Carcinogenese as bases moleculares do cancer
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    Carcinogenese as bases moleculares do cancer Carcinogenese as bases moleculares do cancer Document Transcript

    • 1 “Carcinogênese - a base molecular do câncer” Por: Isabelle Vasconcellos de Souza Monografia apresentado à disciplina “Projeto Trabalho, Ciência e Cultura” do curso de Laboratório em Biodiagnóstico em Saúde como requisito para a conclusão do Ensino Médio Técnico em Saúde. Orientador: Marcos Antônio Marques Co-orientador: Mario Newman Rio de Janeiro 2008
    • 2 Agradecimentos Meus sinceros agradecimentos... ...aos meus mentores espirituais, que me auxiliaram e assistiram durante todo esse processo; ...à meus pais, Elisabete e Damião, pelo apoio, força e confiança em todos os momentos da minha vida; ...à minha irmã, Nathalia, por ter sido a principal motivadora dessa pesquisa e grande responsável por essa nova e eterna paixão que é o câncer; ...ao Prof. Dr. e etc Mario Newman, pelas críticas, elogios, motivações, pelas inúmeras conversas extremamente proveitosas e por acreditar em meu potencial, até mais do que eu mesma. Um verdadeiro mestre que me conduziu durante esta pesquisa com paciência, liberdade e sabedoria. Quero ser igual a você quando crescer; ...aos professores Marcos Marques, pelo apoio prestado, Augusto César, pelas revisões e valiosas sugestões, Dr. Renato Matos, pelo material fornecido; ...à todos que direta e indiretamente ajudaram nesta pesquisa;
    • 3 “Nós somos aquilo que nossos genes nos permitem ser” (Autor desconhecido)
    • 4 LISTA DE FIGURAS E QUADROS FIGURA 1 - Carcinógenos Químicas.................................................................................. 23 FIGURA 2 - Processos Celulares Básicos........................................................................... 25 FIGURA 3 - Fases da Interfase............................................................................................ 29 FIGURA 4 - Ciclo Celular................................................................................................... 30 FIGURA 5 – CDKs e Ciclinas Presentes em Células de Eucariontes Superiores .............. 33 FIGURA 6 - Interações Intracelulares................................................................................. 34 FIGURA 7 - Bases Nitrogenadas dos Ácidos Nucléicos .................................................... 37 FIGURA 8 - Heredograma do Câncer ................................................................................ 57 FIGURA 9 - Invasão Celular............................................................................................... 65 QUADRO 1 - Tumores........................................................................................................ 16 QUADRO 2 – Oncogenes.................................................................................................... 43
    • 5 LISTA DE ABREVIATURAS A - Adenina APC - Polipose Adenomatosa do Cólon C - Citosina CDK – Quinase dependente de ciclina CEA – Carcinoembrionário DNA – Ácido Desoxirribonucléicos EGF - Fator de crescimento epidérmico G - Guanina FGF - Fator de crescimento fibroblástico HBV – Hepatite B HCV – Hepatite C HGF - Fator de crescimento do hepatócrito HIV - Vírus de Imunodeficiência Humana HPV – Papiloma Vírus Humano IGF - Fator de crescimento tipo-insulina INCA – Instituto Nacional do Câncer NGF - Fator de crescimento do nervo PDGF - Fator de crescimento derivado de plaquetas PH - Potencial Hidrogeniônico PIGF - Fator de crescimento derivado da placenta RNA - Ácido ribonucléico RNAm - Ácido ribonucléico mensageiro
    • 6 RNAr - Ácido ribonucléico ribossomal RNAt - Ácido ribonucléico transportador T- Timina TNF – Fator de Necrose Tumoral TSTA - Antígenos Específicos de Transplantação de Tumores UV – Ultra Violeta VEGF - Fator de crescimento endotelial vascular
    • 7 SUMÁRIO Resumo 08 Introdução 09 Objetivos 12 Objetivo Geral 12 Objetivos Específicos 12 Metodologia 13 1 – Estudo Oncológico: informações básicas 14 1.1– Tumor Benigno x Tumor Maligno 17 1.2 – Nomenclatura 19 2 – Fatores que desencadeiam a carcinogênese 20 3 – Base genética do câncer 25 3.1 – Mutações e Câncer 25 3.2 – Ciclo celular e a Carcinogênese 28 3.3 – Regulação do Ciclo Celular 31 3.4 – Genes do Câncer 36 3.4.1 – Da informação gênica à proteína 36 3.4.2 – Oncogenes e Genes Supressores de Tumores 41 3.4.3 – Reparo de DNA e Apoptose 53 3.5 – Síndrome Hereditária de Predisposição ao Câncer 55 3.6 – Etapas da carcinogênese 58 4 – Proliferação Tumoral: mecanismo de angiogênese e metástase 61 5 – Aspectos Imunológicos das neoplasias 68 Considerações Finais 72 Referências 76
    • 8 RESUMO O presente trabalho possui a finalidade de analisar o processo desregulado de crescimento e morte celular no desenvolvimento neoplásico, a partir da compreensão dos mecanismos moleculares que de modo coordenado controlam a expressão gênica ligada à ativação e controle do ciclo celular, diferenciação e apoptose, sendo no processo de tumoração crucialmente afetados. Enfatizando a importância da veiculação dessas informações para a capacitação de profissionais de saúde, buscando a elaboração de novas perspectivas para a manipulação terapêutica e adoção de ações preventivas mais expressiva para toda a população. Palavras-chave: carcinogênese; genes do câncer; oncogenes, genes supressores de tumor.
    • 9 INTRODUÇÃO O termo “câncer” deriva da palavra grega Karcinos, que significa “caranguejo”, palavra utilizada por Hipócrates (500 a.C.) em seus estudos sobre o processo neoplásico. Essa denominação foi atribuída a partir de observações de crescimentos tumorais em forma de pinças em tecidos adjacentes, como os apêndices articulares dos crustáceos (Younes, 2001, p. 14), além disso, a maneira de crescimento infiltrante do câncer é análoga a forma como os membros desse filo fixam-se na areia ou lama e impedem sua remoção (Silvany Filho, 1971, p.20). Na antiguidade, em papiros de Ebers (1600 a.C.) no Egito, já havia registros de processos malignos, todavia foi Galeno (160 d.C.) que desenvolveu os primeiros estudos acerca da fisiopatologia do desenvolvimento do câncer, criando a hipótese de que tal processo era conseqüente do excesso de bile que afetava a área lesionada, isto é, o câncer representaria em um determinado local um desequilíbrio geral do organismo. Essa teoria, denominada constitucionalista, predominou durante 1500 anos no pensamento científico da medicina ocidental, sendo responsável pela incredulidade de intervenções cirúrgicas para o combate do câncer (Younes, 2001, p. 21). No ano de 1838, J. Müller demonstrou com o auxílio do microscópio que os tumores eram células. No mesmo período M. Schleiden e T. Schwann convenceram a comunidade científica de que a célula é a “unidade estruturante da vida”. Essas descobertas contribuíram para os estudos de Virchow (1821-1902) que, dentre outras coisas, determinou que toda célula origina-se de uma célula e descreveu a histologia dos tumores e o processo de crescimento envolvendo vias linfáticas e linfonodos, abordando, também, a invasão de certos órgãos pelas células malignas. Em suas análises, Virchow determinou que a erradicação total do tumor é viável com uma intervenção cirúrgica, fato que despertou o interesse da comunidade médica pelo tratamento cirúrgico de cânceres (DEL GIGLIO, 2002). O tratamento através de drogas surge em 1919 com as observações de Krumbhaar, que detectou mudanças nos padrões de diferenciação mediante exposição a gases de mostarda. Estudos que só foram aprimorados anos depois, em 1942, por Gilman, relatando efetivamente o
    • 10 retardamento do processo neoplásico com o uso de mostarda nitrogenada. Nos períodos seguintes foram descobertas e desenvolvidas outras substâncias anti-câncer: como Metrothexate (1961), Doxorrubicina (entre 1961 e 1980), Vincristina, Mitomicina, dentre outras. Muitas dessas utilizadas até hoje na terapêutica oncológica, combinadas ou não (DEL GIGLIO, 2002). Com o avanço nos estudos dos mecanismos de metastatização, carcinogênese, angiogênese e progressão tumoral, devido principalmente a engenharia genética, surgem investimentos em estudos para a prevenção do câncer e um novo modelo de tratamento voltado, pela primeira vez na história da oncologia, para a mutação genética, ao invés de interferências no processo de proliferação feita por drogas ou intervenções cirúrgicas, prejudiciais à qualidade de vida do paciente. As informações obtidas com o Projeto Genoma Humano e os estudos proteômicos ofereceram suporte para a definição da base molecular de diversas doenças. Segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA, 2006) as contribuições brasileiras, obtendo a seqüência dos genes expressos em amostras de tecidos normais e tumorais, foram muito expressivas, sendo inferior somente à dos Estados Unidos. A caracterização molecular do genoma permite a adoção de medidas de prevenção de risco, diagnóstico precoce e tratamento mais eficaz de várias doenças. Especificamente para a oncologia, a caracterização e compreensão dos genes críticos relacionados com o processo de carcinogênese (oncogenes, genes supressores de tumores e enzimas de reparo do DNA) apresentam-se como um importante meio para o tratamento, detecção e prevenção do câncer. Novas estratégias terapêuticas focalizando as estruturas moleculares alteradas durante o processo de desenvolvimento do câncer, ou ainda, a expressão de genes do tecido tumoral viabilizam a fabricação de drogas mais efetivas e menos tóxicas do que as atualmente adotadas, atacando somente as células neoplásicas e deixando intactas as normais. Além disso, há uma grande circulação de informações a respeito dos mecanismos moleculares de efeitos farmacológicos e dos genes responsáveis pela biometabolização de drogas e carcinógenos,
    • 11 desenvolvendo-se uma linha de pesquisa para a personalização de medicamentos conforme a resposta de cada indivíduo. Segundo dados do INCA (2006), cerca de 5% a 10% dos cânceres são hereditários, sendo que mais de 20 síndromes de câncer hereditário já foram definidas e determinadas as mutações genéticas na linhagem germinativa, permitindo o acompanhamento de pacientes e familiares com a finalidade de evitar o desenvolvimento do câncer antes do aparecimento dos sintomas, evitando testes desnecessários e os conseqüentes efeitos psicológicos que esses possuem sobre os familiares. Criou-se um ramo dentro da oncologia dedicado, principalmente, aos familiares de pacientes com câncer hereditário, a oncogenética, em que são tomadas medidas precoces de prevenção, detecção e tratamento através do aconselhamento genético. Diante da quantidade de informações circulantes nesse período pós-genômico, veiculado pela Internet, revistas científicas e por instituições como o INCA, é essencial que os profissionais de saúde estejam conscientizados desses avanços, cruciais para uma eficaz assistência médica. O presente trabalho possui essa finalidade, apresentando conhecimentos essenciais a respeito do câncer e, principalmente, uma análise dos genes que regulam o processo de carcinogênese ou oncogênese e a proliferação celular resultante desse.
    • 12 OBJETIVO Geral: Apontar, através de revisão bibliográfica, os mecanismos moleculares vinculados ao processo de expressão de genes ligados ao desenvolvimento tumoral. Específicos: - Realizar uma análise da atividade reguladora dos oncogenes (genes resultantes de mutações nos proto-oncogenes, responsáveis pela proliferação celular), genes supressores de tumores (que atuam na inibição de crescimento desordenado) e genes reparadores de lesões no DNA, que ao sofrerem alterações estruturais por ação de agentes mutagênicos desencadeiam a carcinogênese; - Abordar os fatores que desencadeiam a oncogênese, tais como, predisposição genética, dieta, poluentes, vírus, dentre outros, e as conseqüentes interferências nos mecanismos homeostáticos (ligados ao equilíbrio) do organismo causadas por estes.
    • 13 Metodologia Para o estudo do tema proposto será utilizada a abordagem qualitativa de pesquisa elaborada a partir de revisão bibliográfica de material já publicado, no caso, livros, dissertações, monografias, revistas e conteúdo disponibilizado na Internet. Realizando, assim, análise e interpretação das contribuições teóricas sobre câncer e os mecanismos de carcinogênese.
    • 14 CAPÍTULO 1 – ESTUDO ONCOLÓGICO: INFORMAÇÕES BÁSICAS Câncer, neoplasia ou tumor maligno são termos sinônimos que denotam mais de 150 diferentes tipos de doenças que possuem comportamentos biológicos diversificados, estando estes condicionados a vários fatores, como sítio primário (local de origem da formação tumoral), condições imunológicas e clínicas do paciente, histologia do tumor, dentre outros. Entretanto, o que se tem de comum em todas essas patologias é a perda do controle de proliferação, formando, como literalmente o termo neoplasia designa, um novo crescimento, um novo tecido (YOUNES, 2001, p.12). KUMAR, COTRAN e ROBBINS (1994, p. 140) definem o termo “câncer” por: Uma massa anormal de tecidos cujo crescimento excede e está descoordenado daquele dos tecidos normais, persistindo da mesma forma excessiva após a cessação dos estímulos que despertaram a alteração. O câncer é originado por alguns estímulos agressivos, externos ou não ao organismo, que provocam modificações no material genético (mutações), resultando em alterações permanentes no padrão normal de crescimento dessa porção celular, que continuará a replicar-se independentemente dos comandos reguladores do organismo. Essa característica será transmitida a cada nova geração de células, levando a uma multiplicação demasiada das células tumorais. (STEVENS e LOWE, 1996, p. 34). As neoplasias apresentam algumas características fundamentais: - Células tumorais apresentam grande instabilidade genética. Apesar de serem monoclonais na origem, passam por uma série de mutações em velocidade superior as que ocorrem nas células normais, assim, produzem-se novas variantes constantemente. Por isso, em uma mesma massa tumoral têm-se grande variedade de tamanho nuclear e citoplasmático e diferentes níveis de diferenciação (HART, 1990, p. 34-36);
    • 15 - Em comparação às características morfológicas das células normais, as neoplásicas apresentam núcleo com irregularidades mais acentuadas, quantidade de cromossomos anormal (um número não múltiplo de um valor diplóide, sendo denominadas como células poliplóides) que resulta em significativas alterações na relação núcleo/citoplasma, além das modificações na forma, tamanho e trecho de certos cromossomos, fato responsável pelo desencadeamento da transformação neoplásica. São células com uma cromatina mais compacta e hipercorável, que freqüentemente apresentam binúcleos ou polinúcleos (BOGLIOLO, 1978, p. 644). O citoplasma, devido ao enriquecimento na concentração de ribossomos resultantes da intensa atividade mitótica, possui um acentuado aumento da basofilia. Em relação às organelas, o retículo endoplasmático e o complexo de Golgi mostram-se pouco desenvolvidos e as mitocôndrias e lisossomos escassos. As alterações morfológicas mais destacadas estão presentes na configuração do citoesqueleto das células cancerosas, que em comparação com as células normais, é reduzido e disposto de forma desorganizada, a concentração de microtúbulos e filamentos intermediários encontram-se próximas do núcleo e os filamentos de actina sob a membrana basal (região cortical do citoplasma), participando significantemente do aumento da motilidade e capacidade de migração. Já a membrana basal é mais permeável, possuindo, por exemplo, maior quantidade de proteínas transportadoras de glicose para o citoplasma, permitindo maior mobilidade de componentes, e as estruturas juncionais são pouco eficientes, viabilizando o desprendimento do sítio primário. Também aparecem antígenos fetais na superfície, que indicam o processo de desdiferenciação sofrido pela célula tumoral (JUNQUEIRA E CARNEIRO, 2005, p. 292-293); - Com relação à constituição bioquímica dessas células, elas contêm mais água que as normais, concentração essa resultante do intenso processo de respiração celular necessário para suprir suas carências energéticas; a concentração iônica de hidrogênio (pH) é menor por causa da intensa atividade glicolítica, que tem como produto ácido láctico; maior concentração de potássio, especialmente nos tumores de crescimento mais rápido; a concentração de cálcio e ferro é menor que as normais; a quantidade de glicose é pequena devido à intensa atividade metabólica; a captação intensa de aminoácidos, pois continua multiplicando-se mesmo quando há baixo nível protéico no organismo; e a composição lipídica da célula depende da dieta do hospedeiro (BOGLIOLO, 1978, p.645-646);
    • 16 - As células neoplásicas apresentam certo grau de autonomia, aumentam de tamanho de forma relativamente constante, independentemente do estado nutricional do hospedeiro. Contudo, essa autonomia não é plena, dependendo, de qualquer forma, dos nutrientes e fornecimento sanguíneo do organismo (STEVENS e LOWE, 1996, p.38). - Essas células competem com as não mutadas por nutrientes e outras substâncias para suprirem suas necessidades metabólicas, uma das principais causas que levam uma pessoa com câncer à morte. A fraqueza progressiva faz com que o paciente seja acometido por infecções secundárias. Além disso, as obliterações de órgãos ou sistemas vitais causadas por massas tumorais levam ao óbito (STEVENS e LOWE, 1996, p.42).
