% uGlycerol-dibasisch und monobasische Natriumphosphatel¨sung und bis zur Be- onutzung bei -20 C gefroren gehalten.2.2 HilfsmittelAlhydrogel , ein Aluminiumhydroxid (Al(OG)3 ) Gelsuspension, wurde als Quel-le f¨r Alumniumhydroxid benutzt. Alhydrogel wird durch Superfos Biosector a/s u(D¨nemark) hergestellt und erworben uber SIGMA Kanada. a ¨ 2.2.1 Dosen Um die ungef¨hre menschliche Dosis an Aluminiumhydroxid f¨r unsere Ex- a uperimente zu berechnen, benutzten wir folgende Informationen: Der AVA Impf-stoff f¨r den Gebrauch durch Menschen wird durch Bioport Corporation, von uLansing, Michigan hergestellt. Laut Produktdatenblatt vom Michigan Biolo-gic Products Institute (MBPI, Lansing, Michigan, USA; Bioports Vorg¨nger), aenth¨lt eine Einzeldosis von AVA Impfstoff 2,4 mg Aluminiumhydroxid (¨quivalent a azu 0,83 mg Aluminium). Basierend auf das angenommene menschliche Durch-schnittsk¨rpergewicht von 70-80 kg, w¨re die Menge pro kg K¨rpergewicht un- o a ogef¨hr 30-34 µg/kg. Soldaten oder Zivilisten, die den Impfstoff erhalten, w¨rden a uvon 30-34 µg/kg (1 Injektion) bis zu ungef¨hr 200 µg/kg f¨r 6 Injektionen er- a uhalten. Die Hilfsmittelinjektionen in den behandelten M¨usen wurden basierend auf adem durchschnittlichen Tiergewicht f¨r beide Experimente kalibriert. In Ex- uperiment 1, wurden zwei Injektionen einer Aluminiumhydroxid-L¨sung von 50 oµg/kg in einem Gesamtvolumen von 200 µL steriler PBS (0.9%) im Abstandvon zwei Wochen verrichtet. Die M¨use in diesem Experiment h¨tten deshalb a a100 µg/kg erhalten versus einer wahrscheinlichen 68 µg/kg in Menschen. Im Ex-periment 2, erhielten die M¨use sechs Injektionen zu einem Total von 300 µg/kg a 4
  • 5. Aluminiumhydroxid uber 2 Wochen. Kontrollen in beiden Studien wurden mit ¨200 µL PBS injektiert. Der Injektionsort bei Verabreichung an Menschen ist typischerweise sub-kutan uber dem Deltamuskel. F¨r Injektionen in M¨usen benutzten wir eine ¨ u asubkutane Injektion in der lockeren Haut hinter dem Nacken (das “Genick”)um das Unbehagen zu minimieren und f¨r die Einfachheit der Injektion. u2.3 Untersuchung des VerhaltensIn der ersten Studie, wurden die M¨use in regelm¨ssigen Zeitabst¨nden spezi- a a afischen Verhaltenstests bez¨glich der motorischen und kognitiven Funktion un- uterworfen, inklusive Maschendrahthang (2x/Woche), offenes Feld (1x/Woche)und Wasser-Labyrinth (1x/Woche) uber einer 6 monatigen Nachinjektionsperi- ¨ode (s. (22)). Die Reihenfolge mit der die Tiere getestet wurden war f¨r jeden uVersuch zuf¨llig. In der zweiten Studie, haben wir eine detailliertere Verhaltens- auntersuchung durchgef¨hrt basierend auf das automatisierte EthoVision System u(Noldus EthoVision 3.1). Einzelne Bewegungen der M¨use wurden f¨r 5 Minu- a uten auf dem offenen Feld in w¨chentlichen Intervallen beobachtet. Die Software oerlaubte quantitative Messungen f¨r eine Vielzahl von motorischen Funktionen, ueinschliesslich Bewegungsdistanz, Prozent der Zeit in Bewegung, Geschwindig-keit und eine Vielzahl von anderen. Diese letzteren Experimente wurden f¨r 28 uWochen nach der letzten Injektion weitergef¨hrt. u2.4 