Biochem_Symplice Kamgang

UNIVERSITE DE DOUALA FACULTE DES SCIENCES
THE UNIVERSITY OF DOUALA FACULTY OF SCIENCE
Matricule 97FS1461Y
DEPARTEMENT DE BIOCHIMIE
DEPARTMENT OF BIOCHEMISTRY
MEMOIRE PRESENTE ET SOUTENU EN VUE DE L’OBTENTION DE LA MAITRISE EN
BIOCHIMIE
Par
KAMGANG MBE SYMPLICE
Licencié ès Sciences
Option : Biochimie
Directeurs :
Dr. NGONO NGANE Annie
Chargée de Cours Superviseur :
Dr. FOTSO KUATE Honoré Pr. AMVAM ZOLLO Paul Henri
Médecin Biologiste
Hôpital Laquintinie de Douala
Année académique 2003/2004
CCCOOONNNTTTRRRIIIBBBUUUTTTIIIOOONNN AAA LLL’’’ EEETTTUUUDDDEEE DDDEEESSS PPPLLLAAANNNTTTEEESSS
MMMEEEDDDIIICCCIIINNNAAALLLEEESSS DDDUUU CCCAAAMMMEEERRROOOUUUNNN ::: EEEVVVAAALLLUUUAAATTTIIIOOONNN DDDEEESSS
PPPRRROOOPPPRRRIIIEEETTTEEESSS AAANNNTTTIIIBBBAAACCCTTTEEERRRIIIEEENNNNNNEEESSS DDDEEE DDDEEEUUUXXX
EEEXXXTTTRRRAAAIIITTTSSS DDDEEE
GGGRRRAAAIIINNNEEESSS DDDEEE PPPIIIPPPEEERRR GGGUUUIIINNNEEEEEENNNSSSEEE SSSCCCHHHUUUMMM... &&&
TTTHHHOOONNNNNN...

Sommaire
Mémoire rédigé et présenté par KAMGANG MBE symplice, Licencié ès Sciences Option BIOCHIMIE
i
SOMMAIRE
SOMMAIRE ................................................................................................................................ i
DEDICACE ................................................................................................................................iii
REMERCIEMENTS ...................................................................................................................iv
LISTE DES ABREVIATIONS.....................................................................................................vi
LISTE DES TABLEAUX............................................................................................................vii
LISTE DES FIGURES ............................................................................................................. viii
RESUME ...................................................................................................................................ix
ABSTRACT................................................................................................................................ x
INTRODUCTION GÉNÉRALE................................................................................................... 1
Chapitre I : Données bibliographiques....................................................................................... 2
I. Généralités sur les bactéries et les substances antibactériennes ...................................... 2
I.1. Les bactéries ............................................................................................................................... 2
I.1.1. Définition............................................................................................................................ 2
I.1.2. Organisation générale ......................................................................................................... 2
I.1.3. Classification générale........................................................................................................ 3
I.1.4. Croissance et reproduction.................................................................................................. 4
I.1.5. Milieux bactériens et leurs utilisations ............................................................................... 5
I.1.6. Intérêt de l’étude des bactéries............................................................................................ 5
I.1.7. Bactéries entéropathogènes................................................................................................. 6
I.2. Les substances antibactériennes.................................................................................................. 6
I.2.1. Définition............................................................................................................................ 6
I.2.2. Les principales substances antibactériennes....................................................................... 6
I.2.2.1. Les stérilisants.......................................................................................................... 6
I.2.2.2. Les antiseptiques ..................................................................................................... 7
I.2.2.3. Les désinfectants ..................................................................................................... 7
I.2.3. Quelques agents antibiotiques utilisés contre les bactéries entéropathogènes.................... 7
II. Généralités sur les principales méthodes d’évaluation de l’activité antibactérienne........... 8
II.1. Méthode de diffusion en milieu solide ....................................................................................... 8
II.1.1. Méthode des disques de papier ........................................................................................... 8
II.1.2. Méthode par incorporation à la gélose) .............................................................................. 8
II.1.3. Méthode des puits ............................................................................................................... 9
II.1.4. Méthode de microatmosphère............................................................................................. 9
II.2. Méthode de dilution en milieu liquide........................................................................................ 9
II.3. Bioautographie.......................................................................................................................... 10
II.4. Détermination des CMI et CMB : Bactériostase et Bactéricidie.............................................. 10
III. Généralités sur Piper guineense................................................................................... 11
III.1. Botanique et écologie de la plante. ....................................................................................... 11
III.2. Ethnobotanique et pharmacologie ........................................................................................ 11
III.3. Autres utilisations ................................................................................................................. 11
III.4. Travaux antérieurs ................................................................................................................ 12
Chapitre II : Matériel et méthodes............................................................................................ 13
I. Matériel............................................................................................................................. 13
I.1 Matériel végétal. ....................................................................................................................... 13
I.1.1. Extraits hexanique et hydroéthanolique............................................................................ 13
I.1.2. Préparation des extraits à tester ........................................................................................ 13
I.1.2.1. Diffusion en milieu solide ...................................................................................... 13
I.1.2.2. Dilution en milieu solide ........................................................................................ 13
I.2. Matériel biologique : les bactéries............................................................................................ 16
I.3. Milieux bactériens utilisés. ....................................................................................................... 16
I.3.1. Gélose de Mueller Hinton II (gMH)................................................................................. 16
I.3.2. Salmonella Shigella (SS AGAR)...................................................................................... 16

Sommaire
ii
I.3.3. Eosin Bleu de Méthylène (EMB)...................................................................................... 16
II. Méthodes.......................................................................................................................... 16
II.1. La technique de l’extraction ..................................................................................................... 16
II.2. Essais antibactériens. ................................................................................................................ 17
II.2.1. Diffusion en milieu solide................................................................................................. 17
II.2.2. Dilution en milieu liquide................................................................................................. 17
II.2.3. Mise en évidence de la bactéricidie .................................................................................. 18
Chapitre III : Résultats et discussion........................................................................................ 19
I. Résultats........................................................................................................................... 19
I.1. Rendements des extractions...................................................................................................... 19
I.2. Méthode de diffusion en milieu gélosé..................................................................................... 19
I.2.1. Cas de l’extrait hexanique................................................................................................. 19
I.2.2. Cas de l’extrait hydroéthanolique..................................................................................... 20
I.3. Méthode de dilution en milieu solide ....................................................................................... 20
I.4. Tests de bactéricidie.................................................................................................................. 23
II. Discussion ........................................................................................................................ 25
CONCLUSION ET PERSPECTIVES....................................................................................... 27
BIBLIOGRAPHIE..................................................................................................................... 28
ANNEXES................................................................................................................................... I
ANNEXE 1: PROTOCOLE DE PREPARATION DES MILIEUX gMH, SS ET EMB....................I
ANNEXE 2 : COMPTAGE DE BACTERIE.....................................................................................II

Dédicace
iii
DEDICACE
EN TEMOIGNAGE DE MA
RECONNAISSANCE POUR TOUT
L’ENCADREMENT QU’ELLE M’A DONNE SUR LE
CHEMIN DE L’OBTENTION DE MA MAITRISE.
PUISSE L’ETERNEL NOTRE DIEU VOUS
COMBLER DE SON ASSISTANCE ET VOUS
SOUTENIR DANS TOUTES VOS ENTREPRISES
POUR LA SEULE GLOIRE DE SON SAINT NOM.

Remerciements
iv
REMERCIEMENTS
Au moment où j’engage la rédaction de ce document, je tiens tout particulièrement à
remercier :
L’Eternel des armées qui m’a donné de surpasser toutes les difficultés rencontrées et de
pouvoir enfin présenter ce travail. Que la gloire lui revienne.
Le Professeur AMVAM ZOLLO Paul Henri, ancien doyen de la Faculté des Sciences de
l’Université de Douala et Recteur de l’Université de Ngaoundéré, qui a accepté de superviser
ce travail et de veiller sur son bon déroulement.
Le Docteur NGONO NGANE Annie qui a bien voulu diriger ce travail et se dépenser pour
le voir réussir. Que le Roi de gloire veille sur ses entreprises pour les bénir et les fructifier.
Le Docteur FOTSO KUATE Honoré du laboratoire central de l’hôpital Laquintinie de
Douala qui a veillé sur le bon déroulement des travaux effectués au département de
bactériologie du laboratoire central dont il est responsable. Je prie que l’Eternel comble tout le
personnel de ce laboratoire qui a été d’une grande aide pour moi pendant les manipulations.
Tous les membres du laboratoire de phytobiochimie de l’Université de Yaoundé I pour
leur disponibilité et leur encadrement lors des travaux d’extraction.
L’ensemble des enseignants du département de Biochimie de l’Université de Douala
pour les conseils, remarques et orientations que j’ai reçu d’eux tout au long de ce travail. Je
pense ici tout particulièrement au Dr. GOUADO, au Dr KANA SOUOP et à Mme EBELLE qui
ont toujours été disponibles pour me venir en aide pendant mes travaux.
Mes parents (Moumbé Jean Justin et Christine) ainsi que mes oncles et leurs épouses
(Fotsing Thomas et Angèle ; Talla André et Christine) pour leur constance dans l’effort déployé
afin de voir se réaliser chacun de mes projets.
Mr et Mme Gouambé à Libreville au Gabon ; Mlles Aïssatou Seh Bouba, Aminatou
Bouba, Joumukam Martine, Joukouo Moumbé Bénédicte ; Mrs Ngué Jean-Paul, Oumbé
Valère Aimé et Douba Njoh Adolphe pour le soutien qu’ils ont manifesté à mon égard lors de
ce travail.
Les bien-aimés Tsokozo Jean-Claude, Sonwa Emmanuel, Batchami Eric, Kemami
Hilaire, Dinang Jean-Claude, Téné Jonathan, Kemdom Nadège, Nkwégnia Nadine, Ngoula
Basile, Nango Edouard, et Kamdem Francis pour leur assistance dans le cadre de la
réalisation de ce travail.
L’ensemble du corps de Christ et plus particulièrement les bien-aimés de l’assemblée du
Full Gospel Mission de Bépanda-Peuple et du Groupe Biblique des Elèves et Etudiants du

Remerciements
v
Cameroun (GBEEC) pour son soutien spirituel et matériel dans l’effort de réalisation de ce
document.
Ngounou Djamchebi Alain Simplice, Eoné Hermann, Njeundji Suzy Christelle, Gouabé
Patrick, Magne Nadège, Dassie Rosette et Bouyap Joëlle pour leur amitié ayant constituée un
véritable stimulant tout au long ce travail.
Mme Talla Florence à Douala, Mme Tutchamo Berthe à Bafoussam ainsi que mes petits
frères et petites sœurs, cousins et cousines qui par leur chaleur familiale ont contribué à créer
un cadre favorable au développement de l’esprit d’entreprise ayant influencé positivement ce
travail.
Les bien-aimés Kamga Justin, Djomo Nelly, Noualeu Viviane, Magni Julienne, Maba
Patipé Sandrine, et Epoh Billa André Luther pour tous leurs bons soins et conseils.
Tous mes camarades de promotion.
Que la gloire revienne au Dieu tout puisant qui s’est servi de tout ce peuple et beaucoup
d’autres encore pour réaliser ce travail d’initiation à la recherche.

