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Funghi pat

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  • 1. FUNGHI PATOGENI PER L’UOMO
  • 2. La Classificazione dei FunghiI Funghi o miceti sono eucarioti, uno dei 3 Domini (procarioti, archea ed eucarioti) in cuisono stati suddivisi gli esseri viventi.I funghi sono microorganismi evolutivamente più complessi dei procarioti e degli archea.Sono classificati come eucarioti diploidi con il DNA organizzato in cromosomi linearilocalizzati in un nucleo delimitato da una doppia membrana che contiene steroli.Contengono inoltre mitocondri e altri organelli.Sono aerobi, mesofili e/o psicrotofici (basse T), e producono spore.I funghi non sono in grado di fotosintetizzare non avendo la clorofilla e i cloroplasti.Si nutrono necessariamente dei composti organici sintetizzati da altri esseri viventi: sonoquindi organismi eterotrofi.La maggiore complessità nellorganizzazione genica permette loro di avere anche unamaggiore diversificazione morfologica rispetto ai procarioti e agli archea.In genere si nutrono dei tessuti di organismi morti, ma alcune specie sono in grado diparassitare anche esseri viventi nel qual caso possono causare numerose malattie ancheper luomo.
  • 3. Licheni
  • 4. I funghi Il numero delle specie di funghi oggi viventi è sconosciuto.Una stima conservativa fa ritenere che oggi siano presenti sulla Terra almeno 700 000specie, anche se si è arrivati a proporre un numero di 1,5 milioni.Di questi solo una minima parte sono state descritte almeno morfologicamente.A oggi meno di 200 specie sono patogene per l’uomo.•20 di queste causano infezioni sistemiche e•circa 20 infezioni cutanee.•Solo una decina causano infezioni subcutanee gravi.
  • 5. I funghi• A causa delle morfologie molto semplici e variabili che si sono evolute a secondo delle strategie ecologiche adottate, è difficile determinare le loro diversità e le loro relazioni filogenetiche.• Originariamente, la determinazione tassonomica delle specie fungine era basata, come per gli altri microorganismi, su criteri morfologici, ultrastrutturali, fisiologici e immunologici, insieme con il riconoscimento, generico e descrittivo, effettuato al microscopio ottico in campo chiaro.• Negli ultimi vent’anni tecniche di biologia molecolare (PCR, RFLP, analisi di sequenze di tRNA, sequenziamento di genomi, etc.) hanno consentito una più sicura determinazione dell’identità dei funghi studiati e del grado di relazione filogenetica esistente tra i membri dei vari raggruppamenti tassonomici.• Con la crescente disponibilità di alberi filogenetici generati da un numero alto di geni è stato possibile ricostruire una classificazione filogenetica basata sulle similitudini delle sequenze nucleotidiche e proteiche.• Nel 2007 è stata proposta una nuova classificazione filogenetica dei funghi basata sulle recenti analisi genetiche e molecolari.
  • 6. I funghi• I funghi possono essere divisi in 2 forme morfologiche distinte, i lieviti e le ife. I lieviti sono funghi unicellulari che si riproducono asessualmente per gemmazione (budding, per es. Saccharomyces spp.) o per scissione (per es. Schizosaccharomyces spp.).Le ife sono funghi pluricellulari dal diametro normalmente compreso tra i 4 e i 10 µm che si riproducono asessualmente e/o sessualmente.Il micelio (ossia lapparato vegetativo, il “corpo”, dei funghi) costituisce lintreccio delle ife.L’ifa può essere settata uninucleata o multinucleata, o cenocitica (non-settata).Le ife pluricellulari sono dette settate quando le cellule che le compongono sono separate da setti porosi (uno o più pori) che consentono il passaggio di materiale e, in alcuni casi, persino di organelli tra una cellula e laltra. Le ife non settate sono invece costituite da ununica cellula plurinucleata. Ifa settata con setto poroso al microscopio elettronico È anche visibile il passaggio di organelli.
  • 7. I funghiMolti miceli (muffe) sono in grado di crescere o tollerare ambienti con bassa umidità (xenofili),con alto contenuto di sali o zuccheri (osmofili e osmotolleranti) e con basso pH (acidofili eacidotolleranti).Le ife possono essere distinte in vegetative, preposte a compiti nutrizionali, e aeree con funzioniriproduttive. In questultimo caso l’ifa si estende nell’aria e produce esospore libere (conidi) ocorpi fruttiferi (sporangi).In generale, la spora germina producendo l’ifa che cresce e si ramifica nella struttura complessache rappresenta il micelio.
