2. La Classificazione dei Funghi
I Funghi o miceti sono eucarioti, uno dei 3 Domini (procarioti, archea ed eucarioti) in cui
sono stati suddivisi gli esseri viventi.
I funghi sono microorganismi evolutivamente più complessi dei procarioti e degli archea.
Sono classificati come eucarioti diploidi con il DNA organizzato in cromosomi lineari
localizzati in un nucleo delimitato da una doppia membrana che contiene steroli.
Contengono inoltre mitocondri e altri organelli.
Sono aerobi, mesofili e/o psicrotofici (basse T), e producono spore.
I funghi non sono in grado di fotosintetizzare non avendo la clorofilla e i cloroplasti.
Si nutrono necessariamente dei composti organici sintetizzati da altri esseri viventi: sono
quindi organismi eterotrofi.
La maggiore complessità nell'organizzazione genica permette loro di avere anche una
maggiore diversificazione morfologica rispetto ai procarioti e agli archea.
In genere si nutrono dei tessuti di organismi morti, ma alcune specie sono in grado di
parassitare anche esseri viventi nel qual caso possono causare numerose malattie anche
per l'uomo.
4. I funghi
Il numero delle specie di funghi oggi viventi è sconosciuto.
Una stima conservativa fa ritenere che oggi siano presenti sulla Terra almeno 700 000
specie, anche se si è arrivati a proporre un numero di 1,5 milioni.
Di questi solo una minima parte sono state descritte almeno morfologicamente.
A oggi meno di 200 specie sono patogene per l’uomo.
•20 di queste causano infezioni sistemiche e
•circa 20 infezioni cutanee.
•Solo una decina causano infezioni subcutanee gravi.
5. I funghi
• A causa delle morfologie molto semplici e variabili che si sono evolute a secondo delle
strategie ecologiche adottate, è difficile determinare le loro diversità e le loro relazioni
filogenetiche.
• Originariamente, la determinazione tassonomica delle specie fungine era basata, come per
gli altri microorganismi, su criteri morfologici, ultrastrutturali, fisiologici e immunologici,
insieme con il riconoscimento, generico e descrittivo, effettuato al microscopio ottico in
campo chiaro.
• Negli ultimi vent’anni tecniche di biologia molecolare (PCR, RFLP, analisi di sequenze di
tRNA, sequenziamento di genomi, etc.) hanno consentito una più sicura determinazione
dell’identità dei funghi studiati e del grado di relazione filogenetica esistente tra i membri dei
vari raggruppamenti tassonomici.
• Con la crescente disponibilità di alberi filogenetici generati da un numero alto di geni è stato
possibile ricostruire una classificazione filogenetica basata sulle similitudini delle sequenze
nucleotidiche e proteiche.
• Nel 2007 è stata proposta una nuova classificazione filogenetica dei funghi basata sulle
recenti analisi genetiche e molecolari.
6. I funghi
• I funghi possono essere divisi in 2 forme morfologiche distinte, i lieviti e le ife.
I lieviti sono funghi unicellulari che si riproducono asessualmente per gemmazione
(budding, per es. Saccharomyces spp.) o per scissione (per es.
Schizosaccharomyces spp.).
Le ife sono funghi pluricellulari dal diametro normalmente compreso tra i 4 e i 10 µm che si
riproducono asessualmente e/o sessualmente.
Il micelio (ossia l'apparato vegetativo, il “corpo”, dei funghi) costituisce l'intreccio delle ife.
L’ifa può essere settata uninucleata o multinucleata, o cenocitica (non-settata).
Le ife pluricellulari sono dette settate quando le cellule che le compongono sono separate da
setti porosi (uno o più pori) che consentono il passaggio di materiale e, in alcuni casi,
persino di organelli tra una cellula e l'altra.
Le ife non settate sono invece costituite da un'unica cellula plurinucleata.
