Análise de Risco Ambiental do Milho GM: Manejo daResistência de Insetos (MRI)                           José Magid Waquil ...
Protocolo de Cartagena  • Biossegurança de OGMs vivos;  • Países desenvolvidos e em desenvolvimento;  • Métodos científico...
Principais Aspectos 1) Hibridização dos OGM com seus parentes selvagens; 2) Desenvolvimento de resistência de pragas ao OG...
Principais Aspectos (cont.)5) Redução de biodiversidade;6) Efeito sobre polinizadores;7) Efeito sobre inimigos naturais; e...
Análise de Risco de OGMs• É uma iniciativa internacional para desenvolver  uma abordagem científica rigorosa visando avali...
Objetivos: • Formulação e avaliação de hipóteses de risco,   claras, usando o máximo de dados disponíveis   para a tomada ...
Determinação do Risco                      Sistema de produção          Dose de     cultura, fenologia,          Eficácia ...
Risco Ambiental mais Iminente Quebra da Funcionalidade – Resistência  Praga Resistente: “Praga com capacidade de  sobreviv...
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Bases para a Análise:  • Curva de Mortalidade    • linha Probit-Log  • Dose Letal Média    • – suficiente para matar 50% p...
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Bioensaio: distribuição de frequência  Mort. (%)   Freqüência     3,0          20     9,0          40       700    15,0   ...
Bioensaio: mortalidade acumuladaDose (mg)   Mortal. (%)   0,0         0,0                                    Curva de Dose...
Bioensaio: log da dose/mortalidade                                                                   Log dose    Mortalida...
Bioensaio: curva de mortalidade                                                          Log Dose   Probit                ...
Genética da Resistência                          Omoto&Maia
Genética da Resistência: dominância                              Omoto&Maia
Genética de populações  • Equilíbrio de Hardy-Weinberg     –(p+q)2= p 2 (SS)+ 2pq(Ss)+ q 2(ss)= 1 onde:     – q= freqüênci...
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Evolução da Resistência: frequência  Premissas : monogênica, dialética (S e R) e autossômica                            SS...
Evolução da Resistência: dominância
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Frequência Crítica                     Omoto&Maia
Tamanho da AmostraNecessário para detectar pelo menos um indivíduo resistenteP(x1) = 1 – P(x=0)                          ...
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Alta Dose Operacional Depois que se conhece o alelo R, a alta ideal seria aquela concentração que mata 100% dos indivíduos...
Bioensaio: CL de Toxinas Bt/LCMProbabili                 Cry 1 A(b)                               Cry 1F-dade             ...
Índice de Inibição no Ganho Peso        LC50=689,81ng/cm2                                                        LC50=36,4...
Não-Preferência LCM para milho Bt          Não-Bt                       Bt          DKB 330                               ...
Recuperação de Larvas Pequenas                No. vivas=66                                    Sobrevivência = 62,86%      ...
Evolução da Resistência Depende
Fatores que Afetam      a Evolução da Resistência•   Eventos de Bt disponíveis•   Área cultivada com a cultura transgênica...
Manejo da Resistência
Manejo da Resistência/Insetos (MRI)  • Manejo da Resistência(Inseto): Esforço para   adiar ou prevenir a adaptação de espé...
Área de Refúgio - AR • Objetivo da AR – permitir desenvolvimento   de insetos susceptíveis em quantidade   suficiente para...
Manejo da Resistência Milho Bt  • Tamanho da Área de refúgio:    – 10% da área de milho para uma toxina    – 5% da área de...
Funcionamento do RefúgioDispersão suficiente para             Área de refúgio paragarantir cruzamentos                    ...
Refúgio Estruturado I                                                      800 m • Campo separado                         ...
Refúgio Estruturado II/pivô-central •Milho não-Bt no •centro do Pivô    “Refúgio central” 10%                      800 m ...
Refúgio no Saco/“mistura de semente” • Mistura de sementes milho Bt e não-Bt no mesmo saco e foi aprovado nos EUA para 201...
Pirâmide/Sequência de Genes a – 75% mortalidade RS para cada toxina b – 50% mortalidade RS para cada toxina c – 50% + 75% ...
Monitoramento Pós-Liberação        Exemplo: Ostrinia nubilalis – ECB/EUA                              Biomassa            ...
