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COMPOSICIÓN DE MEDIOS A EMPLEARSUERO FISIOLÓGICOCloruro de sodio                               8,5 gAgua                  ...
AGAR BAIRD PARKERDigerido Pancreático de Caseína              10,0 gExtracto de Carne Vacuna                     5,0 gExtr...
CALDO RAPPAPORT-VASSILIADISPeptona de soja                                4,5 gCloruro de magnesio hexahidratado          ...
AGAR VERDE BRILLANTEExtracto de Levadura                          3,0 gDigerido Péptico de Tejido Animal             5,0 g...
TERCER CICLODurante el tercer ciclo (2 clases) se hará el estudio de agentes físicos, químicos y biológicossobre los m.o.O...
1 Agentes Físicos: calor1.1 Preparar una suspensión de Escherichia coli (ATCC 25922) en suero fisiológico, equivalenteal t...
2.2 Hipoclorito de sodio con sustancias interferentes2.2.1 Agregar 1,0 mL de sustancia interferente (p. ej. leche descrema...
2.3 Etanol2.3.1 Preparar una suspensión de Staphylococcus aureus (ATCC 6538) en suero fisiológico,equivalente al tubo Mac ...
ControlesA) Efecto bactericida del neutralizanteTomar 1 mL de la suspensión Ni (preparada en 2.1.3) de S. aureus y agregar...
NORMAS          BÁSICAS         DE      SEGURIDAD        EN     UN     LABORATORIO           DEMICROBIOLOGÍA1. Esta prohib...
UTILIZACIÓN DEL MICROSCOPIO1. Colocar una preparación.2. Abrir el diafragma de la fuente de luz al máximo.3. Abrir el diaf...
CITOLOGÍA Y MORFOLOGÍA DE BACTERIASLas bacterias, junto con los protozoarios, algas microscópicas, hongos microscópicos (i...
El movimiento de traslación de algunas bacterias puede observarse en preparaciones húmedas delmaterial, es decir con los m...
Las células previamente fijadas se tiñen con solución de cristal violeta, se lavan y se tratan conlugol. El yodo del lugol...
extremos), lofotrica (penacho de flagelos en un extremo) y peritrica (flagelos alrededor de toda lacélula sin distribución...
TÉCNICASMANIPULACIÓN ASÉPTICA DE CULTIVOS    •   Tomar el tubo de cultivo con la mano izquierda, de modo que el fondo del ...
2) Secar al aire. Puede acelerarse el secado, manteniendo la lámina encima de la llama delmechero a 15 cm o más de distanc...
CITOLOGIA Y MORFOLOGIA DE HONGOSINTRODUCCIÓNLos hongos constituyen un grupo muy heterogéneo de organismos eucariotas, hete...
Ej.: zigote heterotálico: Absidia coerula, zigote homotálico: Mucor baciliformisASCOMYCETESEstructuraHongos filamentosos c...
La clasificación dentro de este grupo se basa en la observación del aparato conidiógeno. La formaen que se produzca la con...
Fig. 1                                                 Fig. 2               Fig. 3  Micelio no tabicado                   ...
Fig. 12              Aureobasidium                                                              Fig. 13                   ...
SIEMBRA Y AISLAMIENTO - BÚSQUEDASIEMBRASembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) e...
Aislamiento en placa por estríasExisten distintas técnicas, el objeto es obtener colonias aisladas.Consiste en cargar el a...
de aislamiento selectivos puede ocurrir que una colonia característica del m.o. que estamosbuscando pueda contener como co...
MEDIOS DE CULTIVOGENERALIDADESSi se desea recuperar determinados m.o. de sus ecosistemas naturales (agua, tierra, alimento...
•   Fuente de nitrógeno. Generalmente se agrega como sales de amonio o peptonas. Se        puede omitir el agregado de fue...
líquidos que contienen inhibidores, ej., sales biliares, altas concentraciones de cloruro de sodio,etc.3) Medios diferenci...
