Крылов Б.В.

НОВЫЕ МЕХАНИЗМЫ КУПИРОВАНИЯ БОЛИ: РОЛЬ МЕДЛЕННЫХ НАТРИЕВЫХ КАНАЛОВ Б.В. Крылов Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН Санкт-Петербург, Россия

Около 90% всех заболеваний связано с болью. Когда боль переходит в хроническую форму, она перестает выполнять свою физиологическую функцию, связанную с информированием организма о повреждающем воздействии или патологическом процессе.

Согласно Международной ассоциации изучения боли выделяют два понятия:

боль - субъективное переживание, которое служит симптомом большинства острых и хронических заболеваний человека ;

ноцицепция — это нейрофизиологическое понятие, обозначающее восприятие, проведение и обработку сигналов о повреждающих воздействиях и (или) о патологических процессах.

Медленные натриевые каналы (Na v 1.8) играют ключевую роль в

кодировании периферической ноцицептивной информации .

Тела ноцицептивных нейронов (ответственных за передачу болевого сигнала) локализованы в ганглиях задних корешков спинного мозга (DRG). Их афференты иннервируют различные органы тела. Болевое ощущение возникает при частотах, превышающих 5 имп./с Частота импульсной активности ноцицептивного нейрона определяет «силу» болевого ощущения

US Patent

Схема передачи сигнала от опиоид оподоб ного рецептора к медленному натриевому каналу (Крылов и др., 1999, Российский Физиол. Журн.Т. 85, 225-236)

Опиоидные рецепторы и ионные каналы : известные пути сигнализации

Мишень 1 Мембранный рецептор

IBM-compatible computer Data acquisition Data processing DAC ADC AMPLIFIER EPC-7 Perfusion system Nerve cell Current recordings

Исследуемая субстанция - это коменовая кислота

Коменовая кислота относится к классу гамма-пиронов

Получена с помощью прямого химического синтеза

Семейства TTX r натриевых токов до (А) и спустя 13 мин. (Б) после приложения коменовой кислоты в концентрации 1 ммоль / л А Б 0, 3 нА 3, 5 мс 0, 8 нА 3, 5 мс

Изменение эффективного заряда определяется по начальному участку левой ветви вольт-амперной характеристики

Черные квадраты -контроль

Белые квадраты – после воздействия

Потенциалозависимость хордовой проводимости TTXr натриевых каналов

Функция G Na (E) была нормирована, т.е. c троилась G Na (E) norm = G Na (E)/G Na max (E) , где G Na max (E) ее максимальное значение.

Данные контрольных экспериментов – белые кружки

Результаты, полученные после приложения 1 ммоль / л коменовой кислоты – черные кружки

Метод Алмерса определения эффективного заряда по «лимитирующей проводимости» l im (N o / N c ) = l im [G Na (E)/  G Na max - G Na (E)  ]  E  -  E  -   Cexp[z eff eE/kT]

Обоснование выбора шага изменения тестирующего импульса при построении регрессионной прямой лимитирующей проводимости Экспоненциальная функция (уравнение 3.2), представленная в логарифмическом масштабе, позволяет определить величину Zeff по тангенсу угла наклона асимптот, проведенных к начальным участкам этих функций. Шаг изменения тестирующего импульса составляет 5 мВ - белые кружки , 3 мВ - черные кружки.

Gating machinery of Na+ channel

Вляние коменовой кислоты на потенциалочувствительность активационной воротной системы TTX r натриевых каналов Экспоненциальная функция, представленная в логарифмическом масштабе, позволяет определить величину zeff по тангенсу угла наклона регрессионных прямых, проведенных через начальные 2-3 точки этих функций в контрольном опыте ( белые кружки ) и после приложения 1 ммоль / л коменовой кислоты ( черные кружки ) Z eff contr = 6, 0 Z eff comen = 3, 6

Зависимость изменения величины эффективного заряда ( deltaz eff norm ) от внеклеточной концентрации коменовой кислоты

Средние значения ( черные кружки ) и ошибки среднего представляют результаты нескольких измерений. Сплошная кривая – результат расчетов с использованием уравнения Хилла при K D = 100 наномоль и X = 0.5

Налтрексон полностью устраняет действие коменовой кислоты  Z eff norm

Гамма-пироны

Хелатные комплексы гамма-пиронов

US Patent application publication

Formalin test: motor patterns interphase interval 3-5 10-15 20-40 min Flexion and Stirring Phase1 Phase 2 Licking

Коменовая кислота устраняет проявление абстинентного синдрома на стадии отмены морфина

Проявление синдрома отмены наркотика у морфинизированных крыс полностью изчезали через 24 дня после начала введения препарата (коменовой кислоты)

Оптимальная доза коменовой кислоты – 30мг / кг снижает число нажатий на педаль на 40% по сравнению с контролем

Влияние коменовой кислоты на систему положительного подкрепления латерального гипоталамуса

Готовое лекарственное средство неопиоидный анальгетик «Аноцептин»

Факмакокинетика субстанции (коменовая кислота) Испытуемый № 8

Модель типа Ходжкина-Хаксли мембраны ноцицептивного нейрона

Построение модели I m ‑ суммарный ток, протекающий через мембрану; I Na s - медленный натриевый ток I Na f - быстрый натриевый ток I K - калиевый ток задержанного выпрямления I L – ток, протекающий через каналы утечки. Переменные активации и инактивации m , n и h соответствующих типов токов имеют смысл вероятности состояния канала и могут принимать значения от 0 до 1.