    • 17 1.1 TUMOR BENIGNO X TUMOR MALIGNO Rigorosamente, uma tumefação, como edema ou hemorragia, é o que determina um tumor, entretanto, convencionalmente a palavra nomeia, quase que exclusivamente, qualquer aumento tecidual neoplásico, e o estudo destes é feito pela oncologia (de oncos, tumor, e logos, estudo de) (STEVENS e LOWE, 1996, p. 34). Dentro dessa conceituação, os tumores são divididos, de acordo com seu comportamento clínico, em benignos e malignos, sendo somente o segundo o que se entende por câncer. Abaixo no Quadro 1 de distinções entre esses tumores. TUMORES BENIGNO MALIGNO - Apresentam contornos bem definidos e crescimento localizado, formando uma espécie de cápsula fibrosa; - Contornos pouco definidos e, de acordo com crescimento, tendem a invadir outros locais (metástase); - Atingem um grau de diferenciação 1 semelhante ao das células que lhes deram origem; - Não alcançam um estágio de diferenciação completo, apresentando variáveis graus que designam como: neoplasia maligna bem diferenciada; neoplasia maligna pouco diferenciada, apresentando ligeira semelhança com o tecido de origem; neoplasia maligna anaplásica, que não é passível a identificação da célula de origem devido à incapacidade de diferenciação celular; - O grau de diferenciação celular está relacionado com seu comportamento, quanto menos diferenciado, mais agressivo. 1 A partir de células-tronco ou precursoras, as células assumem uma função específica, desenvolvendo determinadas estruturas, esse processo é denominado diferenciação.
    • 18 Histologia: - assemelham-se à célula de origem; - poucas mitoses; - relação núcleo/citoplasma normal ou ligeiramente aumentada; - células uniformes em todo tumor; Histologia: - variados graus de diferenciação; - Inúmeras mitoses; - Relação núcleo/citoplasma aumentada; - Células e núcleos de formas e tamanhos variados; - Os tumores benignos crescem de forma lenta, baixo índice mitótico, e comprimem os tecidos adjacentes, fato que prejudica o funcionamento desses. Além disso, se essa neoplasia benigna possuir funções endócrinas, ocorrerá perturbação aos mecanismos homeostáticos do organismo devido à secreção descontrolada de hormônios; - Tumores malignos crescem e avançam nos tecidos adjacentes, disseminando-se para outras regiões do organismo, formando tumores secundários (metástase); Quadro 1 produzido a partir das informações de STEVENS e LOWE, 1996, p.35-37 e BOGLIOLO, 1978, p. 640-647. Apesar de ambas as neoplasias levarem ao óbito, as malignas são as principais causadoras de mortalidade. Os tumores benignos apresentam um baixo percentual, visto que seu comportamento, de forma geral, é inócuo, apresentando um bom prognóstico que depende somente de sua localização. Há casos, como por exemplo, das massas tumorais localizadas no tronco cerebral, que é um sítio desfavorável, acarretando um rápido agravamento do quadro clínico do paciente até sua morte (FILHO, 1993, p.152-155 e STEVENS e LOWE, 1996, p. 42).
    • 19 1.2 NOMENCLATURA O nome de um tumor depende de sua célula de origem e do comportamento biológico (maligno ou benigno). Entretanto, como em muitas outras áreas da medicina, a nomenclatura das neoplasias evoluiu com o tempo, sendo repleta de justificativas inconsistentes. É muito comum um tipo de tumor apresentar mais de um nome (STEVENS e LOWE, 1996, p. 45). Os tumores benignos são designados pela adição do sufixo “-OMA” ao tipo de célula de origem, por exemplo, em um tecido fibroso, o tumor benigno é um fibroma; no cartilaginoso, condroma. A terminologia dos epiteliais é mais complexa: adenoma é aplicado a neoplasias epiteliais ligados a padrões glandulares; papiloma designa os que apresentam crescimento do tipo arborescente; pólipos são os tumores que se projetam acima da superfície mucosa; os cistadenomas são tipicamente observados nos ovários, caracterizados por massas císticas ocas (STEVENS e LOWE, 1996, p. 45). Já os tumores malignos possuem histogênese mesenquimal, células de sustentação, sendo chamadas de “-SARCOMAS”, seguindo a mesma regra dos tumores benignos, exemplo: fibrossarcoma, osteosarcoma. Os de origem epitelial são denominados “CARCINOMA”, como adenocarcinoma, de caráter glandular (STEVENS e LOWE, 1996, p. 45). As neoplasias que não se enquadram nas categorias de tecido epitelial ou de sustentação são nomeadas de acordo com tecidos de origem: Linfomas (sistema linfóide), Leucemia (elementos hematopoiéticos); Tumores Embrionários (derivados de tecido embrionário “blástico” primitivo, ocorrendo principalmente na faixa etária infantil); Tumores Neuroendócrinos (células neuroendócrinas secretoras de hormônios polipeptídios ou aminas ativas); dentre outros. Há, ainda, os tumores com nomes epônimos (nomes de pessoas que os estudaram, caracterizaram ou os tornaram popular), como Sarcoma de Ewing (tumor maligno de osso encontrado em pessoas jovens); Doença de Hodgkin (um subgrupo dos linfomas); Sarcoma de Kaposi (tumor do endotélio associado com AID’S); Linfoma de Burkitt (presente nos linfócitos B) (STEVENS e LOWE, 1996, p. 45).
    • 20 CAPÍTULO 2: FATORES QUE DESENCADEIAM A CARCINOGÊNESE Por que determinadas pessoas desenvolvem câncer e outras não? Essa pergunta pode ser bem simplista, entretanto, sua resposta, ou pelo menos a tentativa de um esclarecimento maior acerca desse assunto, envolve complexas questões. Nos últimos anos houve importantes avanços no conhecimento das neoplasias, determinando-se que a chave para compreender a carcinogênese está na constatação de que componentes ambientais (como vírus, certos agentes físicos e químicos) assim como fatores genéticos possuem papeis decisivos no aparecimento de vários tumores humanos e de outros animais. Como define Lewin (2001, p. 838), tumores são resultantes de agressões ambientais em indivíduos geneticamente suscetíveis. Entretanto, tem-se também graduações em relação a estes dois fatores cruciais do câncer, a causa ambiental pode atuar de forma crônica (quantidades moderadas com exposições a longo prazo) ou aguda (grande quantidade em um curto espaço de tempo) e o condicionamento genético, que pode ser forte e determinante (como no adenocarcinoma de mama em camundongos, causado por um vírus que se manifesta apenas em animais com específica constituição genética) ou fraca (o mais comum, evidenciado no aparecimento de tumores por carcinógenos químicos ou físicos) (READ, 2002, p. 434). Pode-se concluir com isso que pessoas com constituições genéticas diferentes e que vivem em locais distintos estão expostos a destoantes fatores que determinarão o tipo e a agressividade das tumorações que podem desenvolver. Os estudos sobre a distribuição dos tipos de cânceres nas populações e os fatores de risco apontaram diferentes padrões entre os países, todavia, isso não é suficiente para explicar o adoecimento de alguns indivíduos e de outros não. Não existe uma causa única para o câncer, também não existe um modo único de ação dos agentes cancerígenos. O câncer é o resultado de um processo complexo que se desenvolve em múltiplos estágios, ocorrendo em cada um deles alterações genéticas que levam células suscetíveis a adquirirem crescimento seletivo e expansão clonal, “(...) o câncer está diretamente vinculado a uma multiplicidade de causas, suficientes para a constituição de uma causa necessária” (INCA, 2006, p.20).
    • 21 Com a globalização da economia, a perda de fronteiras e a integração de economias nacionais, o processo de tumoração cresceu em larga escala, resultante da liberação de poluentes no meio; modificação dos padrões de trabalho; a criação de determinados hábitos alimentares; o uso de tabaco e álcool; mudança nas condições reprodutivas e hormonais e falta de exercícios. Ou seja, redefiniram-se condições sociais, econômicas e ambientais. Simultaneamente, tem-se um aumento da expectativa de vida, fato que deixa as pessoas expostas a fatores carcinogênicos por períodos mais longos (INCA, 2006, p.21). Apesar da mortalidade e incidência do câncer ser maior em países pobres, as condições diretamente associadas ao aparecimento de tumorações são primarias de populações urbanas de regiões industrializadas. Isso é explicado de acordo com o INCA (2006, p.23) devido à migração de “padrões ocidentais de vida”. Criam-se, então, tipos característicos de cânceres de acordo com a condição social e econômica, países ricos apresentam alta prevalência de câncer de pulmão, mama, intestino e próstata; já os países tidos subdesenvolvidos, câncer de estômago, colo de útero e fígado. No Brasil, que é considerado um país em desenvolvimento, observa-se à ocorrência de cânceres associados a melhores condições socioeconômicas (mama, próstata e cólon/reto), em concomitância, há uma elevação de tumores a pobreza (cólon do útero, pênis, estômago e cavidade oral). (INCA, 2006, p. 23-24) Pesquisadores da Harvard School of public Health estabeleceram que 35% das mortes por câncer no mundo poderiam ser atribuídas a combinações da ação de nove fatores de risco, separados em cinco grupos (INCA, 2006, p. 24-28): − Dieta e inatividade física: a relação entre a ocorrência de câncer e a alimentação envolve diversos fatores, como o modo de preparo, o tipo de alimento e seus componentes bioquímicos, a proporção de ingestão, a conservação, dentre outros. Apesar disso, sabe-se que alguns alimentos, como frutas, oferecem proteção contra o câncer, em contrapartida, alimentos ricos em lipídios aumentam o risco de câncer ao afetar a homeostase (mecanismos que garantem o equilíbrio das funções) do organismo. Há também os alimentos contaminados por aflatoxinas (liberados por fungos presentes em cereais e grãos mofados). Já as atividades físicas terão papel importante ao manter um equilíbrio
    • 22 entre o que é ingerido e o gasto energético no organismo, melhorando o funcionamento e eficiência das atividades orgânicas. − Uso de tabaco e álcool: o tabagismo é mundialmente reconhecido como uma doença crônica gerada pela dependência à nicotina, sendo o usuário de tabaco exposto a diversas substâncias cancerígenas relacionadas ao câncer de pulmão, laringe, pâncreas, fígado, bexiga rim, leucemia mielóide, dentre outros. E, quando associado ao uso de álcool, é responsável pelo câncer de cavidade oral e esôfago. O próprio álcool já possui uma quantidade significativa de agentes nocivos. − Riscos ambientais (poluição do ar, combustíveis sólidos, tabagismo passivo): a exposição à radiação ultravioleta (UV) proveniente do sol é considerada a principal causa do câncer de pele (melanoma e não-melanoma), estando o nível de exposição necessária para desencadear uma tumoração relacionado tanto com os fatores ambientais como o tipo de pele, por exemplo, pessoas negras possuem mais melanina que lhes conferi maior proteção em comparação com as de etnia branca. Há também o câncer ocupacional, relacionado a exposição crônica ou aguda a agentes cancerígenos no ambiente de trabalho, destacando-se as atividades que exigem uma exposição ao sol acentuada, fato diretamente ligado ao câncer de pele. − Saúde sexual e reprodutiva (infecções sexualmente transmissíveis): estima-se que 18% dos casos de câncer sejam causados por agentes infecciosos, dentre eles, o papilomavírus humano (HPV) – responsável pelo câncer do colo do útero -; o Helicobacter pylori – isolada pela primeira vez em 1982, identificando-se a produção de uma reposta inflamatória na mucosa gástrica, que evoluía para o desenvolvimento do carcinoma e linfoma gástrico; os vírus das hepatites B (HBV) e C (HCV) – causadores de câncer nas células hepáticas; vírus Epstein-Barr – responsável pelo Linfoma de Burkitt e carcinoma nasofaringe; Vírus de imunodeficiência humano (HIV), devido à imunodeficiência é comum a ocorrência do Sarcoma de Kaposi e o Linfoma Não-Hodgkin.
    • 23 Segundo dados do INCA (2006, p.24-26), os jovens são o principal grupo de atenção quando se diz respeito à prevenção do câncer, pois são nas primeiras décadas de vida que ocorrem exposições a uma concentração considerável de fatores de risco, como ausência de práticas regulares de exercícios físicos; alimentação inadequada; exposição à radiação ultravioleta sem proteção; uso de tabaco e álcool; falta de vacinação contra alguns agentes infecciosos (como HBV); prática sexual sem preservativo, dentre ouros. Estes fatores comprometem a formação adequada de estruturas e funções fisiológicas, refletindo na vida adulta. Agrupam-se de modo didático os agentes cancerígenos em três categorias de significativa importância na ocorrência do câncer, sendo alvo de diversas pesquisas: fatores biológicos, como os vírus que se integram ao genoma do hospedeiro e causam mutações; agentes físicos, como luz ultra violeta e radiação ionizante; e químicos, como hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, aminas aromáticas, azocomposto, alquilantes, nitrosaminas. Os cancerígenos químicos subdividem-se em: carcinógenos indiretos, que necessitam sofrer algum tipo de modificação química no organismo para tornar-se ativo; carcinógenos diretos, que já possuem um potencial intrínseco, independente de etapas de transformação (FILHO, 2000, p.183-185) (Vide Figura 1). Figura 1. Fonte: Modificado de FILHO, 2000, p. 185. Carcinógeno Direto Carcinógeno Indireto Transformação Inativo Ativo Esquema de Reparo Eficaz Ineficaz Célula Normal Célula Cancerosa Carcinógenos Químicas
    • 24 O metabolismo desses agentes é realizado por tipos variados de enzimas, solúveis ou aquelas associadas a membrana, sendo de grande importância as do citocromo P-450. Essas enzimas normalmente atuam na conversão de toxinas ingeridas em compostos inofensivos de fácil excreção para o meio externo, todavia, sua atividade sob certos compostos químicos resulta em substâncias mutagênicas. Há uma variação significativa quantitativa e qualitativa dessas enzimas de acordo com o tecido, a espécie e o próprio indivíduo, o que influência o sítio e o tipo de tumor desenvolvido. Esse é um argumento significativa para explicar as diferenças quanto à susceptibilidade a diferentes tipos de câncer em populações humanas de locais e períodos distintos (FILHO, 2000, p.183-185). A compreensão do mecanismo de ação de um fator carcinogênico possui importância fundamental para prevenção do câncer, isto é, orientar a escolha de medidas preventivas mais eficientes que levem a redução desse problema de saúde pública, responsável, de acordo com dados do INCA, por sete milhões de mortes ou cerca de 12% dos casos de mortes mundiais por ano.