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  1. 1. CURSO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL Cátedra de Microbiología Facultad de Química 2009 v3
  2. 2. CURSO DE MICROBIOLOGÍA – 2009. GUÍA DE PRÁCTICOPRIMER CICLODurante el primer ciclo (4 clases) se realizará la identificación primaria de bacterias y hongosa partir de cultivos puros y de muestras de ambiente.OBJETIVOS:Al finalizar el ciclo el estudiante debe ser capaz de:1) Manejarse de acuerdo a las normas de bioseguridad.2) Manejar y mantener el microscopio correctamente.3) Trabajar asépticamente.4) Preparar frotis y teñirlos por Gram.5) Reconocer morfologías microscópicas y coloración Gram de bacterias.6) Reconocer morfologías microscópicas características de hongos uni y pluricelulares.7) Identificar bacterias (género/familia).8) Preparar medios de cultivo.9) Manejar el autoclave.10) Preparar material para esterilización por calor seco.11) Uso de Tablas de identificación de bacterias.Al final del ciclo cada subgrupo (4 estudiantes) deberá entregar un informe indicando:Grupo (n° y horario), nombre de los estudiantesResultados obtenidos:a) Muestra de ambiente: origen de la muestra, medio y condiciones de cultivo, descripciónmacro y microscópica de las colonias obtenidas.b) Cultivos bacterianos problema: código de la muestra, descripción macro y microscópica delas colonias en el medio selectivo aportado, pruebas bioquímicas realizadas y datos obtenidosde cada una, género y/o Familia a la que pertenece el m.o. identificado.Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 1 de 110
  3. 3. Clase Trabajo experimental Material a estudiar - Observación macro y microscópica de cultivos puros - Normas de bioseguridad. de bacterias (medios sólidos y líquidos). - Utilización de microscopio. 1 - Técnica aséptica. Frotis y tinción de Gram. - Citología y morfología de bacterias - Siembra de una muestra: superficie, piel, tierra, aire - Siembra y aislamiento. en TSA a) Muestra sembrada en 1ª clase: - Observación macroscópica de colonias. - Siembra y aislamiento: aislamiento por - Observación microscópica: frotis, tinción de Gram. estrías, cultivo puro. b) Identificación de bacterias. Cada subgrupo recibirá - Medios generalidades; Tabla "Características un m.o. (microorganismo) sembrado en un medio de algunos medios"; selectivo: - Composición de medios (manuales - Observación macroscópica de colonias. comerciales): ALRF, Mac Conkey, MSA, TSA, 2 - Observación microscópica: frotis, tinción de Gram. TSB. - Reaislamiento en medio no selectivo (ALRF y TSA). - Identificación de bacterias: pruebas - Elección de pruebas bioquímicas. Con los datos bioquímicas primarias: oxidasa catalasa, OF, obtenidos de las observaciones macro y microscópicas relación con el oxígeno (crecimiento en y usando la tabla, cada subgrupo deberá elegir las anaerobiosis), fermentación de glucosa. pruebas necesarias para la identificación primaria del m.o. a) Continuación de la muestra sembrada en 1ª clase. - Observación macro y microscópica. b) Identificación de bacterias: - Identificación de bacterias. - Verificación del reaislamiento por observación macro - Siembra y aislamiento: preparación de medios 3 y microscópica. de cultivo y esterilización de material de vidrio. - Siembra de pruebas de identificación primaria. - Citología y morfología de hongos. c) Observación macro y microscópica de hongos en cultivos puros. d) Preparación de medios (mitad del grupo). a) Muestra de ambiente: observación macro y microscópica. b) Cultivo bacteriano puro: lectura de pruebas 4 bioquímicas. c) Observación de hongos, continuación. d) Preparación de medios de cultivo, continuación. e) Entrega de informe y discusión de los resultados.Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 2 de 110