Mortalidade da LCM em Cry 1F
Inibição da LCM em Cry 1F
Determinação do Perigo da Resistência • Caracterização da população em risco      • História de resistência da espécie-alv...
Fluxo Gênico:o milho em referência
Fontes de misturas adventícias 1. Transferência de pólen entre plantas –    fluxo gênico 2. Misturas de sementes (contamin...
Fluxo Gênico• Vertical: entre indivíduos da mesma espécie     1. Alógamas – menos de 5% de autofecundação     2. Autógamas...
Coexistência Estratégia para que os produtores agrícolas continuem a fazendo suas escolhas prática utilizando variedades c...
Características do Milho • Planta monóica: inflorescência masculina (pendão) e   feminina (boneca) na mesma planta • Liber...
Polinização cruzada/milho  •   Distância entre a lavouras  •   Barreiras físicas  •   Condições climáticas  •   Velocidade...
Exemplos de Coexistência1. Manutenção da pureza genética de linhagens elites   em programas de melhoramento2. Manutenção d...
Isolamento Espacial no Milho                                     Resultados de 16 ensaios no                              ...
Taxa de Cruzamento/Distância              Milho                                                      Soja  Indicador: resi...
Regras de Coexistência: Milho-Bt  CTNBio – Decreto 5.991 – 22/11/2005  Liberação planejada – 20/07/2006      Isolamento...
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  1. 1. Análise de Risco Ambiental do Milho GM: Manejo daResistência de Insetos (MRI) José Magid Waquil jmwaquil@gmail.com INOVADEFESA/RIT DA/CNPq Sete Lagoas, MG.
  2. 2. Protocolo de Cartagena • Biossegurança de OGMs vivos; • Países desenvolvidos e em desenvolvimento; • Métodos científicos para avaliar: – biossegurança pré-liberação; – monitoramento pós-liberação; • Uso seguro e sustentável da tecnologia e • Consenso da necessidade da avaliação de Risco
  3. 3. Principais Aspectos 1) Hibridização dos OGM com seus parentes selvagens; 2) Desenvolvimento de resistência de pragas ao OGM; 3) Mudança de status de pragas secundárias; 4) Alterações na composição dos OGMs
  4. 4. Principais Aspectos (cont.)5) Redução de biodiversidade;6) Efeito sobre polinizadores;7) Efeito sobre inimigos naturais; e8) Efeitos sobre organismos do solo - incluindo os decompositores
  5. 5. Análise de Risco de OGMs• É uma iniciativa internacional para desenvolver uma abordagem científica rigorosa visando avaliar os riscos potenciais das culturas OGMs resistentes a artrópodes sobre as espécies alvo e não-alvo .• Adaptação de testes abordando a análise de risco que seja aplicada internacionalmente dentro dos conceitos da toxicologia e da ecologia (meio ambiente).
  6. 6. Objetivos: • Formulação e avaliação de hipóteses de risco, claras, usando o máximo de dados disponíveis para a tomada de decisões consistentes em cada etapa da avaliação. • Espera-se com a ARP-OGM dar subsídios para as agências de regulamentação que estão desenvolvendo suas próprias análises e para harmonizar as exigências regulatórias entre os diferentes países e regiões do mundo.
  7. 7. Determinação do Risco Sistema de produção Dose de cultura, fenologia, Eficácia Manejo, etc. Risco = f (perigo, exposição) História de Dinâmica populacional Resistência da espécie-alvo, da espécie Mobilidade da espécie Sub-estrutura
  8. 8. Risco Ambiental mais Iminente Quebra da Funcionalidade – Resistência Praga Resistente: “Praga com capacidade de sobreviver em resposta a uma pressão de seleção - por ex. um inseto resistente a um inseticida”. Biótipo – indivíduo ou população de inseto distinguível da sua espécie por critérios outros que não o morfológico – por ex. capacidade parasítica.
  9. 9. Omoto&Maia
  10. 10. Omoto&Maia
  11. 11. Omoto&Maia
  12. 12. Omoto&Maia
  13. 13. Bases para a Análise: • Curva de Mortalidade • linha Probit-Log • Dose Letal Média • – suficiente para matar 50% população • Concentração Letal Média • na qual se observa 50% mortalidade.
