PPT Cirillo "La diagnosi di tubercolosi"

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PPT Cirillo "La diagnosi di tubercolosi"

  1. 1. LA  DIAGNOSI  DI  TUBERCOLOSI   D  M  Cirillo   Is+tuto  Scien+fico  San  Raffaele   WHOcc   Milan  Italy  
  2. 2. Outline   •  Problema+che  legate  alla  diagnosi  di  TB  in  HIV   •  Diagnos+ca  tradizionale:   •  POC   •  Raccomandazioni  dell’OMS   •  Diagnos+ca  molecolare  e  analisi  delle   resistenze    
  3. 3. Problema<che  legate  alla  diagnosi     di  TB  in  HIV   •  Localizzazione   •  Paucibacillarità   •  Cri+cità  del  paziente   •  Progressione  della  malaIa  
  4. 4. Rapid test Inexpensive n  Specificità per Mycobacterium spp: >95% n  Sensibilità: 25-65% (90 % infettivi) 1st AFB smear 80-82 % 2nd AFB smear 10-14 % 3rd AFB smear 5-8 % Fluorescence Ziehl-Neelsen staining n Does not allow species identification n Not applicable to all samples Microscopia   LED raccomandato rispetto a microscopia tradizionale e fluorescenza
  5. 5. Il  paziente  HIV  posi+vo  è  +picamente   paucibacillare,  con  TB  non  cavitaria,  spesso   extrapolmonare  =  microscopia  nega<va   Il  paziente  HIV  posi+vo  è  soggeOo  a  infezioni  da   micobaOeri  non  tubercolari  che  non  rispondono   alla  terapia  an+tubercolare=  microscopia   posi<va  che  puo’  essere  misinterpretata  come   fallimento  terapeu<co   Microscopia  in  HIV  posi<vo  
  6. 6. Alere  Determine  TB-­‐LAM  an<gene  
  7. 7. LAM  e  Specificità:  problemi  non  risol<   •  Sensibilità  della  coltura  liquida  come  “gold  standard”   •  Uso  di  campioni  respiratori,  in  par+colare  escreato   •  Follow  up  in  pazien+  con  microbiologia  nega+va   •  NTMs   •  Contaminazione  e  crossreaIvità  degli  an+corpi  con   NTMs  
  8. 8. Vantaggi •  Diagnosi certa di TB •  Aumenta del 30-50% il numero di casi confermati •  Se liquida relativamente rapida •  Disponibilità del ceppo per ATB e epidemiologia LIMITI •  costi legati alla procedura e alla struttura di contenimento •  Tempi di risposta legati alla lentezza di crescita •  Contaminazione RITENUTA; FORSE ERRONEAMENTE IL GOLD STANDARD Coltura    
  9. 9. Vantaggi •  Dati sulla sensibilità in vitro •  Permette di adottare un regime terapeutico presonalizzato •  Permette di raccogliere dati dati di solveglianza che informano regimi empirici standardizzati •  Permette di monitorare lo sviluppo di resistenze Limiti •  Costi legati alla procedura e alla struttura di contenimento •  Complessità di esecuzione •  Tempi di risposta incompatibili con un trattamento rapido •  Contaminazione •  Attendibilità relativa e legata alla complessità di esecuzione e alle caratteristiche delle singole molecole An<biogramma  
  10. 10. •  “gold  standard”  diagnos+co   •  Tempi  di  posi+vizzazione  lunghi  lega+  alla   carica  baOerica   •  ATB  disponibile  dopo  seImane   •  TAT  spesso  incompa+bile  con  il  management   correOo  del  paziente  cri+co   Coltura  e  ATB  in  HIV  posi<vo  