  4. 4. SEGUNDO CICLODurante el segundo ciclo (7 clases) se hará el análisis microbiológico de una muestra paradeterminar si cumple con los requisitos exigidos según una norma determinada.OBJETIVOS:Al finalizar el ciclo el estudiante deberá ser capaz de:1) Realizar el análisis microbiológico de una muestra de acuerdo a una técnica dada.2) Informar adecuadamente los resultados del análisis microbiológico de una muestra.3) Calcular las diluciones adecuadas a sembrar para realizar un recuento (en placa, NMP).4) Manejar tablas de identificación de bacterias.5) Comprender las bases bioquímicas de las pruebas utilizadas en la identificación.6) Comprender la función de cada uno de los componentes de un medio de cultivo.7) Realizar un esquema simplificado de una técnica microbiológica.En la clase 6 del ciclo cada subgrupo deberá entregar el informe final (solo los resultadosobtenidos) de la muestra analizada. En la clase 7 se deberá entregar 2 fotocopias del informedel trabajo asignado en clase 5.Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 3 de 110
  5. 5. Clase Trabajo experimental Observaciones y material a estudiar 1 Análisis microbiológico de una muestra según técnica Técnica microbiológica para el análisis de una aportada. Búsqueda de los 4 m.o. correspondientes y muestra recuentos de mesófilos, enterobacterias y hongos Muestreo para análisis microbiológico. Recuentos: Introducción gral. y recuento en placa 2 Continuación con el análisis microbiológico. Aislamiento Discusión de medios de cultivo empleados: selectivo. Subcultivo a caldos selectivos. composición y uso (manuales comerciales). Resultado preliminar del recuento de mesófilos y Test de esterilidad. enterobacterias. 3 Recuento definitivo de mesófilos. Observación de Informes de los resultados de recuento de colonias típicas en medios selectivos. Aislamiento de mesófilos y enterobacterias los caldos selectivos de Salmonella. Cálculo de diluciones a sembrar para recuentos Reaislamiento en medio no selectivo según diferentes límites. 4 Gram de colonias típicas. Pruebas primarias (catalasa, Recuentos: recuento por NMP. oxidasa). Uso de Tabla NMP. E. coli: IMViC. Límites microbiológicos para agua potable y Salmonella spp: Reaislamiento de colonias sospechosas agua de playa. en medio no selectivo. Identificación de bacterias: pruebas Pseudomonas aeruginosa: crecimiento a 42 ºC, bioquímicas. pigmentos. Presentación y discusión de pruebas S.aureus: catalasa, coagulasa o DNAsa bioquímicas. Recuentos: Siembra de agua potable o de playa por NMP. Recuento de heterótrofos en agua potable por filtración. 5 Leer recuento preliminar por NMP. Confirmación de Discutir Farmacopeas. Ordenanza, normas coliformes totales y fecales. UNIT, etc. Siembra pruebas de tamizaje para Salmonella : TSI, Se entregarán diferentes trabajos de análisis LIA Fenilalanina microbiológico para presentar diseño de metodología por escrito en forma de esuema (diluciones, medios, etc). 6 Leer NMP. Leer bioquímicas de Salmonella. Leer Discutir resultados de NMP. resultado de recuento de heterótrofos por filtración Discusión gral sobre el tema de identificación y recuento de hongos. de una cepa bacteriana. Entregar resultados. 7 Presentación del trabajo de análisis asignado en clase 5 por cada subgrupo.Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 4 de 110
  6. 6. TÉCNICA GENERAL DE ANÁLSIS MICROBIOLOGICO DE UNA MUESTRAEspecificaciones microbiológicas para la muestraRecuento de mesófilos aerobios viables: menos de 1000 UFC/gRecuento de hongos y levaduras: menos de 100 UFC/gRecuento de Enterobacterias: menos de 100 UFC/gAusencia de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Salmonella spen 10 g.Preparar la muestra que se va a analizar mediante un tratamiento apropiado a suscaracterísticas físicas y que no altere el número y tipo de microorganismos originalmentepresentes, a fin de obtener una solución o suspensión adecuada para los procedimientosanalíticos que se van a efectuar. Es recomendable partir de una muestra no menor de 10 g (omL) representativa del lote a analizar y preparar las diluciones en un solvente adecuado (suerofisiológico, tampón fosfato o agua peptonada al 0,1%).1 