    • 25 CAPÍTULO 3 – BASE GENÉTICA DO CÂNCER Para entender o processo de carcinogênese, que envolve a perda do controle de proliferação e apoptose, é necessário compreender os mecanismos que, de forma controlada, levam uma célula a aumentar seu material genético e citoplasmático, dividir-se, diferenciar-se e morrer. Uma série de procedimentos realizados no ciclo celular que são desencadeados por um complexo sistema de sinais bioquímicos externos e internos a célula e coordenados por proteínas- chave sintetizadas pela célula, que determinaram como, onde e quando se dará a proliferação celular (CERQUEIRA, 2000, p. 508). 3.1 - Mutação e Câncer O processo de transformação cancerosa irá iniciar-se com a ação de alguns agentes carcinogênicos que ao interagirem com as moléculas receptoras da célula, desencadeando um conjunto de reações que resultam em mutações no material genético controlador de processos cruciais para a célula. Esquematizado na Figura 2: Figura 2. Fonte: FILHO, 2000, P.178 Processos Celulares Básicos
    • 26 Nos organismos multicelulares, as mutações podem subdividir-se em mutações na linhagem germinativa, aquelas transmitidas aos descendentes, ou mutações somáticas, em geral, não são passadas a prole, exceto nos casos de reprodução assexuada, como o brotamento das plantas. As mutações podem ser originadas de modo espontâneo - no momento da duplicação ou divisão celular na mitose ou meiose, sendo provocada por agentes mutagênicos de procedência eletromagnética, química ou biológica - ou induzida - feita em laboratório sob condições controladas (BIO, 1997, p.219-221). Há ainda uma subdivisão das mutações em: gênicas e cromossômicas. As mutações gênicas são alterações na seqüência do DNA (ácido desoxirribonucléico), freqüentemente, durante a replicação do DNA, sendo essas expressivas (com efeito significativo no organismo) quando ocorrem em células somáticas e nas regiões do DNA codificantes de trechos do RNA que participam da tradução (síntese proteica - exon do RNAm). Além do fato de que diferentes seqüências de nucleotídeos no códon do RNAm podem codificar a mesma proteína. Ou seja, o efeito das mutações são "visíveis" quando a interferência na sequência de um códon modifica toda uma codificação de proteínas. As mutações cromossômicas envolvem alterações em cromossomos inteiros ou parte deles, sendo denominadas estruturais, quando envolve modificações nas sequências gênicas ao longo do cromossomo, ou numéricas, envolvendo ganho ou perda de cromossomos inteiros (sendo divididas em euploidias, altera número total de cromossomos, e aneuploides, alteração no número de um específico cromossomo) (BIO, 1997, p.245-251). Na natureza, a sobrevivência de uma espécie segui a lógica da seleção natural, ou seja, aqueles com melhores capacidades de adaptação ao meio possuem melhores chances de sobreviver do que os menos adaptáveis, deixando uma prole mais numerosa com essas “características vantajosas”. A proliferação celular seguirá a mesma lógica, genótipos com capacidade reprodutiva mais rápida e/ou extensiva superam os demais não mutadas, predominando nas gerações celulares seguintes até o momento de serem suplantados por outros mais eficientes (LEWIN, 2001, p. 838-839).
    • 27 As mutações somáticas criaram uma variante que se prolifera mais rápido e melhor adaptável as condições impostas pelo organismo. Por isso, READ (2002, p. 428) aponta uma tendência natural do homem a se “transformar em tumores”, dentro dessa lógica de luta pela sobrevivência. Entretanto, contrariando essa tendência celular, a nível sistêmico há uma poderosa seleção do organismo contra a tumoração. Ou seja, existem dois mecanismos contrários que regem o homem, um que tende a transformação neoplásica (a nível celular) e outro que a suprime (sistêmico), sendo o primeiro em curto prazo e o segundo a longo. Enfatizando-se que a transformação maligna, evolução de uma célula somática até a tumoração, ocorre durante a vida do indivíduo e é iniciada “do zero” a cada novo ser, além disso, os mecanismos anti-tumor de regeneração e reparação de DNA ou, ainda, que levam à autodestruição de células mutadas são transmitidas à prole. Uma mutação isolada dificilmente escapará dos mecanismos defensivos do organismo. Estudos feitos há alguns anos apontam de seis a sete mutações em média para transformar uma célula normal em maligna, a probabilidade que isso ocorra é de 1 em 1029 . Em outras palavras, a carcinogênese ocorrerá se diversas barreiras independentes forem inativadas por mutações. O acúmulo de todas essas mutações levam tempo, por isso o câncer, de forma geral, é uma doença comum em pessoas de idade avançada, há um aumento na probabilidade de mutações acumularem-se no material genético devido a exposição prolongada a fatores mutagênicos. Em células humanas, por exemplo, o intervalo entre a primeira lesão genética e o aparecimento da tumoração é de 10 a 20 anos, isto é, alguns cânceres poderiam ser preveníveis, fato que torna a compreensão do processo de carcinogênese viabilizante de um traçamento de estratégias de intervenções mais expressivas (READ, 2002, p. 427). Dentro dessa concepção pode-se deduzir que o câncer deveria ser extremamente raro, o que de fato não é. Algo facilmente constatado pela estatística de prevalência dessa doença na população. Isso se deve a dois mecanismos ligados à progressão tumoral: 1) As primeiras mutações originam uma população-alvo maior para as mutações seguintes; 2) Determinadas mutações geram instabilidade a nível genômico, alterando DNA e cromossomos, fato que aumenta a taxa geral de mutações, havendo um crescimento seletivo dos clones que acumulam diversas mutações até a formação de um tumor maligno (READ, 2002, p. 428).
    • 28 Por fim, com os avanços da genética e da Biologia Molecular verificou-se um aprofundamento dos conhecimentos sobre a origem e o desenvolvimento das neoplasias. O câncer, em última instância, é iniciado em um substrato molecular das células (DNA), sobre o qual atuam fatores ambientais de ordem variada que levam a sua alteração e, conseqüentemente, nas proteínas codificadas pelas informações nelas contidas. Dentro dessa compreensão o câncer é entendido como uma doença genética. 3.2 Ciclo Celular e a Carcinogênese O ciclo celular compreende o processo que vai desde a gênese da célula, a partir de outra pré-existente, até sua divisão, originando duas novas células. É através desse mecanismo que organismos unicelulares se reproduzem e os multicelulares renovam unidades degradadas e crescem (AMABIS e MARTHO, 1990, P. 111). Tanto o processo de divisão celular (compreende a mitose, divisão do núcleo, e a citocinese, divisão do citoplasma) como a interfase fazem parte do que se denomina como ciclo celular, esquematizado na Figura 3. Na interfase, o primeiro estágio que corresponde a 95% do tempo do ciclo, os filamentos cromossômicos estão descondensados e distribuídos por todo o núcleo (cromatina). O DNA está em intensa atividade de transcrição e o RNA elaborado sintetiza cada vez mais proteínas, com isso a célula cresce e as moléculas de DNA cromossômicas duplicam-se, preparando-se para a divisão. A interfase é convencionalmente dividida em três fases: G1, S e G2. As fases G1 e G2 (em inglês “gap”, intervalo), respectivamente, período anterior à síntese (S), em que ocorrerá intensos processos de elaboração de moléculas e organelas citoplasmáticas levando ao crescimento celular, e posterior, relacionado à síntese de proteínas importantes para a reorganização da cromatina e à construção do aparato necessário à mitose que se dará em seguida. No período “S” (em inglês “synthesis”) haverá a síntese e duplicação do DNA. A mitose ocorrerá após G2, originando no final desse processo duas novas células (AMABIS e MARTHO, 1990, P. 112-118).
    • 29 Valendo ressaltar que diversas células permanecem em G Zero (G0), um estágio de não divisão da célula, por longos períodos, havendo o retorno ao ciclo celular mediante sinais de comando. Outras células, estando terminalmente diferenciadas, são incapazes de retornar ao processo de divisão (BOLSOVER, 2005, p. 269-70). Figura 3. Fonte: Cerqueira, 2000, p. 509. À medida que a célula entra em processo mitótico ocorrem diversos eventos que resultam em profundas mudanças estruturais (Figura 4). Tradicionalmente, esquematiza-se a mitose em quatro etapas (SOARES, 1997, p. 66-70): − Prófase, onde ocorre a duplicação do centríolo e a migração deles para pólos opostos da célula, formando-se entre eles fusos mitóticos ou acromáticos a partir de fibras, o que resulta na deformação do citoesqueleto; ao redor dos centríolos aparecem os ásteres, conjunto de moléculas protéicas; em seguida, os cromossomos espiralam-se, ficando condensados (curtos, grossos e visíveis); na finalização dessa etapa o nucléolo sofrerá dispersão, o envoltório nuclear é desfeito e os cromossomos espalham-se pelo citoplasma; − Metáfase, compreende a organização dos cromossomos na região mediana da célula em contato com as fibras do fuso mitótico pelos seus respectivos centrômeros, ocupando o plano equatorial, fato que denomina essa disposição como placa equatorial; os centrômeros Fases da Interfase
    • 30 dividem-se e as cromátides-irmãs voltadas para pólos opostos iniciam o processo de migração; − Anáfase, as cromátides já separadas são “puxadas” para os pólos das células, migrando pelas fibras do fuso mitótico, ao término desse movimento tem-se uma distribuição eqüitativa do material genético; − Telófase, ao chegar aos pólos os novos cromossomos se desespiralizam; a carioteca reorganiza-se ao redor do material genético e os nucléolos reaparecem. Haverá a cariocinese, divisão do material citoplasmático, e entrará em ação uma força centrípeta que vai separar as duas novas células, pondo fim ao ciclo celular. Figura 4. Fonte: SOARES, 1997, p. 67. Dentro desses complexos eventos, o foco para compreender o processo de carcinogênese pode ser, de modo simplista, resumido na seguinte questão: Como todos esses processos de grandes mudanças estruturais, que ocorrem em um curto espaço de tempo, são coordenados? Isto é, que mecanismos controlam a proliferação celular e, conseqüentemente, no processo de carcinogênese são crucialmente afetados? CICLO CELULAR
    • 31 Primeiramente, deve-se enfatizar que o crescimento celular organizado acontecerá mediante dois eventos cruciais do ciclo: a duplicação do DNA, no período de interfase, e a distribuição eqüitativa do material genético entre as duas novas células que estarão sendo formadas, na anáfase da mitose, garantindo assim a transmissão integral do genoma (CERQUEIRA, 2000, p.509). Para que isso ocorra existem mecanismos sensíveis que detectam as condições nutricionais do meio e a presença de DNA não replicado ou danificado, esses são os denominados pontos de controle ou restrição do ciclo celular. 3.3 - Regulação do Ciclo Celular A regulação do ciclo celular está vinculada a dois grupos básicos de estímulos: externos (extrínsecos, mecanismos relacionados com às condições do ambiente tecidual) e internos a célula (intrínsecos, reações que visam adequar o ambiente celular interna às mensagens externas) (PINHO, 2005, p. 105). O ciclo celular de cada célula é ordenado por mecanismos regionais regulatórios, atuantes de forma combinada e interativa a fim de preservar o equilíbrio tecidual, o princípio de funcionamento das células reside na submissão de seu próprio metabolismo em prol da homeostase do organismo. Em se tratando do nível extrínseco, a presença de fatores estimulantes ou a ausência de fatores repressores da proliferação celular são significantemente determinantes da formação tumoral. O sistema de comunicação entre as células é mediado por determinadas moléculas que se ligaram a proteínas receptoras situadas nas membranas das células-alvo, desencadeando modificações bioquímicas no segmento intracelular que resultaram, em última instância, em interferências na atividade nuclear, ativando ou não fatores que regulam a codificação pelos genes de proteínas atuantes em situações requeridas pelo ligante externo. Essas são denominadas proteínas sinalizadoras (por exemplo, os fatores de crescimento) (PINHO, 2005, 44-48). Os fatores de crescimento atuam como mitógenos, ou seja, estimulam a entrada da célula no ciclo celular e quando ausentes produziram um efeito freante da atividade mitótica, sendo um
    • 32 tipo de mediador, predominantemente, regional, atuando sobre três vias: parácrina (liberada por células locais), autócrina (relacionado ao próprio controle celular interno) e a existência em membranas celulares, fato com que sua ativação se dê mediante contato entre células adjacentes. Os principais fatores de crescimento identificados são os: fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF); fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); fator de crescimento derivado da placenta (PIGF); fator de crescimento epidérmico (EGF); fator de crescimento fibroblástico (FGF); fator de crescimento tipo-insulina (IGF); fator de crescimento do hepatócrito (HGF); fator de crescimento do nervo (NGF), dentre outros (PINHO, 2005, p. 48-54). Recebido o estímulo externo, o próximo nível é da regulação interna do ciclo celular, cujo princípio básico é a cascata de reações de fosforilação (adição de grupamento fosfato), desfosforilação, síntese e degradação, realizadas por proteínas que respondem às condições ambientais controlando não apenas a proliferação, mas a diferenciação e morte celular. Os mecanismos que permitem a passagem de um período do ciclo celular para outro não estão totalmente elucidados. Entretanto, são reconhecidos três momentos cruciais, que determinam se a célula seguirá ou não no ciclo, denominados “pontos de restrição” ou “checkpoints” (CERQUEIRA, 2000, p. 509). Intervalos correspondentes a pontos de controle de qualidade nos quais sensíveis lesões no DNA são identificadas e desencadeiam cascatas de sinais bloqueadores da progressão do ciclo, ativando processos de reparação ou, caso necessário, apoptose (TAJARA, 2004, p.66). O mais importante dos pontos de restrição, também conhecido como “START”, ocorre em G1, estando relacionado com a entrada da célula no período S, onde ocorrerá a duplicação do DNA, funcionando como um sensor protéico que monitorará a cromatina na busca por DNA parcialmente duplicado, quebrado ou alterado (CERQUEIRA, 2000, p. 508). Os outros pontos de restrição atuarão na passagem de S para G2 e de G2 para M, prevenindo a progressão de danos para a mitose. Dessa forma, a célula somente iniciará seu processo de divisão se o DNA estiver totalmente duplicado. Ações ineficientes nesses pontos levam ao acúmulo de mutações diretamente relacionadas com o aumento da probabilidade de mal-formações de desenvolvimento e câncer (TAJARA, 2004, p. 67).
    • 33 Na década de 60, experimentos realizados por Paul Nurse, Tim Hunt e Leland Hartwell constataram a existência de moléculas ativadoras do ciclo celular. O experimento consistiu na injeção de citosol de uma célula em processo mitótico em uma interfásica, fazendo com que a célula que estava em G2 entrasse em mitose, o que indicou a presença de um constituinte do citoplasma responsável por controlar o comportamento do núcleo. Esse fator recebeu o nome de fator promotor de fase M ou MPF, um complexo de duas proteínas – quinase dependente de ciclina (CDK) e ciclinas. Esse trabalho de identificação bioquímica do MPF levou vinte anos e resultou na premiação dos cientistas com o Nobel de 2001 em fisiologia e medicina (BOLSOVER, 2005, p.270-72). As ciclinas e as quinases dependentes de ciclinas são proteínas responsáveis por regular os pontos de restrição. O complexo ativo ciclina/CDK impulsiona a progressão do ciclo e são inibidas por outras proteínas, ligadas a detecção de condições desfavoráveis do meio, como baixo nível de nutrientes ou danos não reparados no DNA, impedindo que a célula passe de um período para outro e ingresse na mitose (CERQUEIRA, 2000, p. 509). As células animais possuem vários tipos de ciclinas e CDKs que se combinam de formas diversificadas e atuam em fases específicas do ciclo celular (Figura 5). Por exemplo, o início na fase G1 é regulado pelos complexos CDK4 e CDK6 e ciclinas do tipo D (D1, D2 e D3), em seguida, no ponto de restrição, ocorre à passagem do processo de regulação para a ciclina E ligada a CDK2 (TAJARA, 2004, p. 67). Figura 5. Fonte: Tajara, 2004, p.67.
