واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×
 

واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR

on

  • 522 views

PCR

PCR

Statistics

Views

Total Views
522
Views on SlideShare
284
Embed Views
238

Actions

Likes
1
Downloads
0
Comments
0

5 Embeds 238

http://www.sababiomed.org 134
http://pdpsaba.mihanblog.com 86
http://sababiomed.org 11
http://mihanblog.com 6
http://translate.googleusercontent.com 1

Accessibility

Categories

Upload Details

Uploaded via as Adobe PDF

Usage Rights

© All Rights Reserved

Report content

Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
  • Full Name Full Name Comment goes here.
    Are you sure you want to
    Your message goes here
    Processing…
Post Comment
Edit your comment

واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR Document Transcript

  • ‫کلینیک تخصصی طراحی پرایمر و مهنذسی پروتئین‬ ‫‪http://www.Taqprimer.com‬‬ ‫واکنش زنجيره ای پليمراز‬ ‫‪PCR‬‬ ‫1‬ ‫1‪ PCR‬يك تكٌيك آسهبيؾگبّي اعت كِ تكثيز2 يك ًبحيِ اختصبصي ‪ DNA‬را - كِ‬ ‫ثيي دٍ ًبحيِ تَالي ؽٌبختِ ؽذُ ‪ DNA‬قزار دارد- هوكي هيعبسد. ثِ هٌظَر تؼزيف‬ ‫‪ PCR‬هب ثبيذ در اثتذا هَلكَل ‪ DNA‬را ثزرعي كٌين. در ٍضؼيت عجيؼي، ‪ DNA‬ثِ‬ ‫صَرت يك هبرپيچ دٍ تبيي ٍجَد دارد. ايي هبرپيچ داراي رؽتِ ّبيي اس ‪ DNA‬هيثبؽذ‬ ‫كِ ثِ صَرت ًبّوغَ3 ًغجت ثِ يكذيگز قزار گزفتِاًذ ٍ ثِ ٍعيلِ پيًَذّبي ّيذرٍصًي‬ ‫ثِ عَر غيزكٍَاًغي كٌبر ّن ًگِ داؽتِ هيؽًَذ. پيًَذّبي ّيذرٍصًي ثيي ثبسّبي‬ ‫هكول، آدًيي )‪ (A‬ثب تيويي )‪ ٍ (T‬گَاًيي )‪ (G‬ثب عبيتَسيي )‪ ،(C‬تؾكيل هي ؽًَذ. ّز‬ ‫كذام اس ثبسّب ثِ يك هَلكَل قٌذي ثِ ًبم دِاُكغيريجَس4 ٍ ّز هَلكَل قٌذي اس عزيق يك‬ ‫گزٍُ فغفبت ثِ هَلكَل قٌذي ّوجَار خَد هتصل هي ؽًَذ. يك ٍاحذ‪ DNA‬ؽبهل يك‬ ‫گزٍُ فغفبت، يك قٌذ ٍ يك ثبس اعت ٍ ثِ ػٌَاى يك ًَكلئَتيذ ؽٌبختِ هي ؽَد، يك‬ ‫قٌذ ٍ يك ثبس ثِ تٌْبيي ثِ ػٌَاى يك ًَكلئَسيذ5 ؽٌبختِ هيؽَد. ثزاي تؾخيص ثيي‬ ‫ؽوبرُ گذاري ثبس ٍ ؽوبرُ گذاري قٌذ، ؽوبرُّبي كزثيّبي قٌذ ّز يك داراي پزاين‬ ‫(هثال ´5 ٍ ´3) ّغتٌذ. كزثيّبي ´5 ٍ ´3 قٌذّبي هجبٍر اس عزيق گزٍُّبي فغفبت ثِ‬ ‫ّن ٍصل هيؽًَذ، اس ايي رٍ ‪ DNA‬تك رؽتِ ٍ هَلكَل هزثَعِ ٍ ‪( RNA‬ريجًََكلئيك‬ ‫اعيذ) داراي يك پبيبًِ ´5 ٍ يك پبيبًِ ´3 ّغتٌذ. پبيبًِ ´5 يك رؽتِ ‪ DNA‬دٍ رؽتِاي‬ ‫ثب پبيبًِ ´3 رؽتِ ديگز هكول ّغتٌذ. ‪ RNA‬ثِ جبي تيويي )‪ ،(T‬داراي ثبس اٍراعيل )‪(U‬‬ ‫اعت، ٍ يك گزٍُ ّيذرٍكغيل اضبفي در جبيگبُ ´2 رٍي قٌذ هزثَعِ اػ (ريجَس) دارد.‬ ‫در ‪ U ،RNA‬هيتَاًذ ثب ‪ A‬جفت ؽَد.‬ ‫‪1 - Polymerase Chain Reaction‬‬ ‫‪2 - Amplification‬‬ ‫‪3 - Antiparallel‬‬ ‫‪4 - Deoxyribose‬‬ ‫‪5 - Nucleoside‬‬
  • ‫کلینیک تخصصی طراحی پرایمر و مهنذسی پروتئین تک پرایمر‬ ‫‪http://www.taqprimer.com‬‬ ‫عزاحي حزفِ اي اًَاع پزايوز، پزٍة، ٍكتَر ٍ كبعت صى‬ ‫خذهبت تخصصي در سهيٌِ اًجبم پزٍصُ ّبي تخصصي هزتجظ ثب ثيَتكٌَلَصي ٍ سيغت‬ ‫هؾبٍرُ پزٍصُ ّبي داًؾجَيي، تحقيقبتي ٍ تَليذي‬ ‫تکنيک‬ ‫2‬ ‫‪PCR‬‬ ‫تكثيز‪ DNA‬ثب اعتفبدُ اس پزايوزّبي اٍليگًََكلئَتيذي- كِ ّوچٌيي ثِ ػٌَاى‬ ‫آهپليهزّب1 ؽٌبختِ ؽذُاًذ- حبصل هيؽَد. اييّب هَلكَلْبي ‪ DNA‬تكرؽتِاي ٍ‬ ‫كَتبّي ّغتٌذ كِ ثب پبيبًِّبي يك تَالي الگَي ‪ DNA‬هكول هيثبؽٌذ. پزايوزّب ثِ‬ ‫ٍعيلِ ‪ DNA‬پليهزاس رٍي ‪ DNA‬الگَ ٍاعزؽت ؽذُ تكرؽتِاي در حضَر ‪ّdNTP‬ب‬ ‫(داكغي ًَكلئَسيذ تزي فغفبتْب) تحت ؽزايظ هٌبعت ثزاي ٍاكٌؼ، پليوزيشُ2 هيؽًَذ،‬ ‫ثذيي تزتيت عٌتش رؽتِّبي جذيذ ‪ DNA‬هكول ثب رؽتِّبي الگَ، صَرت هيگيزد. ايي‬ ‫رؽتِّب در ايي هزحلِ، ثِ صَرت هَلكَلْبي ‪ DNA‬دٍ رؽتِاي ّغتٌذ. عٌتش رؽتِ،‬ ‫هيتَاًذ ثب ٍاعزؽت ؽذى حزارتي ‪ DNA‬دٍ رؽتِاي، چغجيذى پزايوزّب ثِ ‪DNA‬ي‬ ‫هكول ثب كبّؼ دادى دهبي هخلَط ٍاكٌؼ، ٍ پليوزيشُ ؽذى ٍ تغَيل عبسي پزايوز3 ثِ‬ ‫ٍعيلِ ‪ DNA‬پليهزاس در درجِ حزارت هٌبعت ثزاي ٍاكٌؼ آًشين، تكزار ؽَد. ّز تكزار‬ ‫عٌتش رؽتِ، ؽبهل يك عيكل تكثيز اعت. ّز رؽتِ جذيذ ‪ DNA‬عٌتش ؽذُ، الگَيي‬ ‫ثزاي عيكل ثؼذي تكثيز هيؽَد ٍ ثٌبثزايي تَالي ‪ DNA‬هَرد ًظز تكثيز يبفتِ، ثِ عَر‬ ‫اًتخبثي عيكل ثِ عيكل، تكثيز دادُ هيؽَد. اٍليي هحصَالت پليوزيشُ ؽذى پزايوز‬ ‫حبصل اس عٌتش ‪ ،DNA‬رٍي الگَي اصلي، عَل هؾخصي ًذارًذ. اس آًجبييكِ ‪DNA‬‬ ‫پليهزاس ثِ عٌتش ‪ DNA‬جذيذ اداهِ هيدّذ تب ايٌكِ يب عٌتش ‪ DNA‬هتَقف ؽَد يب آًشين‬ ‫ثِ ٍعيلِ ؽزٍع عيكل ثؼذي اس فؼبليت ثيفتذ. ثِ ّز حبل، در عيكل عَم قغؼبت تَالي‬ ‫هَرد ًظز عَري عٌتش هيؽًَذ كِ عَل هؾخص ثب هَقؼيتّبي پزايوزّب رٍي الگَي‬ ‫اصلي هغبثقت دارًذ. اس عيكل چْبرم ثِ ثؼذ تَالي هَرد ًظز ثِصَرت ًوبيي‬ ‫)‪ (exponentially‬تكثيز هيؽَد. ثٌبثزايي، تكثيز (تؼذاد ًْبيي كپيّبي هَرد ًظز) ثِ‬ ‫ٍعيلِ فزهَل ‪ (2n-2n)x‬ثيبى هيؽَد كِ:‬ ‫تؼذاد عيكلّب =‪n‬‬ ‫اٍليي هحصَل ثِ دعت آهذُ پظ اس عيكل 1 + هحصَالت حبصل پظ اس عيكل 2 ثب‬ ‫عَل ًبهؾخص=‪2n‬‬ ‫تؼذاد كپيّبي الگَي اصلي=‪x‬‬ ‫‪1 - Amplimers‬‬ ‫‪2 - Extend‬‬ ‫‪3 - Primer extension‬‬ ‫تْيِ ؽذُ در هؤعغِ پيك داًؼ پضٍّبى صجب (تك پزايوز)‬ ‫قغوتي اس كتبة "تکنیک ‪ PCR‬و نرم افزار ‪ٍ "FAST PCR‬يزايؼ اٍل‬ ‫ًَيغٌذگبى: هحوذرضب دّقبًي، هٌيزُ ّزاتيبى‬
  • ‫کلینیک تخصصی طراحی پرایمر و مهنذسی پروتئین‬ ‫‪http://www.Taqprimer.com‬‬ ‫واکنش زنجيره ای پليمراز‬ ‫3‬ ‫‪PCR‬‬ ‫اصَالً، ثب در ًظز گزفتي ايٌكِ ثبسدُ در عي ّز عيكل 111% اعت پظ اس 12 عيكل‬ ‫‪ ،PCR‬تكثيز 1212 ثزاثز خَاّذ ؽذ. ثبسدُ ‪ PCR‬اس الگَيي ثِ الگَي ديگز هتفبٍت اعت ٍ‬ ‫ثب درجِ ثْيٌِعبسي1 كِ اًجبم ؽذُ اعت تغبثق دارد.‬ ‫‪ PCR‬يك فزايٌذ درگزدػ2 هيثبؽذ. در ّز‬ ‫عيكل تؼذاد ‪ّDNA‬بي ّذف دٍ ثزاثز‬ ‫هيؽًَذ. رؽتِّب در ‪ّ DNA‬ذف ثب اعتفبدُ‬ ‫اس ٍاعزؽت ؽذى حزارتي اس ّن جذا‬ ‫هيؽًَذ ٍ عپظ عزد هيؽًَذ تب چغجيذى‬ ‫پزايوزّب را ثِ ًبحيِ ّذف هيغز عبسًذ3.‬ ‫عپظ ‪DNA‬پليهزاس، پزايوزّب را عَيل ٍ‬ ‫پليوزيشُ هيًوبيذ (درحضَر 4 ًَع‬ ‫ًَكلئَتيذ ٍ ثبفز هٌبعت) ثؼذ اس 4 عيكل،‬ ‫افشايؼ ًوبيي ثزاي ‪ّ DNA‬ذف دارين.‬ ‫تؼذاد عيكل ثِعَر عجيؼي 14-12 عيكل‬ ‫هيثبؽذ.‬ ‫ؽكل 1-1- ٍاكٌؼ سًجيزُاي پليهزاس‬ ‫‪1 - Optimization‬‬ ‫‪2 - Cycling‬‬ ‫‪3 - Annealing‬‬ View slide
