Espectrofotometria
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  • 1. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA ESCUELA DE POST GRADO MAESTRIA EN TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIASCURSO INSTRUMENTACIÓN DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS - TEORIA ING. ALBERTO JUAN TORRES FLORES Ing. Santos Jaimes Serkovic LIMA 2006
  • 2. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA ÍNDICE Página ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO 3 RELACIONES ENTRE LA ABSORCIÓN DE LUZ Y COLOR 4 ABSORCIÓN DE ENERGIA 5 TIPOS DE LUZ 6 LEYES FUNDAMENTALES DE LA FOTOMETRÍA 8 LEY DE BERNARD 9 ESPECTROFOTOMETROS 10 ESQUEMA SIMPLE DE UN ESPECTROFOTOMETRO 11 SISTEMA DE MONTAJE EMPLEANDO PRISMAS 14 RED DE DEFRACCIÓN O EMPARALLADO 15 TIPOS DE ESPECTROFOTOMETROS 19 ESQUEMAS DE INSTALACIÓNa) ESPECTROFOTOMETRO DE EMISIÓN DE LLAMA 22b) ESPECTROFOTOMETRO DE ABSORCIÓN ATÓMICA 23 ESPECTROFOTOMETRO DE LECTURA DIRECTA 24 ESPECTROFOTOMETRO DE DOBLE HAZ 25 CROMATOGRAFÍA 26 CLASES DE CROMATROGRAFÍA 32I CROMATOGRAFÍA DE PAPEL 33II CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA 35 CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA 383.3 TÉCNICAS DE SEPARACIÓN 40 CROMATOGRAFÍA DE GASES 41 ESQUEMA DE INSTALACIÓN DE UN APARATO PARA CROMATOGRAFÍA DE GASES. 42III SISTEMA HPLC 44M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 2
  • 3. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO REGIONES QUE LO FORMAN RAYOS GAMMA 1 A° Rayos "X" 10 A° Rayos X Suaves 100 A° Vacio UV 2000 A° Cerca de visible UV 4000 A° 0.4 u VISIBLE 8000 A° CERCA DE INFRARROJOS 0.8 u 25 u Infrarrojos 400 u Lejos del IR 25 cm Microondas Radio Ondas 1 kmM. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 3
  • 4. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA RELACIONES ENTRE LA ABSORCIÓN DE LUZ Y COLOR REGIÓN DE LONGITUD ONDA. mu Color MILIMICRA Transmitido < 380 Ultravioleta 380-435 Violeta 435-480 Azul 480-490 Azul verdoso 490-500 Verde azuloso 500-560 Verde azuloso 560-580 Verde amarillento 580-595 Amarillo 595-650 Anaranjado 650-780 Rojo > 780 Cerca de InfrarrojoLa luz visible representa una parte muy pequeña del espectroelectromagnético.Se extiende de 380 a 780 mu (milimitra)La región ultravioleta se extiende de 185 m u hasta la visible.La longitud de onda mas cortas son consideradas como la región mas lejana (ode vacío) ultravioleta.Unidades m u = 10-7 mm = mu 10Aº = milimitron = 1 millón de m. 1000 (1 mil millonésimo de m)La onda electromagnética varía entre cuatrilloncico de metro y 100, 000 km delongitud.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 4
  • 5. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINAABSORCIÓN DE ENERGIA P P DISPERSION bCuando un haz de energía choca contra una sustancia le pueden sucedervarias cosas. - Ser absorbida - Ser reflejada - Ser transmitida - Ser dispersada - Ser refractadaLa longitud del trayecto óptico es “b”Efecto de Luz de haz sobre un objeto:1. Puede pasar a través de la materia habiendo solo una pequeña absorción y por lo tanto poca perdida de energía se mide % de luz transmitida.2. La dirección de la propagación del haz puede ser alterado por : o Reflexión o Refacción o Difracción O puede haber dispersión por la presencia de alguna materia particular suspendida.3. La energía radiante puede ser total o parcialmente absorbida. La absorción implica una transparencia de energía al medio y esto esta relacionado a las características de las estructuras moleculares. En la figura: Po es el haz de luz incidente Po es la energía no absorbida después de pasar por la muestra o recipiente (energía transmitida) Transmitancia = P = T PoM. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 5
  • 6. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA Definición: Viene a ser la relación entre el poder radiante transmitido por una muestra al poder radiante incidente. El poder radiante transmitido se puede medir usando detectores (fotoceldas, fototubos) Absorbancia.- Es el logaritmo a la base 10 del recipado de la transmitancia. A = Log 10 1 T A = Log 10 Po PTIPOS DE LUZ El campo de la luz visible se extiende desde 380 a 780 m u de longitud onda. De acuerdo al tipo de luz se perciben los colores 1. Luz del día (luz indirecta) (fuente C) 2. Luz del Sol (fuente B) 3. Luz de lámpara de tungsteno (artificial) (fuente A) Graficando Se aprecia que estas fuentes aportan diferentes longitudes onda y los colores dependen de la longitud / . La función de la fuente de luz es de provocar la luz INCIDENTE de suficiente intensidad para la medición. A IN T E N S ID A D B C 400 500 600 700 V IO L E T A N A R A N JA V ER D E R O JOM. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores L A ZU A M A R IL L O Ing. Santos Jaimes Serkovic 6
  • 7. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINALa fuente de luz mas usada es la lámpara de tungsteno.El inconveniente es de que emite su principal porción de energía en la regióncercana al infrarrojo del espectro solo el 15% cae dentro del espectro de luzvisible.Temperatura operacional 2854º K.Se tiene espectroplometros de absorción UV – visible emplean 2 tipos delámparas, las halógenas y de dentrecio las halógenas cubren el espectro de luzvisible, las de denterio se emplea para medidas en la zona del ultravioleta.Las lámparas no emiten luz monocromática, es decir radiación de una longitudonda única ya que la luz es policromática, se debe seleccionar la longitud ondaen que interese trabajar el monocromador permite obtener una luzmonocromática.Un cuerpo es incoloro cuando transmite pero no refleja (no refleja ni absorbeEjemplo Agua)Un objeto negro absorbe todos los tipos de radiaciónUn objeto blanco refleja todos las longitudes onda visible.Cuando observamos una manzana, esta absorbe de determinadas longitudesonda y refleja las ondas mas grandes o sea del color rojo.La onda reflejada es la que el ojo humano capta. R E F L E JA D A M A Z A B S O R B ID ASe debe tomar en cuenta:M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 7
  • 8. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA 1. La composición de la fuente luminosa 2. Características físicas y químicas del objeto 3. sensibilidad del ojo.LEYES FUNDAMENTALES DE LA FOTOMETRIA2 LEYES 1. La Ley de Bourguer o de Lambert (1760) 2. La Ley de BERNARD (1852) 1. LEY DE BOURGUER Establece que cuando un haz de luz monocromático previamente dispuesto en paralelo entra a un medio absorbente la velocidad de disminución de su poder radiante con respecto a la longitud de trayecto de luz a través de un medio absorbente b, es proporcional al poder radiante del haz. Esta proporción es geométrica. b P A B P (1/4) (½ ) (½ ) La capa absorbe la 1 de la luz = H 2 2 Capa B absorbe la 1 con la 1 precedente = H 2 2 4luego (derivada parcial) P P b PIntegrando y usando logaritmos de base 10 y haciendoP = P0 cuando b = 0Se obtiene : P 2 . 3 0 3 lo g kb PM. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 8