Histologische Messungen (Experiment 1)2.4.1 NeuN und aktive caspase-3 Wie in Petrik u.a. (8) zitiert, wurden pro Behandlungsgruppe f¨nf M¨use u abenutzt. In jeder wurden mehrere Gehirn (n = 3) und R¨ckenmark (n = 8) uSektionen in verschiedenen Ebenen untersucht. Die Fluoreszenzintensit¨t von aNeuN und aktiver caspase-3 wurde benutzt um Neuronen respektive Zellen, diedurch Apoptose sterben, zu identifizieren. Regionen von Interesse wurden unterBenutzung von Orientierungspunkten aus dem sterotaxischen Mausgehirn und-r¨ckenmark Atlas definiert (23,24). Alle Schnitte wurden in einer unverf¨lschen u aArt unter einem 40x Objektiv untersucht. 2.4.2. Choline acetyltransferase (ChAt) und Glial fibrillary acidicprotein (GFAP) Wie in Petrik u.a. (8) zitiert, wurde das ChAT Antibody benutzt um diecholinergischen Motoneuronen im Gehirn und dem R¨ckenmark zu identifizie- uren (25,26). GFAP wurde benutzt um reaktive Astrozyten zu markieren (27,28). 2.4.3 Iba-1 5
  • 6. Ein polykonaler Hasen-Antibody gegen das ionisierte Kalzium bindende Ad-aptermolek¨l (Iba-1) (Wako, Richmond, VA, USA) wurde zur F¨rbung von u aaktivierten Mirkogliazellen benutzt (29). F¨r das Iba-1 Fluoreszenzimmuno- uLabeling, wurde das gleiche Protokol benutzt wie f¨r das GFAP Labeling aus- u ¨ser der folgenden Anderung: Sektionen wurden in prim¨rer Hasen-anti-Iba-1 a(in PBST mit 1%NGS + 1%BSA; 1:1000 Verd¨nnung) uber Nacht bei 4◦ C u ¨inkubiert. Die Sektionen wurden in anti-Hasen AlexaFluor 546ç sekund¨rer aAntik¨rper f¨r 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert (Molecular Probes; o uEugene, OR, 1:200). 2.4.4 Morin (3,5,7,2,4-pentahydroxyflavone, BDH) Morin (M4008-2G, Sigma) ist ein Fluorochrom, das ein gr¨n fluoreszieren- udes Komplex bildet mit dem Aluminium (mit einer Anregungswellenl¨nge von a420 nm) (15,30). Der Aluminium-Morin Fluoreszenzversuch wurde benutzt umAluminium im Lendenr¨ckenmark und anderen Zentralnervensystem-Geweben uzu visualisieren. Die Morin-F¨rbung wurde als 0.2% L¨sung in 85% Ethylalko- a ohol, das 0.5% Essigs¨ure enth¨lt benutzt. Jede befestigte Sektion wurde zuerst a amit PBS zwei Mal f¨r 5 Minuten gewaschen. Die Sektionen waren vorbehandelt uworden f¨r 10 Minuten in einer 1% w¨ssrigen L¨sung von Hydrochlors¨ure, ge- u a o asp¨lt in doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) zwei Mal f¨r 5 Minuten und f¨r u u u10 Minuten in 0,2% Morin getr¨nkt. Die Sektionen wurden dann zwei Mal in addH2O gewaschen f¨r 5 Minuten, entw¨ssert in 70%, 90% und 100% Ethanol u a(EtOH) und gereinigt mit 100% Xylen. Alle Sektionen wurden dann mit Hilfevon Vectashield mounting medium (Vector Laboratories) befestigt, mit klaremNagellack abgedichtet und an Luft getrocknet. 