Liste des abréviations
vi
LISTE DES ABREVIATIONS
CMB : Concentration Minimale Bactéricide.
CMI : Concentration Minimale Inhibitrice.
DMSO : Dimethyl Sulfoxyde.
E. coli : Escherichia coli.
EDS : Eau Distillée Stérile.
EH : Extrait Hexanique.
EHE : Extrait Hydréthanolique.
EMB : Eosine Bleu de Méthylène.
gMH : gélose de MUELLER HINTON.
MH : MUELLER HINTON.
P. guineense : Piper guineense.
SS : Salmonella Shigella.
UFC : Unité Formant Colonie.

Liste des tableaux
vii
LISTE DES TABLEAUX
Titres Pages
Tableau 1 : Groupes et genres bactériens d’importance médicale ....................................................................3
Tableau 2 : gamme de concentrations de l’extrait hexanique...........................................................................15
Tableau 3 : gamme de concentrations pour l’extrait hydroéthanolique (test sur E. coli) ..............................15
Tableau 4 : gamme de concentrations pour l’extrait hydroéthanolique (test sur Klebsiella sp et Salmonella
sp).........................................................................................................................................................15
Tableau 5 : tests de bactéricidie...........................................................................................................................18
Tableau 6: rendements des extractions...............................................................................................................19
Tableau 7: résultats en mm des diamètres d’inhibition pour l’extrait hexanique ...........................................19
Tableau 8: résultats en mm des diamètres d’inhibition pour l’extrait hydroéthanolique...............................20
Tableau 9 : CMI de l’EH du test d’incorporation à la gélose..............................................................................21
Tableau 10 : CMI de l’EHE du test d’incorporation à la gélose. ........................................................................21

Liste des figures
viii
LISTE DES FIGURES
Titres Pages
Figure 1 : Coupe schématique d’une cellule bactérienne « composite »...........................................................2
Figure 2 : Protocole d’obtention des extraits hexanique et hydroéthanolique ...............................................14
Figure 3 : Disposition des disques dans les boîtes de Pétri. ............................................................................17
Figure 4: Activité de l’EH sur E. coli (A), Klebsiella sp (B) et Salmonella sp (C).............................................20
Figure 5 : Activité de l’EHE sur E. coli (A), Klebsiella sp (B) et Salmonella sp (C) .........................................20
Figure 6 : Test sur E. coli par l’EH........................................................................................................................21
Figure 7 : Test sur Klebsiella sp par l’EH ............................................................................................................22
Figure 8 : Test sur Salmonella sp par l’EH ..........................................................................................................22
Figure 9 : Test sur E. coli par l’EHE......................................................................................................................22
Figure 10 : Test sur Klebsiella sp par l’EHE........................................................................................................23
Figure 11 : Test sur Salmonella sp par l’EHE......................................................................................................23
Figure 12 : Tests de bactéricidie pour l’EH .........................................................................................................24
Figure 13 : Tests de bactéricidie pour l’EHE.......................................................................................................24

Résumé
ix
RESUME
Après les travaux d’extraction à l’hexane et à l’éthanol à partir d’une poudre de graines
sèches de P. guineense, nous avons au travers des méthodes de la diffusion en milieu solide et
de l’incorporation à la gélose évalué les activités antibactériennes des deux extraits obtenus.
Les rendements d’extraction sont de 6,673% pour l’extrait hexanique (couleur rouge) et 8,551%
pour l’extrait hydroéthanolique (couleur noire).
La technique de diffusion en milieu solide a permis de mettre en évidence les activités
antibactériennes des deux extraits sur E. coli, Klebsiella sp et Salmonella sp.
Par la technique de l’incorporation à la gélose, nous avons trouvé que des trois souches
bactériennes testées, seul Klebsiella sp est sensible aux deux extraits utilisés. L’extrait
hydroéthanolique (EHE) présente une CMI à 960 mg/ml pour Klebsiella sp tandis que l’extrait
hexanique (EH) est actif sur la même souche avec 400 mg/ml comme CMB. E. coli et
Salmonella sp ne sont pas sensibles à l’EH même à 800 mg/ml. Néanmoins, l’EHE s’est
montré bactéricide pour E. coli avec une CMB de 480 mg/ml. Le même fait est observé pour
Salmonella sp en présence du même extrait avec une CMB de 960 mg/ml.
Les graines de P. guineense peuvent donc servir de base pour la production industrielle
de substances utilisables dans la lutte contre les infections et diarrhées infantiles causées par
les entérobactéries.

Abstract
x
ABSTRACT
After extracting operations with hexane and ethanol from powder of the dried seeds of P.
guineense, we used the methods of solid medium diffusion and agar incorporation to evaluate
the antibacterial properties of the two extracts. The yields of extraction were 6.673% for the
hexane extract (red color) and 8.551% for the hydroethanolic extract (black color).
The solid medium diffusion technique permitted us to show out antibacterial activities of
the two extracts on E. coli, Klebsiella sp and Salmonella sp.
With the agar incorporation method, we found that out of the three bacteria species
studied, only Klebsiella sp was sensitive to the two extracts tested. The hydroethanolic extract
presented a MIC at 960 mg/ml towards Klebsiella sp while the hexanic extract is active on the
same strain with 400 mg/ml as Minimal Bactericidal Concentration. E. coli and Salmonella sp
are not sensitive, even at 800 mg/ml, to the hexanic extract. Nevertheless, the hydroethanolic
extract shown himself bactericidal to E. coli with a Minimal Bactericidal Concentration of 480
mg/ml. The same fat was observed for Salmonella sp with the same extract with a Minimal
Bactericidal Concentration of 960 mg/ml.
Seeds of P. guineense can then be used for the industrial production of substances
usable in fighting against infantile infections and diarrhea caused by enterobacteria.

Introduction générale

Introduction générale
1
INTRODUCTION GÉNÉRALE
La santé est un bien précieux après lequel l’homme n’a jamais cessé de courir. Ceci
s’explique par le fait que toutes ses activités ne peuvent être menées que s’il est bien portant.
Cette conquête de la santé est encore plus marquée quand elle concerne les nourrissons et
petits enfants car ceux-ci sont vulnérables à divers maux parmi lesquels les diarrhées et
autres infections bactériennes engendrées par des entérobactéries. C’est ainsi qu’on retrouve
E. coli, Salmonella sp, Shigella sp, Klebsiella sp et bien d’autres bactéries du tractus gastro-
intestinal au centre des infections suivantes chez les enfants : choléra (maladie épidémique
intestinale), les fièvres typhoïdes et paratyphoïdes, la dysenterie bacillaire et les diarrhées
(Dosso & al, 1998). Dans les pays en développement comme le Cameroun, ces maux
constituent un réel problème de santé publique.
Dans la majorité des hôpitaux et centres de santé de ces pays, les infections
entérobactériennes constituent la principale cause de morbidité et même de mortalité infantile.
Le personnel médical œuvrant dans ces hôpitaux et centres de santé ne cesse de multiplier
les efforts dans le but de freiner les ravages de ces maladies. Notons tout de même que ces
efforts déployés par ce personnel butent, d’une part sur un développement de la résistance
bactérienne chez les patients, d’autre part sur l’efficacité réduite pour certains antibiotiques
actuellement présents dans nos pharmacies.
La flore camerounaise comporte certainement des essences pouvant aider efficacement
dans la lutte contre ces maladies dues aux entérobactéries citées plus haut. Piper guineense,
plante ayant présentée des résultats remarquables dans des études antérieures (Ivbijaro,
1990 ; Tchoumbougnang, 1996 ; Dongmo, 2002 ; Ngono & al., 2003 ; etc.) est l’espèce
végétale sur laquelle nous avons porté notre choix dans le cadre de cette étude. Cette plante
est déjà largement utilisée de diverses manières par les populations à l’échelle mondiale et
pourrait en fonction des résultats de ce travail servir de base pour la production industrielle
d’antibiotiques efficaces dans la lutte contre les infections bactériennes énoncées plus haut.
Il sera donc question pour nous dans un premier temps d’évaluer la sensibilité des
bactéries étudiées (E. coli, Klebsiella sp et Salmonella sp) aux deux extraits de P. guineense
utilisés (Extrait Hexanique : EH et Extrait Hydroéthanolique : EHE) par le moyen de la
technique de diffusion en milieu solide. Puis nous procèderons de façon générale à la
détermination des CMI et CMB dans les cas où l’extrait concerné est actif. Nous utiliserons
pour le faire la technique d’incorporation à la gélose ou dilution en milieu solide suivi des tests
de bactéricidie quand nécessaire.