  • 9. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINAEsto quiere decir que el poder radiante de una luz no absorbida decreceespontáneamente, conforme al espesor del medio absorbente aumentearitméticamente.2. LEY DE BERNARD.-Establecer que el poder radiante de un haz de una radiación monocromáticaparalela decrece en una forma similar a como aumenta la concentración delconstituyente absorbente de la luz.2.303 Log. Po = K’C P C = ConcentraciónNota.- Esta ley deja de ser lineal a altas concentraciones, por lo que hay quediluir instrumentos colorimétricos comerciales.Los instrumentos para fotometría de absorción se clasifica en :a. COMPARADORES VISUALES.-Usan como fuente de luz, la luz del día y pasa a través de un par de tubosconteniendo la muestra y el standard.Se diluye la muestra hasta llegar al color del estándar y se ve la concentración.Se usa los tubos de NESSIER (50 a 100 ml capa)Otro método es hacer girar un disco con colores hasta igualar al de la muestra.B. FOTÓMETRO DE FILTROColorímetro fotoeléctrico MUESTRA DETECTOR FILTRO REOSTATO AL GALVANOMETRO LAMPARA FOTÓMETROS DE FILTRO (Fig. N°01)ESPECTROFOTOMETROSM. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 9
  • 10. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINAINTRODUCCIÓNCada sustancia absorbe energía radiante de una determinada longitud de onday esto es una característica de todas las sustancias.Si la luz blanca atraviesa una solución que tiene un compuesto colorado,ciertas longitudes de onda serán absorbidas y otras serán transmitidas, de estainteracción nace el color.ESPECTROMETRÍA, etimológicamente es la medida de la absorción otransición de la luz.Cada sustancia (líquido) absorbe o transmite la luz de forma característicagenerando una curva o espectro espacial que depende de la diferenteintensidad con que absorbe la luz a diferentes longitudes de onda.Esto quiere decir que cada sustancia de un espectro definido de absorción conla luz sea ultravioleta, visible o infrarrojo y gracias a este espectro específicopuede ser identificada.Viene a ser una herramienta especial de ayuda a la bioquímica ya queempleando muestra a concentraciones pequeñísimas (trazas) se puedefácilmente hacer análisis cuantitativo de sus constituyentes que se hallan en lamuestra.Permite también no solo identificar una sustancia y su concentración, sinotambién su estructura y configuración molecular atómica y nuclear(espectrómetros magnéticos de observancia nuclear, espectrómetrica infrarrojoinorgánico, etc). Sistema HPLC bucrotografía de grases).En 1941 se usó el primer espectrofotometro del ultravioleta fue un modelo DU-BECKMANN.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 10
  • 11. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINAESQUEMA SIMPLE DE UN ESPECTROFOTOMETRO L E N T E C O L IM A D O R REGISTRADOR FU E N T E L U M IN O S A D IS F R A C T O R DETECTOR (P R IS M A ) C U B ETA A B SO R B ID A (FOTOCÉLULA) ) (F O T O C E D U L A (M U E S T R A D E D IS O L U C IO N ) SE L EC T O R D E (R E N D I J A ) M O N O C R O M A D O REn la figura se tiene un fotómetro de filtro de lectura directa y de luz simple.Usa un filtro de absorción o interpretación y solo deja pasar la Longitud ondadeseada, para el estudio de su margen varia de 20 a 30m u.La luz que ha atravesado la muestra se mide como procedimiento por deflexiónen un galvanómetro.La escala del medidor esta en mitades de transmitancia 0 – 100%.ESPECTROFOTOMETROSCOMPONENETES ESENCIALES DE UN ESPECTROFOTOMETRO .-1. LÁMPARA Es la fuente de luz de alta intensidad para efectuar la medición. En los espectrofotometros de absorción UV – visible se utilizará dos tipos de lámpara: halógenas y deuterio. El 1º abarca la zona de luz visible 250 – 350 m u. la de deuterio de emplea para mediciones de la luz ultravioleta. Rayo efectivo 200 – 375 m uM. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 11
  • 12. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA Si se desea altos niveles de iluminación se empleará lámparas de XENON o vapor de Hg. Debido al intenso calor que producen deben ser aislados terminantemente para no afectar la muestra Temp. de operación 6000º k2. MEDIOS DE DISPERSIÓN Cuando se restringe las longitudes de onda del espectro y se deja pasar solo lo que absorbe el material a medirse, se incrementa notablemente la posibilidad de medición del instrumento. Para ello se utiliza los filtros. - FILTROS La selección apropiada de un filtro es de acuerdo a su pico de transmitancia y el ancho de banda de longitud de onda. El pico debe de ser el más alto posible y el ancho de la banda que cubre el mas angosto posible. 100% Se tiene: Filtros de gelatina TRANSMITANCIA Filtros líquidos Filtros de vidrio coloreados (Absorbe longitud onda no deseada) λmu Debido a que la fuente de luz es de alta temperatura el uso de filtro de gelatina se ha descartado. Clases de filtro: a) Filtro de vidrio teñido Son mejores que los de gelatina, alcanzan un ancho de banda de 35 – 50 m u y pico de trasnmitancia de solo 5-20% (bajo) su trabajo es absorber la longitud onda no deseada. b) Filtro de Interferencia Se consigue anchos de banda mas estrechos. Consiste en una capa dieléctrica de bajo índice de refracción y transparente entre 2 capas de películas de plata semitransparentes. La luz incidente ingresa, se refleja de regreso y vuelve entre las películas.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 12
  • 13. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA Cuando la frecuencia guarda armonía cuando con T pasa la luz. Ancho banda 10 – 17 m u Pico de transmitancia 40 – 60% c) FILTROS DE MULTICAPAS DE INTERFERENCIA Consta de 5 a 25 capas de lato y bajo índice de refracción dieléctrica obtenidas. Ancho de banda de solo 8 m u Pico de transmitancia 60 – 95% Luz blanca Película metal Placa vidrio Son los filtros mas eficientes y remueve la radiación no deseada por transmisión y reflexión en vez de absorción como las otras.3. CELIMADOR Viene a ser un lente que convierte la radiación en la luz lo mas paralelo posible y lo enfoca en el monocromador.4. MONOCROMADOR Las lámparas no emiten luz monocromática, o sea radiación de una única longitud onda. Por lo tanto es necesario descomponer la luz policromática y seleccionar la longitud onda que interese utilizar. Esto se logra aplicando un MONOCROMADOR y hay de 2 tipos. 1. Prisma de refracción: Usa un prisma en donde el rayo luminoso que incide sobre el prisma sufre 2 sucesivas refracciones sobre c/u de sus caras. La luz se descompone en sus diferentes longitudes de onda. Para descomponer la luz visible los prismas de vidrio.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 13