    • 34 A interação com células vizinhas e a resposta a estímulos externos, como fatores de crescimento, hormônios, indutores e outros, irão inibir ou estimular a proliferação ou diferenciação celular, podendo-se esquematizar o processo de crescimento adequado da seguinte forma (Figura 6): Figura 6. Esquema simplificado (Modificado de Cerqueira, 2000, p. 509) Tajara (2004, p.67) define alguns mecanismos moleculares básicos para a regulação do ciclo: a formação de complexos CDK-ciclina mediante a síntese e degradação de seus compostos e, especificamente para a CDK, as reações de fosforilação e desfosforilação. A ciclina interagirá com CDK, resultando no descolamento de um segmento da molécula, denominado alça “T”, possibilitando a ligação de uma molécula residual que ativará a função enzimática. Além disso, para tornar-se um complexo ativo, deve suceder reações de desfosforilação na treonina 14 e da tirosina 15 (próximas ao terminal amino) e fosforilação da treonina 160/161 (localizada na alça T). FATOR EXTERNO (Interagir com receptores da célula, havendo o reconhecimento da mensagem) TRANSDUÇÃO DE SINAL (Consiste numa série de reações desencadeadas pelo estímulo que irão ativar ou inativar diversas proteínas) FATORES DE TRANSCRIÇÃO (O produto dessas reações ligam-se ao DNA) ATIVAÇÃO Genes específicos que codificam ciclinas e CDK Interações Intracelulares
    • 35 Uma célula em G0 o recebe um estímulo externo que se ligará aos receptores, junto a este, fixada à membrana pela face interna da célula, existe uma proteína significativamente ligada à divisão e diferenciação celular, denominada ras. Uma vez ativada esta proteína realizará a transdução do sinal, transmitindo o estímulo para o núcleo, levando a uma elevação dos níveis de ciclinas que se ligaram as quinases formando o Complexo CdK-ciclina, anteriormente mencionados (PINHO, 2005, p. 118-119). Esse complexo inativará a ação repressora da proliferação das proteínas Rb, cuja ação mantem a célula na fase G1, impedindo replicação do DNA. Reprimida a ação da Rb, a atividade da proteína E2F é acionada, atuando como fator de transcrição necessário para a ativação de uma série de genes codificantes de proteínas viabilizantes da evolução do ciclo, como a expressão elevada a ciclina E que permite a passagem de G1/S (PINHO, 2005, p. 118-119). Alterações nos genes que sintetizam moléculas que são substratos dessas proteínas-chave reguladoras do ponto de checagem (Figura 5 apresenta complexos ativos e respectivos substratos) tornam autônoma a transição de uma fase para outra, menos dependentes de sinais externos e insensíveis a controles internos. Por isso o processo de carcinogênese é associado à inibição dos genes supressores de tumores, que tem como tarefa básica à codificação de proteínas que mantêm a célula em G0, ou seja, fora do ciclo mitótico, fato que inviabiliza a transformação maligna; a ativação dos oncogenes (versões mutadas dos proto-oncogenes) relacionados com a proliferação celular; e, existe ainda, aqueles que atuam no reparo das lesões do DNA (JUNQUEIRA E CARNEIRO, 2005, p. 293-297).
    • 36 3.4- Genes do Câncer 3.4.1.Da informação gênica à proteína Genes são partículas localizadas nos cromossomos que contêm as informações genéticas dos indivíduos, sendo transmitidas hereditariamente. A natureza química do material genético foi descoberta a partir de 1869, quando se identificou no núcleo das células grandes moléculas, denominadas nucleínas, cuja característica ácida foi verificada anos depois, passando a denominá-las ácidos nucléicos (Lopes, 1997, p.16-17). No século XX, identificaram-se dois tipos de ácidos nucléicos: ácidos desoxirribonucléicos (DNA) e ácido ribonucléico (RNA). Os ácidos nucléicos são macromoléculas formadas por nucleotídeos, unidades constituídas por base nitrogenada, podendo ser do tipo purínica (adenina e guanina) ou pirimidínica (timina e citosina); um grupo fosfato e uma pentose (açúcar de cinco carbonos), no DNA esse é desoxirribose e no RNA ribose (De Robertis, 1998, 225-227). O DNA é constituído por duas cadeias de polinucleotídeos em forma de dupla hélice em torno de um mesmo eixo, que são unidas nas faces internas por ligações do tipo pontes de hidrogênio entre as bases nitrogenadas, sendo que o pareamento é sempre feito entre adenina- timina e citosina-guanina (Figura 7). Na região lateral do DNA, a interação entre os nucleotídeos de cada fita, é feito por ligações fosfodiéster, em que o fosfato está ligado ao carbono 3’ da pentose de um nucleotídeo e ao carbono 5’ de outro, os grupos restantes conferem ao ácido nucléico suas propriedades ácidas, fazendo com que sejam moléculas basófilas, e possibilitam ligações com outras moléculas básicas (De Robertis, 1998, p. 235-238).
    • 37 Figura 7. Fonte: De Robertis, 1998, p. 22. O RNA se diferencia do anterior apenas pela presença de uma ribose ao invés de uma desoxirribose – sendo a única diferença entre essas a presença de um átomo de oxigênio a menos na desoxirribose – e nas bases pirimidínicas, uma uracila no lugar da timina, além de possuir uma única fita (De Robertis, 1998, p.267-269). A partir dessa concepção, criou-se a definição dos cromossomos como longas moléculas de DNA associadas a proteínas (histonas). O DNA se encontra no núcleo, constituindo os cromossomos, e uma pequena parte está presente no citoplasma, na mitocôndria e no cloroplasto. Já o RNA localiza-se tanto no núcleo, onde é elaborado, como no citoplasma, onde dirige a síntese protéica (Amabis, 2002, p. 437-438). As porções específicas de DNA, denominadas genes, contém as informações que irão determinar a seqüência de aminoácidos de uma proteína, em outras palavras, o gene é o elemento mínimo capaz de transmitir as informações básicas necessárias para a composição do organismo. De forma analógica, todas estas informações estão estruturadas como se fossem uma “escrita”, Bases Nitrogenadas dos Ácidos Nucléicos
    • 38 em que os nucleotídeos irão representar letras (no caso, quatro letras: adenina, timina, guanina e citosina) que colocadas em combinações diferentes determinam diversas palavras (ao todo são 20 aminoácidos diferentes), geradoras de milhares de seqüências de proteínas. O processo de síntese protéica compreende duas etapas: transcrição e tradução (AMABIS, 2002, p. 439-442). Como a seqüência de nucleotídeos de um DNA não possui capacidade de auto leitura do código, há a necessidade de que alguns elementos atuem sobre ela para que essas informações sejam expressas. As duas fitas de DNA estão ligadas de forma estável, tendo todos os sítios químicos devidamente ocupados de acordo com a ordem de pareamento das bases nitrogenadas, inviabilizando com isso reações. A primeira etapa do processo de transcrição é a separação das duas fitas, sendo desnecessário a separação de toda extensão do DNA, apenas um segmento possibilita a síntese de proteínas. A tarefa de separação cabe a enzima RNA polimerase, deslizando sobre a seqüência de nucleotídeos do DNA até encontrar a região promotora, que determinará o início do processo de codificação. A sinalização do fim da ação da RNA polimerase ocorrerá no momento de encontro com a região terminadora, todavia, a função dessa enzima não é simplesmente abrir as fitas de DNA, ela é a principal responsável pelo processo de transcrição do código genético, elaborando o RNA (AMABIS, 2002, p. 439). DNA RNA PROTEÍNA A função do RNA é transformar as informações contidas no DNA em proteínas. Para desempenhar tal função o ácido ribonucléico apresenta três tipos diferentes de moléculas: RNA mensageiro (RNAm), RNA transportador (RNAt) e RNA ribossomal (RNAr). A passagem gradual da RNA polimerase sobre o DNA catalisará a ocupação dos sítios livres por nucleotídeos de RNA (semelhantes ao DNA, exceto pela presença de ribose ao invés de desoxirribose), seguindo uma ordem de pareamento determinada pelas bases nitrogenadas (A-U e G-C). Desta forma, transcreve-se uma “imagem espelho” da seqüência do DNA, cuja única distinção é a uracila que substitui a timina, denominada transcrito primário (De Robertis, 1998, p.268-269). O transcrito primário será uma cópia idêntica do DNA, contento segmentos codificante (exons) e não-codificante (introns). Para que uma molécula de RNA sintetize completamente
    • 39 proteínas é necessário sofrer a remoção dos trechos introns existentes, através de um processo denominado splicing. Ao final, restará apenas uma sequência de exons, denominada RNA mensageiro (AMABIS,2002, p. 438). A segunda etapa da síntese protéica é a tradução da “mensagem” contida no RNAm em proteínas, deixando o núcleo em direção ao citoplasma. Os aminoácidos originados da degradação de proteínas não se ligam diretamente ao RNAm, mas ao RNA transportador (RNAt), sendo a ligação entre os RNA's feita entre o códon do RNAm e o anti-códon do RNAt (a cada trinca de bases nitrigenadas têm-se um códon, as quatro bases nitrogenadas reunidas três a três formaram 64 códons diferentes, algumas delas codificam o mesmo aminoácido, como, por exemplo, a leucina, associada aos códons UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG.). Cada aminoácido que estruturará uma proteína é definido pelo códon pertencente a seqüência formadora do RNAm. A correspondência entre códons e os aminoácidos que eles determinam constitui o código genético (AMABIS, 2002, p. 440). O RNA ribossômico, estrutura complexa formada pela combinação de ribossomo, RNA e determinadas proteínas, proporciona sustentação para que ocorram as reações químicas ligadas a síntese protéica, permitindo o encontro do RNAm com o RNAt. À medida que o ribossoma se desloca sobre o RNAm, traduzindo a mensagem gênica em cadeias polipeptídicas ou proteínas (Amabis, 2002, p. 442). As proteínas representam, após a água, a maior parte da matéria constituinte do organismo, desempenham papéis diversificados no organismo, além dos aspectos nutricionais. Todas as ações que permitem a existência de um organismo são realizadas através de inúmeras proteínas, incluindo hormônios, anticorpos, controladores de divisão celular, mediadores dos estímulos nervosos, contrações musculares, entre outras (Soares, 1997, p.23-28). A distinção existente entre as proteínas reside em variações nas seqüências dos 20 aminoácidos. Isso permite que estas substâncias assumam diversas funções no organismo: enzimas (catalisadoras – aceleradoras - de reações químicas de formação e quebra de ligações covalentes entre as moléculas, necessárias para manter o funcionamento do organismo);
    • 40 proteínas estruturantes (por exemplo, os tecidos que promovem a sustentação são formados por colágeno e elastina; o epitélio é formado por proteínas como ceratina, que é ainda um importante componente dos cabelos); proteínas transportadoras (essenciais à homeostase, realizando o transporte de pequenas moléculas e íons, como a hemoglobina que transporta oxigênio; a albumina e transferrina, transportadores, respectivamente, de lipídios e ferro; o transporte de glicose para dentro e fora das células por proteínas presentes na membrana celular); proteínas motrizes (viabilizantes do movimento, sendo o principal exemplo a miosina, responsável pela contração das células musculares esqueléticas); proteínas sinalizadoras (responsáveis pela emissão de sinais entre os diferentes níveis celulares, é o caso dos hormônios); proteínas receptoras (formadoras de sítios receptores freqüentemente na membrana celular que se ligam aos elementos sinalizadores, desencadeando uma série de reações no interior da célula); proteínas de defesa (as principais são as imunoglobulinas ou anticorpos, elementos básicos da defesa do organismo que se ligaram a moléculas “estranhas” a esse, levando à sua destruição e produzindo de memória imunológica para otimizar futuras identificações e processos defensivos); proteínas de reserva (muitas moléculas são armazenadas no organismo por meio de ligações à proteínas, como é o caso do ferro no fígado através de ligações a proteínas); proteínas regulatórias de genes (são proteínas extremamente importantes que funcionaram como interruptores, ativando ou inibindo a atividade dos genes e, conseqüentemente, a síntese de novas proteínas (Soares, 1997, p. 23-28). A compreensão do processo de carcinogênese está intimamente ligada aos mecanismos pelos quais as proteínas atuam, viabilizando o funcionamento do organismo como um todo, desde o metabolismo interno celular até a atividade funcional de tecidos, órgãos e demais estruturas complexas. O “princípio” básico é o seguinte: “toda ação no organismo é controlada por reações químicas provocadas pelo contato direto entre moléculas, sendo estas em sua grande maioria compostas por proteínas” (PINHO, 2005, p. 43). Contudo, deve-se analisar um pouco mais além, focalizando os genes, que em primeira instância possuem a informação codificantes de proteínas. Diversos genes estão ligados à transformação maligna, entretanto, aqueles de papéis mais expressivos podem ser agrupados em duas classes: 1) genes cujos produtos favorecem o crescimento celular desordenado, que não atende aos mecanismos de controle celular, oncogenes;
    • 41 2) genes que freiam o crescimento e diferenciação, mantendo as células dentro dos parâmetros fisiológicos estáveis, pertencendo a essa categoria os genes supressores de tumores, genes de reparo de DNA, genes controladores da apoptose, dentre outros. O processo de carcinogênese é iniciado quando ocorrem alterações qualitativas e quantitativas nesses genes, sendo que na maioria dos tumores os principais a serem afetados são os oncogenes e genes supressores de tumores (FILHO, 2000, p.169-172; Junqueira e Carneiro, 2005, p. 294). 3.4.2 - Oncogenes e Genes Supressores de Tumores Os eventos celulares descritos nos anteriores capítulos são determinados pelo estímulo ou inibição da ação de proteínas, cuja concentração deve-se a genes específicos. A seguir, uma revisão esquemática dos eventos que ocorrem na célula relacionados ao ciclo celular, em condições normais: − A ação de fatores de crescimento que se ligam aos receptores na membrana celular ativa a proteína ras que estimula a saída da fase G-0, fazendo com que a célula entre em processo mitótico; − Ocorre uma cascata de transdução de sinal, reações no citoplasma da célula, que atuam sobre o núcleo, genes codificadores de enzimas controladoras do ciclo; − Elevação do nível de ciclinas que se ligaram a quinases respectivas, conformando o complexo Ciclina- Cdk, cuja ação consiste na desativação da proteína rb, freadora da proliferação celular através da inibição da proteína E2F (uma espécie de fator de transcrição, estimulante da codificação de determinadas proteínas); − A proteína E2F influência a expressão da Ciclina E, principal fator capaz de permitir a entrada da célula em S, etapa de replicação do DNA; − Caso exista alguma anormalidade, ocorre a elevação do nível intracelular de proteína p53, que por sua vez ativa a proteína p21, inibidora da ação do complexo Ciclinas-CdK, paralisando a continuidade do ciclo e impedindo a entrada na etapa de duplicação do DNA; − Proteínas reparadoras de alterações no DNA atuam sobre áreas mutadas, retirando-as ou substituindo-as por seqüências corretas. Contudo, se as lesões forem extensas e de difícil reparação, ativa-se a família de enzimas caspases, gerenciadoras do processo de apoptose
    • 42 através da autodigestão da célula. Os restos celulares são fagocitados por células de defesa ou adjacentes. Pode-se observar com a descrição geral do processo de proliferação celular que todas as ações estão extremamente interligadas, tendo as proteínas papel fundamental. Qualquer defeito no funcionamento delas resulta em catastróficos erros no processo mitótico. Como as alterações nessas proteínas são resultantes de mutações em genes específicos, logo, defeitos na integralidade gênica são decisivos para o processo de carcinogênese. Tendo também papel significativo na transformação maligna a ineficiência de mecanismos de reparo do DNA. De acordo com o processo acima descrito, podem-se definir dois grupos distintos: proteínas que exercem ação estimulante de ciclo, como as ciclinas, a proteína ras, a proteínas E2F, dentre outras; e as inibidoras, como as proteínas rb, p53 e p21. O equilíbrio proliferativo ocorre devido à interação entre estas proteínas de ações opostas. Caso haja um predomínio da ação de algum grupo, observa-se, por exemplo, uma tendência a um número maior de divisões celulares; uma paralisação do ciclo celular; ou, caso a reparação não seja efetivada, haverá maior ocorrência de células em processo de apoptose (PINHO, 2005, p.130). A carcinogênese baseia-se em alterações no equilíbrio protéico estabelecido devido a presença de alterações (mutações) nos genes responsáveis pela expressão das proteínas estimuladoras e inibidoras do ciclo. Uma analogia clássica adotada por diversos autores é a de que o ciclo celular pode ser entendido como um automóvel, em que erros no freio ou no acelerador resultam na perda do controle do carro, fato semelhante ao que ocorre na divisão celular, a presença exagerada de uma ou outra classe de proteínas devido a um processo patogênico levam a uma proliferação descontrolada, processo característico das neoplasias (READ, 2002, p. 428). As proteínas estimuladoras submetidas a este tipo de processo são denominadas oncoproteínas e seus respectivos genes como oncogenes, ressaltando-se que esses genes em condições proliferativas normais (sem mutações) são denominados proto-oncogenes. Em contrapartida, a ausência de proteínas inibidoras do ciclo celular em decorrência de mutações em
