“ Metodología clásica y molecular en la identificación de especies de Enterococcus spp” AUTORES M.Sepúlveda, H.Bello, M. Ruiz, J. Hormazábal, M. Domínguez, G. González, S. Mella, R. Zemelman Revista médica de Chile v.130 n.1 Santiago ene. 2002 REVIEW hecho por Tessy Caspine

AUTORES

M.Sepúlveda,

H.Bello,

M. Ruiz,

J. Hormazábal,

M. Domínguez,

G. González,

S. Mella,

R. Zemelman

OBJETIVOS Identificar las cepas de Enterococcus utilizando técnicas clásicas de bioquímica y de amplificación genómica con la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Comparar las dos técnicas: convencionales y PCR para la identificación de especies de importancia Clínica.

Identificar las cepas de Enterococcus utilizando técnicas clásicas de bioquímica y de amplificación genómica con la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

Comparar las dos técnicas: convencionales y PCR para la identificación de especies de importancia Clínica.

DATOS INTERESANTES En las bacterias de género Enterococcus, las especies más conocidas son E. fæcalis y E. fæcium. Las cepas de Enterococcus spp. poseen propiedades fisiológicas que facilitan su caracterización fenotípica por métodos bioquímicos convencionales  Muy complejo. Ahora se utilizan métodos moleculares: estudios de ac. Nucleicos para identificación de especies  PCR, hibridación ADN-ADN, hibridación ADN-ARN y análisis de proteínas.

En las bacterias de género Enterococcus, las especies más conocidas son E. fæcalis y E. fæcium.

Las cepas de Enterococcus spp. poseen propiedades fisiológicas que facilitan su caracterización fenotípica por métodos bioquímicos convencionales  Muy complejo.

Ahora se utilizan métodos moleculares: estudios de ac. Nucleicos para identificación de especies  PCR, hibridación ADN-ADN, hibridación ADN-ARN y análisis de proteínas.

¿QUÉ MÉTODOS SE UTILIZARON? Cepas bacterianas Muestreo Identificación . La identificación fenotípica de género se realizó según lo establecido por Facklam. A nivel de especie de acuerdo al esquema propuesto por Carvalho. PCR Multiplex: La identificación genotípica por Dutka-Malen.

Cepas bacterianas

Muestreo

Identificación .

La identificación fenotípica de género se realizó según lo establecido por Facklam.

A nivel de especie de acuerdo al esquema propuesto por Carvalho.

PCR Multiplex: La identificación genotípica por Dutka-Malen.

Cepas Bacterianas Se estudiaron 305 cepas de Enterococcus spp 244 de pacientes hospitalizados 61 de pacientes ambulatorios Controles E fæcalis ATCC 29212 E fæcium cepa Cernelle 68 (C-68)

Se estudiaron 305 cepas de Enterococcus spp

Controles

Identificación fenotípica Clasificación de Facklam Esta clasificación separa las especies en tres grupos basándose en la formación de ácidos en presencia de algunos sustratos como: manitol sorbitol sorbosa la hidrólisis de la arginina.

Clasificación de Facklam Esta clasificación separa las especies en tres grupos basándose en la formación de ácidos en presencia de algunos sustratos como:

manitol

sorbitol

sorbosa

la hidrólisis de la arginina.

Identificación fenotípica: especie Clasificación de Carvalho Se utilizan carbohidratos y un test de suceptibilidad (EFRO) que los divide en 5 grupos. Manitol Sorbosa Arginina Arabinosa Sorbitol Raffinosa Telurito Movilidad Pigmento Sacarosa Piruvato

Clasificación de Carvalho

Se utilizan carbohidratos y un test de suceptibilidad (EFRO) que los divide en 5 grupos.

Manitol

Sorbosa

Arginina

Arabinosa

Sorbitol

Raffinosa

Telurito

Movilidad

Pigmento

Sacarosa

Piruvato

Identificación genotípica Protocolo de Dutka-Malen Por medio de un ensayo de PCR permite la identificación de los genotipos de 4 glucopéptidos resistentes para Enterococcus. Van A: resistencia a Vancomicina y Teicoplanina. Van B: resistencia a Vancomicina y no a Teicoplanina. VanC 1 y Van C 2 : Bajos niveles de resistencia a Vancomicina.

Protocolo de Dutka-Malen

Por medio de un ensayo de PCR permite la identificación de los genotipos de 4 glucopéptidos resistentes para Enterococcus.

Van A: resistencia a Vancomicina y Teicoplanina.

Van B: resistencia a Vancomicina y no a Teicoplanina.

VanC 1 y Van C 2 : Bajos niveles de resistencia a Vancomicina.