  • 14. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA Los prismas de cuarzo o sílice fundido se aplican para la luz U.V. Mediante una bacteria de giro se puede seleccionar la longitud de onda deseada. mu 800 Luz blanca 700 β 600 500 400 Rendija Prisma β = < apical SISTEMA DE MONTAJE EMPLEANDO PRISMAS 1.1 MONTAJE TIPO CORNO Fuente luz Roa Lente Prisma Convergente Rendija Lente colimación Violeta 1.2 USO ESPEJO DE LITTROW ESPECTRO i = < de incidencia < Apical = 30° Rayo Incidente i 90° Superficie de Aluminio Rojo r refacción Azul t = base del prisma 5.- RED DE DEFRACCIÓN O EMPARALLADO.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 14
  • 15. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA La dispersión de la luz también puede ser obtenida por medio de una superficie estirada o escalonada. Consiste en un gran numero de estrías paralelas dispuestas en forma escalonada (15000 a 30000 por pulgada) en una superficie de aluminio altamente pálida. Se prepara con resina epoxica y aluminio. R 2 R 2 β i β θ d Esquema de acción de los rayos i) = < incidencia β) = < reflexión θ) = < de escalón d) = Constante del calor o paso R1 y R2 son 2 rayos de luz que forman el haz luminoso. Cuando el rayo luminoso incide sobre la superficie escalonada se observa que el rayo R2 debe ocupar mayor long. que R1 (distancia d sen i) d i En cambio a la salida R 1 debe ocupar mayor distancia que R 2 para una igual longitud d sen β Cuando los rayos están en pase actúan y se combinan en forma constructivaM. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 15
  • 16. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA o sea m / = d (Sen i ± Sen θ) = O donde m = orden de interferencia Si la diferencia d Sen i – d Sen θ es igual a un múltiplo de m u los rayos están en pase. Este sistema escalonado en conjunto actúa como un espejo plano (cero orden de interferencia). Modificado el < θ pueden ser aplicados para una determinada longitud onda. Tienen mayor poder de resolución que los prismas y pueden ser usados en todas las regiones del espectro. Su poder de resolución esta dado por R = M x N M = N° unidades de onda N = N° total de escalona por unidad de longitud.Ejemplo: Un emparedado graduado a 6000 líneas/mm y 15 mm ancho tiene elsiguiente poder de relaciónR = M x N = 15 cm x 6000 líneas = 9000 Línea cm En la región del verde / = 5400 Å Luego el intervalo de longitud onda mas pequeña (que se puede aplicar es: R = / = 90000 δ/ δ / = 5 400 = 0.06 Å 90000 Un prisma de vidrio para tener este poder de resolución debería de ser muy grande (base de 75cm No practico). Antiguamente la mayoría de los monocromadores eran prismas Actualmente casi todas las redes de reflexión son de emparrillado o gratings. Ventajas: Son mas baratas de fabrica Se obtiene mayor separación de longitudes de onda Dispersan la radiación en forma lineal 6. RENDIJASM. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 16
  • 17. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA Como su nombre lo dice se refiere en una pequeña abertura que restringe al haz de luz. Cumple doble función: a) Contribuye a que el haz de luz no diverja y se concentra sobre la muestra. b) Selecciona una longitud onda de trabajo. El monocromador descompone la radiación policromática en un continuo de ondas monocromáticas, y la rendija contribuye a que sobre la muestra iniciada solo un pequeño intervalo de frecuencias, lo que varia determinados por la ANCHURA DE LA RENDIJA. 7. RECIPIENTE PARA LA MUESTRA.- Se utilizan cubetas de vidrio y para la región del U.V. el de cristal de cuarzo (Ojo: el vidrio absorbe la radiación U.V.). Pueden ser de forma rectangular o cilíndrica Vienen en tamaño: NORMAL SEMI MICRO MICRO de acuerdo al volumen del micro Se tiene también las CUBETAS DE FLUJO CONTINUO, técnica critica de entrada y de salida, permiten el paso continuado de la disolución, mientras hace la medida. 8. DETECTOR El rayo transmitido incide en un fototubo. Es un tubo al vacío con 2 electrodos. La superficie del electrodo negativo es fotosensible por la diferencia de potencial, los electrones se aceleran llegan al electrodo positivo y se establece una corriente en el circuito. El N° de electrones emitidos por unidad de tiempo dependen de la energía radiante. Son de mayor eficiencia los tubos fotomultiplicadores. 9. AMPLIFICADOR Y LECTURA No se dará las características electrónicas de esta etapa de amplificación. Opera como un medidor o instrumento de lectura.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 17
  • 18. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA Los primeros detectores son el ojo humano y las películas fotográficas, consisten en transductores que convierten la energía radiante de una señal eléctrica. La señal eléctrica de respuesta del detector es directamente proporcional a la potencia radiante P. Se tienen los detectores de fotones, se les llama detectores fotoeléctricos y los detectores calóricos (trabajan por el calor). Como Ej. Del Detector de Fotones se tiene la célula fotoeléctrica tipo capa – barrera. Consiste en un plato Fe(+) sobre el cual esta apoyado en peniconductor (Selenio) y sobre el una capa fría semi transparente de plata (signo) La energía radiante sobre el semiconductor, excita los electrones en la interfase plata – selenio los cuales son liberados y pasan al electrodo colector (-). Se genera una pequeña fuerza electromotriz la que puede ser registrada en su galvanómetro. La muestra esta en solución (líquida). Los cubitos de vidrio se emplean en la región de la luz visible las direcciones para la región ultravioleta, las de sal depondrá en la región del infrarrojo.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 18
  • 19. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINATIPOS DE ESPECTROFOTOMETROS • ESPECTROFOTOMETROS UV - VISIBLE • ESPECTROFOTOMETRO DE ABSORCIÓN ATÓMICA • ESPECTROFOTOMETRO INFRAROJO POR TRANSFORMADA DE FOURIA. • ESPECTROFOTOMETRO DE FLUORESCENCIAESPECTROFOTOMETRO DE ABSORCIÓN ATÓMICA (1957 EN AUSTRALIA)Su funcionamiento al principio es semejante al espectrofotómetro de absorciónde sustancia en disolución, excepto que la muestra a analizarse debe servolatilizada por una llama.Se relaciona mucho su función con el de los FOTOMETROS DE LLAMA, perohay diferencias sustanciales.Se explica a continuación: Se suministra una llama de temperatura regulada para volatilizar la muestra, de acuerdo a la mezcla y combustible que se emplea (gas aluminizado, propano, butano, cuetileno).M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 19