Chapitre 1 : Données bibliographiques

2
Chapitre I : Données bibliographiques
I. Généralités sur les bactéries et les substances
antibactériennes
I.1. Les bactéries (Singleton, 1994 ; Stewart & Beswick,
1977)
I.1.1. Définition (Singleton, 1994)
Dans la plupart des cas, la bactérie est un être unicellulaire autonome. Elle présente une
organisation procaryote au niveau de sa cellule et est dans la catégorie des « micro-
organismes ». Toutes les bactéries sont des micro-organismes mais tous les micro-
organismes ne sont donc pas des bactéries. Toujours parmi les micro-organismes nous avons
les algues, les champignons, les lichens, les protozoaires, les virus et les agents subviraux
(Prions par exemple).
I.1.2. Organisation générale (Singleton, 1994)
Il n’existe pas de bactérie type. La figure 1 montre de façon très schématique, une
bactérie « composite ». Il est important de noter que toutes les bactéries ne possèdent pas
toutes les structures indiquées dans ce diagramme, et que, par contre, certaines bactéries
présentent des structures qui n’y appartiennent pas.
Figure 1 : Coupe schématique d’une cellule bactérienne « composite »
Corps basal
Crochet
Filament
Flagelle
Membrane
Cytoplasmique
Paroi cellulaire
Enveloppe cellulaire
Cytoplasme
Chromosome
(nucléoïde)
Ribosomes
Granules
De réserve

3
I.1.3. Classification générale (Stewart & Beswick, 1977)
Tableau 1 : Groupes et genres bactériens d’importance médicale
Groupes Genres
Coccis Gram-positives
Staphylococcus
Streptococcus
Pneumococcus
Peptostreptococcus
Coccis Gram-positives Neisseria
Bâtonnets Gram-négatives aérobies
Pseudomonas
Bordetella
Francisella
Brucella
Bâtonnets Gram-positives formant-endospores
Bacillus
Clostridium
Bâtonnets Gram-positives non-formant-spores
Lactobacillus
Listeria
Erysipelothrix
Bacteries Gram-négatives anaérobies
Bactérioïdes
Fusobactérie
Bactéries Gram-négatives anaérobies facultatifs
Entérobactériaceae
Escherichia
Edwarsiella
Citrobacter
Salmonella
Shigella
Klebsiella
Enterobacter
Hafnia
Proteus
Yersinia
Vibrionaceae
Vibrio
Non-classées
Haemophilus
Pasteurella
Streptobacillus
Calymmotobacterium
Bactéries spiralées et incurvées
bdellovibrio
spirillum
Spirochetes
Treponema
Borrelia
Leptospira
Mycoplasmes
Mycoplasme
Actinomycetes et organismes apparentés
Cornyebactérie
Actinomyces
Nocardia
Mycobactérie
Rickettsies
Rochlimaea
Coxiella
Chlamydia
Bartonella
Les bactéries sont facilement classifiables au travers de leur forme, leur taille ou leur
structure, leurs activités chimiques, la nature des éléments nutritifs qui leur sont nécessaires,

4
la forme de l’énergie qu’elles utilisent, l’ensemble des conditions physiques dans lesquelles
elles peuvent croître et leurs réactions à certains colorants. Elles sont également réparties en
catégories hiérarchisées (familles – genres – espèces).
Tout le monde s’accorde sur le fait que les bactéries doivent être classées autant que
possible de la même manière que les plantes et les animaux. Mais deux difficultés majeures
sont rencontrées dans cette entreprise : (a) le concept d’espèce est basé sur la sexualité, une
espèce étant un groupe d’organismes qui régulièrement se croisent. Ce concept ne peut pas
être appliqué directement à la taxinomie bactérienne puisque les bactéries sont normalement
asexuelles et la notion d’équivalent sexuel est très restreinte pour constituer une base d’une
classification compréhensive. (b) le second problème est de pouvoir classer les espèces et
genres en grands groupes hiérarchiques de familles, tribus, ordres et classes. Ceci a été
l’approche classique des premières éditions de Bergey (Manual of Determinative Bacteriology)
qui a présenté le système de classification le plus largement adopté par les bactériologistes.
Les groupes d’importance médicale, tel que décrits par Bergey, sont présentés dans le tableau
1.
I.1.4. Croissance et reproduction (Singleton, 1994)
La croissance d’une cellule bactérienne consiste en une augmentation coordonnée de la
masse de ses parties constituantes.
Habituellement, la croissance conduit à la division de la cellule en deux cellules
semblables ou identiques. Ainsi chez les bactéries, croissance et reproduction sont
étroitement liées, et le terme « croissance » est généralement employé pour désigner les deux
processus. Pour leur croissance les bactéries ont essentiellement besoin d’une provision de
nourriture, d’une source d’énergie, d’eau, d’une température appropriée, d’un pH approprié et
d’une teneur appropriée en oxygène (parfois l’absence d’oxygène). Pendant que certaines
bactéries satisfont tous leurs besoins nutritifs avec de simples sels inorganiques et des
substances comme le dioxyde de carbone et l’ammoniaque, d’autres requièrent - à divers
degrés - des composés organiques plus ou moins complexes, provenant d’autres organismes.
De l’énergie sera nécessaire, pour les réactions chimiques essentielles qui se déroulent dans
une cellule vivante, pour la mobilité flagellaire et pour l’absorption de diverses substances
nutritives. Le pH optimal pour la croissance de la plupart des bactéries se situe aux environs
de 7 et la majorité des espèces ne peuvent se développer dans des milieux très acides ou très
alcalins.

5
I.1.5. Milieux bactériens et leurs utilisations (Singleton, 1994)
Un milieu est une préparation solide ou liquide, spécifiquement fabriquée pour la
croissance, le stockage ou le transport des bactéries. Quand il sert à la croissance, le milieu
fournit généralement tous les éléments nutritifs nécessaires. Avant l’emploi, un milieu doit être
stérile, c’est-à-dire qu’il ne doit pas contenir d’organismes vivants.
La majorité des milieux solides ressemblent à de la gelée. Ils consistent en une solution
d’éléments nutritifs « solidifiée » par de la gélose. Cet agent gélifiant est un polysaccharide
complexe, extrait de certaines algues. D’habitude, le milieu solide est utilisé en boîte de Pétri
en plastique dont la taille la plus courante est de 9 cm de diamètre. Le milieu à l’état liquide
(fondu) est versé dans la boîte de Pétri et laissé au repos jusqu’à solidification. Pour désigner
une boîte de Pétri garnie de milieu solide, on parlera en raccourci d’une « boîte ».
On classe les milieux selon l’usage qu’on entend en faire :
Les milieux d’enrichissement sont des milieux liquides qui contiennent des substances
complexes stimulant le développement de certains microorganismes et inhibant ou tuant
d’autres microorganismes.
Les milieux sélectifs par leur composition chimique inhibent dans un échantillon le
développement de microorganismes indésirables (l’inhibiteur contenu dans le milieu sélectif
peut être un antibiotique, un sel, un colorant ou un composé chimique particulier).
Les milieux différentiels permettent de distinguer des espèces de microorganismes
appartenant à la même famille et présentant des caractéristiques communes. Ainsi, on fait très
fréquemment appel à la gélose, à l’éosine et au bleu de méthylène (EMB) pour isoler les
bactéries Gram négatif.
Les milieux de propagation. La plupart des espèces microbiennes pathogènes
requièrent un minimum de 18 à 24 heures pour croître sur les milieux de culture. C’est le
temps nécessaire pour pouvoir observer une croissance suffisamment abondante et faire soit
une première identification, soit un repiquage sur un milieu sélectif ou différentiel.
I.1.6. Intérêt de l’étude des bactéries (Singleton, 1994)
La lutte contre les maladies est l’une des raisons majeures de l’étude des bactéries. Les
bactéries sont la cause de quelques maladies graves, ainsi que de multiples affections
bénignes. Aussi importantes qu’elles puissent être, les bactéries pathogènes ne constituent
qu’une petite partie de l’ensemble de la population bactérienne. La plupart des bactéries ne
présentent que peu ou pas de danger et beaucoup s’avèrent indéniablement utiles à l’homme.
Par exemple, certaines d’entre elles produisent les antibiotiques qui ont révolutionné la
thérapeutique, tandis que d’autres fournissent les enzymes des poudres à lessiver

6
« biologiques », d’autres encore servent d’ « insecticides microbiens » et protègent les cultures
de certains insectes nuisibles. Certaines espèces bactériennes sont employées pour la
production alimentaire. Enfin, mais ce n’est pas le moindre de leurs mérites, les bactéries
assurent des rôles essentiels dans les cycles géochimiques donc, en définitive, toute vie
dépend.
Il ressort clairement de ce bref résumé que mieux nous connaîtrons les bactéries, plus
efficacement nous pourrons en limiter les potentialités nocives et en exploiter les activités
utiles.
I.1.7. Bactéries entéropathogènes (Singleton, 1994)
Il s’agit de bactéries Gram-négatifs, non-sporulants, anaérobies facultatifs
(habituellement 0,3-1 x 1-6 µm). Elles sont le plus souvent courtes, droites, immobiles ou
mobiles par une ciliature péritriche et de culture aisée car croissent habituellement bien sur les
milieux de base.
Il s’agit d’une très vaste famille qui représente près des ¾ des isolements d’un
laboratoire de bactériologie médicale. Ce sont pour la plupart des hôtes du tractus digestif
mais certaines, telles les Serratia sont rencontrées d’une manière prépondérante dans le
milieu extérieur.
Elles sont responsables de deux grands types de manifestations pathologiques :
pathologie spécifique telle la typhoïde avec Salmonella typhi ou d’une pathologie opportuniste
avec pour certaines une notion d’hospitalisme infectieux marquée.
Les genres incluent Citrobacter, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Proteus,
Salmonella, Serratia, Yersinia et Shigella.
I.2. Les substances antibactériennes (Singleton, 1994)
I.2.1. Définition
Il s’agit de substances aidant dans la lutte contre les bactéries. Chacune d’elles a son
mode d’action et une utilisation spécifique. Selon les cas, ces substances peuvent faire l’objet
d’une utilisation in vivo ou in vitro.
I.2.2. Les principales substances antibactériennes
I.2.2.1. Les stérilisants
Tout procédé dont on est sûr qu’il tue tous les organismes vivants – y compris les
endospores – constitue une stérilisation. Idéalement les méthodes de stérilisation devraient
être efficaces, rapides, simples et bon marché et elles devraient pouvoir s’appliquer à une
grande variété de matériels. La stérilisation s’effectue habituellement par des méthodes