2.4.5 F¨rbung f¨r hyperphosphoryliertes tau Protein a u Hyperphosphoryliertes tau (Anti-Human PHF-Tau, Pierce Biotechnology,Inc., Rockford, IL) Labeling wurde mit Hilfe von der nichtfluoreszierenden Dia-minobenzidine (DAB) Methode bestimmt. Die Objekttr¨ger mit einer Sektion avon Lendenr¨ckenmark wurden zuerst zwei Mal mit PBS gesp¨lt (2x5 min) be- u uvor das Antigen demaskiert wurde. Endogene Peroxidase-Aktivi¨t wurde mit a0,3% Hydrogenpyroxid in Methanol f¨r 20 Minuten gequencht. Die Sektionen uwurden zwei Mal in PBS gesp¨lt (2x5 min) vor der Blockierung bei Raum- utemperatur f¨r 1 Stunde in M.O.M Blockiermittel (M.O.M. Kit - Peroxidase, ucat # PK 2200, Vector Laboratories, Inc. Burlingame CA), gefolgt von einerschnellen Sp¨lung in PBS und einer 5 min¨tigen Inkubation in M.O.M. L¨sung. u u oDer prim¨re PHF-Tau Antik¨rper wurde 100x in M.O.M. L¨sung verd¨nnt und a o o udie Inkubation wurde bei Raumtemperatur f¨r 1 h durchgef¨hrt. Nach dem u uprim¨ren Antibody Inkubationsschritt, wurden die Objekttr¨ger zwei Mal in a aPBS gesp¨lt und dann in der M.O.M Anti-Maus IgG Reagens inkubiert f¨r 10 u umin. Die Sektionen wurden in PBS gesp¨lt bevor sie mit dem sekund¨ren An- u atibody (Vectastain ABC Elite Kit, cat # PK-6101) f¨r 1 h inkubiert wurden ugefolgt von Inkubation in der Vectorstain ABC Elite Reagens f¨r weitere 30 u 6
  • 7. min. Die Objekttr¨ger wurden wieder in 1x PBS gesp¨lt. Farbentwicklung wur- a ude durch die Vector ImmPACTç DAB L¨sung (cat # SK-4105) erreicht.Wenn odie gew¨nschte F¨rbung erreicht war, wurden die Objekttr¨ger in ddH2O ge- u a asp¨lt f¨r 5 Minuten und gegengef¨rbt in 0,1% Methylgr¨n f¨r 5 min. Nach u u a u uder Gegenf¨rbung, wurden die Tr¨ger kurz in ddH20 gesp¨lt, zwei Mal mit a a u95% Ethanol und zwei Mal mit 100% Ethanol. Die Tr¨ger wurden an der Luft agetrocknet bevor sie in Permount (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) fixiertwurden.2.5 MikroskopieDie Gehirn und R¨ckenmarksektionen behandelt mit fluoreszierendem Antik¨rper u ooder DAB wurden unter einem Zeiss Axiovert 200 M (Carl Zeiss Kanada Li- ¨mited, Toronto, ON, Kanada) Mikroskop bei 40x und 100x (unter Ol) Ver-gr¨sserung betrachtet. DAPI (blau fluoreszierend) wurde mit einem 359/461 onm Absorptions/Emissions Filter betrachtet. Alexa Fluor 546ç (rot) und HasenIgG DuoLuXç (rot) wurden mit einem 556 557/572 573 nm Filter betrachtet.FITC wurde mit einem 490 494/520 525 Filter betrachtet. Gehirn und Len-denr¨ckenmark-Sektionen wurden zuf¨llig f¨r die Histologie gew¨hlt f¨r jede u a u a uGruppe. W¨hrend dem Z¨hlen bei 40x Vergr¨sserung wurden zwei Bilder pro a a oR¨ckenmark-Sektion genommen: ventral links, ventral rechts. Die 40x Bilder uwaren 350 x 275 µm und die 100x Bilder waren 50 x 115 µm. Die Bilder wurdengeschossen unter Benutzung von AxioVision 4.3 Software.2.6 Kriterien f¨r die Bestimmung und Quantifizierung von gelabelten uZellenF¨r die Quantifikation wurden nur Zellen, die im Fokus waren und komplett uim Gesichtsfeld waren gez¨hlt. Um die Wahrscheinlichkeit, dass die gleiche Zelle azwei Mal gez¨hlt wird zu eliminieren, wurden die Schnitte f¨r jedes histologi- a usche Experiment nur von einer Grube der Sammelschale genommen um zu ver-gewissern dass die Sektionen mindestens 250 µm entfernt voneinander waren.Interessante Regionen f¨r die Zellz¨hlung wurden mit Hilfe von Markierungs- u aund Referenzpunkten vom stereotaxischen Mausr¨ckenmark und -gehirn Atlas u(39,40) festgelegt. Im R¨ckenmark wurden nur Zellen, die anterior zum Zentral- ukanal