    • 43 genes denominados genes supressores de tumores gera um desequilibro tecidual resultante do predomínio de fatores estimuladores de divisões celulares, levando também ao surgimento de neoplasias (READ, 2002, p. 428). O processo carcinogênico é iniciado, na maioria dos tumores, quando tanto os oncogenes como os genes supressores de tumor sofrem alterações. Valendo ressaltar que estes são os principais, outros genes também passam por mutações que contribuem para a transformação de uma célula normal em maligna. As vias genéticas do câncer são diversas e complexas (Junqueira e Carneiro, 2000, p. 294). ONCOGENES O termo oncogenes denomina um conjunto de genes que codificam proteínas cuja atuação fisiológica está diretamente relacionadas ao incentivo a proliferação celular. Uma vez submetidos a cumulativas alterações, irão produzir excessivos estímulos à divisão celular, fato que resulta em um processo proliferativo descontrolado, isto é, que não atua em conformidade com os fatores de controle do organismo (PINHO, 2005, p.131). A princípio, acreditava-se que os oncogenes eram originários de unidades virais, sendo transmitidas a células eucariontes por meio de processos infecciosos, sendo entendido da seguinte forma: um vírus retrovírus (com genoma RNA), ao realizar a transcriptase reversa - síntese de RNA a partir da informação presente no ácido ribonucléico - incorpora o provírus (DNA elaborado no processo anteriormente mencionado) ao material genético do hospedeiro. Descobriu-se, algum tempo depois, que o RNA do vírus é uma cópia, em muitos casos, defeituosa do DNA do hospedeiro obtida em infecções anteriores, o que indicou a presença originária do oncogene (ou o proto-oncogene, a versão não alterada) no genoma do homem (Junqueira e Carneiro, 2000, p. 297). Posteriormente, isolaram-se os oncogenes, permitindo a clonagem e a obtenção de quantidades suficientes em forma pura para o seqüênciamento (viabilizando a comparação com outros genes) e para o uso como sonda (facilitando o rastreamento dos oncogenes em unidades
    • 44 celulares). O uso de tais procedimentos permitiu a identificação de diversos oncogenes, que atualmente já formam uma categoria com dezenas de tipos, vide Quadro 3, (2000, p.170) Proto-oncogenes Função Mecanismo Neoplasia associada ERB-B1 Receptor para fator de crescimento epidérmico Expressão aumentada Carcinoma de células escamosas do pulmão ERB-B2 Receptor para fator de crescimento epidérmico Amplificação Câncer de mama, ovário, estômago e pulmão ERB-B3 Receptor para fator de crescimento epidérmico Expressão aumentada Câncer de mama FMS Receptor para fator de crescimento Mutação pontual Leucemia H-RAS Transdução de sinal Mutação pontual Carcinoma de tireóide K-RAS Transdução de sinal Mutação pontual Carcinoma de cólon, pulmão, pâncreas N-RAS Transdução de sinal Mutação pontual Leucemias linfóides e mielóides agudas ABL Transdução de sinal Translocação Leucemia Mielóide Crônica, Leucemia Linfoblástica Aguda MYC Ativação de transcrição Translocação Linfoma de Burkitt N-MYC Ativação de transcrição Amplificação Neuroblastoma e carcinoma de pequenas células do pulmão L-MYC Ativação de transcrição Amplificação Carcinoma de pequenas células do pulmão Quadro 3 elaborado a partir de informações de SILVA, R. L. Oncogenes e Genes Supressores de Tumor. Int: FERREIRA, C; ROCHA, J. C. Oncologia Molecular. São Paulo: Editora Atheneu, 2004. ONCOGENES
    • 45 O estudo da biologia molecular do câncer foca os diferentes tipos de tumores, visando a identificação de oncoproteínas e proteínas inibidoras comprometidas nesses processos que levam ao estado de proliferação descontrolada. Pode-se agrupar as oncoproteínas em três grupos de acordo com suas atuações na sucessão de eventos que ocorrem no ciclo (PINHO, 2005, p.131- 133). Oncoproteínas de membrana: O início da divisão celular ocorrerá mediante estímulo de sinais extracelulares, sendo que já nesse nível há condições para que a célula sofra um processo proliferativo descontrolado. Várias evidências comprovam que em diferentes cânceres os principais fatores oncogênicos encontram-se em alterações presentes em proteínas codificantes de receptores de membrana denominados EGFR (a tradução significa receptora de fator de crescimento epitelial). A produção de estímulos que geram uma divisão excessiva dar-se por duas vias: 1) A ocorrência de mutações que ativem permanentemente este receptor, fato que o torna independente da ligação de fatores de crescimento à membrana, como ocorre em carcinomas de mama, pulmão e ovário; 2) Expressão exagerada de EGRF, aumentando o número destes receptores na membrana, ampliando, conseqüentemente, o estímulo à divisão celular, como em tumores mais agressivos, como melanomas, carcinomas de bexiga, dentre outros. Outro receptor é o Erb-2, cujo aumento de expressão representam um prognóstico negativo para o câncer de mama, sendo importante para a escolha de uma terapêutica. Oncoproteínas de transdução de sinal Levam o estímulo dos receptores da membrana até o núcleo. Alterações nestas proteínas resultam em permanentes estados de proliferação celular, mesmo na ausência de estímulos externos. A família Ras são as principais proteínas de transdução de sinal, composta por três proteínas denominadas h-ras, k-ras e n-ras. Em condições normais, a ausência de estimulação inativa a cascata citoplasmática de reações desencadeadas pela proteína ras e o ciclo celular não é
    • 46 iniciado. Em cerca de 30% dos tumores malignos ocorre mutações em proteínas ras, fato que provoca um estado de permanente ativação, por isso esta oncoproteína possui grande importância clínica. Oncoproteínas nucleares Os conjuntos de reações transmitidas pelas proteínas de transdução irão evoluir até a interação com proteínas contidas no interior do núcleo, atuantes como fatores de transcrição, ou seja, estimulam a expressão de genes que produziram proteínas necessárias para a progressão do ciclo celular. Três fatores de transcrição desempenham importante papel na divisão celular: c- myc, c-fos e c-jun. Alterações nessas proteínas geram uma permanente ativação dessas, representando um grande aumento no número de mitoses. Como essas mutações são comuns em uma grande variedade de tumores, as linhas de estudo voltadas para essas proteínas são de grande expressão dentro do estudo da biologia molecular do câncer. Genes Supressores de Tumores O papel das proteínas supressoras de tumor na transformação maligna não reside em uma ativação inadequada, como ocorre com as oncoproteínas. Sua importância está relacionada com a ausência de proteínas inibidoras do ciclo, conseqüente da inativação de seus genes (Junqueira e Carneiro, 2000, p. 297). As células somáticas que compõe o organismo humano são diplóides, isto é, dispõe de duas cópias de cada gene existente no DNA presentes no mesmo par de cromossomos homólogos (um de origem materna e o outro paterna, que não possuem necessariamente mesma informação, mas codificam determinada característica). Nos oncogenes apenas a alteração de um alelo ocasiona a constante e indevida produção de proteínas estimuladoras do ciclo celular, em contrapartida, a atividade dos genes supressores de tumores somente é inativada quando ambos
    • 47 os alelos sofre mutações ou estão ausentes, sendo considerados recessivos. Ou seja, os oncogenes, ao contrário dos genes supressores de tumores, são dominantes, bastando apenas uma cópia deles no genoma para desencadear uma transformação maligna, mesmo quando o outro par é normal (Junqueira e Carneiro, 2000, p. 297). A ação desses genes fora observada, pela primeira vez, em culturas de células onde a fusão de unidades malignas com normais originou um híbrido (resultado do cruzamento) sem malignidade, constatando a presença de algum tipo de proteína “inibidora” de mutação. Posteriormente, estudos feitos com o genoma de certos tumores indicaram a ausência de um pequeno segmento de cromossomo, levando ao questionamento da função das proteínas codificadas por esse grupamento de genes nas células normais. Essas pesquisas mostraram uma função anti-cancerígena desses grupamentos de aminoácidos, havendo a tumoração apenas na ausência ou na apresentação defeituosa dos genes no par de cromossomos homólogos, variando o cromossomo afetado de acordo com o tipo de tumor (Junqueira e Carneiro, 2000, p. 293-94). Uma análise dos aspectos biomoleculares de diferentes tumores apontam para um papel importante de genes inativadores na proliferação na evolução carcinogênica, dentre eles os principais são: Gene RB1 Gene possuído da informação para a codificação da proteína rb, denominação proveniente da associação deste com o tumor de retina (retinoblastoma), que em algumas famílias possui caráter hereditário, apesar da ocorrência de casos de forma esporádica. Afeta principalmente crianças, visto que nos adultos as células que originam este tumor não realizam mitose, estão em G-0. (PINHO, 2005, p.131) Em todas as células do indivíduo com essa característica hereditária, não somente na retina, observa-se a deleção de um trecho do cromossomo 13, enquanto o outro permanece intacto. Isso não significa necessariamente que uma pessoa com essa característica vá desenvolver o tumor, pois o cromossomo intacto pode produzir quantidades suficientes de
    • 48 proteínas supressoras. Entretanto, esse defeito sistemático leva a uma tendência maior ao desenvolvimento dessa neoplasia, já que são necessárias alterações em apenas um cromossomo do par. Já na população de forma geral é mais raro, pois a probabilidade de ocorrem mutações nos dois genes Rb das duas retinas é baixa (Junqueira e Carneiro, 2000, p.298). Sua ação fisiológica consiste na inibição das proteínas E2F, cuja função consiste na ativação do processo de transcrição de genes responsáveis pela progressão do ciclo, expressando proteínas necessárias para a passagem da fase G1 para S do ciclo, como por exemplo, a ciclina E, timidilato sintetase, dentre outras (PINHO, 2005, p.131). A inativação dos dois alelos do gene Rb1 levará a não produção da proteína rb e uma perda do controle da atividade proliferativa. Essas alterações são observadas, além dos retinoblastomas, em osteossarcomas, sarcomas de partes moles, leucemias, câncer de mama, esôfago, próstata, rins, carcinomas pulomonares de pequenas células (PINHO, 2005, p.131). Gene P53 A denominação desse gene provém do fato de que a proteína p53, por ele codificada, possui peso molecular de 53 kD (quilodáltons). A proteína p53 é reconhecida como um elemento fundamental para o ciclo celular, exercendo importante influência na transição da fase G1 para S como também na passagem de G2 para mitose. Sua função consiste na verificação do genoma em busca de lesões, evitando o acúmulo de mutações e a presença dessas nas células-filhas. Para isso promove uma “parada” no ciclo, a fim de promover a reparação do DNA ou desencadear um processo de morte celular visando à destruição das células caso a reparação apresente-se ineficaz (PINHO, 2005, p.134). A elevação dos níveis intracelulares da proteína p53 ocorre por dois motivos: 1) lesões no DNA causadas por agentes mutagênicos, como radiações ultravioletas e agentes químicos; 2) o stress presente no organismo por aumento de temperatura ou processo inflamatórios, por exemplo, que funcionam como estímulos à produção de p53. Além disso, observa-se em
    • 49 determinadas situações a ação inibidora de proliferação celular da proteína p53 em conseqüência da adesão de células adjacentes (PINHO, 2005, p.134). A participação da proteína p53 nas diversas vias bioquímicas do ciclo celular dar-se mediante diferentes associações com outras proteínas, como ATM, p73, Bax, Bcl-2 e, a de maior destaque, a proteína p21 - a principal mediadora da proteína p53, que atuará inibindo as proteínas ciclino-dependentes (CDKs), paralisando o ciclo celular (PINHO, 2005, p.134). A ausência de um dos alelos desse gene determina a Síndrome de Li-Fraumeni. Indivíduos com essa síndrome apresentam uma tendência alta a desenvolver vários tipos de tumores. Experimentos em camundongos sem os genes p53 demonstraram que ocorre um desenvolvimento normal durante o período embrionário, contudo, morrem em um curto espaço de tempo após o nascimento, vítimas de uma grande variedade de tumores (Junqueira e Carneiro, 2000, p. 298). Esse gene está relacionado com a maioria dos tumores, sua identificação em transformações malignas é de extrema importância para viabilizar a ação de terapias anti- neoplásias como quimioterapia e radioterapia. Tratamentos radioterápicos além de afetar células cancerosas também agem sobre as normais, contudo, pesquisas mostraram que as normais são mais resistentes, pois interrompem o ciclo para a correção dos trechos de DNA danificados, em contrapartida, as cancerosas não possuem mecanismos de restauração eficientes. Estando o p53 funcional, a célula evoluirá para a apoptose e serão eliminadas. No caso de algumas células cancerosas, o gene p53 danificado faz com que sejam mais resistentes as ações dos agentes indutores de morte celular (PINHO, 2000, p.119-121). Gene APC Responsável pela codificação da proteína APC (Adenomatous Polyposis Coli ou polipose adenomatosa do cólon), alterações neste gene estão relacionadas com a polipose adenomatosa familiar (PAF) que é precursor do câncer colorretal, sendo a principal característica gênica da polipose é a herança genética. Encontradas nas células epiteliais secretoras que revestem o cólon,
    • 50 possuem importante atuação no controle na velocidade de descamação das células para a luz intestinal, regulando a adesão, migração e apoptose celular, atuando de forma mais direta na regulação do nível de proteína β-catenina. As células com mutações que reduzem a concentração de proteína APC tendem a ter altos níveis de β-catenina, que ficando livre se ligará a outras proteínas, algumas delas fatores de transcrição que promovem a proliferação tumoral. Nas células normais, as proteínas APC suprimem a proliferação celular, agindo também na promoção da apoptose. Ou seja, estas proteínas regulam forças apostas de proliferação e morte celular dentro do epitélio intestinal (PINHO, 2005, p.135-136). Basta a mutação de um dos trechos do par de cromossomos 5 onde se encontra esse gene para haver um aumento na probabilidade de uma transformação maligna, favorecida também pelo fato das células do pólipo normalmente terem alta taxa de multiplicação por causa da constante renovação. No princípio há um aumento no número de células fazendo com que muitos pequenos tumores benignos se formem no epitélio intestinal, denominados pólipos ou adenomas. Embora sejam inicialmente benignos, há um alto risco de que ao menos um deles se torne um tumor maligno (JUNQUEIRA E CARNEIRO, 2000, p.299). Genes BRCA1 e BRCA2 Estudos com animais de laboratório que tiveram os genes BRCA1 e BRCA2 eliminados não sobreviveram além das primeiras fases embrionárias, fato que aponta para a importância desses no desenvolvimento do organismo (Junqueira e Carneiro, 2000, p.299). Estes genes codificam duas grandes proteínas nucleares relacionadas com o reparo do DNA e a transcrição de outros genes ligados ao ciclo celular. Estudos sobre os mecanismos de atuação desses genes ainda estão em andamento, entretanto, sua importância na ocorrência do câncer de mama hereditário é comprovada, como o acréscimo de 50% de risco de desenvolvimento de câncer de ovário para as mulheres com mutações no BRCA1. (PINHO, 2005, p.136)
    • 51 Anomalias cromossômicas Diversos estudos já demonstraram que as alterações sofridas pelos genes críticos do processo de carcinogênese não ocorrem ao acaso, envolvendo trechos específicos do cromossomo, principalmente aqueles em que estão presentes os proto-oncogenes. São, em geral, segmentos mais frágeis ou hipersensíveis, onde agentes carcinogênicos atuam, provocando quebras ou rearranjos cromossômicos. Se essas forem mutações que representem uma vantagem a célula, serão selecionadas e transmitidas para as células-filhas (SILVA, 2004, p.29-30). A via básica de ação dos agentes carcinogênicos envolve a transformação do proto- oncogene e/ou inibição do gene supressor de tumor (ou anti-oncogenes), agindo das seguintes formas(SILVA, 2004, p.29-31): − Mutações: ativam os proto-oncogenes por causa de alterações estruturais nas proteínas por eles sintetizadas. Há diferentes tipos de mutações, como as de substituição de base, deleções, inserções e, a mais comumente encontradas em tumores, as mutações pontuais, quando um único par de nucleotídeos formadores do DNA encontra-se alterado, que resultam na troca de um único aminoácido dentro da proteína. É o caso do oncogenes ras, que tem os códons 12, 13 e 61 alterados, tendo uma ativação constante de seus produtos mesmo na ausência de estímulo externo; − Amplificação Gênica: está relacionado a um aumento no número de cópias de um alelo, conhecida como “replicação redundante de uma mesma seqüência de DNA”. O resultado desse processo são centenas de cópias de um mesmo gene ou genes que codificaram proteínas diferentes. Esse processo aumento a taxa de transcrições dos genes amplificados, levando a uma proliferação desordenada celular. Ocorre, por exemplo, em adenocarcinomas de mama, onde o gene codificador de proteínas receptoras associadas à proliferação celular, erbB2, encontra-se amplificados; − Rearranjo gênico: quando genes ou fragmentos desses são movidos de lugar, por mecanismos como inversão ou translocação, ou podem ser perdidos por deleção. As translocações são resultantes de quebras nas fitas de DNA, seguidas pela troca recíproca de fragmentos entre dois ou mais genes. Fato diretamente relacionado com a instabilidade de muitos cânceres.