  • ‫کلینیک تخصصی طراحی پرایمر و مهنذسی پروتئین تک پرایمر‬ ‫‪http://www.taqprimer.com‬‬ ‫عزاحي حزفِ اي اًَاع پزايوز، پزٍة، ٍكتَر ٍ كبعت صى‬ ‫خذهبت تخصصي در سهيٌِ اًجبم پزٍصُ ّبي تخصصي هزتجظ ثب ثيَتكٌَلَصي ٍ سيغت‬ ‫هؾبٍرُ پزٍصُ ّبي داًؾجَيي، تحقيقبتي ٍ تَليذي‬ ‫تکنيک‬ ‫4‬ ‫‪PCR‬‬ ‫جذٍل1-1- آًبليش كويتي1يك ‪ PCR‬قجل ٍ ثؼذ اس 52 عيكل‬ ‫فزض ثز ايي اعت كِ تكثيز، 511 ثزاثز صَرت هيگيزد كِ تقزيجب ايي ثب ثبسدُ 17%‬ ‫تكثيز هزتجظ اعت. هحصَل تَالي هَرد ًظزي (ثِ تَالي ّذف، آهپلي كَى2 ًيش‬ ‫هيگَيٌذ) كِ حبصل هيؽَد داراي تَاليّبي پزايوز اٍليگًََكلئَتيذي در پبيبًِّبيؼ‬ ‫اعت. اگز چِ ثبسدُاي ثغيبر ثبال دارد اهب تكثيز تَاليّبي هَرد ًظز ثِ عزيق ًوبيي يك‬ ‫فزآيٌذ ًبهحذٍد ًيغت ثلكِ هحذٍديت دارد. يك تؼذاد فبكتَرّبيي ػليِ ايي فزآيٌذ ػول‬ ‫هيكٌٌذ كِ در ّز عيكل 111% هؤثزًذ. اثز ٍ تأثيزؽبى ثيؾتز در عيكلّبي ًْبيي‬ ‫‪ PCR‬هؾخص هيؽَد. اصَال هقذار آًشين پظ اس 13-52 عيكل ‪ ،PCR‬هحذٍد كٌٌذُ‬ ‫هيؽَد كِ تقزيجب ثب 611 ثزاثز تكثيز هغبثقت داردكِ ثِ ٍاعغِ هيشاى هَالر اضبفي ّذف‬ ‫اعت. فؼبليت آًشين ًيش يك فبكتَر هحذٍد كٌٌذُ اعت كِ ػلت آى ٍاعزؽت ؽذُ ؽذى‬ ‫حزارتي آًشين درعي فزآيٌذ اعت.‬ ‫3‬ ‫فبكتَر ثؼذي كِ كبرآيي ‪ PCR‬را كبّؼ هيدّذ رؽتِّبي هَرد ًظز اعت. اس‬ ‫آًجبييكِ هَلكَلْبي ّذف (الگَ) غلظت ؽبى افشايؼ هييبثذ، چغجٌذگي هجذد‬ ‫رؽتِّبي هَرد ًظز ثب چغجيذى پزايوز ثِ هَلكَل ّذف (الگَ) رقبثت هيكٌذ. حبئش‬ ‫اّويت اعت كِ ّز ٍاريبًغي در رٍػ ‪ PCR‬ثِ حذاقل رعبًذُ هيؽَد تب كبرآييّبي‬ ‫111% عيكل حبصل ؽَد.‬ ‫اجشاي اصلي ‪ PCR‬هؼوَل، در ؽكل سيز ًؾبى دادُ هيؽًَذ ٍ ثِ عَر جشئيتز ثؼذاً‬ ‫ثحث خَاّذؽذ.‬ ‫‪1 - Quantitative‬‬ ‫‪2 - Amplicon‬‬ ‫‪3 - Reannealing‬‬ ‫تْيِ ؽذُ در هؤعغِ پيك داًؼ پضٍّبى صجب (تك پزايوز)‬ ‫قغوتي اس كتبة "تکنیک ‪ PCR‬و نرم افزار ‪ٍ "FAST PCR‬يزايؼ اٍل‬ ‫ًَيغٌذگبى: هحوذرضب دّقبًي، هٌيزُ ّزاتيبى‬ View slide