  • 8. I funghiI lieviti sono funghi unicellulari di forma ovale o sferica di 3-15 µm che si moltiplicanoprevalentemente per gemmazione.Dalla cellula madre viene prodotta una protuberanza chiamata gemma (gemmazione) che,quando raggiunge circa le stesse dimensioni della cellula madre, forma la parete trasversale e sisepara dalla cellula madre.Nel punto di distacco si forma sulla cellula madre una cicatrice permanente (cicatrice digemmazione, scar) sulla quale non si avrà più gemmazione, e sulla cellula figlia una cicatricepermanente detta cicatrice di distacco. L’intero processo richiede circa 30 minuti e ogni cellula,nella sua vita genera in media 24 cellule figlie.Una caratteristica importante della gemmazione è che tutto il materiale di nuova sintesi (parete,membrane, nucleo etc.) andrà a formare la cellula figlia, a differenza del processo di scissionebinaria in cui il materiale di nuova sintesi è distribuito equamente tra cellula madre e cellula figlia. Il lievito Saccharomyces cerevisiae in gemmazione. Sono visibili 4 cicatrici di gemmazione.
  • 9. I funghiLa scoperta del ruolo dei lieviti nei processi fermentativi risale alla metà dell800 quando il fisiologotedesco Theodor Schwann e il francese Cagnard de Latour identificarono e descrissero con precisione lecellule fungine come organismi viventi presenti nel mosto duva.A secondo delle condizioni presenti nellambiente (per esempio, la temperatura), alcuni funghi hanno lacapacità di crescere sia come lieviti sia come miceli.Questo dimorfismo è una caratteristica molto importante per alcuni dei principali funghi patogeni perluomo in quanto solo una delle due forme causa la malattia. I funghi possiedono una parete cellulare una struttura rigida che conferisce stabilità morfologica alla cellula e permette le interazioni con l’ambiente esterno e i contatti con l’ospite infetto. Come nelle piante, quindi, anche nei funghi si osserva in genere la presenza, intorno alla membrana, di una rigida parete cellulare. La parete cellulare di Saccharomyces cerevisiae (× 72 000). Sono visibili anche il nucleo, un vacuolo, mitocondri e il reticolo endoplasmatico.
  • 10. I funghiA differenza della parete delle cellule vegetali, costituita in prevalenza da cellulosa, quella dei funghi ècomposta soprattutto da chitina.La chitina è costituita da polisaccaridi complessi, proteine e glicoproteine.I polisaccaridi, che rappresentano circa l’80% della parete cellulare, sono polimeri di zuccheri semplici edincludono: la chitina, costituita da residui di N-acetilglucosammina legati tra loro da legami β-1,4-glicosidici simili ai residui di glucosio della cellulosa; un glucano, costituito da residui di D-glucosio legaticon legami β-1,6 e con diramazioni β-1,3 e un mannano, un polimero del D-mannosio unito da legami α-1,6 e con diramazioni α-1,2 e α-1,3.Nella parete sono inoltre presenti alcune glicoproteine, che sono importanti determinanti antigenici. La chitina è un lungo polimero di N-acetilglucosammina (un derivato del glucosio) presente nella parete cellulare dei funghi e nell’esoscheletro di crostacei, insetti, e nei molluschi e nei cefalopodi.