Ifa settata con setto poroso al
microscopio elettronico È anche
visibile il passaggio di organelli.
7. I funghi
Molti miceli (muffe) sono in grado di crescere o tollerare ambienti con bassa umidità (xenofili),
con alto contenuto di sali o zuccheri (osmofili e osmotolleranti) e con basso pH (acidofili e
acidotolleranti).
Le ife possono essere distinte in vegetative, preposte a compiti nutrizionali, e aeree con funzioni
riproduttive. In quest'ultimo caso l’ifa si estende nell’aria e produce esospore libere (conidi) o
corpi fruttiferi (sporangi).
In generale, la spora germina producendo l’ifa che cresce e si ramifica nella struttura complessa
che rappresenta il micelio.
8. I funghi
I lieviti sono funghi unicellulari di forma ovale o sferica di 3-15 µm che si moltiplicano
prevalentemente per gemmazione.
Dalla cellula madre viene prodotta una protuberanza chiamata gemma (gemmazione) che,
quando raggiunge circa le stesse dimensioni della cellula madre, forma la parete trasversale e si
separa dalla cellula madre.
Nel punto di distacco si forma sulla cellula madre una cicatrice permanente (cicatrice di
gemmazione, scar) sulla quale non si avrà più gemmazione, e sulla cellula figlia una cicatrice
permanente detta cicatrice di distacco. L’intero processo richiede circa 30 minuti e ogni cellula,
nella sua vita genera in media 24 cellule figlie.
Una caratteristica importante della gemmazione è che tutto il materiale di nuova sintesi (parete,
membrane, nucleo etc.) andrà a formare la cellula figlia, a differenza del processo di scissione
binaria in cui il materiale di nuova sintesi è distribuito equamente tra cellula madre e cellula figlia.
Il lievito Saccharomyces
cerevisiae in gemmazione.
Sono visibili 4 cicatrici di
gemmazione.
9. I funghi
La scoperta del ruolo dei lieviti nei processi fermentativi risale alla metà dell''800 quando il fisiologo
tedesco Theodor Schwann e il francese Cagnard de Latour identificarono e descrissero con precisione le
cellule fungine come organismi viventi presenti nel mosto d'uva.
A secondo delle condizioni presenti nell'ambiente (per esempio, la temperatura), alcuni funghi hanno la
capacità di crescere sia come lieviti sia come miceli.
Questo dimorfismo è una caratteristica molto importante per alcuni dei principali funghi patogeni per
l'uomo in quanto solo una delle due forme causa la malattia.
I funghi possiedono una parete cellulare una struttura rigida
che conferisce stabilità morfologica alla cellula e permette le
interazioni con l’ambiente esterno e i contatti con l’ospite
infetto.
Come nelle piante, quindi, anche nei funghi si osserva in
genere la presenza, intorno alla membrana, di una rigida
parete cellulare.
La parete cellulare di Saccharomyces
cerevisiae (× 72 000). Sono visibili anche il
nucleo, un vacuolo, mitocondri e il reticolo
endoplasmatico.
10. I funghi
A differenza della parete delle cellule vegetali, costituita in prevalenza da cellulosa, quella dei funghi è
composta soprattutto da chitina.
La chitina è costituita da polisaccaridi complessi, proteine e glicoproteine.
I polisaccaridi, che rappresentano circa l’80% della parete cellulare, sono polimeri di zuccheri semplici ed
includono: la chitina, costituita da residui di N-acetilglucosammina legati tra loro da legami β-1,4-
glicosidici simili ai residui di glucosio della cellulosa; un glucano, costituito da residui di D-glucosio legati
con legami β-1,6 e con diramazioni β-1,3 e un mannano, un polimero del D-mannosio unito da legami α-
1,6 e con diramazioni α-1,2 e α-1,3.
Nella parete sono inoltre presenti alcune glicoproteine, che sono importanti determinanti antigenici.