  • ‫کلینیک تخصصی طراحی پرایمر و مهنذسی پروتئین‬ ‫‪http://www.Taqprimer.com‬‬ ‫واکنش زنجيره ای پليمراز‬ ‫‪PCR‬‬ ‫5‬ ‫ؽكل 1-2- اجشاي اصلي تكثيز ‪PCR‬‬ ‫هؼزفْبي هختلف ٍ ٍعبيل ٍ اثشار هتٌَػي ثزاي ‪ PCR‬ثِ عَر آهبدُ اس تْيِ كٌٌذُّبي‬ ‫تجبري در دعتزط ّغتٌذ. ‪ّDNA‬بي الگَ يب ثِ ٍعيلِ هحقق يب ثِ ٍعيلِ عجيت‬ ‫ثبليٌي1 تْيِ هيؽًَذ اس عزفي، ‪ّDNA‬بي صًَهي، كتبثخبًِّبي صًَهيك، كتبثخبًِّبي‬ ‫‪ّRNA ٍ ،DNA‬ب ّوچٌيي ثِ عَر تجبري در دعتزط ّغتٌذ. پزايوزّبي‬ ‫اٍليگًََكلئَتيذي هيتَاًٌذ ّوچٌيي در ثغيبري اس آسهبيؾگبُّب عٌتش ؽًَذ يب هيتَاًٌذ‬ ‫ثِ صَرت هؼزفْبي عٌتش ؽذُ هزعَم خزيذاري ؽًَذ. اجشاي ٍاكٌؼ ‪ً PCR‬ظيز ثبسّب،‬ ‫2‪ّdNTP ٍ ،MgCl‬ب ّوچٌيي تَعظ ثغيبري اس تْيِ كٌٌذگبى در دعتزط قزارهيگيزًذ‬ ‫يب هيتَاًٌذ ثِ ٍعيلِ هحقق، تْيِ ؽًَذ. يك هحذٍدُ ٍعيؼي اس ‪ DNA‬پليهزاسّبي‬ ‫هقبٍم ثِ حزارت اكٌَى اس ثغيبري اس كبرخبًِّب در دعتزط ّغتٌذ. ٍ كبرثزدّب ٍ‬ ‫ٍيضگيْبي اييّب ثِ عَر جشئي تز در قغوت ديگزي ثحث هيؽَد.‬ ‫پزٍتَكلّبي اصلي ‪ ،PCR‬اس قغؼِ كلٌَ‪ DNA‬پليوزاس ‪ E.coli2: I‬ثزاي تغزيغ ًوَدى‬ ‫پليوزاس ٍ تغَيل اٍليگًََكلئَتيذ اعتفبدُ هيؽذ. ثِ ّز حبل، ايي آًشين در عي هزحلِ‬ ‫ٍاعزؽت ؽذى عيكل ‪ PCR‬ثب حزارت غيزفؼبل هيؽَد ٍ ثٌبثزايي هحقق ثبيذ يك هقذار‬ ‫ًوًَِ3 تبسُ اس آًشين را در ّز عيكل فزآيٌذ تكثيز، اضبفِ ًوبيذ. ثذيْي اعت كِ يك‬ ‫هحذٍديت جذي ايجبد هيگزدد، خصَصبً تالػّبيي كِ ثزاي خَدكبر كزدى تكٌيك،‬ ‫صَرت هيگيزد هحذٍد هيؽَد. كبرثزد آًشين كلٌَ ثزاي تكثيز قغؼبت كَتبُ ‪DNA‬‬ ‫)‪ (<200bp‬ثِ كبر ثزدُ هيؽذ. اهب ثزاي آهپليكَىّبي ثشرگتز، هأيَط كٌٌذُ ثَد. اغلت‬ ‫هيشاى هحصَالت كن ثَد ٍ در ضوي تٌَع اًذاسُ هحصَالت هؾَْد ثَد. ايي اهز ثِ ٍاعغِ‬ ‫درجِ حزارتْبي پبييي چغجيذى ٍ عَيلعبسي4 (‪ )37ºc‬ثَد كِ ثبيذ ثزاي آًشين كلٌَ ثِ‬ ‫‪1 - Clinician‬‬ ‫‪2- DNA Klenow fragment‬‬ ‫‪3 - Aliquot‬‬ ‫‪4 - Extension‬‬