  • 11. La riproduzione dei funghiLa riproduzione dei funghi può avvenire per via sessuata (teleomorfi) – attraverso la fusione di due o piùnuclei con un diverso patrimonio genetico – o asessuata (anamorfi), con cicli vitali che possono esseresemplici, ma anche molto complessi.La riproduzione passa nella maggior parte dei casi attraverso la produzione di spore, cellule riproduttivespecializzate che sviluppandosi danno origine a un nuovo fungo. I funghi dei quali non sono ancora stateriscontrate le corrispondenti forme sessuate di proliferazione sono chiamati funghi imperfetti odeuteromiceti.La riproduzione asessuata comprende la riproduzione di lieviti e ife. La proliferazione vegetativa, inparticolare, si può avere per:scissione Meccanismo diffuso nei lieviti (ascomiceti) e in genere nei funghi unicellulari, consiste nelladivisione per mitosi della cellula madre in due cellule figlie uguali.gemmazione Un sistema riproduttivo diffuso soprattutto tra i lieviti, attraverso il quale le cellule figliecompaiono come protuberanze (gemme);sporulazione attraverso un processo mitotico vengono prodotte, allinterno di particolari strutture a forma di“sacchetto globoso” chiamate sporocisti, delle spore (mitospore) capaci di generare un nuovo individuo. Lemitospore, protette da una spessa parete, possono essere flagellate, quindi mobili (zoospore), oppure no(aplanospore). Le spore asessuate (conidi) possono essere localizzate agli apici e ai lati delle ife neiconidiofori, o all’interno di esse (sporangi) e sono chiamate sporagiospore.Le artrospore si formano per frammentazione delle ife. Le spore presentano anche più nuclei, morfologiavariabile e caratteristiche che possono essere importanti per la loro identificazione;
  • 12. La riproduzione dei funghiLa riproduzione sessuata è subordinata alla produzione di spore maschili e femminili a seguito di una meiosidopo una fase transitoria diploide allinterno di strutture del fungo specializzate per la riproduzione, chiamateascospore. Tali spore, prodotte a milioni da ciascun individuo, vengono diffuse attraverso il vento, lacqua o gliinsetti.In numerose specie appartenenti ad esempio ai phyla Oomicota, Zigomicota e Ascomicota le spore maschili efemminili si uniscono formando ununica struttura polinucleata che in seguito alla fusione dei nuclei entra inmeiosi producendo spore aploidi, le quali non appena trovate le condizioni adatte germinano formando nuovimiceli.Nelle specie appartenenti al phylum dei Basidiomicota la spora di una determinata polarità sessuale, unavolta raggiunto il terreno o il substrato più adatto, nelle condizioni più favorevoli di umidità e temperatura,germina formando ife (micelio primario). Per poter completare il ciclo biologico e organizzare le struttureriproduttive, dal micelio primario il fungo passa al micelio secondario, attraverso l’unione di due miceli primari(maschile e femminile), fenomeno noto come somatogamia: Il micelio secondario genererà il frutto (carpoforo)che porta nuovamente spore. (a) Scissione trasversale. (b) Frammentazione delle ife da cui si formano artroconidi (artrospore) e (c) clamidospore. (d) Sporangiospore in uno sporangio. (e) Conidiospore strutturate in catene all’estremità di un conidioforo. (f) Si formano le blastospore dalle gemme delle cellule parentali.
  • 13. La riproduzione sessuale: mating typesDurante la fase sessuale avviene la fusione dei gameti aploidi generando cellule diploidi. La fasesessuale richiede lespressione coordinata di numerosi geni coinvolti in importanti processi molecolari egenetici come la riduzione del numero di cromosomi durante la meiosi e la formazione di gameti aploidi,la ripartizione dei cromosomi durante la meiosi, la regolazione dei geni coinvolti nel ciclo cellulare, etc.
  • 14. DimorfismoDiversi funghi possono assumere in risposta alle variazioni ambientali due diverse morfologie (filamentosa-miceli e unicellulare-lieviti). Questo processo è definito dimorfismo ed è una delle caratteristiche principalidi diversi funghi patogeni per luomo (Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Histoplasmacapsulatum e Paracoccidioides brasiliensis).I pazienti infettati con questi funghi dimorfici presentano nei loro tessuti cellule nella fase lievito che è lasola forma virulenta. Al contrario, nellambiente vengono trovati i miceli che rappresentano la formasaprofitica. In condizioni di laboratorio è possibile crescere in forma pura entrambe le forme modificando latemperatura di crescita: 25°C per i miceli e 37°C per i lievitiÈ possibile quindi trasformare lieviti in miceli e viceversa semplicemente modificando la temperatura diincubazione. Poiché nei funghi dimorfici vi è una precisa correlazione tra la forma presente nei tessutiumani (lieviti) e la malattia fa ritenere che il processo di differenziamento sia strettamente collegato allacapacità di indurre l’infezione. Va in ogni caso tenuto presente che la transizione di fase micelio ↔ lievitoindotta dalla temperatura in assenza dellospite umano è a sua volta collegata alla capacità di questi funghidi adattarsi a due ambienti diversi indipendentemente dalla presenza di un ospite.