7
physiques – le plus souvent par la chaleur. On peut recourir à une stérilisation par la chaleur
(le feu, le four à air chaud et l’autoclave), par les radiations ionisantes, par filtration et par les
agents chimiques tel que l’oxyde d’éthylène (C2H4O).
I.2.2.2. Les antiseptiques
L’antisepsie est la désinfection des tissus vivants. Elle peut être appliquée de façon
prophylactique ou thérapeutique.
Parmi les antiseptiques nous pouvons citer : le Dettol qui ici doit être dilué,
l’hexachlorophène qui est un savon antiseptique beaucoup plus actif contre les bactéries
Gram-positives que contre les Gram-négatives, le mélange éthanol/eau (70/30) qui peut servir
d’antiseptique général pour la peau, les composés d’ammonium quaternaire comprenant le
bromure de cétyltriméthylammonium qu’on introduit dans les crèmes antiseptiques et l’iode qui
est un puissant antiseptique bactéricide et sporicide.
I.2.2.3. Les désinfectants
Par ces agents on détruit, inactive ou élimine les microbes potentiellement nuisibles –
sans nécessairement affecter les autres organismes présents. Ils n’ont généralement que peu
ou pas d’effet sur les endospores bactériennes. Souvent le terme « désinfection » fait
spécifiquement référence à l’usage de certains produits chimiques (désinfectants) pour le
traitement de surfaces ou d’objets inertes, mais on l’emploie aussi dans le sens d’antisepsie.
Bien que la désinfection chimique soit très répandue, les méthodes physiques
conviennent mieux dans certains cas. Parmi les nombreux désinfectants chimiques en usage,
nous ne citerons ici que quelques-uns des plus communs à savoir : le phénol, le chlore, les
composés d’ammonium quaternaire, et les hypochlorites. L’utilisation des rayons ultraviolets et
la pasteurisation sont des méthodes de désinfection par les agents physiques.
I.2.3. Quelques agents antibiotiques utilisés contre les bactéries
entéropathogènes
Les entérobactéries sont le plus souvent, dans le cadre médical, isolées à partir de
prélèvements urétraux, vaginaux et de selles et urines. Après l’identification de la bactérie, un
antibiogramme est fait afin de définir les antibiotiques utilisables dans le traitement du patient
concerné. En ce qui concerne les entérobactéries, les antibiotiques généralement utilisés
sont : les aminoglycosides, les polymyxines et les sulfamides.
Dans leur mode d’action, ces antibiotiques peuvent inhiber la synthèse protéique,
augmenter la perméabilité de la membrane ou encore interférer dans les réactions du
métabolisme.

8
II. Généralités sur les principales méthodes d’évaluation de
l’activité antibactérienne
A côté de la méthode de diffusion en milieu solide on trouve la méthode de dilution en
milieu liquide et la bioautographie.
II.1. Méthode de diffusion en milieu solide (Leclerc, 1975 ;
Alcamo, 1984 ; Rios & al. 1988)
A cause de la simplicité de sa réalisation, cette méthode est régulièrement utilisée
pour la recherche préliminaire.
La substance antibactérienne à tester est mise en présence du germe étudié après
que les boîtes de Pétri contenant le milieu gélosé soient ensemencées. L’activité de cette
substance est évaluée à plusieurs concentrations. Après environ 18 heures de culture à 370
C
on observe s’il y a inhibition dans les boîtes afin de déterminer si la substance est active ou
non. Plusieurs facteurs conditionnent la formation du diamètre de la zone d’inhibition parmi
lesquelles on peut citer la vitesse de diffusion de la substance à tester dans la gélose et sa
concentration, la composition du milieu utilisé, la densité de l’inoculum, la sensibilité des
microorganismes et les conditions d’incubation.
L’inhibition se manifeste par la formation d’une auréole d’inhibition autour du lieu de
dépôt de la substance. En plus du fait que cette méthode ne permet pas de quantifier les
résultats, elle est également limitée dans les cas où on a une mauvaise diffusion de la
substance testée sur le milieu gélosé.
II.1.1. Méthode des disques de papier (Leclerc, 1975 ; Alcamo, 1984 ;
Rios & al., 1988)
On imprègne une certaine quantité de la substance antibactérienne à tester sur des
disques de papier Whatman stériles qu’on dépose ensuite à la surface de la gélose
ensemencée par le germe étudié. Les boîtes sont alors incubées dans les conditions
optimales en fonction du germe testé. Au terme de l’incubation, si la substance est active vis-
à-vis du germe étudié, on note la formation d’une auréole d’inhibition autour du disque. Dans
le cas contraire le germe pousse normalement à la surface de la gélose.
II.1.2. Méthode par incorporation à la gélose (Taudou, 1990 ; Dwivedi &
Dubey, 1993)
Dans les boîtes de Pétri, on introduit une quantité du produit à tester et de la gélose
liquéfiée et maintenue en surfusion au bain- marie à 450
C. Après solidification de ce mélange,
une suspension appropriée du germe étudié est ensemencée (en nappe de préférence). Après

9
incubation on note la plus petite concentration de la substance testée qui inhibe les germes
étudiés.
II.1.3. Méthode des puits (Rios & al., 1988)
Cette méthode consiste à creuser des puits d’environ 6 mm de diamètre dans la gélose à
l’aide d’un emporte-pièce. Les souches sont ensemencée comme précédemment. Après
l’étape de pré-incubation, on introduit dans les puits, une quantité de la substance à tester
qu’on laisse diffuser pendant le temps d’incubation.
On note alors soit la croissance, soit l’inhibition de la souche étudiée et on mesure le
diamètre d’inhibition des germes sensibles.
II.1.4. Méthode de microatmosphère (Kellner & Kobert, 1954 ; Amvam
& al., 1998)
Pour sa réalisation, on ensemence le germe sur milieu solide dans une boîte de Pétri.
Ensuite un disque de papier saturé en solution à tester est déposé au centre du couvercle de
la boîte de Pétri qui est mise à incuber en position renversée. La substance à tester s’évapore
et la phase volatile exerce une activité inhibitrice sur le germe testé.
Une variante de cette méthode consiste à ensemencer de façon radiale plusieurs
germes. Ceci permet de comparer l’activité de plusieurs germes testés dans les mêmes
conditions. On pourra ainsi déterminer les zones d’extension d’inhibition sur la surface de la
gélose.
II.2. Méthode de dilution en milieu liquide (Alcamo, 1984 ;
Torrez-Rodriguez & al. 1993)
Cette méthode consiste à réaliser une gamme de plusieurs concentrations du produit à
tester, dans le même volume d’un milieu de culture reparti dans des plaques à microcupules
ou dans des tubes, en présence de la souche bactérienne. Après l’incubation on observe la
croissance du germe dans les micro-cupules ou les tubes. La plus petite concentration qui
empêche totalement la croissance visible du germe représente la Concentration Minimale
Inhibitrice (CMI). Cette méthode a pour avantage de mettre directement le microorganisme et
la substance à tester en contact et de permettre une bonne quantification des résultats.
Suivant que l’on travaille avec les plaques ou des tubes on parle respectivement de
micro méthode et macro méthode de dilution.
Un prolongement de cette méthode, la réalisation du test de bactéricidie, permet de
mesurer la Concentration Minimale Bactéricide (CMB). Dans ce cas on effectue une
subculture sur un milieu gélosé à partir des tubes ou cupules ne présentant pas de croissance.

10
Après incubation, on note la concentration d’antibactérien chez laquelle la subculture est
négative (Ngono 1999).
II.3. Bioautographie (Rahalison, 1994)
Elle consiste à réaliser une chromatographie sur couche mince (CCM) du mélange de
composés antimicrobiens à tester et à utiliser des microorganismes comme révélateurs. Après
culture dans les conditions optimales, on observe la croissance des microorganismes, et on
note s’il y a ou pas inhibition. Plusieurs variantes de cette méthode sont connues.
Dans le cas de la bioautographie par contact la plaque de CCM est mise en contact
avec la surface d’une gélose ensemencée dans une boîte de Pétri. Les produits qui auront
diffusé depuis la couche mince vont agir sur les microorganismes. On observe les zones
d’inhibition après incubation.
Pour ce qui concerne la bioautographie directe, la CCM est directement révélée à
l’aide d’une suspension de microorganismes en milieu liquide ou semi solide. Les zones
d’inhibition sont observées après incubation.
La CCM dans la bioautographie par immersion est immergée dans une suspension de
microorganismes dans un milieu liquide. Des révélations supplémentaires peuvent être faites
pour visualiser les zones d’inhibition.
II.4. Détermination des CMI et CMB : Bactériostase et
Bactéricidie (Carbonnelle & al., 1987 ; Ngono, 1999)
Différentes techniques d'évaluation de l'activité antibactérienne peuvent être mises en
oeuvre au laboratoire de bactériologie. Elles reposent sur les mesures de CMI (Concentration
Minimale Inhibitrice) : plus faible concentration de la substance antibactérienne capable
d’interrompre, dans un milieu et à des concentrations parfaitement définies, toute croissance
visible d’une souche bactérienne donnée. Selon que la substance antibactérienne inhibe la
croissance bactérienne ou détruise les bactéries, il y a bactériostase ou bactéricidie.
On définit également la CMB (Concentration Minimale Bactéricide) qui est la plus
faible concentration de la substance antibactérienne ne laissant subsister qu’un nombre de
survivants inférieur ou égal à 104
bactéries de l’inoculum (soit un survivant sur 10 000) après
18 heures de culture et à 370
C. Ce chiffre est estimé suffisant en pratique médicale.
Pour certains antibactériens, la concentration permettant d’obtenir un effet bactéricide
important (CMB) est proche de leur CMI et facilement atteinte dans l’organisme. Ces
substances sont dites « bactéricides ». Parmi elles nous avons les bêta-lactamines
(pénicillines et céphalosporines), les aminoglycosides, les polymyxines et les quinolones.

