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Seleção de Meiócitos de Agapanthus por coloração com carmim acético

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Cartaz relativo à meiose em células de Agapanthus elaborado em 2008 por António Marcelino Lopes, Maria Rita Araújo e Teresa Lacerda

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Seleção de Meiócitos de Agapanthus por coloração com carmim acético

  1. 1. SUMÁRIO SELECÇÃO DE MEIÓCITOS DE AGAPANTHUS Sendo a meiose um processo de divisão celular que conduz à formação de células com metade do número de cromos- POR COLORAÇÃO COM CARMIM ACÉTICO somas da célula inicial, é também o principal processo responsável pela variabilidade genética dos indivíduos com reprodu- ção sexuada. Durante a primeira divisão da meiose, na profase I, ocorre uma recombinação do material genético, denomi- nada permuta ou crossing-over, principal fonte de variabilidade genética. Por ser uma das fases mais importantes da meio- se, este poster centra-se nos acontecimentos desta primeira etapa. Para isso, procedeu-se à selecção de meiócitos de Agapanthus por coloração com carmim acético e à identificação das etapas de evolução dos cromossomas ao longo da pro- fase I. Utilizando flores de Agapanthus, procedeu-se à selecção de meiócitos começando por se extrair, com a ajuda de um bisturi e de uma pinça, as anteras menos maduras das inflorescências. Em seguida, para se evidenciar o conteúdo cromos- António Marcelino Lopes, Maria Rita Araújo, Teresa Lacerda sómico dos meiócitos das anteras separadas procedeu-se à sua coloração com carmim acético. Com o microscópio óptico composto foi possível observar meiócitos de Agapanthus e identificar as várias fases do processo da meiose. No decurso da profase I identificaram-se os cromossomas corados, primeiro pouco condensados - em leptóteno - e progressivamente Escola Secundária da Póvoa de Lanhoso cada vez mais condensados em zigóteno, paquíteno, diplóteno e diacinese. O carmim acético revelou-se um bom corante pois permitiu evidenciar, com alguma clareza, o conteúdo cromossómico dos meiócitos das anteras extraídas. Junho de 2008 Palavras-chave: meiose, profase I, Agapanthus INTRODUÇÃO A meiose é um processo de divisão celular que conduz à formação de células com metade do número de cromossomas da célula inicial, através de duas divisões nucleares sucessivas: divisão I ou reducional e divisão II ou equacional (Raven & Johnson, 1996). A célula que vai entrar em divisão começa por sofrer uma duplicação do seu ADN e um aumento do seu volume e tamanho, fenómenos característicos da interfase, fase do ciclo celular que antecede a meiose. A primeira divisão da meiose é a mais complexa, durante a qual ocorre a redução a metade do número de cromossomas. Qualquer das divisões (I e II) ocorre em quatro fases: profase, metafase, anafase e telofase. Por ser uma das fases mais importantes da meiose, o nosso trabalho focalizou-se sobre os acontecimentos que decorrem durante a profase I, fase de longa duração e de reconhecida relevância, pois contribui para o aumento da variabilidade genética dos organismos (Van den Heuvel, 2005). Esta fase caracteriza-se pela evolução das características e posições dos cromossomas no núcleo descritas através de cinco sub- divisões: leptóteno, zigóteno, paquíteno, diplóteno e diacinese. É notório o início da condensação dos cromossomas em leptóteno bem como o início do alinhamento dos homólogos, em zigóteno, com a formação das tétra-DIVIDIR PARA DIVERSIFICAR: MEIOSE das cromatídicas ou bivalentes. Nesta fase forma-se o complexo sinaptonémico que corresponde a uma estrutura proteica que permite o alinhamento correcto dos cromossomas homólogos que constituem o bivalente; este complexo fornece o suporte necessário à recombinação (crossing-over) não estando, contudo, envolvido no processo. A sinapse total dos cromossomas homólogos bem como o processo de crossing-over acontece em pa- quíteno. No diplóteno os cromossomas homólogos, mais condensados, começam