  • 15. Dimorfismo Lieviti Queste cellule contengono una parete cellulare ricoperta da microfibrille alle quali sono associati diversi enzimi. I lieviti di B. dermatitidis e di P. brasiliensis sono multinucleati, mentre quelli di H.capsulatum contengono un solo nucleo. Allinterno del lievito sono presenti diversi organelli ed inclusioni, tra cui il reticolo endoplasmatico che comunica con la membrana nucleare e i vacuoli che hanno funzioni lisosomiali. I lieviti si riproducono per gemmazione. Ife Nel citoplasma delle ife sono presenti gli stessi organelli e i diversi tipi di inclusioni identificati nei lieviti. I miceli di B. dermatitidis e di H.capsulatum sono costituiti da ife settate. Le parti terminali delle ife, che contengono dei corpi che possono aggregare fra di loro, possono contenere uno o due nuclei. In prossimità dei pori tra due cellule possono essere presenti i cosiddetti corpi di Woronin.Transizione lievito ↔ ifa Le cellule di lievito cresciute a 37°C si trasformano, in condizioni di laboratorio, in ife quando la temperatura di incubazione viene ridotta a 25°C (o almeno meno di 30 °C). Da un punto di vista morfologico le modalità di questa transizione di fase sono molto simili fra tutti i funghi dimorfici. In condizioni ottimali, tale transizioni morfologiche avvengono in genere tra i 3 e i 5 giorni. Transizione ifa ↔ lievito I cambiamenti morfologici da micelio a lievito richiedono un tempo maggiore, 6-8 giorni, quando la temperatura di crescita passa da 25°C a 37°C. Nel caso di miceli giovani, virtualmente tutte le ife si trasformano in lieviti mentre miceli che sono cresciuti per periodi lunghi di tempo a 25°C richiedono anche 15 - 20 giorni per trasformarsi in lieviti. In questo caso, solo le parti terminali delle ife (la parte vegetativa) si trasformano in lieviti, mentre le regioni più interne delle ife del micelio hanno scarsa vitalità o sono morte. Lo studio molecolare della transizione ifa ↔ lievito è particolarmente importante in quanto linfezione in natura viene contratta inalando le spore prodotte dalle ife o frammenti delle stesse ife che una volta penetrate nellorganismo umano (polmoni) germinano e si trasformano in lieviti patogeni. Parete cellulare Membrana plasmatica Ammassi di microfilamenti Nucleo Parete cellulare Microtubuli Citoplasma Gruppo di ribosomi Cicatrice di gemmazione polare Cromosoma Reticolo endoplassmatico liscio Membrana plasmatica Mitocondri Membrana nucleare Reticolo endoplasmatico ruvidoMitocondrio Apparatodi Golgi Apparato di golgi Membrana plasmatica Invaginazioni della membrana plasmatica
  • 16. Micosi sistemicheLe infezioni sistemiche causate da funghi sono divise in due categorie:•infezioni causate da funghi patogeni che possiedono la capacità intrinseca di causare, con un inoculosufficiente, una malattia in un ospite sano:Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum e Paracoccidioidesbrasiliensisinfezioni causate da organismi opportunisti, funghi la cui capacità di determinare unamalattia dipende dalle diminuite capacità immunologiche dellospite:Aspergillus fumigatus, Candidaspp., Cryptococcus neoformans e RhizopusTranne C. immitis, gli altri funghi intrinsecamente patogenisono tutti dimorfici.La patogenicità non è una caratteristica essenziale di questi funghi in quanto la loro disseminazionenon dipende dalla presenza di un ospite. Infatti, infezioni uomo - uomo non sono state descritte e latransizione reversibile micelio (saprofita) ↔ lievito (patogeno) può avvenire al di fuori dellospitemodificando semplicemente le condizioni di crescita e di temperatura. La forma lievito isolata nei tessutidi pazienti infetti non necessita la presenza dellospite umano per svilupparsi. Questo suggerisce che igeni lievito-specifici non sono necessariamente responsabili nella patogenicità e che gli stessi sonomantenuti in questi organissmi in assenza di una pressione selettiva esercitata dallospite. È quindiragionevole ritenere che i prodotti dei geni coinvolti nel mantenimento della fase lievito e nellatransizione micelio ↔ lievito sono utilizzati anche durante la crescita nellambiente in assenza di tessutiumani.
  • 17. Micosi sistemicheQuesti organismi non sono intrinsecamente molto virulenti, e in genere circa il 90% delle infezioni sonoasintomatiche, con un quadro clinico lieve e autolimitante.Negli ultimi decenni però lincidenza di infezioni causate da questi funghi è significativamenteaumentata con la diffusione dellAIDS e in generale per lincremento di pazienti con uno statoimmunologico depresso.I funghi che causano malattie sistemiche hanno la caratteristica di essere presenti in particolari areegeografiche le cui condizioni ecologiche ne favoriscono la diffusione in quel particolare ambiente.Per esempio, H. capsulatum è endemico negli stati centrali e nel Sud degli Stati Uniti ma non èpresente in Europa, anche se negli ultimi anni è stato isolato in pazienti immunodepressi che avevanovissuto o visitato queste regioni. In ogni caso, tale fungo non è stato mai isolato dallambiente inEuropa.Nel Midwest degli USA circa il 90% degli individui è positivo quando viene inoculata sottocutelhistoplasmina, indicando che hanno contratto una infezione primaria. Al contrario, funghi comeCandida e Aspergillus sono ubiquitari. Unaltra caratteristica dei funghi patogeni opportunisti è quella dinon indurre unimmunità specifica e una successiva infezione può avvenire se le difese immunologichesono di nuovo ridotte.