wo sich graue und weisse Substanz treffen in Betracht gezogen als Teildes Vorderhorns; umgekehrt wurden nur Zellen die posterior zum Zentralka-nal waren in Betracht gezogen als Teil des Hinterhorns. Diese Kriterien wurdenunabh¨ngig welches R¨ckenmarksegment untersucht wurde angewendet. Im Ge- a uhirn, wurden nur Zellfunde in den entsprechenden Hirnstrukturen gez¨hlt. Alle aSektionen wurden auf eine unverf¨lschte Art gez¨hlt (eine Kennnummer war den a aTieren zugeteilt zur Verfolgung, die jedoch nicht die Identit¨t der Behandlung ades Tieres verrieten). 7
  • 8. 2.7 StatistikF¨r jede Maus wurden Werte bei der individuellen Aufgabe und in der Zellz¨hlung u abenutzt um den Mittelwert +/- Standartabweichung f¨r jede Gruppe und Kon- udition zu berechnen. Verhaltenswerte und Zellz¨hlungen wurden normalisiert amit dem Mittelwert der Kontrollen. Die Mittelwerte wurden unter Benutzungvon ein- oder zwei-Weg ANOVA (Statistica, Statsoft Inc. Tulsa, OK; GraphPadPrism, San Diego, CA) verglichen.3. ErgebnisseAnders als die Studie von Petrik u.a. (8), das in Lendenwirbel einen Verlust vonChAT positiven Motoneuronen bei Aluminiumhydroxid behandelten M¨usen azeigte war kein signifikanter Unterschied im ChAT Labeling oder in der Mo-toneuronenanzahl weder in Hals- noch in Brust-R¨ckenmarksegmenten (Fig. u1A und B). Allerdings zeigte die Alumminiuminjiziierte Gruppe eine stark si-gnifikante Erh¨hung in der Expression von GFAP positiven Astrocyten (70%) o(Kontrollgruppe aufgez¨hlt als 100% f¨r alle Graphen; Fig. 1C) im Brustseg- a ument des R¨ckenmarks. Diese GFAP Ergebnisse spiegeln die fr¨her berichteten u uErgebnisse in den Lendenwirbel. Das Iba-1 Labeling zeigte signifikant erh¨hten Level an aktivierten Mikro- oglialzellen im Lendenr¨ckenmark der Tiere behandelt mit Aluminium (111%) uim Vergleich zur Kontrolle (Fig. 1E). Andere Ebenen des R¨ckenmarks wurden unicht f¨r Mikroglialzellen getested in dieser Studie. u Nur M¨use injiziiert mit Aluminiumhydroxid zeigten signifikant erh¨htes a oMorin Labeling der Zellen im Lendenr¨ckenmark im Vergleich zu anderen Grup- u ¨pen (Fig. 2A-E). Ahnlich zeigten nur Aluminiuminjiziierte M¨use die Pr¨senz a avon abnormalem tau Protein in Motoneuronen der Lendenwirbel (Fig 3). An-dere Regionen des R¨ckenmarks wurden in dieser Studie nicht getestet weder uf¨r Morin noch f¨r das tau Protein. u u Die mehreren Aluminiumhydroxid-Injektionen des Experiments 2 zeigteneinen schweren Effekt auf die motorischen und andere Verhaltensweisen wie ge-zeigt in Fig. 4 und 5. Mehrere Aluminium-Injektionen f¨hrten zu signifikanten uAuswirkungen auf das Verhalten inklusive Ver¨nderungen im Fortbewegungs- averhalten, (Fig 4) und l¨sten Ged¨chtnisst¨rungen aus in der Wasserlabyrinth- o a oAufgabe (Fig 5). Andere Verhaltensmessungen inklusive Muskelst¨rke und - aausdauer gemessen mit dem Drahthang und der Muskelkoordination und Gleich-gewicht gemessen durch das Laufrad waren nicht signifikant betroffen.4. DiskussionDas vorliegende Ergebnis erweitert die fr¨heren Resultate von Petrik u.a. (8), uindem es zeigt, dass mikrogliale Aktivation Teil der zu Grunde liegenden Pa- 8