Экспериментальные записи семейства медленных натриевых токов Тестирующий потенциал изменялся от ‑ 45 до + 40 мВ с шагом 5 мВ. Поддерживаемый потенциал: ‑ 110 мВ, длительность 500 мс.

Построена по максимальным значениям токов. Вольт-амперная характеристика каналов Nav1.8 .

Характеристики активационной воротной системы каналов Na v 1.8 Потенциалозависимость стационарной активации. Построенная по экспериментальным данным и в результате аппроксимации по функции m 3 (E) .

Характеристики инактивационной воротной системы каналов Na v 1.8 Стационарный уровень быстрой фазы процесса инактивации . Семейство медленных натриевых токов, нормированных к максимальному значению при различных значениях Е конд

Характеристики инактивационной воротной системы каналов Na v 1.8 Постоянная времени быстрой фазы процесса инактивации

Характеристики инактивационной воротной системы каналов Na v 1.8 Временной ход восстановления из инактивированного состояния

Характеристики инактивационной воротной системы каналов Na v 1.8 Стационарный уровень процесса медленной инактиавации

Характеристики каналов Nav1.8 :

Констатнты скорости активационного процесса:

Констатнты скорости инактивационного процесса:

Константы скорости инактивационного процесса с учетом медленной инактивации:

Экспериментальные значения других параметров модели:

G Na f max = 50 нС, G Na s max = 200 нС, G K max = 40 нС, G L = 5 нС , С m = 20 пФ, E Na = 55 mV , E K = ‑ 85 mV , E L =- 70 мВ, ПП=-70 мВ G Na f max = 50 нС, G Na s max = 200 нС, G K max = 40 нС, G L = 5 нС , С m = 20 пФ, E Na = 55 mV , E K = ‑ 85 mV , E L =- 70 мВ, ПП=-70 мВ

Зависимость импульсной активности ноцицептивного нейрона от характеристик активационной воротной системы каналов Nav1.8 (расчеты на модели)

Зависимость частоты импульсной активности ноцицептивнго нейрона от величины стимулирующего тока (расчеты на модели)

Gating machinery of Na+ channel

Мишень 2 Натрий-калиевая АТФаза

Доказательство участия натриевого насоса в рецепции ИК излучения

1 – CO 2 -лазер

2, 5 – оптический клин

3 – измеритель мощности

4 – прерыватель

6 - полупроводниковый лазер

7 – дисковый ослабитель

8, 9 - зеркала

Схема экспериментальной установки

Семейство медленных натриевых токов

а – контрольный опыт

б – после воздействия лазерного излучения

а б

Зависимость нормированной проводимости от мембранного потенциала

Влияние излучения CO 2 лазера на потенциалочувствительность активационной системы медленных натриевых каналов

Влияние оуабаина на величину эффективного заряда при воздействии ИК излучения Низкоинтенсивное ИК излучение He-Ne и твердотельного (ТТЛ) лазеров (длины волн 3,39 и 1,06 мкм ) не влияет на величину эффективного заряда Z эфф Z эфф

Измерение порога ответов на ИК излучение в методике локальной фиксации потенциала

пороговые плотности мощности и энергии излучения, достигающего поверхности мембраны, составляли:

w =5,3  10 -15 Вт.см -2 , q =9,5  10 -13 Дж  см -2 , соответственно

Снижение возбудимости TTXr каналов, ведущее к купированию периферической боли, возможно в узком энергетическом диапазоне ( λ = 10.6 мкм) Диапазон низкоинтенсивной ИК-терапии (СО 2 –лазер)

Блок-схема установки для «формалинового теста» Регистрация числа сгибаний лапы («формалиновый тест»)

Опытный образец – «Камертон» прибор для накожной лазеротерапии

Мишень 3 Медленный натриевый канал

Endomorphin-1 (Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2)

Endomorphin-2 (Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2)

EM1applied internally inhibits TTXr currents

Возможный механизм блокирования проводимости медленных натриевых каналов эндоморфинами

Генетическая терапия Плазмида, экспрессирующая дефенсин человека NP1, обещает стать самым эффективным аналгетиком

NP-1 defensin

Концентрационная зависимость изменения относительной величины эффективного заряда Z eff активационной воротной системы ТТХ r каналов Средние значения - красные кружки - и ошибки среднего представляют результат нескольких измерений ( n - их число в скобках). Сплошная кривая - результаты расчетов с использованием уравнения Хилла при K D = 2 пмоль/л и Х = 0.9. Ось абсцисс- логарифм концентрации дефенсина [ Д ] , ось ординат - относительное изменение величины эффективного заряда.  Z eff norm =  Z eff /  Z eff max ={Z eff -Z eff min }/{Z eff max -Z eff min }=1-  1/[1+(K D /[Д]) X ]  , 1*10 -13 1*10 -12 1*10 -11

Sodium pump is involved in a membrane signalling pathway as a signal transducer

На основании теории Алмерса (Алмерс, 1981) р азработан количественный метод измерения величин ы эффективного заряда активационного воротного устройства медленных натриевых каналов . Установлено, что модуляция возбудимости этих каналов может быть рецептор-опосредованной и трансдуктор-опосредованной.

Рецептор-опосредованная модуляция возбудимости медленных каналов осуществлена гамма-пиронами, причем коменовая кислота стала лекарственной субстанцией нового неопиоидного аналгетика «Аноцептин». Первая фаза клинических исследований успешно завершена.

Трансдуктор-опосредованная модуляция возбудимости медленных натриевых каналов осуществлена с помощью низкоинтенсивного ИК лазерного воздействия. Опытный образец медицинского изделия проходит клинические исследования.

Выводы