    • 52 Esse mecanismo é observado entre os cromossomos 9 e 22, originando o cromossomo Philadelphia; entre os cromossomos 8 e 14, associado ao linfoma de Burkitt; ocorre com o gene MYC, codificante de proteínas que controlam a transcrição de genes diretamente ligados ao ciclo celular; Além dessas alterações, existem os mecanismos considerados epigenéticos, que modificam a constituição química do DNA, embora não altere as seqüências de nucleotídeos. A adição de um grupo metil (CH3) é a principal modificação identificada no genoma, possuindo um papel relevante no desenvolvimento e progressão de vários cânceres (Rainho, Esteves e Rogatoo, 2004, p.87). Nos proto-oncogenes as alterações mais freqüentes são de substituição (mutação) e amplificação, onde apenas a modificação de um alelo ativa o gene. Já nos genes supressores de tumores são do tipo deleção e mutação pontual, sendo necessários que ambos os cromossomos sejam afetados (Rainho, Esteves e Rogatoo, 2004, p.87). O processo de oncogênese, resultante destas alterações, culminará com o crescimento sucessivo de populações celulares ou clones possuidores de mutações acumuladas em seu genoma, havendo a expansão clonal graças aos processos de metástase e angiogênese.
    • 53 3.4.3- Reparo de DNA e Apoptose Seja por erros na replicação do DNA (que são de modo geral mais raros) ou por mutações, para evitar a progressão dessas alterações nas células-filha existem mecanismos internos formadores de proteínas atuantes sobre outras proteínas capazes de impedir ou estimular a evolução do ciclo celular (PINHO, 2005, p.133-135). A elevação na concentração da proteína p53, codifica pelo gene P53 situado no cromossomo 17, devido a uma lesão no DNA, conseqüentemente, levará à ativação da proteína p21, inibidora da ação progressista do complexo CDK-ciclina. Mecanismos semelhantes ocorrerão com proteínas elaboradas por outros genes supressores de tumores, impedindo a mitose de erros de replicação (PINHO, 2005, p.133-135). Uma vez identificado algum dano do DNA nos dois pontos de checagem do ciclo celular, torna-se necessário à execução de mecanismos de reparo desta lesão. Esses processos são relativamente primários, sendo herdado pelas células humanos de seres tidos como inferiores no processo evolutivo, como as bactérias que possuem proteínas responsáveis por se ligarem a pareamentos incorretos, inserções ou deleções de bases nitrogenadas, havendo a participação de outras moléculas removedoras de segmentos defeituosos (PINHO, 2005, p.133-135). Caso a correção não seja eficiente, as células dispõem de mecanismos internos realizadores de autodestruição fisiológica programada (apoptose), que são ativadas por estímulos internos ou externos a célula. Este processo é de fundamental importância para a preservação da homeostase (equilíbrio) do organismo. Algo que difere a apoptose da morte celular “não- programada” (necrose) é que a segunda resulta de lesão tecidual, sofrendo um processo não controlado de aumento do volume celular, sendo os elementos celulares liberados desencadeadores de respostas inflamatórias. Na apoptose, o fim da “vida útil” da célula ocorrerá através de uma seqüência de eventos intracelulares envolvendo uma família de enzimas denominadas caspases, que destruírão os elementos estruturais fundamentais da célula, como o citoesqueleto, o envelope nuclear e o próprio DNA. Ou seja, será uma morte “limpa”, em que os resíduos serão fagocitados por células vizinhas e macrófagos (PINHO, 2005, p.133-135).
    • 54 A apoptose está subordinada a uma série de mecanismos protéicos regulatórios, sendo o principal deles o feito pela família dos Bcl-2, grupo de proteínas transmembranárias capazes de controlar a ativação das caspases, conseqüentemente, estimulam ou inibem a ocorrência da apoptose, sendo que a ativação de tais proteínas está ligada a complexos processos de sinalização intracelular. A resposta a estímulos internos e externos que desencadeiam o processo de morte celular requer a existência de receptores específicos, como o fator de necrose tumoral (TNF), que irão interagir com moléculas ligantes (PINHO, 2005, p.133-135). A existência de distúrbios que afetam a capacidade das células de reparar lesões em seu DNA foi mais bem estudado em algumas doenças hereditárias, que predispõem o desenvolvimento precoce de tumores hereditários, como a Síndrome de Lynch (responsável pela ocorrência de câncer colorretal familiar); Xeroderma pigmentado (determina maior sensibilidade a raios ultravioletas); Ataxia telangiectásica (hipersensibilidade a alguns agentes químicos e radiação ionizante, levando ao desenvolvimento de linfomas de célula B, leucemias e câncer de mama); Anemia de Fanconi (tumores hematopoiéticos). Além do fator hereditário, a presença de um padrão de instabilidade do genoma eleva a incidência de mutações (PINHO, 2005, p.133- 135). Ou seja, o perfil biomolecular de determinados tumores aponta para a ocorrência de mutações em proteínas responsáveis pelo reparo do DNA. Entretanto, a falta de um conhecimento sobre todos os genes de reparo envolvidos na transformação maligna assim como a complexidade e o elevado custo de seqüenciamento inviabilizam a realização de procedimentos na prática clínica.
    • 55 3.5- Síndrome Hereditária de Predisposição ao Câncer No senso comum, a palavra genética está associada diretamente à hereditariedade, ou seja, a transmissão de características de pais para filhos através dos cromossomos. Entretanto, este é um conceito errôneo, pois distúrbios de natureza genética ocorrem por alterações no funcionamento dos genes, de segmentos codificantes do DNA. Essas modificações poderão ser transmitidas para as células-filha por mitose formando tecidos constituídos por células com os mesmos defeitos no DNA. Existem situações em que determinadas doenças de origem genética poderão ser transmitidas de forma hereditária de pais para filhos. Contudo, para que isso ocorra é necessário que as alterações na seqüência do DNA estejam presentes no material genético dos gametas envolvidos na reprodução. Por exemplo, o câncer colorretal, denominado polipose adenomatosa familiar (conhecida como FAP), é causada por alterações no gene APC que são transmitidas de forma hereditária através dos cromossomos presentes nos gametas paternos ou maternos, sendo incluídas no genoma do zigoto e, conseqüentemente, em todas as células somáticas dos indivíduos da prole. Uma análise de todas as células não-tumorais do indivíduo mostra alterações do gene APC, não causando nenhum distúrbio em outros órgãos (KALIKS E LOZINSKY, 2007, p.29). As doenças hereditárias, necessariamente, são de origem genética, transmitidas por alterações contidas nos cromossomos maternos e paternos herdados pelos filhos. Se um indivíduo com um câncer hereditário procriar, há uma probabilidade de 50% de transmissão desse alelo comprometido para os filhos, já que o zigoto é formado por material genético materno e paterno e o gameta pode herdar o alelo normal. Não havendo comprometimento dos gametas, esta doença permanecerá restrita ao indivíduo em questão, sem possibilidade de transmissão à sua prole de forma hereditária (KALIKS E LOZINSKY, 2007, p.30-31). É relevante ressaltar que as células formadoras dos organismos são denominadas somáticas, havendo além destas um pequeno grupo de células específicas para a reprodução conhecidas como gametas ou células germinativas (na mulher são os óvulos formados nos
    • 56 ovários e no homem os espermatozóides nos testículos). A principal distinção entre essas encontra-se no número de cromossomos, células somáticas são diplóides, ou seja, possuem duas cópias de cada cromossomo, sendo 46 cromossomos ao total, já as células germinativas são haplóide, possuem somente uma cópia de cada cromossomo, já que o zigoto será formado pela fusão de dois gametas que resultará em uma célula diplóide que passará por uma seqüência de mitoses e diferenciações até a formação completa do indivíduo (Snustad e Simmons, 2001, p.26). Células neoplásicas apresentam como principal característica um processo de divisão celular desordenado, como já foi abordado em momentos anteriores deste trabalho, dando origem à célula com conteúdo genética anárquicos, observando-se não somente alterações nas seqüências no DNA como no número de cromossomos. Ou seja, os conjuntos de cromossomos das células originadas não, necessariamente, são múltiplos de “n”, sendo células consideradas aneuplóides, essa característica será transmitida às células-filha. Isso ocorre devido a distúrbios na função dos centrossomos, estruturas participantes da formação do fuso mitótico e responsáveis pela ligação das cromátides-irmãs, que farão a separação normal dos cromossomos durante a divisão celular. (TAJARA, 2004, p. 66). Segundo Kaliks e Lozinsky (2007, p.28), a presença de neoplasias características de pessoas de idade avançada em indivíduos jovens ou quando diversos membros de uma mesma família desenvolvem algum tipo de tumoração - não necessariamente o mesmo tipo histológico de câncer - pode-se estar diante de uma Síndrome Hereditária de Predisposição Genética de Câncer, decorrente da herança de genes predisponentes a formação tumoral (oncogenes) ou à ausência de genes de inibição de tumores no material obtidos pelos gametas. Representa cerca de 5 a 10% dos casos totais de câncer. O principal meio de identificação dessa síndrome hereditária é através da elaboração do heredograma de tumores, Figura 8, em que se determina o padrão e o tipo de neoplasia recorrente. No caso das neoplasias hereditárias, além da ativação do oncogene e inativação do gene supressor de tumores, há fatores predisponentes extras, como a instabilidade genética, em que erros no DNA não são reparados por deficiência em genes específicos (Kaliks e Lozinsky, 2007, p.28).
    • 57 Fonte: Kaliks e Lozinsky, 2007, p.28. O câncer é uma doença genética produzida a partir de mutações no DNA de células somáticas, contudo, os casos hereditários de câncer também possuem origem apenas em células somáticas embora sua ocorrência seja “facilitada” por mutações oriundas de células germinativas. Basicamente, o que difere um câncer de síndrome hereditária de um câncer adquirido é a presença de alterações genéticas em todas as células (exceto nos gametas, podem ou não apresentar, depende da presença ou não do alelo comprometido), contudo, o câncer aparecerá somente em locais específicos. Já os cânceres decorrentes de alterações adquiridas somente as células tumorais apresentam a alteração genética (SNUSTAD E SIMMONS, 2001, p.656). O diagnóstico de predisposição genética ao câncer possui diversos implicações familiares, alguns aspectos positivos, como uma maior taxa de cura e intervenções que diminuem o risco de aparecimento do câncer, e outros negativos, o estresse gerado pelo conhecimento do risco aumentado e, em alguns casos, a futilidade de tal conhecimento e tratamentos exagerados, pois muitos nem chegam a desenvolver o câncer, e os aspectos éticos envolvidos nos testes genéticos e na aplicação de tais resultados. Por fim, antes de qualquer teste é de extrema importância o aconselhamento genético, que esclarecerá o paciente e sua família dos diversos efeitos que envolvem o diagnóstico de câncer hereditário (KALIKS E LOZINSKY, 2007, p.31). Figura 8. Heredograma do Câncer
    • 58 3.6 - Etapas da Carcinogênese De forma geral, o câncer é uma doença de múltiplos passos, havendo a necessidade de lesões diferentes no genoma para estruturar uma transformação maligna. Por isso, o processo de carcinogênese é classicamente dividido em quatro fases: I) Iniciação, II) Promoção, III) Manutenção e IV) Progressão Tumoral (INCA, 2006, p. 31). No início do processo de tumoração, a célula sofrerá a ação de um agente cancerígeno que causa alterações no material genético, etapa denominada iniciação. Todavia, para gerar a doença, essa mutação deve ser herdada pelas células-filhas originadas por mitose e, como já foi elucidado anteriormente, uma única alteração no DNA não é suficiente para causar o câncer. Além disso, o efeito desvantajoso e prejudicial dessa mutação deve ocorrer em classes de genes específicos, preferencialmente, os genes supressores de tumores e os prooncogenes, sendo também de importante relevância os genes de reparo de DNA associados, principalmente, a Síndromes Hereditárias (POLLOCK, 2006, p. 8-9). A etapa seguinte é a promoção, onde células já iniciadas (geneticamente alteradas) sofreram o efeito de agentes não mutagênicos indutores de expansão da população celular possuidora de mutação inicial. Lesões causadas por bactérias, parasitas e vírus podem atuar como promotores do câncer, por exemplo, a bactéria Helicobacter pylori é o principal causador do câncer de estômago, associado também a gastrite; o platelminto Schistosoma haematobium aparentemente é ligado ao câncer de bexiga; o vírus da hepatite B (HVB) em sua fase crônica tem sido relacionado ao desenvolvimento do câncer hepático; dentre outros (POLLOCK, 2006, p. 8- 9). Resumidamente, pode-se afirmar que o câncer só ocorrerá se as células forem expostas a um iniciador e, em seguida, a um agente promotor, se essa ordem for alterada não haverá desenvolvimento neoplásico, podendo, não necessariamente, serem exposições imediatamente seqüenciais. Alguns agentes mutagênicos também podem ser promotores, estes são chamados carcinógenos completos (POLLOCK, 2006, p. 8-9).