  • 9. thologie der Lendenwirbel ist. Diese Daten f¨gen zu den vorherigen hinzu, z.B. uder Verlust an motorischen und anderen Neuronen und die Aktivierung vonreaktiven Astrozyten. Zusammengefasst mit den aktuellen Daten, deutet dieGesamtaktivierung der glialen Entz¨ndungsantwort in den Lendenwirbel hin, udass dieser Prozess ein Schl¨ssel ist zur fr¨hen Phase der pathologischen Ereig- u unisse die zum Tod von Motoneuronen f¨hren. Diese Interpretation wird durch udie Abwesenheit von Motoneuronen-Verlust und Astrozytenaktivierung in ande-ren Ebenen des R¨ckenmarks beobachtet in dieser Studie unterst¨tzt. In ALS u uund im Tiermodell der Krankheit, scheint die gliale Aktivierung gefolgt vomTod der Motoneuronen oft fortzuschreiten in einer sequentiellen Art entlang derventralen Nervenachse mit den ersten Zeichen von Pathologie zuerst in den Len-denwirbel erscheinend (31). Angesichts dessen scheint es m¨glich zu sein, dass oeine Untersuchung zu sp¨terem Zeitpunkt pathologische Antworten in Brust- aund Halswirbel zeigen w¨rde. Alternativ, k¨nnte das Aluminium, das in den u oLendenwirbel-Motoneuronen gezeigt wurde, die anderen Segmente noch nichterreicht haben. In laufenden Studien wird bestimmt werden ob Motoneuronenin diesen anderen Segmenten positiv f¨r Aluminium gef¨rbt werden. u a Die positive Morin-F¨rbung in den Lendenwirbel zeigt deutlich, dass nach ader Injektion das Aluminium Zugang zu diesem Teil des Nervensystems findet.Eine M¨glichkeit ist, dass es dies durch retrograden Transport von den Muskeln ozu den Motoneuronen des jeweiligen Segmentes erreicht. Dies scheint unwahr-scheinlich gegeben, dass unser Paradigma der subkutanen Injizierung nicht einbestimmtes Segment des R¨ckenmark betreffen sollte. Eine andere M¨glichkeit u oist, dass das Aluminium in das Zentralnervensystem auf eine bestimmte Arteindringt wenn es das Kreislaufsystem eintritt. Es sind Experimente im Gange,die diese M¨glichkeiten unterscheiden sollen. o Die Pr¨senz von hyperphosphoryliertem tau Protein in Motoneuronen der aLendenwirbel, das ein Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit und dem ALS-PDC von Guam ist, deutet darauf hin, dass zus¨tzliche pathologische Prozesse adie mit dem Aluminium in Zusammenhang stehen, stattfinden. Die Auswirkung auf das Verhalten im zweiten Experiment best¨tigt die pa- athologische Wirkung, das im ersten Experiment beobachtet wurde. W¨hrend adie histologischen Messungen von diesen Studien noch anstehen, deutet dasAusmass der Verhaltensst¨rungen stark darauf hin, dass wir weit ausgebreite- ote neurologische Pathologien beoabachten werden. Die gr¨ssere Auswirkung auf odas Verhalten in diesem Experiment k¨nnte dem experimentellen Paradigma oentsprechen, das die Anzahl von Aluminiumhydroxidinjektionen verdreifacht. Im Gesamten spiegeln die hier berichteten Ergebnisse vorhergehende Arbeit,das klar gezeigt hat, dass Aluminium in oraler als auch injiziierter Form, neu-rotoxisch sein kann (15,16,32,33). M¨gliche toxische Aktionsmechanismen f¨r o uAluminium k¨nnte die Steigerung der Entz¨ndung (z.B. Mikrogliosis) und die o uInterferenz mit cholinergen Projektionen (34), reduzierte Glucosenutzung (33), 9
