Molecular Epidemiology of Methicillin-Resistant
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Molecular Epidemiology of Methicillin-Resistant Presentation Transcript

  • 1. Molecular Epidemiology of Methicillin-ResistantStaphylococcus hominis (MRSHo): Low Clonality and Reservoirs of SCCmec Structural Elements Ons Bouchami, Assia Ben Hassen, Herminia de Lencastre, Maria Miragaia Stanislav Cardona Cardona Cielo Castro Correa Molecular Biology Medicine-UPB Agosto-2011
  • 2. INTRODUCTION Staphylococcus•Are gram-positive cocci•Bunch of grapes•Diameter of 0,5 y 1µm•The genus includes 40 species and24 subspecies.•Some species normally grow inspecific niches.•These bacteria are presentin human skin and mucousmembranes.
  • 3. INTRODUCTION Staphylococcus•Grow in a medium with a highconcentration of salt(eg sodium chloride 10%) and temperatureof 18-40 ° C.•Key differences are: oxygenrequirements, morphology, growthrequirements (45°C and supplements)•Is a facultative anaerobic coconut.
  • 4. INTRODUCTION Hominis•S. hominis may occasionally causeinfection in patients whose immunesystem is compromised, for exampleby chemotherapy.•S. hominis tends to colonize in areaswith numerous apocrine glands, suchas axillae and the pubic region.•S. hominis cell are gram-positive cocciand are usually 1.2 to 1.4 micrometersin diameter.•Colonies of S. hominis are small,usually 1–2 mm after 24 hours.
  • 5. INTRODUCTION Bacterial resistance• 1945: Alexander Fleming: Penicillin• Bacterial resistance may have different causes, in general, all include changes in genetic information, either by mutation or by introducing new genes.• These genetic changes cause biological changes in the bacteria and these are responsible of the resistance.
  • 6. INTRODUCTIONMethicillin•The resistance againstthe meticila bacterial penicillin aremediated by the acquisition of agene (mecA).•Methicillin inhibits the synthesisof bacterial cell wall.•Prevents the formation ofcrosslinks betweenthe linear peptidoglycan polymerchains that are an importantcomponent of the cell wallof gram-positive bacteria.
  • 7. INTRODUCTION SCCmec• The acquisition of a gene (mecA) that encodes a novel penicillin- binding protein, PBP2, which does not bind to penicillin, but retains its enzymatic activity.• The mecA gene is located on chromosome mec staphylococcal cassette (SCCmec) and five gene sequences described in this cassette (type).
  • 8. INTRODUCTIONRelationship between antibiotic resistance ofStaphylococcus, the methicillin and the gene•The methicillin resistance of the S.hominis is determined by thepresence of mecA gene that providesthe antibiotic resistence.•This is going to be proved by takingisolates from diferent hospital units,antiobiotic susceptibility testing andgene identification.
  • 9. GENERAL OBJECTIVEFind molecular epidemiology of S. hoministhrough the description of the diversity of clonaltypes in MRSHo and MSSHo and reservoirs ofSCCmec structural elements and a detailedanalysis on the most likely contribution of S.hominis to SCCmec evolution.
  • 10. MATERIALES Y MÉTODOSÉticaDeclaración de ética: Aprobado por el ComitéLocal de Ética Médica del Hospital de CharlesNicolle, Túnez, Túnez.
  • 11. MATERIALES Y MÉTODOSAislamientoUn total de 34 aislamientos nosocomiales depacientes neutropénicos en las unidades delinjerto o hematológicas en diferentes hospitalesde Túnez.
  • 12. MATERIALES Y MÉTODOS Controles• S. aureus ATCC25923 y S. epidermidis RP62A, control de calidad.• S. hominis ATCC27844T identificación en ITS-PCR.• S. aureus NCTC10442, N315, 85/2082, JCSC4744, WIS y HDE288 identificacion de SCCmec tipo I, II, III, IV, V y VI.• S. aureus cepa COL para la sonda de mecA y como control positivo de ccrAB1 en los ensayos de hibridación.
  • 13. MATERIALES Y MÉTODOS Controles• S. aureus WIS para sonda ccrC.• S. epidermidis RP62A de control interno de PFGE y el origen de la sonda ccrAB2.• S. aureus 85/2082 control positivo para ccrAB3 y ccrC en los ensayos de hibridación.• S. epidermidis ATCC12228 control positivo para ccrAB2 y ccrAB4.• HDE288 fuente de sonda ccrAB4.
  • 14. MATERIALES Y MÉTODOSIdentificación ITS - PCREl ADN fue aislado por el método de extracciónde guanidina isotiocianato utilizando loscebadores G1 (5-GAAGTCGTAACAAGG) y L1(5-CAAGGCATCCACCGT). Programa consistióen un paso de desnaturalización durante 4minutos a 25 ciclos a diferentes temperaturas.