La chitina è un lungo polimero di N-acetilglucosammina
(un derivato del glucosio) presente nella parete cellulare
dei funghi e nell’esoscheletro di crostacei, insetti, e nei
molluschi e nei cefalopodi.
11. La riproduzione dei funghi
La riproduzione dei funghi può avvenire per via sessuata (teleomorfi) – attraverso la fusione di due o più
nuclei con un diverso patrimonio genetico – o asessuata (anamorfi), con cicli vitali che possono essere
semplici, ma anche molto complessi.
La riproduzione passa nella maggior parte dei casi attraverso la produzione di spore, cellule riproduttive
specializzate che sviluppandosi danno origine a un nuovo fungo. I funghi dei quali non sono ancora state
riscontrate le corrispondenti forme sessuate di proliferazione sono chiamati funghi imperfetti o
deuteromiceti.
La riproduzione asessuata comprende la riproduzione di lieviti e ife. La proliferazione vegetativa, in
particolare, si può avere per:
scissione Meccanismo diffuso nei lieviti (ascomiceti) e in genere nei funghi unicellulari, consiste nella
divisione per mitosi della cellula madre in due cellule figlie uguali.
gemmazione Un sistema riproduttivo diffuso soprattutto tra i lieviti, attraverso il quale le cellule figlie
compaiono come protuberanze (gemme);
sporulazione attraverso un processo mitotico vengono prodotte, all'interno di particolari strutture a forma di
“sacchetto globoso” chiamate sporocisti, delle spore (mitospore) capaci di generare un nuovo individuo. Le
mitospore, protette da una spessa parete, possono essere flagellate, quindi mobili (zoospore), oppure no
(aplanospore). Le spore asessuate (conidi) possono essere localizzate agli apici e ai lati delle ife nei
conidiofori, o all’interno di esse (sporangi) e sono chiamate sporagiospore.
Le artrospore si formano per frammentazione delle ife. Le spore presentano anche più nuclei, morfologia
variabile e caratteristiche che possono essere importanti per la loro identificazione;
12. La riproduzione dei funghi
La riproduzione sessuata è subordinata alla produzione di spore maschili e femminili a seguito di una meiosi
dopo una fase transitoria diploide all'interno di strutture del fungo specializzate per la riproduzione, chiamate
ascospore. Tali spore, prodotte a milioni da ciascun individuo, vengono diffuse attraverso il vento, l'acqua o gli
insetti.
In numerose specie appartenenti ad esempio ai phyla Oomicota, Zigomicota e Ascomicota le spore maschili e
femminili si uniscono formando un'unica struttura polinucleata che in seguito alla fusione dei nuclei entra in
meiosi producendo spore aploidi, le quali non appena trovate le condizioni adatte germinano formando nuovi
miceli.
Nelle specie appartenenti al phylum dei Basidiomicota la spora di una determinata polarità sessuale, una
volta raggiunto il terreno o il substrato più adatto, nelle condizioni più favorevoli di umidità e temperatura,
germina formando ife (micelio primario). Per poter completare il ciclo biologico e organizzare le strutture
riproduttive, dal micelio primario il fungo passa al micelio secondario, attraverso l’unione di due miceli primari
(maschile e femminile), fenomeno noto come somatogamia: Il micelio secondario genererà il frutto (carpoforo)
che porta nuovamente spore.
(a) Scissione trasversale. (b) Frammentazione delle ife da cui si
formano artroconidi (artrospore) e (c) clamidospore. (d)
Sporangiospore in uno sporangio. (e) Conidiospore strutturate in
catene all’estremità di un conidioforo. (f) Si formano le blastospore
dalle gemme delle cellule parentali.
13. La riproduzione sessuale: mating types
Durante la fase sessuale avviene la fusione dei gameti aploidi generando cellule diploidi. La fase
sessuale richiede l'espressione coordinata di numerosi geni coinvolti in importanti processi molecolari e
genetici come la riduzione del numero di cromosomi durante la meiosi e la formazione di gameti aploidi,
la ripartizione dei cromosomi durante la meiosi, la regolazione dei geni coinvolti nel ciclo cellulare, etc.