11
Pour d’autres antibactériens au contraire, leur CMB est très supérieure à leur CMI et
difficile à atteindre in vivo, ils sont dits « bactériostatiques », car ils auront en clinique le plus
souvent un effet bactéricide limité (102
survivants), soit un survivant sur 100 ; ce sont : les
tétracyclines, le chloramphénicol et les macrolides et synergistines.
III. Généralités sur Piper guineense
III.1. Botanique et écologie de la plante (Noumi, 1984).
P. guineense communément appelé poivre de guinée et poivre noir d’Afrique tropicale
est connu sous les noms vernaculaires : Abomedjang en Bulu ; Abomedjang nkol & ondodo en
Ewondo ;.Soup, Sop en Bamiléké ;
C’est une plante appartenant à la famille des Pipéracées. Elle est décrite comme étant
une liane à nombreuses tiges grêles flexibles ramifiées atteignant 10 à 12 m de haut en
s’appuyant et en s’enroulant sur les arbres. Les feuilles sont alternes, ovales, à base élargie et
arrondie. Les fleurs sont jaune verdâtres et produisent des fruits sphériques de 4 à 5 mm de
diamètre, rouges à maturité.
III.2. Ethnobotanique et pharmacologie
Les fruits de cette plante sont utilisés dans l’assaisonnement du « Nkui » et de la sauce
jaune dans la région Bamiléké. En Côte d’Ivoire, elle est très souvent associée à d’autres
plantes comme condiments. Au Bénin, on associe les graines de cette plante à de
nombreuses préparations médicinales comme aromatisants. (Noumi, 1984 ; Adjanohoun &
al., 1989).
P. guineense est utilisé dans le traitement de la toux, des maladies intestinales, des
bronchites, des maladies vénériennes, du rhume et du rhumatisme. On l’utilise encore comme
insecticide non toxique (Amusan & Okorie, 2002).
III.3. Autres utilisations
Les graines de P. guineense sont des épices qui à faible dose, sont toniques et
stomachiques : elles font accroître les secrétions gastriques et pancréatiques. L’essence des
racines est douée de propriétés carminatives (Noumi, 1984).
Fruits et feuilles sont utilisés comme condiments. Les cendres de la plante servent à
préparer un sel alimentaire. Bien qu’importés en Europe dès le XVe
siècle, les fruits n’y ont
pas connu une large utilisation (Busson & al., 1965).

12
III.4. Travaux antérieurs
Ivbijaro (1990) met en évidence l’activité insecticide de l’huile de graines de P.
guineense contre Callosobruchus maculatus. Cette activité est manifeste au niveau des œufs
produits par l’insecte.
Tchoumbougnang (1996) par ses travaux conclu que les huiles essentielles des feuilles
et des fruits ont la même activité antifongique, elles sont dans tous les cas très actives vis-à-
vis de M. gypseum et très peu active sur les autres germes et que l’activité de l’essence issue
des feuilles serait due principalement au linalol (4,5%) alors que celle de l’huile des fruits serait
liée en plus du linalol (3,5%), au p-cymène (0,3%) et γ- terpinène (0,3%).
Semacumu & Kouahou (1996) trouvent que l’extrait éthéré de P. guineense est actif à
des pourcentages considérables vis-à-vis de C. maculatus. A l’égard de S. oryzae cet extrait
présente encore une activité très acceptable et exploitable dans la protection post-récolte de
graines contre la bruche du niébé et le charançon du riz.
Kamtchouing & al. (2002) confirment par leurs travaux, en faisant des tests sur des
rats, l’utilisation traditionnelle de P. guineense comme stimulant sexuel.
Amusan & Okorie (2002) découvrent que l’extrait éthanolique de graines de P.
guineense peut être utilisé dans la protection du poisson sec contre Dermestes Maculatus. Ils
concluent également que cet extrait est hautement toxique pour les insectes mais sain pour
une consommation humaine.
Les travaux de DONGMO (2002) révèlent que P. guineense a une activité considérable
dans la lutte contre Fusarium Pallidoraseum sans toutefois montrer une inhibition totale même
à 0,5 g/ml.
Ngono & al. (2003) obtiennent un effet antifongique significatif avec l’extrait
hydroéthanolique des graines de P. guineense.

Chapitre 2 : Matériel et méthodes

13
Chapitre II : Matériel et méthodes
I. Matériel.
I.1 Matériel végétal.
I.1.1. Extraits hexanique et hydroéthanolique
Les graines de P. guineense ont servi de base pour l’obtention des deux extraits étudiés.
Ces graines furent achetées au marché de Bafoussam en Novembre 2002 et l’extraction a
suivi en Juillet 2003 et fut exécutée d’après le protocole de la Figure 2.
I.1.2. Préparation des extraits à tester
I.1.2.1. Diffusion en milieu solide
Cas de l’extrait hexanique
Après l’opération de pesée à l’aide d’une balance de précision, l’extrait est solubilisé de
façon appropriée dans du DMSO 2%. 100 mg/ml, 200 mg/ml et 400 mg/ml sont les
concentrations préparées.
Cas de l’extrait hydroéthanolique
Ici c’est l’éthanol 50% qui est utilisé pour solubiliser l’extrait préalablement pesé. La
quantité de l’extrait pesée est fonction du volume de préparation désiré. Les concentrations
suivantes ont été préparées et utilisées dans les manipulations : 120 mg/ml, 240 mg/ml et 480
mg/ml.
I.1.2.2. Dilution en milieu solide
Une solution mère (8000 mg/ml pour l’EH et 9600 mg/ml pour l’EHE) devant servir de
base pour la réalisation des gammes de concentrations dans la gélose est préparée à partir de
l’extrait brut. A la suite de ceci on apprête la quantité de gélose nécessaire pour la
manipulation.
Cas de l’extrait hexanique
Pour les tests effectués sur les trois souches bactériennes étudiées (E. coli, Klebsiella sp
et Salmonella sp), la gamme de concentrations utilisée ici est la suivante : 50 mg/ml, 100
mg/ml, 200 mg/ml, 400 mg/ml et 800 mg/ml. Pour arriver à cette fin le tableau 2 a été réalisé :

14
Figure 2 : Protocole d’obtention des extraits hexanique et hydroéthanolique
Filtration
Extrait
hydroéthanolique
85,51 (g)
Evaporation au
Rotavapor
Filtration
Poudre végétale 1000g
Macération dans l’hexane
72 h à l’obscurité avec des
agitations fréquentes
(Agitation continue pendant
la première heure)
Macération dans l’éthanol
90%
72 h à l’obscurité avec des
agitations fréquentes
(Agitation continue pendant
la première heure)
Résidu solide
(Sécher à l’air libre quelques
minutes)
Phase hexanique
Evaporation au
Rotavapor
Extrait
hexanique 66,73 g)

15
Tableau 2 : gamme de concentrations de l’extrait hexanique
N0
de la boîte de Pétri 1 2 3 4 5 T
-
T+
Volume de la gélose en ml 9,9375 9,875 9,75 9,5 9 10 8,75
Volume de la solution mère
en ml (8000 mg/ml)
0,0625 0,125 0,25 0,5 1 / /
Volume de la gentamicine
en ml (80µg/ml)
/ / / / / / 1,25
Concentration finale de l’extrait
(mg/ml) ou de gentamicine
(µg/ml)
50 100 200 400 800 0 10
Cas de l’extrait hydroéthanolique
Deux séries de gammes de concentrations ont été utilisées dans ce cas afin d’optimiser
l’action de l’extrait sur les souches bactériennes étudiées. C’est ainsi que pour le test sur E.
coli la gamme suivante fût réalisée : 30 mg/ml, 60 mg/ml, 120 mg/ml, 240 mg/ml et 480 mg/ml.
Les concentrations suivantes : 60 mg/ml, 120 mg/ml, 240 mg/ml, 480 mg/ml et 960 mg/ml sont
celles exploitées pour les tests sur Klebsiella sp et Salmonella sp. Les tableaux 3 et 4 donnent
le détail sur les manipulations faites à cette occasion :
Tableau 3 : gamme de concentrations pour l’extrait hydroéthanolique (test sur E. coli)
N0
de la boîte de Pétri 1 2 3 4 5 T-
T+
Volume de la gélose en ml 9,96875 9,9375 9,875 9,75 9,5 10 8,75
en ml (9600 mg/ml)
0,03125 0,0625 0,125 0,25 0,5 / /
en ml (80µg /ml)
/ / / / / / 1,25
Concentration finale de
l’extrait (mg/ml) ou de
gentamicine (µg/ml)
30 60 120 240 480 0 10
Tableau 4 : gamme de concentrations pour l’extrait hydroéthanolique (test sur Klebsiella sp et
Salmonella sp)
N0
de la boîte de Pétri 1 2 3 4 5 T-
T+
Volume de la gélose en ml 9,9375 9,875 9,75 9,5 9 10 8,75
en ml (9600 mg/ml)
0,0625 0,125 0,25 0,5 1 / /
en ml (80µg /ml)
/ / / / / / 1,25
Concentration finale de l’extrait
(mg/ml) ou de gentamicine
(µg/ml)
60 120 240 480 960 0 10