  • 15. MATERIALES Y MÉTODOS Protocolos de pruebas de sensibilidad para antimicrobianosPenicilina G Gentamicina CloranfenicolOxacilina Kanamicina RifampicinaCefoxitina Tobramicina OfloxacinaCotrimoxazol Eritromicina CiprofloxacinaEstreptomicina Pristinamicina VancomicinaAmoxicilina Lincomicina TeicoplaninaAmoxicilina y Tetraciclina y Ácido FosfomicinaÁcido Clavulánico fusídico
  • 16. MATERIALES Y MÉTODOS Preparación del DNA• El DNA fue preparado mediante el PFGE: Similar a la electroforesis en gel estándar, pero la tensión se cambia periódicamente entre el eje central y los dos n ángulos de 120 grados a cada lado. PFGE se puede utilizar para determinar el genotipo o la huella genética.
  • 17. MATERIALES Y MÉTODOSPreparación del DNA • El DNA para PCR preparado mediante ITS-PCR es una técnica de amplificación enzimática en este caso necesitaban hacer la identificación de los genes de resistencia que estaban asociados con el staphylococcus.
  • 18. MATERIALES Y MÉTODOSPreparación del DNA• Los fragmentos de DNA digeridos en Xhol que se encontraban en los geles de PFGE, fueron trasladados al vacío Blot, e hibridado con una sonda de ADN para mecA usando ECL, este sistema permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de este ácido nucleico.
  • 19. MATERIALES Y MÉTODOS Preparación del DNA• El análisis de complejos mec y ccr fue analizado mediante reacción de PCR.• Los tipos de SCCmec en el S. hominis fue definido por la combinacion del complejo ccr y complejo mec.• Los complejos ccr y mec no fueron tipificados cuando la amplificación PRC no se produjo con los primers usados.
  • 20. MATERIALES Y MÉTODOSSouthem blotting• Southern blot o hibridación Southern, es un método permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de este ácido nucleico. Se emplea la electroforesis en gel de agarosa con el fin de separar en base a la longitud de los fragmentos de ADN, después, una transferencia a una membrana en la cual se efectúa la hibridación de la sonda.
  • 21. RESULTADOSOptimización del método de marcado PFGE para S. hominis• La enzima SmaI genera un patrón de 4-5 sólo fragmentos, utilizando el protocolo definido por S. aureus.• Al utilizar la enzima XhoI y cambiar las condiciones de funcionamiento se logró la obtención de perfiles de bandas claras, reproducibles, separadas, que contienen fragmentos que van desde 18 a 20 aproximadamente y de 6 a 165 Kb de tamaño.
  • 22. RESULTADOSLa diversidad genética y clonalidad de MRSHo:•Se presenta una alta diversidad genética, ya que de las 34 cepas deS. hominis que se tomaron se clasificaron 28 tipos de PFGE (A-AA)Se presentan 6 PFGE contenidas en 2 cepas cada uno, por ejemplo: • Las cepas 5162a y 3030a compartían el PFGE tipo C. • Las cepas 6074ae y 4488 compartían el PFGE tipo A.•Además de esto se halló que los que MRSHo pertenecientes almismo tipo de PFGE fueron encontrados en un mismo hospital en unperiodo de 3 años. Ejemplo X1 y X2.
  • 23. RESULTADOS Patrones de susceptibilidad antibiótica• La sensibilidad a los antibióticos a un panel de 22 antibióticos y la MIC de oxacilina se determinó para los 34 mecA positivos MRSHo.• Un total de 28 de los 34 aislamientos (80%) expresó fenotípica resistencia a la meticilina (1,5 mg / ml). Sin embargo, seis de los aislados fueron sensibles a la oxacilina y Etest a pesar del hecho de que llevaban mecA.
  • 24. RESULTADOS Distribución de SCCmec en S. hominisPresencia de:•SCCmec VI (4B) se encontraba en 6 cepas. Ej. 6074aé, 4488 y 2772.•SCCmec VIII (4A) se encontraba en 5 cepas. Ej. 4842, 2916 y 2730.•38% de las cepas contenían una variante única nueva entre el complejomec y complejo ccr. Ej. 5162a, 3140aé, etc.•En el 27% de las cepas se encontró el complejo mec con dos diferentesalotipos de ccr en la misma cepa. Ej. 3030a, 4793a, 1781, etc.
  • 25. RESULTADOS Distribución de SCCmec en S. hominis•2 cepas con complejo mec tipo A pero sin gen de ccr. Ej. 5265b y 2060.•2 cepas no se halló complejos ccr ni complejos mec a pesar de la presenciade mecA.•Las cepas que compartían los tipos PFGE A, O y R, comparten SCCmec4B, 1A y 4A, respectivamente, pero también se encontró que cepas condiferente PFGE también los compartían. Ej. SCCmec 1A en 12 cepasdiferentes, SCCmec 4A en 4 cepas diferentes, esto demuestra la presenciade clon con gran capacidad de adaptación y diversidad.