14. Dimorfismo
Diversi funghi possono assumere in risposta alle variazioni ambientali due diverse morfologie (filamentosa-
miceli e unicellulare-lieviti). Questo processo è definito dimorfismo ed è una delle caratteristiche principali
di diversi funghi patogeni per l'uomo (Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Histoplasma
capsulatum e Paracoccidioides brasiliensis).
I pazienti infettati con questi funghi dimorfici presentano nei loro tessuti cellule nella fase lievito che è la
sola forma virulenta. Al contrario, nell'ambiente vengono trovati i miceli che rappresentano la forma
saprofitica. In condizioni di laboratorio è possibile crescere in forma pura entrambe le forme modificando la
temperatura di crescita:
25°C per i miceli e 37°C per i lieviti
È possibile quindi trasformare lieviti in miceli e viceversa semplicemente modificando la temperatura di
incubazione. Poiché nei funghi dimorfici vi è una precisa correlazione tra la forma presente nei tessuti
umani (lieviti) e la malattia fa ritenere che il processo di differenziamento sia strettamente collegato alla
capacità di indurre l’infezione. Va in ogni caso tenuto presente che la transizione di fase micelio ↔ lievito
indotta dalla temperatura in assenza dell'ospite umano è a sua volta collegata alla capacità di questi funghi
di adattarsi a due ambienti diversi indipendentemente dalla presenza di un ospite.
15. Dimorfismo
Lieviti Queste cellule contengono una parete cellulare ricoperta da microfibrille alle quali sono associati diversi enzimi. I lieviti di B.
dermatitidis e di P. brasiliensis sono multinucleati, mentre quelli di H.capsulatum contengono un solo nucleo. All'interno del lievito sono
presenti diversi organelli ed inclusioni, tra cui il reticolo endoplasmatico che comunica con la membrana nucleare e i vacuoli che hanno
funzioni lisosomiali. I lieviti si riproducono per gemmazione.
Ife Nel citoplasma delle ife sono presenti gli stessi organelli e i diversi tipi di inclusioni identificati nei lieviti. I miceli di B. dermatitidis e di
H.capsulatum sono costituiti da ife settate. Le parti terminali delle ife, che contengono dei corpi che possono aggregare fra di loro, possono
contenere uno o due nuclei. In prossimità dei pori tra due cellule possono essere presenti i cosiddetti corpi di Woronin.Transizione lievito ↔
ifa Le cellule di lievito cresciute a 37°C si trasformano, in condizioni di laboratorio, in ife quando la temperatura di incubazione viene ridotta
a 25°C (o almeno meno di 30 °C). Da un punto di vista morfologico le modalità di questa transizione di fase sono molto simili fra tutti i
funghi dimorfici. In condizioni ottimali, tale transizioni morfologiche avvengono in genere tra i 3 e i 5 giorni. Transizione ifa ↔ lievito I
cambiamenti morfologici da micelio a lievito richiedono un tempo maggiore, 6-8 giorni, quando la temperatura di crescita passa da 25°C a
37°C. Nel caso di miceli giovani, virtualmente tutte le ife si trasformano in lieviti mentre miceli che sono cresciuti per periodi lunghi di tempo
a 25°C richiedono anche 15 - 20 giorni per trasformarsi in lieviti. In questo caso, solo le parti terminali delle ife (la parte vegetativa) si
trasformano in lieviti, mentre le regioni più interne delle ife del micelio hanno scarsa vitalità o sono morte. Lo studio molecolare della
transizione ifa ↔ lievito è particolarmente importante in quanto l'infezione in natura viene contratta inalando le spore prodotte dalle ife o
frammenti delle stesse ife che una volta penetrate nell'organismo umano (polmoni) germinano e si trasformano in lieviti patogeni.