a repelir-se permanecendo unidos pelos pontos de quiasma, locais onde ocorreu crossing-over entre os dois cromatídeos de cromossomas homólogos (Araújo et al., 2007). Na última etapa da profase I, a diacinese, os cromossomas encontram-se muito condensados, desaparecem o invólucro nuclear e o nucléolo e verifica-se a telomerização que consiste no movimento dos quiasmas para as extremidades dos cromossomas (Cowan et al., 2001). Este processo de divisão celular assume uma importância fundamental, pois, para além de assegurar a estabilidade do número de cromossomas próprio de cada espécie de geração em geração (na fecundação ocorre a du- plicação cromossómica e na meiose uma redução do número de cromossomas para metade), permite novas recombinações genéticas, contribuindo para uma acentuada variabilidade de características da descendência produzida por reprodução sexuada (Amabis & Martho, 1999). Como material biológico para a observação das subdivisões da profase I utilizou-se anteras de flores de Agapanto (figura 1). Esta planta do género Agapanthus, oriunda da África do Sul, pertence à família Agapanthaceae, da ordem Asparagales que inclui nove espécies: A. campanulatus, A. africanus, A. orientalis, A. umbellatus, A. mooreanus, A. praecox, A. caulescens, A. inapertus, A. pendulus. A observação dos cromossomas, no decurso da profase I, nos meiócitos das anteras de Agapanthus foi possível devido à utilização de um corante: o carmim acético. Um corante é toda a substância que, se adicionada a ou- Figura 1 - Inflorescências de Agapanthus tra substância, altera a cor desta. Pode ser uma tintura, pigmento, tinta ou um composto químico. MATERIAIS E MÉTODOS SELECÇÃO E COLORAÇÃO DE MEIÓCITOS Recolheu-se uma inflorescência imatura de uma planta do género Agapanthus que foi cortada longitudinalmente com o auxílio de um bisturi (figura 2) para que os botões ficassem a descoberto. Com uma pinça seleccionaram-se os botões mais interiores pelo facto de conterem anteras menos maduras (figura 3) e assim ser possível observar as fases iniciais da meiose. Um dos botões foi colocado numa lâmina e foi aberto à lupa, com auxílio de uma pinça e de uma agulha muito fina, para se poderem destacar as anteras (figura 4). Retirou-se uma das anteras que se colocou numa gota de carmim acético (figura 5) e cobriu-se com uma lamela (figura 6). De seguida, rebentou-se a antera através de uma pancada seca vertical realizada sobre a lamela com o auxílio de um palito ou do cabo da pinça (figura 7). Este procedimento deve ser feito de forma cuidada para não partir a lamela. No sentido de activar a coloração, aqueceu-se a preparação à chama de uma lamparina (2 ou 3 passagens rápidas pela chama, evitando a fervura) (figura 8). Após a realização da preparação fez-se a sua observação ao microscópio óptico composto (figura 9) para identificar a(s) fase(s) da meiose das células presentes na antera seleccionada. Feita esta identificação, colocaram-se as restantes anteras numa placa de Petri onde foi aplicado previamente um papel de filtro humedecido com a indicação das diferentes fases da meiose (figura 10). Assim, as anteras foram dispostas na zona correspondente à fase em que se encontravam preferencialmente os meiócitos (figura 11) e que foi identificada pela observação microscópica. Figura 2 - Agapanthus Figura 3 - Selecção de botões de Agapanthus Figura 4 - Selecção de anteras de Agapanthus Figura 5 - Lâmina com carmim acético Figura 6 - Antera entre lâmina e lamela Figura 7 - Pancada para rebentar a antera FIXAÇÃO DE MEIÓCITOS Para a fixação das anteras procedeu-se à etiquetagem de tubos tipo eppen- PREPARAÇÃO DO CARMIM ACÉTICO PARA A dorf com o nome da planta, a fase da meiose em que os meiócitos se en- COLORAÇÃO DOS MEIÓCITOS contravam e a data de fixação (figura 12). De seguida, pipetou-se para o tu- bo etanol acético 3:1 (v/v – 3 partes de etanol absoluto para uma parte de ácido acético glacial) à temperatura ambiente (figura 13). Colocaram-se as A preparação do carmim acético que foi