  • 10. defekte Phosphorylations-Dephosphorylationsreaktion (35), ver¨nderte Rate der a ¨transmembranen Diffusion und selektive Anderungen im s¨ttigbaren Transport- asystem in der Blut-Hirn-Schranke (BBB 36) und oxidativem Schaden der zel-lul¨ren Prozesse durch die Inhibierung vom Glutathion-Redox-Zyklus (37). a Obiges gegeben, ist es nicht uberraschend, dass Aluminium weitgehend als ¨einen Faktor f¨r neurodegenerative Erkrankungen vorgeschlagen wird und in uZusammenhang mit degenerierten Neuronen in spezifischen Regionen des Zen-tralnervensystems gefunden wurde (38-41). In Tierversuchen wurde Aluminiummit der Ansammlung vom tau Protein und Amyloid-beta Protein verbundenund das Induzieren von neuronaler Apoptose in vivo als auch in vitro (30). MitAluminium injiziierte Tiere zeigen schwere anterograde Degradation von dencholinergischen Enden im Kortex und im Hippocampus (42). Aluminium ist ein Hilfsmittel, das sich Zugang zum Zentralnervensystemverschaffen kann (42-44). Wie auch immer erscheinen orale Verabreichung vonAluminiumhydroxidgel nicht neurotoxisch zu sein in Menschen (45), obwohl diesder Fall ist f¨r Aluminiumchlorid in Ratten (46). Der Weg der Aufnahme und uvielleicht die Form von Aluminium k¨nnten wichtige Faktoren sein die das Po- otential der Giftigkeit bestimmen. Wir spekulieren, dass die beobachteten neurotoxischen Auswirkungen vonAluminiumhydroxid in der aktuellen Studie durch direkte als auch indirekteWege entstehen, manche von ihnen oben zitiert. Direkte Toxizit¨t werden der aphysikalischen Pr¨senz (oder N¨he) von Aluminium zugeschrieben und dessen a aPotential den Zelltodweg auszul¨sen. Die Ansammlung von Aluminium im Zy- otoplasma durch zellul¨re Aufnahmemechanismen oder Diffusion k¨nnten die a oVer¨nderungen in der Glutaminase und Glutaminsynthetase verursachen und aleicht die Verf¨gbarkeit vom Neurotransmitter Glutamat ver¨ndern (47). Alu- u aminium, das eine Ansammlung von abnormalem tau Protein induziert, k¨nnte odas Gewirr von Neurofibrillen erh¨hen und den zellul¨ren Transportmechanis- o amus behindern (48). Ausserhalb der Zelle k¨nnte Aluminium die Neuronen be- oeintr¨chtigen durch Ver¨nderung der Synapsen. Zum Beispiel ist gezeigt wor- a aden, dass Aluminium die Dicke der postsynaptischen Dichte verringert, den Ab-stand des synaptischen Spalts vergr¨ssert und die Anzahl von flachen Synapsen oerh¨ht (49). Aluminium k¨nnte auch die Spannungsaktivierten Kalziumkan¨le o o ablockieren (50), die Aktivit¨t der Acetlycholinesterase erh¨hen (51) oder mit der a o ¨synaptischen Ubertragung interferieren einfach durch das Ansammeln im syn-aptischen Spalt (52). Aluminium kann auch Apoptose induzieren in Astrozyten(53). Da die Astrozyten essentiell sind f¨r die Erhaltung der neuronalen Gesund- uheit, ist jeder Verlust von der Funktion der Astrozyten toxisch f¨r die Neuronen. uIndirekte Toxizit¨t von Aluminium k¨nnte durch verschiedene Wege entstehen a oinklusive durch die Aktivierung von verschiedenen Cytokinen (54), Freisetzungvon Glutamat in einer anregungstoxischen Kaskade oder durch Ver¨nderung avon enzymatischen Wegen (55). 10