  • ‫کلینیک تخصصی طراحی پرایمر و مهنذسی پروتئین تک پرایمر‬ ‫‪http://www.taqprimer.com‬‬ ‫عزاحي حزفِ اي اًَاع پزايوز، پزٍة، ٍكتَر ٍ كبعت صى‬ ‫خذهبت تخصصي در سهيٌِ اًجبم پزٍصُ ّبي تخصصي هزتجظ ثب ثيَتكٌَلَصي ٍ سيغت‬ ‫هؾبٍرُ پزٍصُ ّبي داًؾجَيي، تحقيقبتي ٍ تَليذي‬ ‫تکنيک‬ ‫6‬ ‫‪PCR‬‬ ‫كبر گزفتِ هيؽذ تب اس لحبػ كبتبلتيكي فؼبل ثبؽذ. هحذٍديت جذي ديگز در رٍسّبي اٍل‬ ‫تكٌيك ‪ ،PCR‬اعتفبدُ اس اًتقبل دعتي ًوًَِّب ثيي حوبمّبي آة يب قبلت ّبي حزارتي‬ ‫در درجِ حزارتْبي اختصبصي اثقبء ؽذُ ثزاي ّز عيكل ‪ PCR‬هَرد ًيبس ثَد. دٍ ٍعيلِ‬ ‫تكٌَلَصيكي ثغيبر هْن ‪ PCR‬را ثِ صَرت يك رٍػ كليذي در آسهبيؾگبُّبي تحقيقبتي‬ ‫ٍ كليٌيكي عبختِاًذ:‬ ‫1- اعتفبدُ اس ‪ DNA‬پليهزاسّبي هقبٍم ثِ حزارت كِ كل رٍػ را ثغيبر آعبى‬ ‫كزدُاًذ ثِ ايي دليل كِ اضبفِ كزدى آًشين تبسُ ثؼذ اس ّز هزحلِ دًبتَراعيَى ديگز السم‬ ‫ًيغت. اٍليي ‪ DNA‬پليهزاس هقبٍم ثِ حزارت كِ ثِ ‪ّPCR‬ب القبء ؽذ، تك ‪DNA‬‬ ‫پليوزاس1 ثَد.‬ ‫2- تَعؼِ يكغزي دعتگبُّبي عبدُ عيكليٌگ درجِ حزارت (ّوچٌيي ثِ ػٌَاى‬ ‫تزهبل عبيكلزّب يب دعتگبُّبي ‪ PCR‬ؽٌبختِ ؽذُ اًذ) هٌجز ثِ اتَهبتيك ؽذى ‪PCR‬‬ ‫ؽذ.‬ ‫فزآيٌذ ‪ PCR‬تَعظ اهتيبسّب ٍ حق ثجت اًحصبري هتؼلق ثِ ‪Hoffmann-La Roche‬‬ ‫‪ F.Hoffmann-La Roche ،Ltd ٍ Inc‬پَؽؼ دادُ هيؽَد.‬ ‫به زودی توسط تک پرایمر منتشر می شود:‬ ‫‪ ‬کتبة تکنیک ‪ PCR‬و نرم افسار ‪ FAST PCR‬ویرایش جذیذ‬ ‫‪ ‬کتبة آموزش طراحی پرایمر و نرم افسار ‪GENERUNNER‬‬ ‫برای تهیه این کتببهب می توانیذ از اول آررمبه 1392به آدرس زیر‬ ‫مراجعه فرمبییذ:‬ ‫‪http://www.taqprimer.com‬‬ ‫‪1 - Taq DNA polymerase‬‬ ‫تْيِ ؽذُ در هؤعغِ پيك داًؼ پضٍّبى صجب (تك پزايوز)‬ ‫قغوتي اس كتبة "تکنیک ‪ PCR‬و نرم افزار ‪ٍ "FAST PCR‬يزايؼ اٍل‬ ‫ًَيغٌذگبى: هحوذرضب دّقبًي، هٌيزُ ّزاتيبى‬