  • 20. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA Se consiguen temperaturas desde 1700 a 4550 ºC. La mezcla se posee generalmente en líquida mediante un atomizador en cantidad medida y constante. La función del sistema óptico, es reunir la luz de la parte mas intensa de la llama (se ayuda con el espejo cóncavo). Se selecciona una determinada longitud, vida y se mide la intensidad de los átomos ACTIVADOS (ionizados). b) ESPECTROFOTOMETRO DE ABSORCIÓN ATOMICA. A diferencia del anterior mide la absorción por medio de los átomos vaporizados NO IONIZADOS de parte la luz emitida por una lámpara catódica hueca. En la sustancia vaporizada se encuentran ionizados sólo una pequeña fracción de los átomos. La mayor parte son los NO IONIZADOS, sobre estos efectúa la medición el instrumento, resultando por consiguiente mucho mas sensible que la FOTOMETRIA DE LLAMA. Tiene asimismo ventajas que se reconocen lo siguiente: b.1 Su costo es relativamente bajo comparado a otros tipos de espectrofotómetros. Su costo es algo superior al de fotómetro de llama, que es un instrumento simple. b.2 Las lecturas instrumentales son directamente proporcionales a la concentración. b.3 Analiza separadamente mediante su lámpara cataliza empiece un elemento, identificándolo y cuantificándolo. b.4 Es apreciable su análisis de productos alimenticios para la determinación de trazas de ciertos alimentos metálicos.Nota: Estos instrumentos determinan la presencia de elementos metálicos,pero no como se encuentran combinados en la muestra.Principio de funcionamiento.El método se basa en la medición de la luz absorbida a longitud onda de unalínea de resonancia dada por los átomos NO IONIZADOS o oxidados de unasustancia.A la temperatura normal de una llama de O 2 – acetileno y a la temperatura de 2800º K solamente una fracción muy pequeña de todos los átomos es excitada(ionizada).El 99% permanece no excitada.Se logra medir el nivel de concentración de los átomos de la llama.El instrumento puede ser de simple haz o de doble haz luminoso.Ejemplo: El espectrofotómetro de absorción atómica.PERKIN – ELMER Modelo 303 de doble haz luminoso.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 20
  • 21. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINAFUNDAMENTOS.La espectrofotometría de absorción atómica se funda en el principio deKIRCHOFF, de absorción por resonancia, según el cual los átomos absorbenradiaciones de la misma longitud de onda que puedan emitir.En la absorción atómica se usan una fuente independiente de luzmonocromática, específica para cada elemento a analizar y que se hace pasara través de vapor de átomos midiéndose posteriormente la radiación absorbida.Se usa la alta temperatura de la llama como fuente de excitación en donde losespectros son sencillos y los resultados cuantitativos que se obtienen puedenser reproducibles.Los espectros son sensibles por que el nivel de excitación (ionización) es bajoal emplearse un nivel bajo de energía de la llama.Esto da por ventaja que no hay interferencia de otras bondades de mayor nivelde energía.El nivel bajo de la llama no es problema ya que su función es solamenteatomizar la muestra y formar un vapor de átomos sin excitar.Por ello se puede aplicar a mayor número de elementos que la FOTOMETRÌA.La lámpara catódica actúa como fuente de radiaciónM. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 21
  • 22. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINAESQUEMA DE INSTALACIÓN a) ESPECTROFOTOMETRO DE EMISIÓN DE LLAMA. (FOTOMETRO DE LLAMA).M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 22
  • 23. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA b) ESPECTROFOTOMETRO DE ABSORCIÓN ATÓMICA Se tiene en la figura 2 esquemas (a) y (b) Dada la estrecha relación entre ambos es necesario una comparación. La sensibilidad del espectrotol - de absorción atómica es del 99% y corresponde al número de átomos no excitados. Ambos métodos son complementarios. En el gráfico (b) se ha señalado una fuente de radiación. Esto elimina la señal de fotometría de llama y recoge solamente la de absorción, la que se modifica con su cátodo hueco (Chopple). Funciones de la Ciama. 1. Grafica la muestra que ingresa al estado líquido 2. Descompone los compuestos moleculares del elemento a analizar las moléculas señaladas o átomo individuales. 3. Ioniza o excita estos átomos o moléculas.Espectrofotómetros de HAZ SIMPLE DE DOBLE HAZ DE DIODOS DE DOBLE LONG. ONDA Mod. PERKIN-ELMERM. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 23
  • 24. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA ESPECTRO FOTÓMETRO DE LECTURA DIRECTAAPLICACIONES. A. ESPECTROFOTOMÉTRO DE LUZ VISIBLE. • Análisis cuantitativo. Determinación de cantidades inferiores al 1% de cationes, de grupos funcionales. • Estudios de equilibrios, determinación de formulas complejas y de caracteres de equilibrio. • Estudios cinéticos • Otros: Determinación del almidón, azúcares reactores, proteínas, V, T, C, en alimentos. B. DE ULTRAVIOLETA. • Determinación desustancias orgánicas (hidrocarburos, vitaminas, esteroides, etc). Proteínas (Biuret), ácidos nucleicos. Separación analítica son frecuentemente necesarios antes de la medida espectrofotométrica. • Identificación de moléculas orgánicas aromáticas como los aminoácidos (tirosina, fenilolanina) • Algunas sustancias inorgánicas así como el plomo en huesos, fluor en mezclas de fluor y oxigeno, etc.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 24
  • 25. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA • Amplia apliación en el campo de la medicina, metabolitos de la sangre, tejidos, caña, etc. ESPECTROFOTOMETRO DE DOBLE HAZM. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 25