16
I.2. Matériel biologique : les bactéries.
L’activité de nos deux extraits a été testée sur les souches d’Escherichia coli, Klebsiella
sp et Salmonella sp. Des échantillons de selles de nourrissons ont servi de base pour
l’isolement et la purification de ces entérobactéries.
Escherichia coli et Klebsiella sp ont été conservés sur le milieu EMB en pente dans des
tubes à vis. Salmonella sp par contre était conservé sur le milieu SS également en pente dans
des tubes à vis. Ces différentes souches étaient repiquées sur de nouvelles pentes après une
période de 7 jours quant elles ne sont pas utilisées afin d’en assurer une bonne conservation.
I.3. Milieux bactériens utilisés.
I.3.1. Gélose de Mueller Hinton II (gMH)
La gélose ordinaire ou gélose de Mueller Hinton II est le milieu que nous avons le plus
utilisé dans les manipulations. Il s’agit d’un milieu qui se solidifie après sa préparation et est
utilisé pour la réalisation des antibiogrammes et également dans la recherche. Son mode
d’emploi et sa formulation se trouvent en annexe 1.
I.3.2. Salmonella Shigella (SS AGAR)
Il s’agit là d’un milieu différentiel hautement sélectif et servant pour l’isolation de
Salmonellae et Shigellae à partir des échantillons cliniques ou alimentaires. Pour l’occasion ce
milieu a été utilisé pour Salmonella sp. Sa composition ainsi que son mode de préparation se
trouvent en annexe 1.
I.3.3. Eosin Bleu de Méthylène (EMB)
C’est un milieu de prédilection pour la croissance et l’identification des organismes
coliformes donc les entérobactéries. Pour cela ce milieu fût utilisé pour identification, isolement
et conservation de Escherichia coli et Klebsiella sp. En annexe 1 nous trouvons également des
informations sur sa composition et sa préparation.
II. Méthodes.
II.1. La technique de l’extraction
Les deux extraits ont été obtenus à partir d’un Rotavapor ou Vaporateur Rotatif qui
sépare le solvant d’extraction de l’extrait. Le point de fusion du solvant est l’élément capital
expliquant ce phénomène de séparation. Elle est définie comme la température à laquelle,
sous pression atmosphérique ou toute autre pression spécifique, un liquide est transformé en
vapeur ; c’est-à-dire la température à laquelle la pression de vapeur du liquide est égale à
celle du gaz environnant ou vapeur. (Hackh’s Chemichal Dictinary, 1944).

17
La concentration des extraits étaient faite à l’aide d’un Rotavapor Heidolph. Chacun des
extraits possède des substances solubles dans son solvant d’extraction. Ainsi on rencontre
des substances apolaires dans l’extrait hexanique et des substances polaires dans l l’extrait
hydroéthanolique.
II.2. Essais antibactériens.
II.2.1. Diffusion en milieu solide
Dans cette technique l’extrait peut être sur des disques comme support ou peut avoir
des puits comme points de départ pour la migration. Dans le cadre de ce travail les disques
ont été utilisés. Lorsqu’une bactérie est sensible à un extrait donné, on note la formation d’une
auréole d’inhibition autour du disque ou puits concerné.
Le dépôt des cinq disques sur le milieu ensemencé a été fait de la manière suivante :
G : disque imprégné de10 µl de gentamicine.
S : disque imprégné de 10 µl de solvant de dilution.
C1, C2 et C3 : disques imprégnés de 10 µl d’une préparation d’extrait (concentrations
croissantes et doublées de C1 à C2).
Figure 3 : Disposition des disques dans les boîtes de Pétri.
II.2.2. Dilution en milieu liquide
Dans cette méthode on permet à la souche bactérienne étudiée d’être en contact direct
avec une concentration donnée de l’extrait. Lorsque l’extrait est actif ou la bactérie sensible,
on notera une inhibition de la croissance de cette dernière.
Les différentes préparations de 10 ml chacune des tableaux 2, 3 et 4 sont coulées dans
des boîtes de Pétri et on laisse l’ensemble se solidifier à la température ambiante mais hors de
portée de toute contamination microbienne. Il faut ensuite préparer l’inoculum à tester (voir
Annexe 2). L’ensemencement en nappe est alors faite à la surface des boîtes. Enlever l’excès
de liquide à l’aide d’une pipette Pasteur. L’incubation à 37°C est faite pendant environ 18
heures de temps. Il faut alors lire et interpréter les différents résultats.
S
C1C3
G
C2

18
Quand on trouve un extrait actif à l’égard d’une souche donnée, on poursuit le travail
dans le but de déterminer sa CMI et sa CMB.
II.2.3. Mise en évidence de la bactéricidie
Les surfaces de boîtes d’essais où il n’y a pas eu de croissance visible de bactéries sont
prélevées en y promenant une anse. L’inoculum prélevé est utilisée pour ensemencer
directement une nouvelle boîte de gélose. Ces dernières boîtes sont incubées 18 heures à
37°
C. S’il n’y a pas de croissance, on note la concentration de la boîte prélevée comme une
CMB. Elle sera notée comme une CMI s’il y a reprise de la croissance (Carbonelle & al,
1987 ; Ngono 1999).
Après les résultats de la méthode de dilution en milieu solide, les tests de bactéricidie
tels que présentés dans le tableau suivant ont été effectués :
Tableau 5 : tests de bactéricidie
Concentrations testées (mg/ml)
EH EHE
E. coli NT 480
Klebsiella sp 400 800 960
Salmonella sp NT 960
NT : Non Testé.

Résultats et discussion

19
Chapitre III : Résultats et discussion
I. Résultats
I.1. Rendements des extractions.
Les rendements d’extraction ont été calculés par rapport au poids de matière végétale
sèche en utilisant la formule suivante :
L’extrait hexanique obtenu est rouge tandis que l’extrait hydroéthanolique est noir.
Tableau 6: rendements des extractions
Date et lieu d’achat
des graines
Date d’extraction Rendements
Extrait hexanique
Extrait
hydroéthanolique
Novembre 2002 au
marché de
Bafoussam
Juillet 2003
6,673% 8,551%
I.2. Méthode de diffusion en milieu gélosé
Sur la base de tests préliminaires effectués, les concentrations d’extraits, de
Gentamicine et de solvants de travail dans les tableaux 2, 3 et 4 ont été utilisées. Les
diamètres d’inhibition représentent la moyenne de trois essais effectués. Les figures 1 et 2
donnent un aperçu des résultats obtenus.
I.2.1. Cas de l’extrait hexanique
Tableau 7: résultats en mm des diamètres d’inhibition pour l’extrait hexanique
Concentrations (mg/ml)
Extrait
hexanique 100 200 400
Gentamicine
10µg/ml
DMSO
(2%)
E. coli 0 2 1 11 0
Klebsiella sp 1 2 3 12 0
Salmonella sp 1 3 4 11 0
Masse d’extrait X 100
Rendement (%) =
Masse de matière végétale

20
I.2.2. Cas de l’extrait hydroéthanolique
Tableau 8: résultats en mm des diamètres d’inhibition pour l’extrait hydroéthanolique
Concentrations (mg/ml)
Extrait
hydroéthanolique 120 240 480
Gentamicine
10µg/ml
Ethanol
(50%)
E. coli 1 2 7 12 0
Klebsiella sp 1 1 1 11 0
Salmonella sp 2 4 4 11 0
Figure 4: Activité de l’EH sur E. coli (A), Klebsiella sp (B) et Salmonella sp (C)
Figure 5 : Activité de l’EHE sur E. coli (A), Klebsiella sp (B) et Salmonella sp (C)
I.3. Méthode de dilution en milieu solide
Les concentrations utilisées ici découlent de celles utilisées dans la méthode de
diffusion en milieu gélosé. Les essais ont été repris deux fois pour confirmation de résultats.
Les résultats obtenus pour cet extrait sont résumés dans le tableau 9:
A B C
A B C

21
Tableau 9 : CMI de l’EH du test d’incorporation à la gélose.
Concentrations de l’extrait (mg/ml)
T-
50 100 200 400 800 T+
E. coli + + + + + + -
Klebsiella sp + + + + - - -
Salmonella sp + + + + + + -
T-
: Témoins négatif (DMSO 2%).
T+
: Témoins positif (10µg/ml de gentamicine).
- : Pas de croissance bactérienne (inhibition).
+ : Croissance.
Les résultats obtenus pour cet extrait sont résumés dans le tableau 10 :
Tableau 10 : CMI de l’EHE du test d’incorporation à la gélose.
Concentrations de l’extrait (mg/ml)
T-
30 60 120 240 480 960 T+
E. coli + + + + + - NT -
Klebsiella sp + NT + + + + - -
Salmonella sp + NT + + + + - -
T-
: Témoins négatif (Ethanol 50%).
T+
: Témoins positif (10µg/ml de gentamicine).
NT : Non Testée.
- : Pas de croissance bactérienne (inhibition).
+ : Croissance.
Les figures 6, 7, 8, 9, 10 et 11 illustrent les différents résultats précédents :
Figure 6 : Test sur E. coli par l’EH
Gentamicine 10 µg/ml
EH 200 mg/ml
EH 100 mg/ml
EH 50 mg/ml
EH 800 mg/ml
EH 400 mg/ml
DMSO 2%

22
Figure 7 : Test sur Klebsiella sp par l’EH
Figure 8 : Test sur Salmonella sp par l’EH
Figure 9 : Test sur E. coli par l’EHE
EH 400 mg/ml
EH 800 mg/ml
EH 100 mg/ml
EH 50 mg/ml
EH 200 mg/ml
DMSO 2%
EH 50 mg/ml
EH 100 mg/ml
EH 400 mg/ml
EH 800 mg/ml
EH 200 mg/ml
DMSO 2%
EHE 800 mg/ml
EHE 400 mg/ml
Ethanol 50%
EHE 50 mg/ml
EHE 100 mg/ml
EHE 200 mg/ml