PCR Multiplex Tipo especial de PCR Se amplifica más de una secuencia blanco. Se logra agregando en la reacción más de un par de primers. Ahorra tiempo y esfuerzo sin comprometer efectividad. Requisitos Los primers deben ser compatibles. Los primers utilizados deben tener un Tm parecidos y no deben exhibir interacción entre ellos o en la cadena de ADN.

Tipo especial de PCR

Se amplifica más de una secuencia blanco.

Se logra agregando en la reacción más de un par de primers.

Ahorra tiempo y esfuerzo sin comprometer efectividad.

Requisitos

Los primers deben ser compatibles.

Los primers utilizados deben tener un Tm parecidos y no deben exhibir interacción entre ellos o en la cadena de ADN.

Utilización de PCR Multiplex Aplicaciones en: Pruebas de ADN Análisis de delecciones Mutaciones Polimorfismos Ensayos cuantitativos Transcripción reversa (RT-PCR) Desventajas: Falta de amplificación o amplificación desigual. Dificultades en reproducir algunos resultados.

Aplicaciones en:

Pruebas de ADN

Análisis de delecciones

Mutaciones

Polimorfismos

Ensayos cuantitativos

Transcripción reversa (RT-PCR)

Desventajas:

Falta de amplificación o amplificación desigual.

Dificultades en reproducir algunos resultados.

Ejemplo

Protocolo General PCR Multiplex

PCR de bacterias en identificación 2 colonias 200uL de agua Centrifugar 10s 2uL sobrenadante 1uL de MgCl 2 (50mM) 2.5uL dNTP’s (1.25mM) 2uL de c/u De los primers (20p/mol) 2.5uL buffer 10X 0.15uL (5U/uL)

Programa de PCR

Programa de PCR

Primers utilizados

RESULTADOS E.Faecalis  89.2% E.faecium  10.2% E. hirae  1.2% E.gallinarum  0.4%, E.raffinosus  0.4%, E.avium  0.4% , E. durans  0.4% No identificada  0.4% 272 25 3

RESULTADOS: PCR Amplificación de 8 cepas E fæcalis por métodos bioquímicos. El fragmento de ADN amplificado (941 pb) fue comparable con aquel obtenido a partir de la cepa control de E fæcalis ATCC 29212.

Amplificación de 8 cepas E fæcalis por métodos bioquímicos.

El fragmento de ADN amplificado (941 pb) fue comparable con aquel obtenido a partir de la cepa control de E fæcalis ATCC 29212.

RESULTADOS: PCR Amplificación de 6 cepas de E fæcium. Producto de amplificación (550 pb), comparable con el producto de amplificación de la cepa control E fæcium C-68.

Amplificación de 6 cepas de E fæcium.

Producto de amplificación (550 pb), comparable con el producto de amplificación de la cepa control E fæcium C-68.

RESULTADOS:PCR Amplificación positiva (822 pb) de 1 cepa para E gallinarum. En una cepa que fenotípicamente había sido identificada como el complejo E casseliflavus/E gallinarum . 7 cepas de especies poco frecuentes no dieron amplificación positiva.

Amplificación positiva (822 pb) de 1 cepa para E gallinarum.

En una cepa que fenotípicamente había sido identificada como el complejo E casseliflavus/E gallinarum .

7 cepas de especies poco frecuentes no dieron amplificación positiva.

DISCUSIÓN FINAL E.faecalis y E. faecium son las bacterias mayormente aisladas en centros hospitalarios. En este trabajo se estandarizó un protocolo de identificación por medio de amplificación por PCR de algunas especies de Enterococcus . Los resultados permitieron confirmar en 100% el estudio fenotípico, además de identificar especies en casos donde la identificación a través de las propiedades fisiológicas no fue concluyente.

E.faecalis y E. faecium son las bacterias mayormente aisladas en centros hospitalarios.

En este trabajo se estandarizó un protocolo de identificación por medio de amplificación por PCR de algunas especies de Enterococcus .

Los resultados permitieron confirmar en 100% el estudio fenotípico, además de identificar especies en casos donde la identificación a través de las propiedades fisiológicas no fue concluyente.

CONCLUSIÓN y RECOMENDACIÓN Con la amplificación por PCR (molecular) hecha a las distintas cepas bacterianas fue posible comprobar la identificación fenotípica (bioquímica) La técnica de PCR puede ser de utilidad en la identificación de especies de Enterococcus , particularmente de aquellas cuya identificación fenotípica es más compleja.

Con la amplificación por PCR (molecular) hecha a las distintas cepas bacterianas fue posible comprobar la identificación fenotípica (bioquímica)

La técnica de PCR puede ser de utilidad en la identificación de especies de Enterococcus , particularmente de aquellas cuya identificación fenotípica es más compleja.