  • 26. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINASmith y J Feinbug. Cromatografía sobre papel y capa fina.Dana Abbott. Introducción a la cromatografíaCROMATOGRAFÍAEn 1906 el biólogo ruso TSWETT utilizó una columna de vidrio en forma detubo relleno con sulfato de Ca, ese polar y con una valirida de salida en la partesuperior.Usó como muestra una mezcla de pigmentos de plantas y por la parte superioriba agregando eter de petróleo.Observó la aparición de una serie de bandas horizontales de distintos coloresque corresponden a los componentes de los pigmentos.A partir de esto se usó el termino CROMATROGRAFÍA.Esta separación no tiene que ver nada con el calor de los compuestos sino conla diferente afinidad de ADSORCIÓN de los pigmentos hacia el material base yESO.CASO:Los de MENOR GRADO DE ADSORCIÓN avanzan mas rápido a lo largo de lacolumna.En 1 944 GORDON Y MARTÍN describieron los cromatógrafos de papel, setiene: • De columna abierta (papel extendido) • De capa fina (se tiene un soporte de placa de vidrio)En 1952 se descubrió la cromatografía de gases.Un gas reemplaza al disolvente líquido, por lo que la separación se realiza enuna columna cerrada.En química y Biología es frecuente separar, aislar, purificar e identificar loscomponentes de mezclas complejas. Ejemplo: Los amino ácidos de unapectina.Dado que algunos a. a. son muy parecidos entre sí, es muy difícil la separaciónpor cristalización fraccionada o métodos químicos por lo que se usa laCROMATOGRAFÍA.CROMATOGRAFÍA.Definición. Es una técnica de separación de una mezcla de solutos, basándoseen la diferencia de velocidad con que se mueve cada uno de los solutos através de un medio poroso, arrastrándose por un disolvente en movimiento.La cromatografía hizo posible el análisis químico de materias orgánicas,complejas que por otros métodos era casi imposible.La cromatografía en papel liso posible la separación e identificación decantidades de un soluto del orden de 0.1 u g. (un microgramo es la millonésimaparte del gramo), lo normal es de 1 a 50 u g.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 26
  • 27. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINACROMATOGRAFÍA EN PAPELEs la técnica de separación e identificación de sustancias químicas medianteun disolvente que se mueve sobre hojas o tiras de papel filtro.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 27
  • 28. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINATécnica: a) Cromatografía ascendente b) Cromatografía descendente c) Separación sencilla Cromatografía unidimensional X Origen SF Creato del disolvente. Línea que alcanza al final del proceso. Se tiene una tira de papel filtro En el origen se deposita una gota de la Solución a separar de deja secar la gota Queda una mancha el extremo próximo de la Mancha en el papel se introduce en un disolvente (Sin tocar a la mancha) Ej. (a) Por capilaridad el disolvente va subiendo a través del papel al avanzar disuelve y arrastra las sustancias de la mancha que por lo general se mueve a distinta velocidad se deja actuar por un tiempo determinado se seca el papel. Se observan las sustancias separadas que tienen color. A esta técnica se le llama cromatografía MONODIMENSIONAL.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 28
  • 29. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINACLASE INSTRUMENTAL DE ANALISIS DE ALIMENTOS – TEORÍA16/05/06Pregunta¿Por qué habiendo partido las sustancias desde un mismo punto aparecencomo manchas separadas y con distancias recorridas diferentes?Explicación.Cuando el disolvente se mueve sobre la mancha de las sustancias actúan 2tipos de fuerzas opuestas: a) Fuerzas propulsoras b) Fuerzas retardantes a) Fuerzas propulsoras, actúan apartando las sustancias de su punto de origen y desplazándolas en la dirección del flujo de disolvente. Se tiene 2 fuerzas:a.1 El flujo del disolvente. Cuando fluye el disolvente arrastra con él todas las materias disueltas, sino fuera por las fuerzas de retardo se podría lograr que el disolvente y se una con él (esto cuando es soluble). Si fuera insoluble se quedaría en el origen. Ejemplo: azúcar y acetato de etilo.a). Solubilidad Viene a ser una fuerza diferencial ya que no todas las sustancias tienen la misma solubilidad de cualquier disolvente. En igualdad de condiciones cuanto mas soluble sea una sustancia con mayor rapidez se moverá a lo largo del papel y por lo tanto se alejarían mas de los menos solubles.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 29
  • 30. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA Se elige disolventes en base a conseguir los mejores efectos diferenciadas en la solubilidad de las sustancias a separar. Como ningún disolvente puede producir las diferencias mismas de solubilidad, se acude al uso de 2 disolventes con diferentes propiedades. El segundo se emplea al girar 90° el papel y se tiene la cromatografía BIDIMENSIONAL. b). Fuerzas retardantes. Son fuerzas que trata de impedir el movimiento de las sustancias. Se tiene: b.1Adsorción. Ejemplo: Una esferita de vidrio sobre una superficie abierta con melaza. Retarda su avance, se tiene que se cubre con polvo adsorve muchos gases. La celulosa también tiene propiedades adsorventes. La adsorción es una propiedad reversible y la celulosa irá frenando gradualmente la mayor parte de sustancias del disolvente a medida que esta caída sobre la marcha. La adsorción también es una fuerza diferencial, ya que hay sustancias que son adsorvidas con mas fuerza que otros. La mas fuertemente adsorvidas se irán quedando atrás. b.2 Reparto En y sobre el papel filtros de apariencia seca (6-12% humedad). Definición Adsorción: Adherencia a la superficie. Absorción: Introducción de una sustancia en el cuerpo de otra. Ejemplo: agua en esponja. Se tiene el carácter del disolvente circulando por el papel filtro y la celulosa contenida en el mismo papel filtro. Si una sustancia es soluble a dos disolventes no mezclables y es expuesto a ambos, se repartirá entre ellos. La cantidad de sustancia que se cuente en cada disolvente dependerá de la relativa solubilidad del soluto.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 30
  • 31. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA El grado de reparto una vez conseguido el equilibrio se le conoce como coeficiente de reparto o razón de distribución. El agua que forma parte del papel filtro esta firmemente adherido en las fibras de la celulosa, el cual esta formado por un mismo es sustancia de celdillas microscópicas. El agua se halla estacionaria en estas celdillas y cada una puede ser considerada como un diminuto “tubo”. El disolvente avanza sobre estos “tubos”, recoge por reparto parte de la sustancia disuelta en el agua del tubo y va depositando parte de ella y por reparto en los siguientes tubos. A medida que avanza el proceso se repite una y otra vez. Como el soluto recogido por el disolvente en movimiento va siendo disuelto continuamente al papel, se tiene que retardará su avance. Este retardo esta en relación con el coeficiente de reparto de cada soluto. La constante R, esta dado por el movimiento relativo de una sustancia con respecto al disolvente. Distancia recorrida por la sustancia R = ___________________________________ Distancia recorrida por el disolvente Como en algunos casos al frente del disolvente sale fuera del papel es mas conveniente emplear el movimiento de la sustancia con respecto a un estándar (similar químicamente). Distancia recorrida por la sustancia Rx = ___________________________________ Distancia recorrida por el estándar XM. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 31