23
Figure 10 : Test sur Klebsiella sp par l’EHE
Figure 11 : Test sur Salmonella sp par l’EHE
I.4. Tests de bactéricidie
Ces tests ont également été repris deux fois afin de garantir la qualité scientifique des
résultats.
Pour les boîtes 400 et 800 mg/ml (concentrations utilisées contre Klebsiella sp) on ne
note aucune reprise de croissance. Dans ce cas nous avons CMB = 400 mg/ml.
E. coli : On ne note aucune reprise de croissance pour la boîte 480 mg/ml. La CMB
ici est de 480 mg/ml.
Klebsiella sp : La boîte 960 mg/ml présente une reprise de croissance. On aura
pour CMI ici 960 mg/ml.
Salmonella sp : Dans la boîte 960 mg/ml il n’y a pas de croissance bactérienne.
CMB = 960 mg/ml
EHE 50 mg/ml
EHE 400 mg/ml
EHE 800 mg/ml
EHE 100 mg/ml
EHE 200 mg/ml
Ethanol 50%
EHE 50 mg/ml
EHE 400 mg/ml
EHE 800 mg/ml
EHE 100 mg/ml
EHE 200 mg/ml
Ethanol 50%

24
Les figures 12 et 13 illustrent les résultats obtenus par ces tests de bactéricidie.
Figure 12 : Tests de bactéricidie pour l’EH
kj Figure 12 : Tests de bactéricidie pour l’EH
Figure 12 : Tests de bactéricidie pour l’
Figure 13 : Tests de bactéricidie pour l’EHE
A
C
B
A : Inoculum prélevé sur la boîte ‘’EH 400 mg/ml (test sur Klebsiella sp)’’ dans la technique de dilution
en milieu solide
B : Inoculum prélevé sur la boîte ‘’EH 800 mg/ml (test sur Klebsiella sp)’’ dans la technique de dilution
en milieu solide
C : Gentamicine 10 µg/ml
A
C
B
D
A : Inoculum prélevé sur la boîte ‘’EHE 480 mg/ml (test sur E. coli)’’ dans la technique de dilution
en milieu solide
B : Inoculum prélevé sur la boîte ‘’EHE 960 mg/ml (test sur Klebsiella sp)’’ dans la technique de
dilution en milieu solide
C : Inoculum prélevé sur la boîte ‘’EHE 960 mg/ml (test sur Salmonella sp)’’ dans la technique de
dilution en milieu solide
D : Gentamicine 10 µg/ml

25
II. Discussion
Le rendement d’extraction pour l’extrait haxanique (6,673%) est comparable à celui
obtenu par Ngono qui toujours avec les graines de Piper guineense a eu pour l’extrait
hydroéthanolique des rendements variant entre 7,11 et 8,96% (Ngono, 1999). Pour ce qui est
de l’extrait hydroéthanolique, son rendement (8,551%) est dans la gamme de ceux de Ngono
(1999) et est également proche de celui obtenu par Rosario & al. (2003) lors de l’extraction
des graines de Croton ruizianus (8,2%), plante utilisée dans le traitement de blessures et
comme antiseptique.
Au terme de l’évaluation de l’activité antibactérienne des deux extraits de graines de P.
guineense étudiés, il ressort clairement que l’extrait hydroéthanolique est le plus actif. Cet
extrait présente une CMB pour E. coli (480 mg/ml), une autre pour Salmonella sp (960 mg/ml)
et une CMI pour Klebsiella sp (960 mg/ml). La technique de diffusion en milieu solide prouve
que l’extrait hexanique possède des substances pouvant agir sur les trois souches
bactériennes étudiées. Malheureusement, il était impossible d’aller jusqu’à certaines
concentrations élevées dans la méthode de dilution en milieu solide. Des concentrations en
extrait d’une certaine valeur empêchent en effet la gélose de jouer son rôle de gélifiant lors de
la consolidation du milieu. Ainsi, seule la CMB de l’extrait pour Klebsiella sp a été obtenue
(400 mg/ml). Lorsque l’analyse est faite sous un autre angle, on trouve que Klebsiella sp est la
bactérie la plus vulnérable parmi les trois étudiées ici.
Dans la méthode de diffusion en milieu solide, on note pour le cas de l’extrait hexanique
(test sur E. coli), que le passage de la concentration 200mg/ml à 400mg/ml se traduit par une
baisse du diamètre d’inhibition. On constate également que ces diamètres restent constants
dans le cas de l’extrait hydroéthanolique quand le test est fait sur Klebsiella sp. Ces constats
peuvent s’expliquer par plusieurs raisons. La diffusion en milieu solide des substances
antibactériennes est influencée par plusieurs facteurs parmi lesquels, la concentration de la
substance sur le disque. Cette concentration doit être inférieure ou égale à la CMI qui sera
obtenue en dilution. On note l’impossibilité de la diffusion quand la concentration de la
substance antibactérienne est deux à quatre fois la CMI. La seconde raison est le temps
critique ou temps minimal de préincubation. Lorsque ce temps est débordé on ne peut plus
noter une activité de la substance antibactérienne. Une autre raison est le dépassement de la
population critique qui traduit la concentration de l’inoculum bactérien à partir de laquelle ne se
forme plus de plage d’inhibition. On peut finalement faire mention ici du fait que la diffusibilité
de la substance testée est également importante. Ces différentes raisons sont soutenues dans
leur intégralité par Carbonnelle & al. (1987) et évoquées en partie par Ngono (1999). Pour ce

26
qui est des deux faits observés dans ce travail et mentionnés en début de ce paragraphe,
nous pensons, à la vue des conditions de travail, que la charge du disque en serait la cause
principale si non unique. Il faut donc toujours tenir compte de la charge du disque dans de
telles manipulations.
Pour ce qui concerne les autres diamètres obtenus, on peut noter que l’antibiotique de
référence utilisé ici a montré une bonne activité avec des diamètres d’inhibition oscillant entre
10 et 11mm. Le DMSO et l’éthanol utilisé comme témoins négatifs n’ont eu d’effet sur la
croissance bactérienne.
Les valeurs de CMI et CMB obtenues pour les deux extraits sont inférieures à 1000
mg/ml. Elles sont ainsi très petites devant celles trouvées par Ahmad & al. (2000) au terme de
l’étude des activités antimicrobiennes de l’extrait éthanolique de T. bellirica sur
Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Salmonella typhimurium, E. coli et Candida albicans
(4000 à 7000 mg/ml). Il faut également noter que ces mêmes valeurs obtenues pour les deux
extraits de P. guineense dans ces travaux sont largement supérieures à celles obtenues par
Ngono (1999) pour l’extrait éthanolique et ses fractions. Les concentrations actives alors
trouvées variaient entre 100 et 1000 µg/ml. Signalons que les fractions dérivées de cet extrait
alcoolique étaient très activent sur les champignons étudiés.
Nous pouvons comprendre que les activités présentées par P. guineense sur E. coli,
Klebsiella sp et Salmonella sp sont liées aux diverses substances contenues dans chacun des
deux extraits.

Conclusion et perspectives

Conclusion et perspectives
27
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
En réalité il est clair qu’un travail de recherche ne peut être déclaré complètement
achevé. On arrive toujours juste à des conclusions partielles qui ouvrent de nouveaux horizons
pour la recherche. Le présent document ne saurait se soustraire à cette réalité.
Faire une contribution dans la résolution des difficultés que pose dans beaucoup de pays
du monde les diarrhées et autres infections infantiles causées par les entérobactéries est
l’objectif principal qui était assigné à ce travail. Les résultats obtenus ont permis de dire
aujourd’hui que l’extrait hexanique tout comme l’extrait hydroéthanolique des graines de P.
guineense présentent des activités antibactériennes. Klebsiella sp est l’espèce sensible à la
fois pour les deux extraits. E. coli quant à lui s’est montré sensible à l’action de l’extrait
hydroéthanolique. A son égard, l’extrait hexanique a eu une activité en demi-teinte car elle ne
s’est limitée qu’à la technique de diffusion en milieu solide. Ce fut le même cas de figure pour
Salmonella sp.
Plusieurs projets de recherche se dégagent de ce travail à la vue des éléments qu’il faut
encore élucider et voir même explorer. Cette étude n’a pris en compte que les extraits
hexanique et hydroéthanolique. Une investigation peut donc être faite sur les entérobactéries
responsables d’infections et de diarrhées infantiles, mais utilisant un extrait total des graines
de P. guineense. D’autres tests encore peuvent se faire en utilisant des fractions obtenues de
ces différents extraits du poivre de guinée. Ceci permet de se faire une idée plus claire sur les
substances agissant sur les bactéries étudiées. Notons pour terminer qu’on peut également
mener ces mêmes recherches en utilisant la technique de dilution en milieu liquide.
P. guineense, malgré ses diverses utilisations dans le monde par les peuples et les
organisations à travers les civilisations, se montre par ce travail comme une ressource de
substances aux propriétés antibactériennes et tout particulièrement les entérobactéries
responsables de diarrhées et infections infantiles.