  • 18. Histoplasma capsulatumDa un punto di vista biochimico e molecolare H. capsulatum è tra i funghi dimorfici maggiormentestudiati.L’Histoplasma esiste in due fasi di crescita, una parassitica, il lievito, 1-3 µm di diametro, ed unasaprofita, il micelio di circa 1,2 - 1,5 µm di diametro.I lieviti sono la forma virulenta che si localizza nei macrofagi e nel reticolo endoteliale e, in condizioni dilaboratorio, a 37°C in terreni di coltura liquidi. I lieviti hanno un singolo nucleo e si riproducono pergemmazione. Il tempo di duplicazione dei lieviti in un terreno ricco è di circa 6 ore. Le ife crescono piùlentamente dei lieviti: miceli giovani raddoppiano il peso secco in 24 ore e producono in particolaricondizioni macro- e micro-conidi. Questultimi, con dimensioni di 5 µm, se inalati germinano negli alveolipolmonari dove si trasformano in lieviti causando lhistoplasmosi. Microconidio Macrofago Macroconidio Lievito in gemmazione Micelio VacuoloLa fase sessuale di H.capsulatum è stata chiamata Ajellomyces capsulatum. Tale forma genera duemating types (+) e (-) che in un mezzo di sporulazione produce dei corpi macroscopi fruttiferi checontengono gli asci.
  • 19. Histoplasma capsulatum dimorfismo
  • 20. Histoplasma capsulatum dimorfismoI macrofagi sono delle cellule fagocitiche che hanno un ruolo fondamentale nel controllodelle infezioni da patogeni. Sebbene H. capsulatum non sia un patogeno intracellulareobbligato la sua fagocitosi da parte dei macrofagi è un evento importante per lo sviluppodella malattia.Il fungo è infatti capace di sopravvivere allattacco dei macrofagi e di moltiplicarsi al lorointerno.Una volta penetrato in un fagocita Histoplasma si localizza allinterno di fagosoma che sifonde con un lisosoma generando un fagolisosoma. Tale processo (fusione fagosoma-lisosoma) è un importante meccanismo generale che viene utilizzato dai macrofagi perdifendere lorganismo dalla presenza di patogeni (e non).Allinterno di un fagolisosoma lambiente è molto acido con un valore di pH inferiore a 4 einsieme con enzimi degradativi contribuisce alleliminazione dellorganismo che è statofagocitato.
  • 21. Histoplasma capsulatum dimorfismo e HSPsLe HSP come antigeni - vacciniSintesi di HSP e virulenzaHSP70 e 82 - splicing
  • 22. Histoplasma capsulatum stato fisico della membrana Δ9-desaturasiSchema generale di desaturazione di fosfolipidi saturi (SFA) in insaturi (UFA) daparte di diverse desaturasi. Il grado di insaturazione e la posizione in cui avvienel’introduzione del doppio legame influenza in maniera diversa il livello di stato fluido dellamembrana (MPS) in cui sono presenti gli UFA. Il diverso livello di MPS é determinato dalrapporto SFA/UFA che è regolato a sua volta da una diminuzione di temperatura che attivatrascrizionalmente i geni che codificano per questi enzimi.
  • 23. Histoplasma capsulatum stato fisico della membrana Schema dello stato fluido della membrana in condizioni di stress termico. A. La membrana a temperatura fisiologica. B. In condizioni di moderato incremento della temperatura i complessi lipidi/proteine delle membrane sono in grado di mantenere funzionali le proprietà della membrana. C. In condizioni di aumento repentino della temperatura fra i 5 °C e i 7 °C le proprietà fisiologiche delle proteine di membrana sono alterate. Al tempo stesso l’aumento della fluidità attiva un sensore (forse una proteina G2) che attiva il fattore di trascrizione HSF inducendo la sintesi delle proteine da stress con il compito di proteggere il folding delle proteine e compensare la fluidità a valori simili a quelli esistenti prima dello shock termico.La sovra-espressione della Δ9-desaturasi causa un aumento della fluidità di membrana a temperatura fisiologica e uno stato iperfluido che impedisce l ’ attivazione del sensore a temperature che normalmente inducono le HSP.(37 °C ).
  • 24. Histoplasma capsulatumstato fisico della membrana - virulenza - vaccini

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