  11. 11. WHO  Global  plan  (2006-­‐2015):development  and  roll  out  of  new  technologies  to  be  adopted  in   resources-­‐limited  seIngs   GenoType  MTBDRplus   • Reverse  hybridiza+on,  colorimetric  reac+on   • Results  in  6-­‐7  h   •   some  flexibility  (n  probes/strip:  30-­‐40)   •   Technical  exper+se:  some   • Biosafety  lev  2   Xpert  MTB/RIF     • Integrated/automated  qPCR   • Results  in  2h   • Closed  system  (limited  number  of  probes:   <10)   •   Technical  exper+se:  none   Test  molecolari  commerciali  approva<   dall’OMS  per  TB/MDR  TB  
  12. 12. Il  WHO  raccomanda  test  molecolari   (Xpert/LPA)  per  la  diagnosi  di  TB  
  13. 13. Tubercolosi  Extrapolmonare:   Xpert  TB/(Rif)   confidenziale  
  14. 14. Drug   Gene   Gene  product/  func<on   Isoniazid   katG,  inhA,   ahpC,       kasA   catalase  peroxidase,  enoyl  acp  reductase     alkyl  hydroperoxide  reductase   β-­‐ketoacyl-­‐ACP  synthase       Rifampicin   rpoB   RNA  polymerase  β  subunit     Pyrazinamide   pncA   pyrazinamidase   Ethambutol   embA,  embB,  embC   arabinosyl  transferase     Streptomycin   Kanamycin,   AMK,CAP   Rrs,  whiB7   rpsL,  tlyA     gidB,  eis  promoter   16S  ribosomal  RNA,  promotor  eis  and  tap   ribosomal  subunit  12,  methyltransferase     16Smethyltransferase,  acetyltransferase   Quinolones   PAS     Cycloserine   Prothionamide   gyrA,  gyrB   thyA,dfrA,folC,   nhoA.acc   alr,  ddlA,  cycA   inhA,  eta   DNA  gyrase   Thymidylate  synthase,  folate  reductase/   synthase,  acetyltransferease   D-­‐ala  ligase,  racemase,  transporter   InhA,  ac+vator  monoxygenase   Mul+ple,  interac+ng,  heterodisperse  muta+ons  -­‐    variable  suscep+bility  phenotypes   Determinan<  gene<ci  della   resistenza  
  15. 15. Xpert  MTB/Rif  per  la  diagnosi  di   Rif-­‐Resistenza  
  16. 16. Boehme  CC  et  al  2011.  Lancet  377(9776):1495-­‐505   RIF-­‐R  detec<on   Time  to  report  to  treatment  center   Xpert  MTB/RIF:  0-­‐1  d   LPA:  10-­‐26  d*   Culture  DST:  30-­‐124  d**   Xpert  MTB/RIF:  0-­‐1  d          (Microscopy:  1-­‐2  d)   LPA:  27-­‐53  d*   Culture  DST:  38-­‐102  d**  (culture:  42-­‐62  d)   Some  results  not  reported/lost   *  test  on  AFB-­‐pos  clinical  specimen  +  test  on  clinical  isolate  for  AFB-­‐neg  cases   **  DST  performed  by  MGIT  +  DST  performed  on  LJ   TAT  to  Rif  –R  detec<on  and  repor<ng  
  17. 17. WHO/HTM/TB/2011.2     VPP  e  VPN  per  la  resistenza  della  Rif  a   diverse  prevalenze  di  resistenza  della  Rif  
  18. 18. Test  commerciali  per  Fluoroquinoloni  ed   InieXabili   •  I  test  LPA  commerciali  per  la  diagnosi  della  resistenza   ai  farmaci  di  seconda  linea  mostrano  un  alto  valore   di  VPP  e  un  basso  valore  di  VPN  causato  dal  numero   limitato  di  mutazioni  incluse  nei  test   •  VPP  e  VPN  potrebbero  variare  con  il  backgroud   geno+pico  dei  ceppi  e/o  con  la  prevalenza  di  uno   specifico  geno+po  nella  popolazione  target   •  Alta  prevalenza  di  cloni  specifici  recan+  mutazioni   selezionate  non  comprese  negli  aOuali  test   diagnos+ci  possono  modificare  i  valori  di  VPP  e  VPN   MioOo  et  al.  ERJ  2012  
  19. 19. Sanità  Pubblica      –  indagini  in    real  +me  di  outbreak                –  epidemiologia  molecolare   • Whole genome sequencing (WGS) e analisi delle resistenze 900+  mutazioni  in  ~50  geni    associa+  a  farmacoresistenza     in  Mycobacterium  tuberculosis       WGS + algoritmo interpretativo Cole  et  al.,  Nature  393  (1998)   ImpaXo  clinico  della  genomica  