  • 11. Zus¨tzlich zu den obigen Auswirkungen auf neuronalen Zellen, k¨nnte Alu- a ominium indirekt eine abnormale, generalisierte Immunantwort stimulieren. Diesist wozu Hilfsmittel in erster Linie eingesetzt werden. Neurotoxizit¨t von Hilfs- amitteln k¨nnte deshalb das Resultat einer unbalancierten Immunantwort sein. oRook und Zumla (56) nehmen an, dass mehrere Impfungen, Stress und die Impf-methode eine Verschiebung der Immunantwort bewirken kann (56,57). Alumini-umhydroxid wurde fr¨her gezeigt die Th2-Cytokinantwort zu stimulieren (9,58). u W¨hrend die aktuellen Ergebnisse und unsere vorhergehende Studie signifi- akante Auswirkungen von Aluminiumhydroxid auf das Verhalten und die Neuro-pathologie aufzeigt und zus¨tzlich signifikante Resultate durch die Kombination avon Hilfsmitteln, ist es wichtig zu erkennen, dass diese alle unter minimalen Kon-ditionen erreicht wurden. Tabelle 1 fasst die Aspekte der menschlichen ALS undGWS Symptomen zusammen im Vergleich zu den Auswirkungen beobachtet inAluminium injiziierten M¨usen. Es besteht die Wahrscheinlichkeit, dass ein syn- aergetischer Effekt zwischen den Hilfsmitteln und anderen Variabeln wie Stressund mehrere Impfungen und Kontakt zu anderen Giften entsteht. Eine neue Stu-die, das einige dieser Faktoren in Kombination untersucht, zeigte dass Stress,Impfung und Pyridostigminbromid (ein Carbamat Anticholinesterase (AchE)Inhibitor), synergistisch auf die multiplen Stress-aktivierten Kinasen im Gehirnwirken k¨nnten um eine neurologische Behinderungen in GWS auszul¨sen (59). o oZus¨tzlich, k¨nnte der genetische Hintergrund im Zusammenhang mit Kontakt a ozu Aluminium eine wichtige Rolle spielen und k¨nnte ein wichtiger Bereich f¨r o udie zuk¨nftige Forschung sein. u Die Demonstration der neuropathologischen Auswirkungen und den Verhal-tensdefiziten in Aluminiumhydroxid injizierten M¨usen k¨nnte Einblick geben a onicht nur in den Ursachen von GWS-ALS, sondern auch Zugang er¨ffnen f¨r die o uErforschung von anderen neurologischen Erkrankungen.DanksagungDiese Arbeit wurde unterst¨tzt durch die Scottish Rite Charitable Foundation uvon Kanada und der Natural Science and Engineering Research Council von Ka-nada (CAS). Wir danken Dr. Meryl Nass (Mount Desert Island Hospital, Maine,USA) und Lt. Col. John A. Richardson (USAFR, ret.) f¨r deren unsch¨tzbare u aBemerkungen und Ratschl¨gen zum Projekt und Manuskript. a 11
  • 12. Abbildung 1: Auswirkung von Aluminiumhydroxid auf verschiedenen Ebenendes R¨ckenmarks (RM). (A und B) ChaT Markierung in Hals- respektive Brust- uwirbel. (C und D) Normalisierte Anzahl Zellen f¨r GFAP Labeling der reaktiven uAstrozyten in Hals- respektive Brustwirbel. Die Aluminiumhydroxid behandel-te Gruppe zeigt im Halswirbel h¨heres GFAP Labeling. (E) Iba-1 Fluoreszenz oLabeling im Vorderhorn des Maus Lendenwirbel zeigte dass die Aluminium inji-ziierte M¨use eine signifikant erh¨hte Anzahl von aktivierten Microgliazellen a ohatte. Daten sind Mittelwert +/- Standardabweichung. *** p < 0,001, ein-WegANOVA. 12