    • 59 Após essas etapas, há a fase de manutenção, onde as células geneticamente alteradas são mantidas na seleção natural, respeitando três critérios: 1) células com excessivas mutações não serão selecionadas devido a grande instabilidade genética; 2) alterações genéticas associadas a maior capacidade de proliferação representam uma vantagem significativa em relação as demais células e importante para a formação da massa tumoral; 3) se as mutações representarem um meio de escape do processo de morte celular induzida, ação defensiva do organismo (POLLOCK, 2006, p. 8-9). Se os mecanismos homeostáticos intracelulares não forem capazes de eliminar a célula tumoral essas mutações prevalecem nas populações celulares seguintes e sua freqüência gênica (aparecimento no genoma) irá aumentar à medida que as células realizam mitose. Além disso, haverá um comprometimento maior se os mecanismos reguladores do genoma forem afetados. Ressaltando-se que a progressão do tumor, última fase da carcinogênese, se manifestará em função do acúmulo destas mutações (POLLOCK, 2006, p. 8-9). Em relação a expansão tumoral, uma característica fundamental das células transformadas é sua capacidade de replicação sustentada ou “replicação infinita”. Isso se deve ao fato de que as células normais tendem a um determinado número de divisões e, a cada mitose, há um progressivo encurtamento das extremidades dos cromossomos (telômeros). Os telômeros funcionam como mediadores do período de vida celular, isto é, haverá seu encurtamento até um determinado limite, sendo este alcançado a célula sofrerá apoptose (LEWIN, 2001, p.838-839). Há uma relação inversamente proporcional entre o grau de diferenciação celular e a manutenção de processo replicativo, por exemplo, células embrionárias, stem cells (células progenitoras dos diferentes tecidos) e células tumorais apresentam mecanismos de reposição dos telômeros, fato que as torna em “imortais”. Além disso, observa-se que o processo de diferenciação celular em algumas culturas e até em organismos culminam em morte celular. No caso da carcinogênese, aceita-se que as células transformadas conservam algumas características das progenitoras, contudo, o processo de diferenciação em tumores é incompleto e disfuncional, o
    • 60 grau de diferenciação das células neoplásicas está ligado com o caráter agressivo da massa tumoral (LEWIN, 2001, p.838-839). As etapas da carcinogênese estarão submetidas à interação de diferentes fatores, sendo basicamente moldado pela interação entre as células geneticamente alteradas e o ambiente tecidual que as cerca, sua capacidade de migração, por exemplo, estará diretamente ligada com as informações presentes no DNA da célula e com a disponibilidade de nutrientes oferecidos pelos vasos sanguíneos e linfáticos – tais características serão elucidadas no próximo capítulo. A invasão de estruturas vitais levam ao comprometimento das funções destas, além da deterioração indireta de diversas estruturas causada pelo “desvio” energético que leva a um comprometimento sistêmico.(POLLOCK, 2006, p. 8-9)
    • 61 CAPÍTULO 4 – PROLIFERAÇÃO TUMORAL: MECANISMO DE ANGIOGÊNESE E METÁSTASE A intensificação do processo mitótico, viabilizado pelos suprimentos obtidos por meio da angiogênese, e a capacidade de migração para outros tecidos (metástase) são características fundamentais de um tumor maligno. Esses processos estão interligados e, na maioria dos casos, ocorrem simultaneamente, desempenhando cruciais papéis para a sobrevivência das células neoplásicas e crescimento do volume tumoral (ARAP, PASQUALINI e ARAP, 2004, p. 97-100). ANGIOGÊNESE “A expansão tumoral depende da proliferação de vasos e capilares, conhecida como angiogênese” (ARAP, PASQUALINI e ARAP, 2004, p. 97). Para crescer e prolifera-se a célula depende de um fornecimento adequado de oxigênio e fatores de crescimento, além da retirada de resíduos metabólicos tóxicos que reduzem o tempo de vida útil celular, portanto, um suprimento vascular inadequado leva ao comprometimento da atividade da célula e, por fim, à morte celular (ARAP, PASQUALINI e ARAP, 2004, p. 98-100). Tumores acima de 1-2mm dependem de vasos para receber nutrientes, os de tamanho inferiores suprem sua necessidade por difusão. Quanto maior for a vascularização do tumor, menos o tratamento torna-se eficaz, levando ao óbito (FILHO, 2000, p. 166-167). A indução da angiogênese é realizada por diversos fatores provenientes tanto das células tumorais como das normais (células endoteliais, linfócitos-T, mastócitos, macrófagos), sendo os principais fatores angiogênicos: fator de crescimento do endotélio (VEGF), produzido por estímulos variados, como deficiência de glicose, estrogênio e citocinas; interleucina 8 (IL-8), que induz a proliferação, migração e invasão das células endoteliais; além do fator de necrose tumoral (TNF –ą) e outras moléculas pertencentes as diversas famílias de fatores de crescimento. Existem também os fatores antiangiogênicos, como a angiostatina e a trombospondina, o segundo é estimulado pela proteína p53, sintetizada pelo gene P53 (gene supressor de tumor) que no processo carcinogênico é inibido, o que faz com que a produção de trombospondina seja
    • 62 reduzida, favorecendo, assim, o prevalecimento da ação dos fatores angiogênicos (FILHO, 2000, p.166-167). A angiogênese consiste na formação de novos vasos a partir de outros já preexistentes. Isso se inicia com a formação de brotos, a partir de células endoteliais de capilares, que proliferam, migram e penetram a estroma do tecido. Em seguida, ocorrerá o desenvolvimento desses brotos, transformando-se em capilares maduros. Com isso, pode-se esquematizar a angiogênese em algumas etapas: 1ª) Dissolução da membrana basal de um vaso preexistente; 2ª) Deslocamento de células sangüíneas para a massa tumoral; 3ª) Formação de uma “rede vascular”; 4ª) Amadurecimento do brotamento, finalizado com a formação da membrana basal (FILHO, 2000, p.166-167). Algumas das principais características dos vasos resultantes do processo de angiogênese tumoral são a presença de um grande número de fenestrações intercelulares e a expressão de marcadores, inexistentes ou quase indetectáveis nos vasos sanguíneos normais, além de receptores para certos fatores de crescimento. Esses atributos fazem com que sejam, em relação aos vasos de processos angiogênicos fisiológicos, mais acessíveis a moléculas e células circulantes. A presença dessas peculiaridades permitem que o endotélio tumoral possa ser usado como alvo em determinadas terapias, as tornando, cada vez mais, específicas para o tipo de câncer de acordo com o perfil vascular do endotélio do órgão ou tecido afetado (ARAP, PASQUALINI e ARAP, 2004, p. 97-100). “O desprendimento (...) e a disseminação celular são eventos subseqüentes á vascularização do tumor primário” (ARAP, PASQUALINI e ARAP, 2004, p. 98), isto é, a vascularização é importante para o processo migratório das células malignas, sem o suprimento adequado essas permaneceriam em seu sítio originário. METÁSTASE Dentre todas as características dos tumores malignos, a capacidade de realizar metástase pode ser considerada fundamental para o processo evolutivo da massa celular e o freqüente
    • 63 prognóstico dessa doença, a morte do hospedeiro, é a aspecto do câncer mais temido e o menos compreendido. Metástase (do grego meta, que significa diferente e stasis, que se refere à posição) (FLECK e VENEGAS, 1992, p.51) é a migração de células neoplásicas para um local diferente de seu sítio de origem. Para metastatizar, as células devem superar uma série de mecanismos homeostáticos do organismo, potencialmente fatais para a sobrevivência da maioria das células. Entretanto, deve-se ressaltar que a capacidade de invasão tecidual não é exclusiva para células tumorais, células embrionárias e leucócitos realizam ações semelhantes, como os macrófagos que recebem denominações distintas de acordo com a área de instalação, no sangue chamam-se monócitos; no sistema nervoso, células da micróglia; no fígado, células de Kupfer; nos ossos, osteoclastos; nos rins, células mesangiais; nos alvéolos, macrófagos alveolares (ARAP, PASQUALINI e ARAP, 2004, p.100-102). A formação de metástases é resultante da ativação de genes promotores, os chamados “genes para metástase”, a expressão desses explica o porquê de um mesmo tumor apresentar clones com potencial metastático diferente; e da inativação de genes supressores de invasão tecidual, que podem, por exemplo, com seus produtos inibir as proteinases que facilitam a invasão das células neoplásicas ou mais diretamente reduzir a incidência de metástase, como é o caso do nm 23, um gene aparentemente com papel antimetastático (FILHO, 2000, p.167-169). O processo de metastatização, desde o início dos estudos do câncer, foi dividido em fases indispensáveis e interligadas, comum a todos os tipos de cânceres. Inicialmente, têm-se as multiplicações clonais das células tumoral, a partir dos nutrientes e outras substâncias fornecidas pelos processos angiogênicos (ARAP, PASQUALINI e ARAP, 2004, p.100-102). O passo seguinte na formação de metástases é o desprendimento das células do sítio primário. As células tumorais possuem pouca adesão entre si, isso se deve ao número escasso (ou inexistente em alguns casos) de estruturas juncionais; a grande eletronegatividade, o que favorece a repulsão elestrostática entre as células; a liberação de enzimas que enfraquecem a adesão; e a
    • 64 superfície irregular, diminuindo a área de contato entre as células tumorais. Fatores que naturalmente favorecem a metástase (BOGLIOLO, 1978, p. 645-647). Quando as células estão separadas das demais, liberam-se da inibição por contato celular existente quando agregadas que desfavorecia seu movimento, atividade metabólica e reprodutiva. Com isso, células neoplásicas são dotadas de grande capacidade de motilidade, que também está ligada a alterações no citoesqueleto, o desenvolvimento de sistemas de microfilamentos e, principalmente, a disponibilidade de energia (ARAP, PASQUALINI e ARAP, 2004, p.100-102). Na etapa após desprendimento ocorrerá a migração tecidual das células pela circulação. A disseminação do tumor dá-se por quatro vias principais: invasão local, o crescimento direto em direção a tecidos adjacentes; linfática, através de vasos linfáticos drenantes que levam as células neoplásicas para os linfonodos onde crescem como tumores secundários, fato freqüente no câncer de mama; vascular, via básica de metástase; disseminação transcelômica, a proliferação direta pelos espaços celômicos, comum em tumores primários da cavidade abdominal ou torácica. Ressaltando que o envolvimento de vias linfáticas depende da localização da massa tumoral, se essa via de circulçao é responsável pela drenagem do órgão primário. Entretanto, há comunicações veno-linfáticos (entre canais linfáticos e sanguíneos) nos linfonodos e em certos tecidos que permitem o descolamento de uma via para outra (STEVENS e LOWE, 1996, p.38- 40). No processo de migração ocorre a degradação e morte da maioria das células neoplásicas que tentam metastatizar, devido à presença de células de defesa (células Natural killer, monócitos) e a própria turbulência do sangue, dentre outros fatores. As que sobrevivem aderem- se às células endoteliais e, em seguida, a moléculas receptoras da membrana basal dos órgãos- alvo, como as proteoglicanas e o colágeno tipo IV, saindo, assim, do vaso e penetrando a parênquima do órgão-alvo (ARAP, PASQUALINI e ARAP, 2004, p.100-102).
    • 65 Invasão Celular Para realizar a invasão tecidual a célula neoplásica deve apresentar alguns atributos, características obtidas por mutações genéticas adicionais realizadas no próprio tumor primário, como a expressão de moléculas de adesão necessárias para a fixação em outras estruturas (ARAP, PASQUALINI e ARAP, 2004, p.100-102). A produção de enzimas que degradem a matriz extracelular é algo fundamental para a metástase, a metaloproteinase, responsável por degradar o colágeno tipo IV nas membranas basais das células invadidas, é a enzima mais estudada. Segundo Stevens e Lowe (1996, p.40-41), tanto as células tumorais como as do órgão e sua estroma envolvidas no processo devem expressar moléculas de adesão celular complementares, além da ausência no órgão hospedeiro de inibidores de proteases (dependendo do tipo de neoplasia, a presença de inibidores não assegura a combate a invasão, pois há antiproteases nas células tumorais) e a presença de fatores de crescimento adequados no meio. Figura 9. Fonte: modificado de STEVENS e LOWE, 1996, p.41. Secreção de Proteases Secreção de Antiproteases Célula Tumoral Bloqueio da ação das antiproteases Figura 9. INVASÃO CELULAR
    • 66 Na Figura 9 tem-se a esquematização do processo de invasão: 1º Secreção de proteases pelas células tumorais a fim de romper a membrana; 2ª Células estromais liberam antiproteases que são bloqueadas por substâncias lançadas no local pelas neoplásicas, permitindo a continuação do processo de ruptura; 3º Uma vez rompida a membrana, as células serão aderidas e ocorrerá o extravasamento celular e a interação com as células do órgão, iniciando a proliferação celular para o desenvolvimento do tumor. Concretizado com sucesso esse processo, inicia-se, como no sítio primário, o processo de angiogênese, permitindo a sobrevivência e crescimento da metástase. Essas células metastatizadas podem passar pelo mesmo processo de suas progenitoras, havendo a “metástase de metástase”, repetindo, assim, o ciclo (ARAP, ARAP e PASQUALINI, 2004, p.100-102). Em 1889, Paget elaborou a teoria de seed and soil (semente e solo), segundo a qual cada tipo de célula neoplásica tem afinidade especial por determinado ambiente, encontrado em tecidos e órgãos específicos. Cada “semente” tem afinidade por um “solo”, isto é, as células neoplásicas não reconhecem os receptores e moléculas do próprio órgão-alvo, mas sim do seu endotélio, a membrana basal de seus vasos sanguíneos e linfáticos que apresentarão afinidades específicas para as células metastatizadas. Segundo ARAP, PASQUALINI e ARAP (2004, p.100-102), é um fato que pode explicar a ocorrência de metástases um longo período após a retirada do tumor primário, pois as células endoteliais mantêm as células neoplásicas metastatizadas pouco vascularizadas para não serem reconhecidas pelos mecanismos de defesa do organismo e agentes quimioterápicos, garantindo a sua sobrevivência e o desenvolvimento da massa tumoral. Além do que células cancerosas, em comparação com as normais, são resistentes a apoptose. O endotélio tumoral do sítio primário e de suas metástases são muito diferentes, pois há expressões em níveis contrastantes de moléculas e receptores, aumentando com isso o reconhecimento do sistema imune e, conseqüentemente, a quantidade de anticorpos produzidos pelos linfócitos B e plasmócitos. A qualificação e identificação desses é um foco para determinar
    • 67 o estadiamento (nível de desenvolvimento) de muitos tipos de cânceres (ARAP, PASQUALINI e ARAP, 2004, p.100-102). As informações aqui apresentadas é o que, atualmente, é defendido e aceito pela maioria dos oncologistas e profissionais ligados à área, entretanto, há mecanismos moleculares mais complexos envolvidos no processo de invasão tecidual que não foram totalmente elucidados. A disseminação do câncer torna as medidas de erradicação praticamente ineficientes, por isso, os estudos de angiogênese e metástase são focos para o entendimento do câncer, proporcionando o aprimoramento dos tratamentos anti-câncer.