  14. 14. Omoto&Maia
  15. 15. Bioensaio: distribuição de frequência Mort. (%) Freqüência 3,0 20 9,0 40 700 15,0 70 600 20,0 100 30,0 300 500 40,0 550 400 50,0 600 60,0 550 300 70,0 300 200 85,0 150 93,0 100 100 96,0 90 0 98,0 85 0 20 40 60 80 100 99,0 80 100,0 78
  16. 16. Bioensaio: mortalidade acumuladaDose (mg) Mortal. (%) 0,0 0,0 Curva de Dose-Mortalidade (%) 100 1.690,0 3,0 90 2.856,1 9,0 80 Porcentagem (%) 3.712,9 15,0 70 4.826,8 30,0 60 50 5.550,8 50,0 40 6.274,9 70,0 30 8.157,3 85,0 20 1010.604,5 93,0 013.785,8 96,0 0 5000 10000 15000 20000 2500017.921,6 98,0 Dose (mg)23.298,1 99,0
  17. 17. Bioensaio: log da dose/mortalidade Log dose Mortalidade (%) 3,22789 3,0 3,33000 5,0 Dose - Mortalidade (%) 100 3,45577 10,0 90 3,56972 15,0 80 3,68366 25,0 Mortalidade (%) 70 3,74436 40,0 60 50 3,79760 60,0 40 3,91155 88,0 30 3,98000 93,0 20 4,02549 95,0 10 0 4,09000 97,0 3,00 3,50 4,00 4,50 4,13943 98,0 Log Dose 4,20000 99,0 4,25338 99,5 4,36732 99,9
  18. 18. Bioensaio: curva de mortalidade Log Dose Probit 3,2279 3 LC50=5626,18 mg 3,3300 3,4 Log-Probit 3,4558 3,9 8 3,5697 4,2 3,6837 4,6 7 3,7444 4,8 6 3,7976 5.0 5 3,9115 5,6 Probit 4 3,9800 5,8 3 4,0255 6,1 4,0900 6,5 2 y = 4,0764x - 10,3 4,1394 6,7 1 R² = 0,99 4,2000 6,9 0 4,2534 7,2 3,00 3,50 Log Dose 4,00 4,50 4,3673 7,5
  19. 19. Genética da Resistência Omoto&Maia
  20. 20. Genética da Resistência: dominância Omoto&Maia
  21. 21. Genética de populações • Equilíbrio de Hardy-Weinberg –(p+q)2= p 2 (SS)+ 2pq(Ss)+ q 2(ss)= 1 onde: – q= freqüência do Susceptível – p= freqüência do Resistente • Condições do equilíbrio –População infinita e cruzamentos aleatórios –Não há seleção, migração, mutação de alelos –Meiose normal - gametogênese ao acaso • Interações gênicas
  22. 22. Omoto&Maia
  23. 23. Evolução da Resistência: frequência Premissas : monogênica, dialética (S e R) e autossômica SS RS RR SS RS RR SS RS RR __________________ Fonte: Georghiou (1983)
  24. 24. Evolução da Resistência: dominância
  25. 25. Omoto&Maia
  26. 26. Omoto&Maia
  27. 27. Frequência Crítica Omoto&Maia
  28. 28. Tamanho da AmostraNecessário para detectar pelo menos um indivíduo resistenteP(x1) = 1 – P(x=0) 10000P(x=0) = (1 – f)n 0.1% R na pop.Onde: Sample Size (n) 1000n = tamanho da amostraf = freqüência de Resistente 1% R na pop.1 - P(x1) = (1 – f)n 100 10% R na pop.n log (1 – f) = log [1 - P(x1)] 10 log [1 - P(x1)] 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1n= Probability of detection (%) log (1 – f) Roush & Miller (1986)
  29. 29. Omoto&Maia
  30. 30. Alta Dose Operacional Depois que se conhece o alelo R, a alta ideal seria aquela concentração que mata 100% dos indivíduos heterozigotos (RS). Antes de se conhecer o alelo R, o EPA-US: “alta dose” é a concentração da toxina equivalente a 25 vezes a concentração LC99 para a praga-alvo.