  • 13. Abbildung 2: Morin Fluoreszenz Labeling im Vorderhorn des Maus Lendenwir-bels. Sektionen von der Kontrolle (A) zeigten kein Morin Fluorezenz Labeling.Massleiste = 20µm. (B) Morin-positive Motoneuronen in Aluminiumhydroxidbehandelten M¨usen. (C und D) H¨here St¨rke der Motoneuronen in Alumini- a o aum injiziierten M¨usen zeigt starke Intensit¨t an Morin Labeling. Massleiste = a a20µm. (E) Anzahl Zellen der Morin positiven Zellen in verschieden behandel-ten Gruppen (n = 4 M¨use/Gruppe, je vier Sektionen). Daten sind Mittelwert a+/- Standardabweichung. Ein-Weg ANOVA Analyse ergab einen Signifikanzle-vel von *p < 0,005. 13
  • 14. Abbildung 3: Hyperphosphoryliertes tau Immunof¨rbung im Vorderhorn des aMaus Lendenwirbels im Vergleich zur Alzheimer-Krankheit. (A) Eine Sek-tion der menschlichen entorhinalem Kortex von einem Kontrolpatienten.(B) Menschliche entorihinaler Kortexsektion von einem Patienten mit derAlzheimer-Krankheit (Sektionen von Dr. P. McGeer). (C) Lendenwirbel von ¨einer Maus injiziiert mit Salz. (D) Aquivalente Sektion von einer Aluminium-hydroxid inhiziierter Maus. Alle Bilder sind 100x Vergr¨ssert. o 14
  • 15. Abbildung 4: Bewegungsanalyse im offenen Feld zur Bestimmung der spontanen a ¨Aktivit¨t und Angstlichkeit in den Kontrolm¨usen vs M¨usen, die sechs Mal mit a aAluminiumhydroxid injiziiert worden sind. Aluminium injiziierte M¨use zeigten afolgende Verhaltens¨nderungen: (A) K¨rzere bewegte Distanz (***p<0,0001). a u(B) Langsamere Bewegung (***p<0,0001). (C) Gr¨ssere durschschnittliche oDrehwinkel (***p<0,0001). (D) Schnellere Drehungen (***p<0,0001). (E)Gr¨ssere M¨ander (***p<0,0001). (F) 15 o a Kleinerer Prozent der Zeit an Gesamtbe-wegung (**p=0.0030). (G) Weniger Betreten des Zentrums des offenen Feldes(***p<0.001). Sp¨tes Betreten des Zentrums (***p<0,0001). (Alle Messungen, azwei-Weg ANOVA).
  • 16. Abbildung 5: Wasser-Labyrinthtest als Evaluation des Lernens und desGed¨chtnisses. M¨use 6x injiziiert mit Aluminiumhydroxid brauchten durch- a aschnittlich signifikant l¨nger um das Labyrinth zu beenden im Vergleich zu mit aSalz injiziierten M¨usen (zwei-Weg ANOVA. *p=0,0389). a 16
  • 17. Tier Alter Dosis Injektionstyp Ergebnis Referenz Weibliche NIH M¨use a 4 Wochen 315-335 µg/kg i.p. Signifikant erh¨htes Level an Al im Gehirn o Redhead u.a., 1991 M¨nnliche und weibliche a 2 Monate 100 oder 300 Oral Signifikant reduzierte Lernf¨higkeit und er- a Bilkei-Gorzo, Lang Evan Ratten mg/kg/Tag hohtes Level an Al im Gehirn 1993 M¨nnliche Schweizer Albi- a nicht genannt 20 µg/kg/Tag Oral Signifikant erhohtes Level an Al im Gehirn, Sahin u.a., nom¨use a Niere und Leber. 1994 Phz:SFIS M¨use a nicht genannt 1,0 mg jede zweite i.p. Signifikant erhohtes Level an Al in der Le- Fiejka u.a.,17 Woche oder 0,1 mg ber, die Tibia (Knochen), aber nicht im Ge- 1996 5 Tage/Woche hirn Table 1: Zusammenfassung der menschlichen ALS und GWI Symptomen im Vergleich zu den Symptomen beobachtet in ¨ Alluminium injiziierten M¨usen und Ratten. Diese Tabelle zeigt auch die Ahnlichkeiten zwischen dem menschlichen ALS und a dem Golfkriegssyndrom.