  • 32. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINAEn la cromatrografía de reparto, separación de una mezcla entre la fase móvil(disolvente) y la estacionaria (soporte), la celulosa y la del gel de sílice, actúancomo soporte del agua.La celulosa es un polímero de glucosa, posee una gran cantidad de grupos:hidróxido (-OH) y una microestructura muy complicada (2 clases: fibrosa ymicrogranular).Cuando se desea que no haya fenómeno de adsorción se emplea la celulosapara la separación de las sustancias solubles de agua.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 32
  • 33. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINACLASES DE COMATROGRAFÍA. 1. Cromatrografía líquida – Liquido Usa de base celulosa o gel de sílice en forma de tira de papel, capa fría o columna. 2. Cromatrografía de gas – Liquido. Si dispone un líquido sobre un sólido y hay flujo de gas en sistema. 3. Cromatrografía de filtración sobre el gel. Ejemplo. Dextramo que usados en aleiado contenido de grupos de hidróxido tiene mucha afinidad con el agua, por lo que se hincha en su contacto, formando un gel semitransparente. La sustancia de tamaño molecular menor. Se le usa en la determinación de pesos moleculares. 4. Cromatrografía de adsorción. Se usa la diferencia de comportamiento en la adsorción, deserción de sustancias contenidas en un disolvente móvil sobre un sólido estacionario, para la separación de los componentes de una mezcla. 5. Cromatografía gas – sólido. El disolvente es un gas. 6. Cromatografía de intercambio ionico. Se emplea materiales especiales de estructura, pesos e insolubles. Estos contienen: grupos reactivos que están asociados a iones. Se emplea en la separación de sustancias ionicas orgánicas o inorgánicas. Se usa resinas, geles y celulosas de intercambio iónico.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 33
  • 34. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINAI. CROMATOGRAFÍA DE PAPEL Emplea tiras u hojas de papel WHATMAN N° 1 ó N° 3.OPERACIÓN.1.1 Preparación de muestras. Las muestras se aplican sobre el papel en forma de solución. Para ello los sólidos han sido disueltos en una pequeña cantidad de disolvente adecuado. Las sustancias puras se aplican directamente. En los tejidos biológicos es necesario hacer una purificación preliminar debido al nivel de componentes; proteínas o sales e impurezas. Las sustancias no deseadas se pueden superar por varios métodos. Ejemplo: Los lípidos en los disolventes orgánicos. Las proteínas con alcohol. Las sales con reseñas de intercambio iónico o por electrolesis. Al final se tiene muestras con tipos de moléculas mas homogéneas. 1.2 Aplicación de muestras sobre el papel Se traza con un lápiz una línea paralela al lado por donde se va comenzar. Se marca con pequeñas cruces a distancias iguales los lugares donde se va aplicar las muestras. Se identifica cada uno (A, B, C, D). Se aplica las muestras con un tubo capilar o un hito de platino. Las manchas tendrán un Ø máximo de 5 mm. Sacar la mancha después de cada aplicación.1.3 Elección del disolvente. Será de acuerdo a la sustancia que se ha desaparecer. Se usa mucho el n-butanol.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 34
  • 35. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA Si se agrega el disolvente ácido acético y formic, piridina o solución de amoniaco, ayudan a incorporar mas agua al disolvente cimentando la solubilidad. La técnica puede ser ascendente o descendente. El papel (H colgado y colorado dentro de una cubeta ingresándose una atmósfera saturada de vapor). En la precedente el disolvente asciende hasta el extremo superior del papel, cesando el flujo del líquido. Los componentes permanecen sobre el papel y la distancia recorrida por el disolvente es fija. Esto es importante para la separación BIDIMENSIONAL. Con la técnica dominante el disolvente corre a lo largo de papel debido a la gravedad llegando fuera del papel. Se puede aumentar la longitud del papel y obtener mejores resultados en la separación.1.4 Secado de papel. Cuando el disolvente ha recorrido la distancia requerida o transcurrido un tiempo especificado, se saca los papeles de la cubeta. Se saca el papel con ayuda de un ventilador. Estará listo para el revelado o localizado.3.1. Revelado. Interesa al final localizar la posición de las sustancias en el papel si son colocadas no hay dificultad. Si son varios se puede visualizar por métodos físicos como la fluorescencia y la radiactividad o por aquellos químicos.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 35
  • 36. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINAII. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINAEn la cromatrografía de papel, la hoja de papel aparta su propia columna decelulosa. No necesita un tubo de vidrio para sostenerla.Para muchos compuestos orgánicos el uso del papel y celulosa no essatisfactorio. Otros medios tales como alumina y gel de sílice no puedenprepararse en forma de tiras, por lo que se accede a fabricar capas finas sobrelaminas de vidrio.Se aplica una capa de un material pastoso sobre una lamina de vidrio. Espesarmaterial = 0.50 u o 0.250 m. m.La ventaja de esta técnica aparte de separar compuestos tales como lípidosque no se puede en la de papel, es que se puede usar una amplia variedad demateriales bioquímicos pulverizados como capa fina tales como: Gel de sólidos Celita AliminezSe elige la capa de acuerdo al material a usar.Cromatografía de capa fina.Definición. Es una técnica de separación e identificación de sustanciasquímicas por medio de un disolvente que se mueve sobre una capa delgada deun disolvente que se mueve sobre una capa delgada de un adsorvente idóneocolocado sobre una hoja de vidrio.Otras ventajas sobre la separación en papel es que requiere menos tiempo, seobtiene mejor resolución y manchas mas compactas.2.1. Preparación de las placas. Se prepara la papilla disolviendo con agua llegando a una consistencia apropiada, no debe tener grumos. Se extiende haciendo uso de una varilla de vidrio o se puede usar en extender o aplicador especial. El espesor habitual es de 0.25 m.m. Placas mas finas dan separaciones mas rápidas; pero menos eficaces. Placas mas gruesas 0.5 a 1 m.m. se emplean en el trabajo microperativo.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 36
  • 37. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA2.2 Alcado Se calienta la placas en una estufa a 100 – 105° C por 2 horas por lo que se activan. Si se les deja luego a la atmósfera, se discurre (gran humedad). Para medios tales como el gel, el secado es lento.2.3 Elección del medio. Celulosa microeristalina (Clomatrografía de reparto) Gel de sílice (Clomatrografía y reparto) Alumina (para adsorción)2.4 Elección de disolvente. Depende de la naturaleza del compuesto a separar. Para sustancias solubles en agua se elige capas de celulosa o gel de sílice. Para sustancias menos polares se elige capas de alivana o gel de sílice. El disolvente apropiado se aplica en el centro de marcha mediante un capilar muy fino o se evapora rápidamente. Se cuenta con una variedad de segundos dizar ventas.2.5 Desarrollo de las placas. Por el método ascendente se hace uso de cubeta.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 37