  31. 31. Bioensaio: CL de Toxinas Bt/LCMProbabili Cry 1 A(b) Cry 1F-dade Intervalo confiança Intervalo confiança(%) CL (95%) CL (95%) (g / cm2 ) Inferior Superior (g / cm2) Inferior Superior01 1,05 0,20 2,97 2,48 1,47 3,6905 7,04 2,37 13,98 5,45 3,66 7,4010 19,37 8,81 32,39 8,30 5,94 10,7550 689,81 459,55 1241,0 36,46 31,09 42,3390 24561,0 8823 129291,0 160,21 129,54 209,2495 67622,0 20041 491001,0 243,75 188,94 338,2199 452007,0 92947 6027744,0 535,58 380,15 839,82
  32. 32. Índice de Inibição no Ganho Peso LC50=689,81ng/cm2 LC50=36,46 ng/cm2 =91,61% inibição peso =89,81 % inibição peso Índice de inibição da LCM/Cry 1A(b) Í ndice de I nibição da LCM /Cry 1F 90 100 80 90 70 80 Arcsin % Inibição Arcsen % Inibição 60 70 60 50 50 40 40 30 30 y = 16,08x + 27,562 y = 15,8x + 46,606 20 20 R2 = 0,7594 R2 = 0,7435 10 10 0 0 0 1 2 3 4 0 1 2 3 Log dose Log Dose
  33. 33. Não-Preferência LCM para milho Bt Não-Bt Bt DKB 330 DKB 330 YG 86,00  4,27% 11,00 ± 4,47% LCM neonatas, 24 h após infestação
  34. 34. Recuperação de Larvas Pequenas No. vivas=66 Sobrevivência = 62,86% No. total= 105 Após 10 dias de exposição 800 Peso Inicial 700 2a pesagem Peso de pupa 600 500 Peso (mg) 400 300 200 100 0 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 101 População
  35. 35. Evolução da Resistência Depende
  36. 36. Fatores que Afetam a Evolução da Resistência• Eventos de Bt disponíveis• Área cultivada com a cultura transgênica• Espécies-alvo• Impacto sobre os sobreviventes inverno• Definição: pragas primárias e secundárias• Impacto da expressão e dose
  37. 37. Manejo da Resistência
  38. 38. Manejo da Resistência/Insetos (MRI) • Manejo da Resistência(Inseto): Esforço para adiar ou prevenir a adaptação de espécies-praga à pesticida pela preservação de genes de susceptibilidade na população; • MR padrão: combinação da estratégia de alta dose da toxina (25X DL99) com área de refúgio (área cultivada com não Bt); • Pirâmide de genes: combinação de mais de uma toxina de diferentes receptores.
  39. 39. Área de Refúgio - AR • Objetivo da AR – permitir desenvolvimento de insetos susceptíveis em quantidade suficiente para reduzir a chance de cruzamento entre insetos resistentes e Reduzir a pressão de seleção • Distância da AR – deve estar no máximo 800 metros de qualquer planta de milho Bt. • Tamanho da área de refúgio – – Fórmulas empíricas – Através de Modelo (computador)
  40. 40. Manejo da Resistência Milho Bt • Tamanho da Área de refúgio: – 10% da área de milho para uma toxina – 5% da área de milho para duas toxinas • Distância da Área de Refúgio: – 800 m dispersão da mariposa no campo • Cultivar da Área de Refúgio: – Deve ter mesmo ciclo – Características semelhantes à cultivar Bt. – Preferencialmente o híbrido isogênico
  41. 41. Funcionamento do RefúgioDispersão suficiente para Área de refúgio paragarantir cruzamentos produzir SSentre RR ou RS X SS 10% área: 90% área produção SSSobrevivênciaRR ou RS Perda potencial: 34% X 10%= 3,4% Bt Refúgio 800 m Milho-Bt Refúgio: milho não-Bt com ___________________ Adaptado de Omoto&Maia mesmo ciclo e porte
  42. 42. Refúgio Estruturado I 800 m • Campo separado “Refúgio • qual tamanho? externo” • qual distância? 800 m 800 m • Área definida com 800 m plantas não-Bt, dentro “Refúgio dentro do campo com OGM da lavoura Bt” (faixas de plantas)
  43. 43. Refúgio Estruturado II/pivô-central •Milho não-Bt no •centro do Pivô “Refúgio central” 10% 800 m “Refúgio • Campo separado externo” 10% 800 m 800 m • Área definida com “Refúgio em Pivô plantas Bt e não-Bt, independente” Milho-Bt Milho Milho-Bt não-Bt 800 m
  44. 44. Refúgio no Saco/“mistura de semente” • Mistura de sementes milho Bt e não-Bt no mesmo saco e foi aprovado nos EUA para 2012 •Dificuldades operacionais/Empresa •Facilidade para o semeio/produtor •Efetividade do uso do refúgio •Distribuição uniforme do refúgio •Inviabilidade controle químico •Redução da área de refúgio •Melhor distribuição IN na área •Movimento de lagartas (+/-)
  45. 45. Pirâmide/Sequência de Genes a – 75% mortalidade RS para cada toxina b – 50% mortalidade RS para cada toxina c – 50% + 75% mortalidade RS das toxinas Fonte: Roush (1998)
  46. 46. Monitoramento Pós-Liberação Exemplo: Ostrinia nubilalis – ECB/EUA Biomassa Moralidade________________________Fonte: Siegfried et al 2008
  47. 47. Mortalidade da LCM em Cry 1F
  48. 48. Inibição da LCM em Cry 1F
  49. 49. Determinação do Perigo da Resistência • Caracterização da população em risco • História de resistência da espécie-alvo • Variabilidade natural à toxina do Bt • Frequência inicial do gene R ao Bt • Efetividade potencial da toxina transgênica • Qual é a Dose?