    • 68 CAPÍTULO 5: ASPECTOS IMUNOLÓGICOS DAS NEOPLASIAS O sistema imunológico é composto por um conjunto de células e moléculas responsáveis pela defesa do organismo, sendo a resposta imune gerada para proteger o indivíduo (de forma geral) e eliminar antígenos estranhos ao corpo. A existência de estimulação antigênica pelas células neoplásicas é o foco para compreender os mecanismos de atuação e reconhecimento do sistema imunológico (OTTO, MOTA e SILVA, 1989, p. 85). Apesar da proporção imunogênica das células tumorais não ser um consenso na comunidade médica, se aceita que toda célula neoplásica possui antígenos - moléculas protéicas que interagem com o sistema imune, desencadeando uma resposta de defesa -, pertencentes a cinco categorias básicas (FILHO, 2000, p. 190-192): − antígenos oriundos da célula de origem, não sendo imunogênicos para o hospedeiro (não desencadeiam resposta imunológica) já que são próprias do organismo. Como, por exemplo, o PSA (Prostate Specific Antigen) expresso em células prostáticas normais e, no caso das neoplásicas, são encontradas em quantidades elevadas no soro do paciente, identificando também a ocorrência de metástases; − antígenos normais que sofreram modificações devido a ações enzimáticas; − antígenos encontrados no tumor que se expressão no organismo no período embrionário, como os antígenos oncofetais (carcinoembrionário ou CEA e β-fetoproteína) que são codificados por genes reprimidos após o nascimento e voltam a se expressar na transformação neoplásica, sendo úteis marcadores tumorais e indicadores de existência de neoplasia residual após tratamento; − Antígenos codificados por vírus associados a tumoração (p. ex. Proteína E7 do papilomavírus), ressaltando que esses são os mesmos independentemente do sítio e da espécie do hospedeiro; − antígenos específicos dos tumores, ou seja, novos antígenos não existentes nas células não-
    • 69 neoplásicas, tais proteínas são derivadas da expressão de genes antes inativos ou mutações gênicas nos trechos de DNA codificante. Determinados estudos apontam a rejeição do tumor quando instalados em outros organismos devido aos antígenos de superfície, sendo esses conhecidos como antígenos específicos de transplantação de tumores (TSTA). Como a tumoração maligna possui uma grande instabilidade genética, o aparecimento de novos clones celulares acarreta o surgimento de novos TSTA. O sistema imunológico do hospedeiro desenvolverá uma resposta de acordo com a identificação desses antígenos, visando a eliminação das células tumorais. A partir dos estudos antigênicos formulou-se a teoria da VIGILÂNCIA IMUNITÁRIA, em 1950, por Lewin Thomas, recebendo essa denominação na década de 60 por McFarlane segundo a qual ao longo da vida do indivíduo as defesas do organismo suprimem diversas células mutadas (VIOLA, TEIXEIRA e WERNECK, 2004, p. 105). FILHO (2002, p.192) identificou que os tumores clínicos (com volume e que desencadeiam sintomatologia) são apenas a “ponta do iceberg”, isto é, são aqueles resultantes de uma falha dos mecanismos de defesa, dentro de um grande universo de combate a tumorações. A teoria de Lewis Thomas é comprovada ao realizar-se uma análise de indivíduos imunossuprimidos, que apresentam maior incidência de cânceres, como o Sarcoma de Kaposi como em pessoas com AID's. Por um lado à reação imunitária destrói certo número de células e inibe o desenvolvimento neoplásico, em contrapartida, ao destruir suscetíveis (em outras palavras, “mais fracas”) contribui para a disseminação de clones mais resistentes e agressivos, princípio básico de Seleção Natural e Luta pela Sobrevivência de Darwin, os organismo que mais bem se adaptam ao meio têm maiores chances de sobreviver a ação de fatores ambientais do que os menos adaptáveis, deixando um número maior de prole. Isto é, restam aqueles que melhor suportam as imposições e limitações do meio. Os principais componentes do sistema imunitário envolvidos na eliminação de tumores que atuam de forma inespecífica, representando a primeira linha de defesa do organismo, denominada imunidade inata, são segundo VIOLA, TEIXEIRA e WERNECK (2004, p. 106):
    • 70 − Macrófagos, que através da produção de fator de necrose tumoral (TNF-α), por meio da liberação de radicais livres de oxigênio ou pela ação conjunta com anticorpos (que facilitam a atividade fagocitária) irão agir de forma eficaz na destruição de células cancerosas. Dependendo do sítio onde se localizam, os macrófagos receberam denominações específicas, como histiócito no pulmão, monócito no sangue, células da glia no sistema nervoso, dentre outros. − Células NK (Natural killer) que são capazes de reconhecer e matar células neoplásicas por lise direta, fato que leva a quimiotaxia (atração mediada por fatores químicos) de macrófagos e outras células NK. O sistema imune inato é capaz de estimular uma resposta imune específica (adaptativa). Os macrófagos apresentaram os antígenos ao linfócito TCD4 auxiliar, ativador das duas vias de resposta imunológica adaptativa: humoral, produção de anticorpos pelos linfócitos B e plasmócitos (versões do primeiro que passaram por um processo de diferenciação), sendo essa via pouco expressiva na destruição de tumores; celular, liberação de toxinas pelos linfócitos T citotóxicos (VIOLA, TEIXEIRA E WERNECK, 2004, p. 111). A reação imunológica celular, em relação a tumores, é mais eficaz que a humoral, entretanto, o efeito final depende do balanceamento da ação das duas vias. Um fenômeno que favorece a proliferação tumoral, porém não se encontra satisfatoriamente esclarecido, é a denominada FACILITAÇÃO IMUNOLÓGICA. Tem-se documentado a existência de fatores bloqueadores presentes em concentrações elevadas nos períodos acentuados de crescimento e disseminação tumoral, não se sabendo ao certo a natureza desses agentes apesar de sua ação ser um feedback aos mecanismos de combate imunológicos. Acredita-se que ocorra a ligação ao antígeno na superfície das células neoplásicas ou aos receptores das células de defesa do organismo (FILHO, 2000, p.193). Mesmo com toda ação defensiva do organismo, o câncer desenvolve-se graças aos mecanismos de evasão adotados, como: a variação dos antígenos de acordo com o tipo de célula
    • 71 tumoral, liberação de antígenos solúveis que ocupam os sítios das proteínas sintetizadas pelas células de defesa, internalização dos antígenos de superfície impedindo o reconhecimento do sistema imunológico, endocitose de anticorpos, produção de TGFβ, que suprimi a resposta inflamatório dos linfócitos T, dentre outros (FILHO, 2000, p.192). Por fim, apesar da constante vigilância imunológica, as células tumorais fazem uso de mecanismos de escape que levam ao desenvolvimento de cânceres. O atual grande desafio para a imunologia tumoral é o desenvolvimento de terapias antitumorais baseadas na imunoterapia (empregado no tratamento de tumores já existentes) e vacina (visando a prevenção da transformação tumoral), sendo os principais objetivos desses focos de pesquisa a ativação da vigilância imunológica e a quebra da escape tumoral. Ressaltando-se que os avanços na genética, bioquímica e biologia molecular permitiram a caracterização de diferentes antígenos, que juntamente com os conhecimentos nas áreas genômica e proteômica, possibilitaram o desenvolvimento de novas estratégias em imunoterapia e o desenvolvimento de vacinas antitumorais.
    • 72 CONSIDERAÇÕES FINAIS As ações de determinadas proteínas em diferentes etapas do processo de divisão celular geradas pela ativação e inativação de genes específicos codificantes é aquilo que mediará a evolução da doença, as diversas etapas envolvidas no distúrbio proliferativo (a capacidade angiogênica, a adesividade celular e a formação de metástases). A presença de genes mutados comuns em vários tipos tumores – como p53, BRCA1, BRCA2, APC, ras, dentre outros2 – viabilizam a criação de um perfil genômico tumoral, o qual servirá como referência para análise particular de cada tumor, determinando com isso o comportamento e o prognóstico clínico. Contudo, existe provavelmente um padrão específica de atividade das biomoléculas envolvidas na carcinogênese que determinará a faixa de variação individual que, em último instância, definirá o prognóstico. A aplicação prática dos conceitos de biologia tumoral encontra-se em fase progressiva de implantação, sendo estes suficientes para alterar a percepção clínica atual e futura do câncer. As informações obtidas acerca do processo de carcinogênese refletem nas três bases da saúde assistencialista: prevenção, diagnóstico e tratamento. O aconselhamento genético oncológico é o processo clínico que lida com todos os aspectos relacionados à informação genética obtidas através de testes, identificando o subgrupo de pacientes e familiares que apresentam alto risco de desenvolvimento e/ou transmissão de câncer. A esses devem ser fornecidas todas as informações necessárias para o esclarecimento a respeito dos riscos inerentes a cada condição, opções de vigilância e os subsídios necessários para a tomada de decisões informadas. Os problemas com os quais o aconselhamento genético irá lidar envolvem a ocorrência ou possibilidade de ocorrência de um distúrbio genético em uma família, atendendo às seguintes premissas: utilização voluntária dos serviços; tomada de decisões após discussões e exposição 2 - Genes relacionados com o controle do ciclo são mais estudados que os codificantes de proteínas responsáveis pela adesão e motilidade celular, descobertos mais recentemente.
    • 73 prévias; aconselhamento não coercitivo; respeito a privacidade e confidencialidade; respeito as aspectos psicossociais que essa informação pode causar no indivíduo. Ressaltando-se que os testes genéticos para identificação de uma Síndrome Hereditária do Câncer somente serão realizados se houver informações no histórico familiar ou características clínica marcantes e específicas que induzam para tal. O aconselhamento genético agirá na identificação dos indivíduos em risco genético de desenvolver câncer hereditário, aos quais devem ser oferecidas estratégias de vigilância e/ou prevenção do câncer. A importância clínica das informações teóricas a respeito dos oncogenes e genes supressores de tumores, assim como de todo o processo que os envolve, deve-se ao fato de que esses são alvos potenciais para novos tipos de terapias para o câncer, que visam a eliminação seletiva de células cancerosas deixando as normais intactas e, conseqüentemente, reduzindo os efeitos colaterais do tratamento no paciente, alguns exemplos de drogas com alvos moleculares específicos que vêm sendo usadas com sucesso são a herceptina (anticorpo específico para o câncer de mama) e o STI57 (uma droga aplicada no tratamento da leucemia mielóide crônica e tumores gastrointestinais). Desde os primórdios do desenvolvimento da quimioterapia almeja- se o desenvolvimento de terapias que possa minimizar a toxicidade sofrida pelo paciente sem prejuízo a ação antitumoral do medicamento, essa nova geração de drogas com alvos específicos desenvolvidos a partir da compreensão da fisiopatologia da progressão das neoplasias vem atender a essa demanda, podendo ser utilizadas isoladamente ou em combinação com cirurgias (remoção da massa tumoral) e radioterapias ou outras quimioterapias (destruição das células por efeito tóxico). Em última instância, busca-se resultados mais eficientes no tratamento de pacientes oncológicos, visando sempre o melhor para o enfermo. Em relação às síndromes hereditárias do câncer, a farmacogenética vem como um dos principais focos para o tratamento destas. O termo “farmacogenética” (Kurtz, 2004, p. 395) foi criado em 1959 para designar “estudo sobre a variabilidade na resposta a medicamentos de acordo com características hereditárias”, explorando-se proteínas chaves específicas a determinados grupos (determinados perfis gênicos) envolvidas no processo de biotransformação
    • 74 de fármacos. Ou seja, reuniram-se grupos, em alguns casos da mesma família, e identificam-se características peculiares que permitam a elaboração de terapias direcionadas que garantam a máxima de resposta com mínima toxicidade, sendo com isso medicamentos “personalizados” para subgrupos com características farmacogenéticas definidas. No entanto, há muitas questões que envolvem a aplicação da farmacogenética na realidade clínica prática, são elas de cunho tecnológico e econômico, as dificuldades envolvidas na identificação da genotipagem, e bioéticas, se por um lado a caracterização do perfil gênico do indivíduo traz benefícios para a eficiência de um tratamento, por outro pode gerar discriminações, como, por exemplo, em relação a alguns tipos de trabalho que envolvem exposição a agentes tóxicos, caso o indivíduo tenha maior suscetibilidade genética será recusado. Entretanto, a questão reside em evitar o risco da exploração inadequada desses conhecimentos, prevalecendo o enorme efeito benéfico para a sociedade. Uma outra forma de tratamento, diferente das convencionais que atuam apenas aliviando sintomas, é a terapia gênica, que tem como objetivo reparar a perda ou mau funcionamento de um gene celular, através da transferência de genes terapêuticos as células do paciente. Como as células vivas são resistentes a entrada de DNA, o uso de vetores virais faz-se necessário. Esses iram proliferar-se e produzir proteínas cujas informações estão defeituosas no DNA do hospedeiro. O principal exemplo da aplicação da terapia gênica no câncer é a reposição de genes supressores de tumor, levando a codificação de proteínas de controle da proliferação celular. Todos estes avanços na pesquisa da genética do câncer são viáveis graças aos projetos de seqüênciamento do DNA em larga escala que tornaram necessária a criação de bases de dados dos experimentos, dinamizando tanto a comunicação como o acesso às informações, tendo a internet um importante papel na divulgação científica. Contudo, a bioinformática não se limita às bases de dados, abrange também a análise e interligação de diferentes informações. A bioinformática na oncologia tem demonstrado um importante papel tanto no auxílio ao prognóstico como no diagnóstico dos pacientes com câncer ou com predisposição e na
    • 75 terapêutico, utilizando-se informações globais para o entendimento dos alvos metabólicos atingidos pelas pelo câncer. Um dos principais desafios da era pós-genômica é o entendimento da estrutura e função das proteínas codificadas pelos genes (proteoma). A compreensão deste campo genes/proteínas no câncer possui um efeito conflitante nos estudos científicos, se por um lado ofereci um novo campo de pesquisa em que qualquer novo conceito representa uma importante contribuição, por outro constrói um enorme quebra-cabeça, com múltiplos caminhos interligados que dificultam a compreensão do todo. Uma análise do cenário de pesquisa clínica e experimental em biologia molecular dos tumores revela linhas bastante restritas e definidas, em que se busca a identificação da expressão de genes específicos em uma série de pacientes, visando uma integração da clínica com a pesquisa e, se possível, a universalização de alguns padrões. Esta é a tarefa daqueles que tem como um campo de estudo a oncogenética.
    • 76 REFERÊNCIAS AMABIS, José Mariano; MARTHO, Gilberto Rodrigues. Fundamentos da Biologia Moderna. Rio de Janeiro: Moderna, 1990. ARAP, M. A.; PASQUALINI, R; ARAP, W. Mecanismos de Metástase e Angiogênese. In: FERREIRA, C.G.; ROCHA, J.C. Oncologia Molecular. São Paulo: Atheneu, 2004. BARROS, A. J. P; LEHFELD, N.A. de S. Fundamentos de metodologia: um guia para a iniciação científica. São Paulo: McGraw-Hill, 1986. BOGLIOLO. Patologia Geral Básica: agressão, defesa, adaptação, doença. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1978. BOLSOVER, S. R.; et al. Biologia Celular. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005. BOOTH, W. C; COLOMB, G. G; WILLIAMS, J. M. A arte da pesquisa. São Paulo: Martins Fontes, 2005. CERQUEIRA, E. de M. M. Câncer e Genética. In: BARACAT, F. F; SILVA, Maria José; FERNANDES, H. J. Cancerologia atual: um enfoque multidisciplinar. São Paulo: Roca, 2000. COSTA, M. A. F; COSTA, M. F. B. Metodologia da Pesquisa: conceitos e técnicas. Rio de Janeiro: Interciência, 2001. DE ROBERTIS, E.M.F.; HIB, J. Bases da Biologia Celular e Molecular. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1998. DEL GIGLIO, A. Cancerologia: do passado ao futuro. Revista da Sociedade Brasileira de Cancerologia, São Paulo - SP, v. 17, p. 6-8, 2002. Disponível em: < http://www.rsbcancer.com.br >. Acesso: 20 de dez. 2007. FERREIRA, A. B. de H. e et al. Mini Aurélio. 4. ed. Ver. Ampliada. Rio de Janeiro: Nova Pronteira, 2001. FILHO, Geraldo Brasileiro e et al. Bogliolo Patologia. 6. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000. FILHO, Geraldo Brasileiro. Bogliolo Patologia Geral. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1993. FLECK, James. Org. Câncer: integração Clínico - Biológica. Rio de Janeiro: Médica e Científica Ltda, 1992. GOLDSBY, R. A; KINDT, T. J; OBORNE, B. A. Kuby Imunologia. 49. ed… Revinter, 2002.
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