  20. 20. High  confidence  calls   e.g.    >85%  INHR    SNPs  in  katG  or  inhA    95%  RifampicinR    rpoB  SNPs  in    RRDR  –  codons    507-­‐533    quinolones  gyrA  SNPs  in  QRDR    (D94G  vs  A90V)   Predic<ve  calls  e.g.         KANR        rrs    A1401G      &  C517T    plus  eis  promoter  G-­‐10A    or  C-­‐14     CAPR            rrs        A1401G,  C1402T,  G1158T    +  possible  eis  C-­‐12T     AMK  R    rrs  A1401G  +  eis  promoter       Problemi:  associazione    con  MIC  e  risposta  al  farmaco   SNPs  filogene+ci  /  polimorfismie/o  sinonimi   Non  tuXe  le  mutazioni  sono  uguali:  High   confidence  calls/predic<ve  calls  
  21. 21. Table  1.  List  of  M.  tuberculosis  isolates  used  in  this  study.   Malik  S,  Willby  M,  Sikes  D,  Tsodikov  OV,  et  al.  (2012)  New  Insights  into  Fluoroquinolone  Resistance  in  Mycobacterium  tuberculosis:  Func+onal   Gene+c  Analysis  of  gyrA  and  gyrB  Muta+ons.  PLoS  ONE  7(6):  e39754.  doi:10.1371/journal.pone.0039754   hOp://www.plosone.org/ar+cle/info:doi/10.1371/journal.pone.0039754  
  22. 22. •  gyrA:   –  7582AG  =  D94G  (mutazione  high  confidence)     –  >8ug/ml  ciprofloxacin/ofloxacin/levofloxacin   –  >2ug/ml  moxifloxacin   •  Altre    tre  mutazioni  non  sinonime  in  gyrA  che  potrebbero   alterare  la  funzione.     •  Studio  sorveglianza  WHO:   o  97  campioni  sequenzia+   o  Concordanza  MGIT-­‐seq  (84/97  campioni):  86,6%  (46  R-­‐mut,  38  S-­‐ wt)   o  Discordanza  MGIT-­‐seq  (13/97):  13,4%  (13  R-­‐wt)     FluoroquinoloneR  -­‐  Conclusioni  
  23. 23. Alto    numero  di  mutazioni  in  pncA   disperse  nell’intero  gene     Necessità  di  sviluppo  di  un  test  rapido     Marker  di  resistenza  (80-­‐85%)   Poliformismi  silen<    (1-­‐2%)   Non  associa<  a  resistenza  (4-­‐5%)   Associazione  da  chiarire  (4-­‐5%)   Falsi  resisten<  (2-­‐3%)   •  Studio  sorveglianza  WHO:   o  874  campioni  sequenzia+   o  Concordanza  MGIT-­‐seq  (60/62):                  96,8%  (22  R-­‐mut,  38  S-­‐wt)   o  Discordanza  MGIT-­‐seq  (2/62):  3,2%                  (1  S-­‐mut,  1  R-­‐wt)     Solo  marker:  prom  -­‐11, cod  10-­‐49-­‐51-­‐57-­‐68-­‐94 Pirazinamide  
  24. 24. •  E’  legata  alla  determinazione  della  presenza  di  MTB  o   sue  componen+  nel  campione,  per  questo  mo+vo  la   sensibilità  rimane  suboImale  nei  campioni  pauci   bacillari   •  Futuro  approccio  all’ATB:      NGS  permeOerà  un’analisi   completa  delle  mutazioni  interpretabili  sulla  base  di   regole  chiare  e  associabili  ad  un  outcome  clinico.  La   tecnologia  permeOerà  di  sviluppare  piaOaforme   user-­‐friendly  aOe  all’iden+ficazione  degli  SNPs   rilevan+   •  Biomarcatori   •      Take  home  message:  Diagnosi  di   microbiologica  di  TB  
  25. 25. Riccardo  Alagna   Emanuele  Borroni   Andrea  M.  Cabibbe   Lucinda  Furci   Paola  Mantegani   Paolo  MioXo   Enrico  Tortoli   Elisa  Tagliani   Ilaria  Valente       Grazie per l’attenzione

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