  • 26. RESULTADOS Identificacion de genes ccrAB y ccrC en cepas mecA-negativo de S. hominis• La presencia de genes ccr entre los aislados MSSHo fue probado por hibridación de Southern seguido por marcado ccr .• Entre los mecA negative 11cepas analizadas, tres albergaba CCRC, dos realizadas ccrAB1, dos ccrAB4, y un aislamiento realizado ccrAB2.• También se encontró una cepa que demostró que llevan los genes ccr por hibridación de Southern, pero que no fue marcada por ccr marcación por PCR.
  • 27. RESULTADOSHomología de nucleótidos entre ccrB de S. hominis y otras especies deStaphylococcus•Alto grado de homología entre las muestras de estudio y de base de datos: • ccrB1 de S. hominis y los ccrB1 de otros de S. hominis. • ccrB1 del S. hominis y el ccrB1 de S. epidermidi. • ccrB4 del S. hominis y el ccrB4 de S. aureus•13 de las cepas no tenían tipificación con marcador ccrB por la presenciade superposiciones que podían significar la presencia de alelos de ccr en elmismo alotipo.•En 4 cepas se detectó por PCR el gen ccrAB1, pero la secuenciación con laccrB indicaba la presencia de ccrAB4 sugiriendo la presencia de los dosalotipos ccrB1 y ccrB4.
  • 28. RESULTADOSHomología de nucleótidos entre ccrB de S. hominis y otras especies deStaphylococcus•Un total de cuatro diferentes ccrB1 y 10 alelos diferentes ccrB4 seencontraron en las 34 cepas, por lo que podría ser un alotipo ccrABdeterminado.•Los alelos de ccrB4 se agruparon en tres ramas: el ccrB4 de la SCCpbp4de S. epidermidis, SCCmec, S. aureus, S. aureus.•El análisis filogenético demostró que ccrAB1 y ccrAB4 de S. hominis y quese encuentran en SCCmec S. aureus son muy similares y debe haber tenidoun origen común.
  • 29. FIGURA N° 1
  • 30. FIGURA N° 2
  • 31. DISCUSSION AUTHOR WHAT THE SAYS YES OR NOT Another interesting feature of S.Hanssen hominis molecular epidemiology wasAM. the finding of a high frequency of Yes SCCmec types containing ccrAB4,Kjeldsen G. ccrAB1 and mec complex A in itsSollid JU. composition, like VI (4B), SCCmec VIII (4A) and a new SCCmec type with mec complex class A associated to ccrAB1 (1A), and the complete absence of SCCmec structures containing ccrAB2, ccrAB3, ccrC and mec complex C. Previous studies where SCCmec was characterized for only a few S. hominis isolates also showed that S. hominis predominantly carried, ccrAB1, ccrAB4 and mec complex A [18,46].
  • 32. DISCUSSION AUTHOR WHAT THE SAYS YES OR NOTHanssen AM. The prevalence of specific mec complex YesSollid JU. classes and ccr allotypes observed in thisMiragaia M. study was previously detected in otherCouto I. CoNS species like mec complex C in S.De Lencastre H. haemolyticus and mec complex B and ccrAB2 in S. epidermidis [46,47]. This fact may turn this staphylococcalKloos WE. species into a particularly privileged Yes reservoir and donor for other pecies sharing the same ecological niche, like S. pidermidis, S. haemolyticus and S. aureus [45].
  • 33. DISCUSSION AUTHOR WHAT HE SAYS YES OR NOTKatayama Y. However, the involvement of S. hominis inTakeuchi F. the assembly of SCCmec I was previously YesIto T. suggested due to the finding of a SCCMa XX. non-mec element in MSSHo with highUi-Mizutani Y. homology with the SCCmec I from S.et al. aureus [12].
  • 34. CONCLUSIONS• The deep research of existing strains could lead to the elaboration of even more potent antimicrobial agents to help eliminate possible causes of sepsis in hospitals and create new dosage parameters to prevent the emergence of new resistant strains.• Due to the repeated presence of the same strain over time (3 years) in the same place, should be more comprehensive tracking about why this happens, despite the cleanup code that must be managed in hospitals and implements that are used in it.
  • 35. CONCLUSIONS• The characteristics shown different species of staphylococcus to conduct investigations like this, succeed in identifying important parameters for the realization of accurate diagnosis and consistent with the efficacy of antimicrobial treatment.• Techniques and laboratory methods used in this research unveiled the features and important aspects of the S.hominis estrucctura perimiter so know the mechanism of action of antimicrobials used in the treatment of these pathogens.
  • 36. MAPA CONCEPTUAL Stanislav Cardona Cardona Stanislav Cardona Cardona
  • 37. MAPA CONCEPTUAL Cielo Cristina Castro Correa
  • 38. GRACIAS