Your SlideShare is downloading. ×
0
Immunology
Immunology
Immunology
Immunology
Immunology
Immunology
Immunology
Immunology
Immunology
Immunology
Immunology
Immunology
Immunology
Immunology
Immunology
Immunology
Immunology
Immunology
Immunology
Immunology
Immunology
Immunology
Upcoming SlideShare
Loading in...5
×

Thanks for flagging this SlideShare!

Oops! An error has occurred.

×
Saving this for later? Get the SlideShare app to save on your phone or tablet. Read anywhere, anytime – even offline.
Text the download link to your phone
Standard text messaging rates apply

Immunology

417

Published on

0 Comments
0 Likes
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

  • Be the first to like this

No Downloads
Views
Total Views
417
On Slideshare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
0
Actions
Shares
0
Downloads
7
Comments
0
Likes
0
Embeds 0
No embeds

Report content
Flagged as inappropriate Flag as inappropriate
Flag as inappropriate

Select your reason for flagging this presentation as inappropriate.

Cancel
No notes for slide

Transcript

  • 1. Гепатоциты приводят кдеградацииаутореактивных CD8 Т-клеток Hepatocyte entry leads to degradation of autoreactive CD8 T cells www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.11 12251108
  • 2.  Большиство аутореактивных Т клеток элиминируются в тимусе, механизм инактивации или контроля Т клеток, специфичных для внетимусовых антигенов существует в периферии. Изучая места, где ауторекативные Т клетки становятся толерантными был обнаружен уникальный механизм периферийного делетирования, в котором наивные аутореактивные цитотоксические Т лимфоциты быстро элиминируют в печени после внутрипечёноной активации. Т клетки активно проникают в гепатоциты, входя в эндосомальные/лизосомальные компартменты, и деградируют. Блокирование этого процесса ведёт к накоплению аутореактивных CD8 Т клеток, прорыву толерантности и развитию аутоиммунного гепатита. Проникновение клетки в клетку или эмпериполез — давно наблюдаемый феномен, для которого не была ранее показана физиологическая роль. Было предложено что такой «самоубийственный эмпериполез» есть уникальный механизм делеции аутореактивных Т клеток, критичный для сохранения толерантности.
  • 3. Аутореакивные Т клетки не индуцируютгенерализованные аутоиммунные процессы вмышах, повсеместно экспрессирующихродственный им антиген. Для моделирования аутоиммунного процесса были перенесены Т клетки Des CD8 (экспрессирующие TCR специфичный к MHC-I H- 2Kb) мышам C57BL/6 (B6), экспрессирующих повсуюду H-2Kb. В контроле использовались мыши B10.BR, не экспрессирующие антиген. Несмотря на высокую частоту переноса аутореактивных CD8 Т клеток у мышей-хозяев никогда не развивалось аутоиммунной патологии по оценке АлТ и ряду симптомов.
  • 4. Механизм потери аутоиммунностиограничен наивными Т клетками Каждая инъекция 108 Des клеток из лимфоузлов не приводила к системной аутоиммунной реакции, что показывало об очень эффективном механизме умолкания донорских Т клеток, насыщение у которого достигнуть нелегко. Когда in vitro полученные (культивированием с В6 гепатоцитами и IL-2) эффекторные Т клетки были перенесены, они индуцировали тяжёлый гепатит у мышей В6, но не у мышей B10.BR, не экспрессирующих антиген.
  • 5. Потеря аутоиммунности в В6 реципиентахассоциирована с активной миграцией донорскихклеток из лимфоузлов в печень ивнутрипечёночном удержании Были проведены измерения содержания донорских лейкоцитов фенотипа CD8 в крови, лимфоузлах, печени и селезёнке спустя короткое время после переноса.Как и ожидалось, у не экспрессирующих антиген B10.BR контрольных реципиентовдонорные Т клетки сохранили наивность, оценённую по экспрессии CD69 через 5часов после переноса Т клеток и по преимущественной миграции в лимфоидныеорганы (отсутствуя в печени). В B6 реципиентах донорские Т лимфоциты оченьредко находились в крови и лимфоидных органах, а спустя 24 и 48ч после переносане детектировались в лимфоузлах вообще
  • 6.  Перенос радиоактивно меченых (хром 51) клеток показал что Des донорские клетки вообще никогда не накапливаются в лимфоузлах.Контрастом с отсутствием миграции в лимфоузлы донорских Т клетокявляется высокое их содержание в печени мышей В6 и высокийуровень экспрессии CD69 уже спустя 1 час после переноса, из чегопредполагается что большинство Т клеток входит в печень испецифически в ней сохраняется после активации in situ.
  • 7. Высокое содержание донорских Т клеток, сохраняющихся в печени, теряется за первые 22 часа после переноса: Число CFSE меченных Des клеток снижалось на 80- 90% к 22 часу после переносаПечень определена как место первичной активацииCD8 Т клеток, ведущей к толерантности, такжеизвестно что наивные CD8 Т клетки послевнутрипечёночной активации погибают по Bim-зависимому пути в течении 4 суток. Донорские Тклетки, взятые через 2 суток из печени, показываютвысокой уровень экспрессии Bim. Если гипотеза опреобладании Bim апоптоза верна — то Des клеткидолжны начинать снижать своё количество после 2суток.