Parete cellulare
Membrana plasmatica
Ammassi di microfilamenti
Nucleo Parete cellulare Microtubuli
Citoplasma
Gruppo di ribosomi
Cicatrice di gemmazione
polare
Cromosoma
Reticolo endoplassmatico liscio
Membrana plasmatica
Mitocondri
Membrana nucleare Reticolo endoplasmatico ruvido
Mitocondrio
Apparatodi Golgi Apparato di golgi
Membrana plasmatica
Invaginazioni della membrana
plasmatica
16. Micosi sistemiche
Le infezioni sistemiche causate da funghi sono divise in due categorie:
•infezioni causate da funghi patogeni che possiedono la capacità intrinseca di causare, con un inoculo
sufficiente, una malattia in un ospite sano:
Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum e Paracoccidioides
brasiliensisinfezioni causate da organismi opportunisti, funghi la cui capacità di determinare una
malattia dipende dalle diminuite capacità immunologiche dell'ospite:Aspergillus fumigatus, Candida
spp., Cryptococcus neoformans e RhizopusTranne C. immitis, gli altri funghi intrinsecamente patogeni
sono tutti dimorfici.
La patogenicità non è una caratteristica essenziale di questi funghi in quanto la loro disseminazione
non dipende dalla presenza di un ospite. Infatti, infezioni uomo - uomo non sono state descritte e la
transizione reversibile micelio (saprofita) ↔ lievito (patogeno) può avvenire al di fuori dell'ospite
modificando semplicemente le condizioni di crescita e di temperatura. La forma lievito isolata nei tessuti
di pazienti infetti non necessita la presenza dell'ospite umano per svilupparsi. Questo suggerisce che i
geni lievito-specifici non sono necessariamente responsabili nella patogenicità e che gli stessi sono
mantenuti in questi organissmi in assenza di una pressione selettiva esercitata dall'ospite. È quindi
ragionevole ritenere che i prodotti dei geni coinvolti nel mantenimento della fase lievito e nella
transizione micelio ↔ lievito sono utilizzati anche durante la crescita nell'ambiente in assenza di tessuti
umani.
17. Micosi sistemiche
Questi organismi non sono intrinsecamente molto virulenti, e in genere circa il 90% delle infezioni sono
asintomatiche, con un quadro clinico lieve e autolimitante.
Negli ultimi decenni però l'incidenza di infezioni causate da questi funghi è significativamente
aumentata con la diffusione dell'AIDS e in generale per l'incremento di pazienti con uno stato
immunologico depresso.
I funghi che causano malattie sistemiche hanno la caratteristica di essere presenti in particolari aree
geografiche le cui condizioni ecologiche ne favoriscono la diffusione in quel particolare ambiente.
Per esempio, H. capsulatum è endemico negli stati centrali e nel Sud degli Stati Uniti ma non è
presente in Europa, anche se negli ultimi anni è stato isolato in pazienti immunodepressi che avevano
vissuto o visitato queste regioni. In ogni caso, tale fungo non è stato mai isolato dall'ambiente in
Europa.
Nel Midwest degli USA circa il 90% degli individui è positivo quando viene inoculata sottocute
l'histoplasmina, indicando che hanno contratto una infezione primaria. Al contrario, funghi come
Candida e Aspergillus sono ubiquitari. Un'altra caratteristica dei funghi patogeni opportunisti è quella di
non indurre un'immunità specifica e una successiva infezione può avvenire se le difese immunologiche
sono di nuovo ridotte.
18. Histoplasma capsulatum
Da un punto di vista biochimico e molecolare H. capsulatum è tra i funghi dimorfici maggiormente
studiati.
L’Histoplasma esiste in due fasi di crescita, una parassitica, il lievito, 1-3 µm di diametro, ed una
saprofita, il micelio di circa 1,2 - 1,5 µm di diametro.