  50. 50. Fluxo Gênico:o milho em referência
  51. 51. Fontes de misturas adventícias 1. Transferência de pólen entre plantas – fluxo gênico 2. Misturas de sementes (contaminações) 3. Misturas de grãos nas operações de colheita,transporte e armazenamento 4. Plantas voluntárias Fonte: Commission of the European Communities, Recomendations of 23 July 2003
  52. 52. Fluxo Gênico• Vertical: entre indivíduos da mesma espécie 1. Alógamas – menos de 5% de autofecundação 2. Autógamas – mais de 95% de autofecundação 3. Intermediárias – entre 5% e 95% de autofecuandação• Horizontal: entre indivíduos diferentes, distantes geneticamente
  53. 53. Coexistência Estratégia para que os produtores agrícolas continuem a fazendo suas escolhas prática utilizando variedades convencionais, cultivares transgênicos e cultivos orgânicos, de acordo com as obrigações legais para rotulação e padrões de pureza. _________________________________________________________ Fonte: Commission of the European Communities, Recomendations of 23 July 2003
  54. 54. Características do Milho • Planta monóica: inflorescência masculina (pendão) e feminina (boneca) na mesma planta • Liberação do pólen: dura em média 13 dias • Pendão: produz em média de 25 milhões de grãos de pólen • Alta competição para fertilização: 645 grãos de pólen competem para fertilizar um único estilo-estigma (cabelo) • Viabilidade no campo: aproximadamente 2 horas • Polinização: predominantemente pelo vento • __________________________________ Fontes: Bignotto 2002 e Luna et al 2001
  55. 55. Polinização cruzada/milho • Distância entre a lavouras • Barreiras físicas • Condições climáticas • Velocidade do vento • Topografia • Sincronia das cultivares • Arranjo espacial __________________________________ • Fonte: Eastham & Sweet. IN: European Environmental Agency, Environmental Issue Report 28, Capitulo 5.
  56. 56. Exemplos de Coexistência1. Manutenção da pureza genética de linhagens elites em programas de melhoramento2. Manutenção da pureza genética de cultivares crioulas3. Em cultivos de milhos especiais não transgênicos para consumo humano (“speciality maize”)4. Em cultivos de milhos coloridos importantes na alimentação de povos latino-americanos5. Cultivo de milho “waxy” para a industria de amido
  57. 57. Isolamento Espacial no Milho Resultados de 16 ensaios no Canadá e de 40 ensaios nos Estados UnidosGustafson et al. Crop Science 46:2133-2140, 2006.
  58. 58. Taxa de Cruzamento/Distância Milho Soja Indicador: resistência à herbicida ________________________________________ Fonte consultada: Siqueira et al.Cadernos de Ciência & Tecnologia, 21(1): 11-81, 2004
  59. 59. Regras de Coexistência: Milho-Bt  CTNBio – Decreto 5.991 – 22/11/2005  Liberação planejada – 20/07/2006  Isolamento de 400 m ou 40 dias  Liberação comercial – 16/08/2007  Isolamento de 100 m  20 m + 10 fileira milho não-Bt  Híbrido de igual ciclo e igual porte
  60. 60. Obrigado!

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