  • 8. Быстрая потеря Т клеток требуетраспознавания родственного антигена в печени и в ней не участвуют лимфоциты рецепиента Таким-же образом распределяются и убывают Des клетки в мышах RAG-1-/- B6 (у которых не функциональны В, Т-клетки и ЕК), мышах штаммов 178.3 (Β10.ΒR, экспрессирующим Η- 2Κb) и H-2Kb F1, что исключает участие ЕК и аллореактивные клетки реципиента. Эксперимент по вводу OT-I CD8 Т клеток (где экспрессировались TCR, специфичные к пептиду овальбумина SIINFEKL) на сингенных мышах В6 вместе с пептидом и перенос Des CD8 костно-мозговым химерам 178.3, у которых Η-2Κb экспрессировался только в клетках- производных костного мозга, дал такое-же их распределение по организму с накоплением в печени и быстрым убыванием донорских Т клеток, из чего следует необходимость распознавания антигена в печени.
  • 9. Печёночно-активируемая делеция Т клеток не зависит от апоптоза и фагоцитирующих клеток Прокрашивание Аннексином 5 не усиливалось через 6 часов, время когда большая часть клеток уже распалась, что сходится с тем, что апоптоз не имеет отношения к массовой потере Т клеток. Это подтверждает и такая-же скорость распада Т клеток Bim-/-.Эффективное подавление макрофагов икупферовских клеток с использованиемклодронатных липосом и блокированиепотенциально экспонируемыхфосфадитилсеринов на Т клеточнойповерхности с использованием димеров ихлигандов, Дианнексина, не привело кпредотвращению делеции Т клеток.
  • 10. Наивные Т клетки активируютсяпроникновением в гепатоциты и в нихподвергаются деградации в лизосомах Для отслеживания судьбы Т лимфоцитов были выполнены ультраструктурные исследования с помощью электронной и конфокальной микроскопии через 3-6 часов после переноса Т клеток. Лимфоциты проникли в гепатоциты и распадались в везикулах за 12 часов.
  • 11. Video 1 Синий DAPI – ядра. У Т клетки ядро всё ещё интактно. Красный анти-LAMP-1 – лизосом, рассеяна по цитоплазме гепатоцита. Зелёный кросс-реактивный анти-FITC с CFSE – метка донорских Т клеток.
  • 12. Video 2  Аналогичный прокрас.  DAPI у лейкоцита негативно, ядро уже разрушего.
  • 13. Т клетки активно проникаютв гепатоциты Для изучения эффекта проникновения Т клетки и гепатоциты кокультивировались и изучались методами КМ, ПЭМ и СЭМ. Спустя 4 часа наблюдалось расширение подосомальных выступов к Т клеткам у гепатоцитов В6. Через 6 часов Т клетки полностью содержались в больших везикулах внутри гепатоцитов. Фиксированные или инактивированные нагреванием Т клетки не проникали, что говорит о том, что со стороны Т клетки необходимо активное участие.
  • 14. Video 3
  • 15. Video 4Активно проникают в гепатоциты именно сами Т клетки.Подвижность Des CD8 много выше по сравнению с инертнымигепатоцитами. Главную роль в проникновении Т клетокподтверждает отсутствие взаимодействия после их инактивации.
  • 16. Т клеточное проникновение в гепатоциты зависит от активации Т клеток, перегруппировкицитоскелета и вортманнин-чувствительных киназ Для определения молекулярного механизма проникновения Т клеток в гепатоциты использовалась in vitro система в виде ко-культуры, в которую добавляли ингибиторы потенциально важных путей для процесса проникновения, таких как ТКР передача сигнала, деградация внеклеточного матрикса (ММР), формирование подосом и адгезии (клапсины), G- белковый хемотаксис и полимеризация/деполимеризация клеточного матрикса (актин, миозин). Киназа лёгких цепей миозина (MLCK) и ρ-ассоциированная протеинкиназа 1 (ROCK) — две киназы, в основном регулирующие клеточное движение и трансэндотелиальный перенос, к которым есть ингибиторы: ML-7, ML-9 и вортманнин для MLCK, Y-27632 и H-1152 для ROCK.
  • 17. Перебор ингибиторов Подавляли проникновение Т клеток in vivo только ингибиторы активации Т клеток (анти- CD8 — Дасатиниб), ингибиторы реорганизации актиновых филаментов (цитохалазин Д) и вортманнин.
  • 18. Вортманнин увеличивает число Т клетокв крови и печени, и ведёт к прорывутолерантности у В6 мышей Для проверки того, насколько эффективно вортманнин ингибирует проникновение Т клеток in vivo В6 мыши подвергались воздействию его до переноса Des CD8. Поскольку вортманнин токсичен для организма и вызывает снижение общего числа лейкоцитов, сравнение велось с контролем B10.BR, также подвергавшихся вортманнину. Вортманнин вызывал абсолютное и относительно повышение содержания донорских Т клеток относительно контроля В6. При этом Dеs CD8 были примерно также активированны, как и в негативном контроле В6. На 3 день у В6 после переноса Des CD8, подвергавшихся обработке вортманнином наблюдалось развитие срыва толерантности и тяжёлого аутоиммунного гепатита.
  • 19.  Гистология биоптата печени мышей + и – контроля по Т клеткам и вортманниму, показатели АлТ, FACS профиль В6 мышей по меченым донорским Т клеткам, распределение содержания Des CD8 для В6 с + и – Ворт. относительно содержания в контрольных В10.BR, содержание Т клеток в печени для всех 4 групп мышей.

×