Bibliographie

Bibliographie
28
BIBLIOGRAPHIE
1. Adjanohoun E.J., Adjakidje V., Anyi M. R. A., Ake A. L., Akoegninou A., d’Aleida J.,
Apovo F., Bouke F. K., Chadare M., Cusset G., Dramane K., Eyme J., Gassita J.
N., Gbaguidi N., Goudote E., Guinko S., Hounson P., Issa Lo, Keita A., Kiniffo H.
V., Konebamba D., Musampa N. A., Saadou M., Sodo-Gandji Th., De S. S.,
Tchabi A., Zinsou D. C. et Zohoun T.; Médecine traditionnelle et pharmacopée :
Contribution aux études ethnobotaniques et floristiques de la République
populaire du Bénin; A.C.C.T., Paris; 274-282, 305 (1989).
2. Ahmad I., Mehmood Z., Mohammad F. et Ahmad S.; antimicrobial potency and
synergistic activity of five traditionally used Indian medicinal plants. Journ. of Med.
and Aromatic Plant Sci.; 22 (1): 34 (2000).
3. Alcamo E. I.; Fundamentals of microbiology; Addison-Wesly publishing company,
London; 310-341, 617-699 (1984).
4. Amusan A.A.S. et Okorie T.G.; The use of P.guineense fruit oil (PFO) as protectant
of dried fish against Dermestes Maculatus (Degeer) infestation; Glob. J. of P. and
App. Sci. ; 8 (2): 197-201 (2002).
5. Amvam Z. P. H., Biyiti L., Tchoumbougnang F., Menut C., Lamaty G. and Bouchet
P.; Aromatic plants of tropical Central Africa. Part XXXII Chemical composition
and antifungal activity of thirteen essential oils from aromatic plants of Cameroon;
Flavour Fragrance J.; 13: 107-114 (1998).
6. Busson F., Jaeger P., Lunven P. et Pinta M.; Plantes Alimentaires de l’Ouest
Africain ; Etude botanique, Biologique et chimique ; Marseille Leconte ; 126
(1965).
7. Carbonnelle B., Denis F., Marmonier A., Pinon G., Vargues R. ; Bactériologie
médicale, Techniques usuelles ; 3ème
tirage, SIMEP S.A.-Paris, France, 231 – 250
(1987).
8. Dongmo A. M. E. ; Evaluation de l’activité antifongique des huiles essentielles
extraites de huit épices vis-à-vis de Fusarium Pallidoroseum ; Mémoire de
maîtrise Biochimie à l’Université de Douala, 28 (2002).
9. Dosso M., Coulibaly M. & Kadio A., Place des diarrhées bactériennes dans les
pays en développement, (1998).

Bibliographie
29
10. Dwivedy S. K. et Dubey N. K.; Potential use of the essential oil Tachyspernum
ammi against seed-borne fungi of Guar (Cyamopsis tetragonoloba L. Taub.),
Mycopathol; 121:101-104 (1993).
11. Hackh’s Chemichal Dictionary ; Philadelphia (1944).
12. Ivbijaro M.F.; The efficacy of seed oils of Azdrachta indicia, A Juss and Piper
guineense Schum and Thonn on the control of Callosobruchus maculates; Inset
Sci. and App.; 11(2): 149-152 (1990).
13. Kamtchouing P., Mbongue G.Y.F., Dimo T., Watcho P., Jatsa H.B. et Sokeng S.D. ;
Effets de Aframomum melegeuta et Piper guineense sur le comportement sexuel
des rats ; Behaviour. Pharmacol. ; 13 : 243-247 (2002).
14. Kellner W. et Kobert W.; Röglichkeiten der werwendung atherischer öleezur raum
desinfecktwin, Arzeimitell forshung; 419 (1954).
15. Leclerc H. ; Microbiologie générale ; Doin, Paris ; 279 (1975).
16. Michael Pelczar J. Jr et Roger Reid d, Microbiology, second edition, 325 (1965).
17. Ngono N. A. ; Contribution à l’étude des propriétés antifongiques et analyse
phytochimique de cinq plates médicinales Camerounaises.1999 ; Thèse
présentée en vue de l’obtention du grade de : Docteur de l’Université de Reims
Champagne Ardenne et de l’Université de Yaoundé I. Mention : Pharmacie,
Spécialité :Mycologie ; 22-24,88-89 (1999).
18. Ngono N. A., Biyiti L., Bouchet P., Nkenfack A. et Amvam Z. P. H.; Antifungal
activity of P. guineense of Cameroon; Fitot; 74(5): 464-468 (2003).
19. Noumi E.; Les plantes à épices, à condiments et à aromates du Cameroun ; Thèse
de Doctorat ; 100-117 (1984).
20. Rahalison L.; Mise au point et application d’une méthode de dépistage d’activité
antifongique (Candida albicans) dans des extraits végétaux ; Thèse de Doctorat,
Université de Lausanne ; 229 (1994).
21. Rios J. L., Recios M. C. and Villar A.; Screening method for natural products with
antimicrobial activity: A review of literature, J. Ethnopharmacol.; 23: 127-149
(1988).
22. Rosario R., Beatriz B., José B., Irma F., Joaquina A. et Olga L.; Antimicrobial
activity of selected Peruvian medicinal plants; Journ. Of Echnopharm.; 88:199-204
(2003).

Bibliographie
30
23. Semacumu G. et Kouahou F. ; Effet d’extraits de plantes sur la bruche du niébé
(Callosobruchus maculatus Fab) et le charançon du riz (Sitophilus oryzae L.) ;
Cahier Agricultures ; 5 :39-42 (1996).
24. Singleton P. ; Bactériologie, 2e
édition ; Masson ; 1-224 (1994).
25. Stewart F. S. et Beswick T. S.; Bacteriology, Virology and Immunity for Students of
Medicine, Tenth edition, 201-203 (1977).
26. Taudou A. ; Activité antifongique des Labiatae; Données bibliographiques; Etudes
in vitro de treize huiles essentielles (Intérêt de la microémulsion) ; Thèse de
Doctorat d’Etat ès-Sciences pharmaceutiques ; Université Paul Sabatier-
Toulouse ; 1-245 (1990).
27. Tchoumbougnang F. ; Contribution à la détermination des teneurs, des
caractéristiques chimiques et des activités antifongiques des huiles essentielles
de quelques plantes aromatiques, condimentaires et médicinales du Cameroun ;
Thèse de Doctorat 3e
Cycle en Biochimie, Université de Yaoundé I ; 168-171,
224-240 (1996)
28. Torres-Rodriguez J. M., Carrillo-Munoz A. et Madrenys-Brunet N.; Minimal
inhibitory concentrations of Sertaconazole, Miconazole and Clotrimazole against
14 strains of Scopulariopsis brevicaulis isolated from onychomycoses ; J. Mycol.
Méd.; 4: 225-228 (1993).

Annexes
I
ANNEXES
ANNEXE 1: PROTOCOLE DE PREPARATION DES MILIEUX gMH, SS ET
EMB.
GELOSE MUELLER HINTON II (gMH).
Base servant pour réalisation de l’antibiogramme par la technique des disques (diffusion
en gélose).
Mode d’emploi :
Mettre 38 g de poudre en suspension dans un litre d’eau distillée stérile. Bien mélanger.
Chauffer sous agitation fréquente et laisser bouillir pendant une minute de manière à
dissoudre parfaitement la poudre. Placer l’ensemble à l’autoclave à 121° C pendant 15
minutes. Ne pas surchauffer.
Formule approximative par litre
Extrait de bœuf……………………….2,0 g
Hydrolysat acide de caséine ……….17, 5 g
Fécule de maïs………………………1,5 g
Gélose…………………………………17,0 g
pH définitif …………………………….7,3 ± 0,1
EOSINE BLEU DE METHYLENE (EMB).
Milieu différentiel pour l’isolement et l’énumération des organismes coliformes
Indications:
Peser 37,5 g de poudre et les disperser dans un litre d’eau distillée stérile. Laisser
tremper 10 minutes. Remuer pour mélanger et stériliser en portant à l’autoclave à 121°C
pendant 15 minutes. laisser refroidir jusqu’à 47°C et agiter légèrement pour assurer une
distribution uniforme des composés précipités avant de couler dans des boîtes de Pétri.
Apparence : Bleu/pourpre.
Formulation grammes/litre
Peptone équilibrée N°1………………………10,0
Lactose…………………………………...……10,0
Phosphate Dipotassique………………………0,7
Phosphate Monopotassique…….……………1,3
Eosin Y…………………………………….……0,4
Bleu de Méthylène……………….…………0,065
Agar N°2………………………………………15,0
pH …………………………………………6,8±0,2

Annexes
II
SALMONELLA SHIGELLA (SS AGAR)
Directions :
Peser 60 g de poudre et y ajouter 1l d’eau distillée stérile. Laisser trempé 10 minutes.
Remuer pour mélanger et porter l’ensemble à l’ébullition. Laisser refroidir à 47°C, bien
homogénéiser et couler les boîtes. Sécher la surface avant inoculation. Ne pas porter ce milieu
à l’autoclave.
Il s’agit d’un milieu hautement sélectif pour l’isolement de Salmonella et Shigella à partir
d’échantillons alimentaires ou cliniques.
Formulation grammes/litre
Extrait de Bœuf 5,0
Peptone équilibrée 5,0
Citrate de Sodium 8,5
Thiosulphate de Sodium 8,5
Agar Agar 13,5
Lactose 10,0
Lamelle de bile n°3 8,5
Citrate ferrique 1,0
Vert Brillant 0,00033
Rouge Neutre 0,025
pH 7,0 ± 0,1
ANNEXE 2 : COMPTAGE DE BACTERIE (Singleton, 1994)
Avant l’utilisation des différentes souches bactériennes il fallait faire leur comptage afin
d’avoir 106
UFC (Unités Formant Colonie). Voici le procédé employé pour cela :
Une colonie purifiée et gardée en pente sur le milieu approprié est mise en solution à
l’aide de quelques ml d’EDS.
Prélever ensuite un ml par exemple de cette préparation qu’on dilue dans environ 20 ml
d’EDS.
Monter l’échantillon sur une cellule de Mallassez (ou toute autre cellule de comptage
disponible) et laisser l’ensemble reposer 30 minutes.
A l’aide d’un compteur et d’un microscope, compter les bactéries visibles sur tout le
quadrillage de la cellule.
Si le résultat du comptage donne par exemple n’, utiliser la formule suivante pour
déterminer la concentration de la préparation en bactéries :

Annexes
III
N=n x 105
. Ici n= n’/25 et N est le nombre de bactéries par ml de préparation.
Dans le cas où N est supérieur à 106
UFC, faire une dilution appropriée pour retrouver la
concentration désirée. Il faudra reprendre toute l’opération si jamais on trouvait N inférieur à
106
UFC.

Biochem_Symplice Kamgang

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Viewers also liked

Viewers also liked (20)

Similar to Biochem_Symplice Kamgang

Similar to Biochem_Symplice Kamgang (20)

Biochem_Symplice Kamgang