I lieviti sono la forma virulenta che si localizza nei macrofagi e nel reticolo endoteliale e, in condizioni di
laboratorio, a 37°C in terreni di coltura liquidi. I lieviti hanno un singolo nucleo e si riproducono per
gemmazione. Il tempo di duplicazione dei lieviti in un terreno ricco è di circa 6 ore. Le ife crescono più
lentamente dei lieviti: miceli giovani raddoppiano il peso secco in 24 ore e producono in particolari
condizioni macro- e micro-conidi. Quest'ultimi, con dimensioni di 5 µm, se inalati germinano negli alveoli
polmonari dove si trasformano in lieviti causando l'histoplasmosi.
Microconidio
Macrofago
Macroconidio
Lievito in gemmazione
Micelio
Vacuolo
La fase sessuale di H.capsulatum è stata chiamata Ajellomyces capsulatum. Tale forma genera due
mating types (+) e (-) che in un mezzo di sporulazione produce dei corpi macroscopi fruttiferi che
contengono gli asci.
20. Histoplasma capsulatum
dimorfismo
I macrofagi sono delle cellule fagocitiche che hanno un ruolo fondamentale nel controllo
delle infezioni da patogeni. Sebbene H. capsulatum non sia un patogeno intracellulare
obbligato la sua fagocitosi da parte dei macrofagi è un evento importante per lo sviluppo
della malattia.
Il fungo è infatti capace di sopravvivere all'attacco dei macrofagi e di moltiplicarsi al loro
interno.
Una volta penetrato in un fagocita Histoplasma si localizza all'interno di fagosoma che si
fonde con un lisosoma generando un fagolisosoma. Tale processo (fusione fagosoma-
lisosoma) è un importante meccanismo generale che viene utilizzato dai macrofagi per
difendere l'organismo dalla presenza di patogeni (e non).
All'interno di un fagolisosoma l'ambiente è molto acido con un valore di pH inferiore a 4 e
insieme con enzimi degradativi contribuisce all'eliminazione dell'organismo che è stato
fagocitato.
21. Histoplasma capsulatum
dimorfismo e HSPs
Le HSP come antigeni - vaccini
Sintesi di HSP e virulenza
HSP70 e 82 - splicing
22. Histoplasma capsulatum
stato fisico della membrana
Δ9-desaturasi
Schema generale di desaturazione di fosfolipidi saturi (SFA) in insaturi (UFA) da
parte di diverse desaturasi. Il grado di insaturazione e la posizione in cui avviene
l’introduzione del doppio legame influenza in maniera diversa il livello di stato fluido della
membrana (MPS) in cui sono presenti gli UFA. Il diverso livello di MPS é determinato dal
rapporto SFA/UFA che è regolato a sua volta da una diminuzione di temperatura che attiva
trascrizionalmente i geni che codificano per questi enzimi.
23. Histoplasma capsulatum
stato fisico della membrana
Schema dello stato fluido della
membrana in condizioni di stress
termico. A. La membrana a temperatura
fisiologica. B. In condizioni di moderato
incremento della temperatura i complessi
lipidi/proteine delle membrane sono in
grado di mantenere funzionali le proprietà
della membrana. C. In condizioni di
aumento repentino della temperatura fra i 5
°C e i 7 °C le proprietà fisiologiche delle
proteine di membrana sono alterate. Al
tempo stesso l’aumento della fluidità attiva
un sensore (forse una proteina G2) che
attiva il fattore di trascrizione HSF
inducendo la sintesi delle proteine da
stress con il compito di proteggere il folding
delle proteine e compensare la fluidità a
valori simili a quelli esistenti prima dello
shock termico.La sovra-espressione della
Δ9-desaturasi causa un aumento della
fluidità di membrana a temperatura
fisiologica e uno stato iperfluido che
impedisce l ’ attivazione del sensore a
temperature che normalmente inducono le
HSP.(37 °C ).