  • 38. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA MÉTODO. Se coloca en el interior un papel filtro empapado de disolvente que cubra las paredes exteriores de la cubeta para tener una atmósfera saturada. El fondo tiene disoluto 0.5 a 1.0 cm. Se introduce la placa. Se puede hacer la prueba con una o varias placas. Con varias placas es mejor ya que se puede tener una cubeta sanduaich en el que hay mejor control de la atmósfera. Se deja que ascienda el disolvente unos 10 cm. por encima del origen y se saca la placa. Se marca con lápiz el efecto del disolvente y se deja empezar.2.6 Revelado de placas. A diferencia de la cromatografía de papel en la de capa fina es posible usar en el revelado agentes corrosivos y alta temperatura, tales como ácidos concentrados y compuestos oxidantes. Se usa vapores de yodo (en cristal) al cabo de unos minutos el yodo tiende a concentrarse donde están los compuestos. Aparece una mancha marrón oscura sobre fondo amarillo que no es destructivo. Se puede emplear también la fluorescencia y la radioactividad (rayos ultravioleta).2.7 Cromatrografía Acanlitatura. Se puede emplear un mayor espesor de capa adsorvente. Conociendo la posición de las barras que interesan se retiren de la placa mediante una espátula, se extrae la sustancia de polvo usando un disolvente. Ejemplo: Extraer Soxhlet. En la cromatografía de capa fina cuantitativa se conoce el volumen de la muestra. Se analiza el producto disuelto.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 38
  • 39. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA2.2. Conservación del cromatrograma. La conservación del cromatrograma de capa fina es difícil e indeseable ya que las placas se pierden muchas veces. La capa es delicada. Se puede fotografiar la posición de las manchas después del mezclado. Otra técnica es pulsar polarizar la capa con una dispersión de un plástico especial transparente, al enderezarse permite retirarlo de la placa de vidrio manteniendo el cromatrograma. De otra manera puede generarse indefinidamente. CROMATROGRAFÍA EN COLUMNA Son unos tubos o columnas de vidrio con una válvula de Sclich en la parte superior. En el mezclado se tiene gran variedad de tipos y tamaños3.1. Llenados en la columna. Se coloca el tubo en posición vertical se sostiene un sujetador que se coloca en el fondo de la columna un disco de porcelana (filtro) y encima deM. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 39
  • 40. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA este un poco de lana de vidrio. Esto retardará el material sólido de la columna mientras que el líquido eluyente puede circular libremente. El material adsorbente puede introducirse un poco, peso diferente es colocado en la prima de papilla con el eluyente. Antes de introducir el adsorbente se ha h echado empiece de disolvente puro 2 a 4 cm. por encima de la lana de vidrio. Se elimina el aire que pueda quedar retenido agotado por medio de una varilla larga de vidrio. La papilla formada por el adsorbente y el disolvente se agrega lentamente en porciones hasta llegar a la altura deseada, se golpea suavemente ... La altura del disolvente no debe exceder 2 a 5 m. m. sobre el sellado, a partir de esto la columna esta lista para recibir la muestra que se desea separar.3.2. Disolventes empleados Según sea la preparación de reparto, adsorción o intercambio ionico se aplican 3 tipos de disolventes. Para los separadores por adsorción es fundamental que los disolventes empleados sean puros ya que si hay impurezas pueden alterar el desarrollo del proceso. Empleando adsorventes tales como alumina y gel de sílice, la intensidad de la adsorción aumenta al crear la naturaleza polar del material adsobido. Por esto se emplea disolventes apolares con el eter de petróleo. Se emplea para la correcta elección de la columna, una serie de disolventes en los que vaya aumentando la polaridad. Ejemplo: la serie agua > metanol > etanol > acetina > acetato de etilo > eter > cloeceperaco > buceno. Para las separaciones basadas en el intercambio único, la solución acuosa, sería pasar por una columna de resina de intercambio iónico.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 40
  • 41. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA 3.3 TÈCNICAS DE SEPARACIÒN Guías de separación. Columnas de reparto. La mezcla a separa se disuelve en el disolvente apropiado vertiendo una solución diluida que se introduce en la columna por medio de una pipeta. El disolvente elegido debe ser miscible con el empleado para llenar la columna; la adición se ayuda empleando una varilla de vidrio también. Se abre una llave inferior y se deja salir el disolvente hasta que el nivel de la muestra este 1 o 2 m. m. del adsorbente, a través del adsorbible remplazando la llave. El flujo se continua hasta que se han separado todos los componentes.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 41
  • 42. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA b) Columnas de adsorción dibujo: No naportucto Disolvente A Disolvente B A B 3.4 Examen e identificación de los compuestos. Cuando la muestra aplicada a la columna es colocada, se abrieron fácilmente el proceso de separación. Embollo Metálico Mediante un embolo o pistón se emplea con cuidado el adsorbente evitando que se desmorone. COLUMNA RELLENO DE COLUMNA Se deja secar (evaporar). EXTRUCIÓN DEL RELLENO Se corta en rodajas Se extrae con disolvente cada rodaja Se analiza el extracto.II. CROMATOGRAFÌA DE GASES Las 3 técnicas de separación ya descritas se vienen utilizando desde hace mucho tiempo y son las mas apropiadas para separaciones de sólidos y líquidos NO VOLATILES en solución. La cromatografía de gases es particularmente apropiada para la separación de gases y líquidos volátiles. M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 42
  • 43. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA ESQUEMA DE INSTALACIÓN DE UN APARATO PARA CROMATOGRAFÍA DE GASES. 1. Aire Fig. CROMATOGRAMA REPRESENTADO LA SEPARACIÓN B. Etano DE GASES DEL PETROLEO, SOBRE ALUMINA, USAN- C. Propano DO HIDROGENO COMO GAS PORTADOR. D. Isobutano E. n-butano F. Isoperitano G. N-pentano La pequeña muestra de gas a separar se inyecta en la corriente de gas inerte tal como N, H, dióxido carbónico, argón o helio que pare hasta una columna que contiene un medio apropiado, capaz que irá retardando el flujo, de manera gradual, de cada uno de los compuestos individuales de la muestra que fluye a través de la columna.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 43