utilizada para a coloração do ADN anteras dentro do tubo no referido fixador (figura 14), o qual foi renovado no existente nos meiócitos fez-se dissolvendo 4,5 g de carmim numa mistura Figura 8 - Aquecimento da preparação na lamparina Figura 9 - Observação da preparação ao microscópio período entre as 3 e as 12 horas. Após este procedimento as anteras po- de 45 ml de ácido acético glacial e 55 ml de água destilada. dem ser conservadas a -20 ºC durante vários meses. Ferveu-se a mistura durante uma hora, em banho-maria, agitando bem. Em seguida, deixou-se arrefecer e filtrou-se para um frasco. Mergulhou-se um prego ferrugento, durante 10 minutos, no preparado indicado para que este procedesse à oxidação do carmim. Filtrou-se e colocou-se num frasco escuro à temperatura ambiente. Pode ser conservado nesse frasco durante meses desde que bem fechado. Figura 12 - Etiquetagem do tubo Figura 13 - Pipetagem do fixa- Figura 14 - Fixação das anteras (nome planta - fase meiose) dor (etanol acético 3:1) de Agapanthum Figura 10 - Reserva das anteras para fixação Figura 11 - Colocação das anteras para fixação na fase da meiose correspondente RESULTADOS CONCLUSÕES As preparações observadas permitiam distinguir os meiócitos – células sinalizadas para entrar em meiose – das células do tapete – ten- O carmim acético permitiu a coloração do ADN em meiócitos de Agapanthus. do-se centrado as observações nas diferentes sub-divisões da profase I (figura 15) devido à grande duração e importância desta fase. Nas diversas preparações com meiócitos de Agapanthus foi possível observar, no decurso da profase I, os cromossomas corados com Durante a profase I ocorrem 3 eventos sequenciais que são fundamentais para o sucesso da meiose: carmim acético, primeiro pouco condensados - em leptóteno (figura 16) - e progressivamente cada vez mais condensados em zigóteno - condensação da cromatina (ou dos cromossomas); (figura 15A; 17), verificando-se o início do emparelhamento dos cromossomas homólogos que se conclui em paquíteno (figura 15B; 18, - emparelhamento (ou sinapse) dos cromossomas homólogos; 20A). Em diplóteno (figura 15C; 19) observou-se que os cromossomas homólogos começaram a repelir-se, permanecendo os homólo- - recombinação entre cromossomas homólogos. gos unidos pelos pontos de quiasma. A condensação total dos cromossomas, a desagregação da membrana nuclear e dos nucléolos e a telomerização verificou-se em diacinese (figura 15D, 20B). REFERÊNCIAS Amabis, J. M.; Martho, G. R. 1999. Biologia das Populações – Genética, Evolução e Ecologia. São Paulo: Editora Moderna Lda. Raven, P. H.; Johnson, G. B. 1996. Biology. USA: Wm. C. Brown Publishers. Cowan, C. R.; Carlton, P. M.; Cande, W. Z. 2001.The Polar Arrangement of Telomeres in Interphase and Meiosis. Rabl Organization and the Bouquet. In: Plant Physiology. American Society of Plant Physiologists. Vol. 125, pp. 532–538. Araújo, C. H.; Araújo, M. C.; Martins, W. P.; Ferriani, R. A.; Reis, R. M. 2007. Gametogênese: Estágio Fundamental do Figura 15 - Prófase I (A - Zigóteno; B - Paquíteno; Figura 16 - Leptóteno (ampliação 400x) Figura 17 - Zigóteno (ampliação 400x) Desenvolvimento para Reprodução Humana. Medicina (Ribeirão Preto). 2007; 40 (4): 551-8, out./dez. Disponível na C - Diplóteno; D - Diacinese. - Ampliação 400x) World Wide Web: http://www.fmrp.usp.br/revista Van den Heuvel, S. 2005. Cell-cycle regulation. In: WormBook. James M. Kramer and Donald G. Moerman (ed), The C. elegans Research Community, WormBook, http://www.wormbook.org. Disponível na World Wide Web: http:// www.wormbook.org/chapters/www_cellcyclereguln/cellcyclereguln.html Poster elaborado no âmbito da Acção de Formação Dividir para diversificar: Meiose Promovida pelo Centro de Formação da Ordem dos Biólogos Orientada por Filipe Ressurreição Figura 18 - Paquíteno (ampliação 400x) Figura 19 - Diplóteno (ampliação 400x) Figura 20 - Paquíteno (A) e Diacinese (B) Visionarium de Santa Maria da Feira (ampliação 400x)

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