  • 44. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA Los compuestos separados margen a intervalos (de acuerdo a cada componente) y pasan a través de un director. Se hace posible la separación por las diferencias en la adsorverí en la columna.4. Los análisis de gases se llevan acabo en una columna de cada par (gas - sólido). Los líquidos y sólidos volátiles en canaletas de gas – líquido. Sobre el gas partidor. Se adquiere al estado puro en citados a presión o para resultados óptimos se saca el gas antes de ser poco pasándose a través un tamiz molecular (eliminan el vapor de agua). El gas portador a emplear depende de la naturaleza de la muestra y del tipo de detector instalado. La velocidad del flujo del gas portador se controla con una medida de caudal (rotavetro). La colectora vertical del flotador indica continuamente la velocidad del flujo.4.1 Introducción de la muestra. Se usa muestras pequeñas de 0.19 10 ul para gases y líquidos y fracciones de mg. para sólidos. Muestras mayores darán una mala separación. Se hace uso de una micro-jeringa mediante una aguja que atraviesa el tapón de goma. La muestra aplicada debe evaporarse rápidamente a la entrada para ello hay una resistencia eléctrica que calienta la entrada. Una buena temperatura es 50°C. Con gases o muestras muy pequeñas, la calefacción no es esencial.4.2 La columna. Son de vidrio, plástico o metales. Se perfora los metales por ser inertes, resistentes y tener buena transferencia de calor. Tiene 1.5 a 4.5 m. de longitud y 2 a 20 mm O.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 44
  • 45. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA En el sistema de cromatrografía capilar de gases los tubos o en 1.3 a 3 m.m. de longitud y de 0.1 a 1 mm. de O de diámetro.4.1 Preparación de relleno.a. Columnas de alumina Los adsorventes mas empleados son alumina, carbón activo, gel de sílice o trabajen bien a temperatura ambiental. Para compuestos de elevado peso molecular se eleva la temperatura y empleado adecuadamente en líquido no volátil para bloquear los cortes activos y bajar el poder de adsorción. b. Columnas de reparto. El material de relleno viene a ser un soporte soluto finamente dividido, que parte un líquido volátil. 3. SISTEMA HPLC (HIGH PRESSURE LIQUID CHRDNATLLGRAPY). CROMATROGRAFÍA DE LIQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN. En cromatrografía de líquidos tiene lugar aveces usa ensanchamiento de banda significativo fuera del relleno de la columna. Se produce debido a la diferencia de hióabidad de flujo que hay entre las capas de líquido coadyuvantes a las paredes del tubo y las del centro. En la parte central el soluto se mueve con mayor rapidez que en la peritica. En el aparato HPLC, se hace uso de altas presiones y el equipo es mas complejo, que un cromatografo común (ver Fig). Tiene varias respuestas que pueden ser de vidrio o de accioina, cada uno tiene 500 ml. de un disolvente. Cuando hay formación de gases (O 2, N) disueltos que pueden interferir en la sustancias de detección se hace uso de un difusor que mediante una sustancia de vacío arrastra los gases disueltos fuera de la solución mediante finas burbujas de un gas fuerte y de baja solubilidad. Esos procesos y instrumentos HPLC se puede introducir los disolventes a través de 2 ó mas recipientes hacia una cámara de mercía.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 45
  • 46. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA5.1 Sistema de bombas Se usa presiones por encima de 600 psi, el flujo debe estar libre de pulsaciones, el intervalo de calidad de 0.1 a 10 ml/min. Componentes resistentes a la corrosión (se saca acero y teflón). Se usan 3 tipos de bombas:• Bombas reciprocantes (produce pulsaciones) por cierta fusión.• Bombas de jeringa• Bombas neumáticas (presión constante).• Bombas de jeringa o de desplazamiento. Son cámaras como una jeringa y un embolo. Desventaja: Capacidad limitada de disolvente 250 ml, dificulta su cambio de disolvente. Ventaja: Flujo libre de pulsaciones. • Bombas neumáticas. Son mas simples. La fase móvil esta en un ceritenedor plegada el que puede prescindirse mediante aire comprimido, no provoca pulsaciones, son baratos pero de baja presión y capacidad limitada. Control del caudal de bombeo. Tiene dispositivos controlados por ordenador. Cualquier diferencia entre la señal y lo programado su fuerza abstractiva se aumenta o disminuye la velocidad del motor de la bomba. Sistema de inyección de muestra. Un factor limitante en la presión de las medidas es la reproductibilidad en introducir la muestra de la columna. Por ello los volúmenes que se emplean deben ser muy reducidos. De unas pocas decinas de microlitro a 500 u litro (1/2 ml) e introducir la muestra sin despresurizar el sistema. Adicionalmente se usa un mecanismo llamado bucle de muestra. Su tamaño varía de acuerdo a la muestra, son intercambiables y van de 5 a 500 u l.M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 46
  • 47. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA La ventaja es que puede introducir la muestra a presiones de hasta 7000 psi con una presión de unas décimas por ciento. Columnas para cromatografía de líquidos. Se construye de acero inoxidable, vienen empaquetados cientos de columnas de O variable. Su longitud varía de 10 a 30 cm, son rectas y se pueden alargar acoplando 2 o mas columnas. El O entero varía de 4 a 10 mm y los tamaños de partículas de los rellenos van de 3.59 a 10 u m. Tipos de relleno de la columna Los mas empleados son de 2 tipos: a. Películas. Bolas de vidrio o de polmero, no perones, esféricas de O 30 a 40 u m. Es la superficie las bocas tienen un ambiente de sílice o alumina o de una resina de intercambio ionico. b. De partícula porosa. O de 3 a 10 u m. material sílice, alumina o resina de intercambio iónico.• Detectores. En cronometría de líquidos se usan los detactores de ionización de llama y de conducción térmica. Se usan 2 tipos:a. Detectores basados en una propiedad de la disolución. Ejemplo: índice de refracción, la constante dielectica o la deusidad.b. Detectores basados en una propiedad de soluto. Ejemplo: absorvación UV, fluorescencia o intensidad de difección que no son propias de esta fase móvil. ESQUEMA DE UN APARATO HPLC (PERKIN-ELMER)M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 47
  • 48. UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINAM. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 48