RECUENTOS1 Preparación previa de la muestra1.1 Pesar asépticamente 10 g de la muestra y disolver o suspender en 90 mL de suerofisiológico. Esta es la dilución 1/10 o 10-1.1.2 Pipetear 1mL de esta dilución en cada una de tres placas de Petri estériles. Continuar elprocedimiento en 2, 3 y 4.2 Recuentos de mesófilos aerobios viables2.1 Agregar inmediatamente a una placa 15 a 20 mL TSA (agar tripticasa soja), previamentefundido y termostatizado a 45 ºC.2.2 Mezclar por rotación y dejar solidificar a temperatura ambiente.2.3 Incubar a 35 ± 2 ºC durante 48 a 72 h. Examinar para verificar la presencia de colonias.3 Recuento de Enterobacterias3.1 Agregar inmediatamente a otra placa aproximadamente 15 mL de VRBGA (violet red bileglucose agar), previamente fundido y termostatizado a 45 ºC.3.2 Mezclar por rotación y dejar solidificar a temperatura ambiente. Luego cubrir con unasobrecapa del mismo agar de aproximadamente 5 mL. Dejar solidificar.3.3 Incubar a 35 ± 2 ºC durante no más de 24 h. Examinar para verificar la presencia decolonias típicas (colonias rojas, con diámetro mayor a 1 mm, habitualmente con halo de bilisprecipitada). Reaislar un número representativo de colonias típicas (no menos de cinco) a TSA.Confirmar mediante tinción de Gram y el ensayo de oxidasa.4 Recuento de hongos y levaduras4.1 Agregar inmediatamente a la placa restante 15 a 20 mL de SDA (agar glucosado deSabouraud) con cloranfenicol, previamente fundido y termostatizado a 45 ºC.4.2 Mezclar por rotación cada placa y dejar solidificar a temperatura ambiente.4.3 Incubar a 25 ± 2 ºC durante 5 a 7 días. Examinar para verificar la presencia de coloniastípicas de hongos filamentosos y/o levaduriformes (realizar una coloración simple).Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 5 de 110
  7. 7. 5 - BÚSQUEDAS.5.1 - Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli5.1.1 Pesar asépticamente 10 g de la muestra y agregar a 90 mL de medio TSB. Si fueranecesario homogeneizar mediante suave agitación.5.1.2 Incubar 18 a 24 h a 35 ± 2 ºC.5.1.3 Realizar el aislamiento a los siguientes medios sólidos en placa: MSA (agar manitol sal) oagar Baird Parker para Staphylococcus aureus, agar cetrimida para Pseudomonas aeruginosa yagar Mac Conkey o EMB-Levine (agar eosina azul de metileno-Levine) para Escherichia coli.(Para la búsqueda de Salmonella continuar el procedimiento en 5.2).5.1.4 Incubar las placas a 35 ± 2 ºC durante 24 a 48 h y examinar el desarrollo de coloniastípicas.5.1.5 Si no existen colonias típicas en los respectivos medios, la muestra cumple la exigencia deausencia de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli en 10 g demuestra.5.1.6 Si aparecen colonias típicas de Staphylococcus aureus en MSA o agar Baird Parker,realizar un reaislamiento de algunas colonias en TSA. Luego tomar colonias de este medio yhacer la coloración de Gram, el ensayo de catalasa y el ensayo de coagulasa.5.1.7 Si aparecen colonias típicas de Pseudomonas aeruginosa en agar cetrimida, realizar unreaislamiento de algunas colonias en TSA. Tomar colonias de este medio y realizar la coloraciónde Gram, el ensayo de oxidasa y el crecimiento a 42 ± 0,5 ºC en TSB. Si fuese necesarioconfirmar la producción de pigmento piocianina en agar King A (incubar no menos de 3 días a 35± 2 °C o a temperatura ambiente).5.1.8 Si aparecen colonias típicas de Escherichia coli en agar Mac Conkey o EMB-Levine,realizar un reaislamiento de algunas colonias en TSA. Tomar colonias de este medio y realizaruna coloración de Gram, el test de catalasa, oxidasa y realizar el ensayo de IMViC (indol, rojode metilo-Voges Proskauer, citrato)Descripción de colonias típicas de Staphylococcus aureusMedio Descripción de colonias típicasAgar manitol sal Colonias amarillas rodeadas de un halo amarilloAgar Baird-Parker Colonias negras, brillantes rodeadas de un halo claroDescripción de colonias típicas de Pseudomonas aeruginosaMedio Descripción de colonias típicas Colonias castaño claro con pigmento verde-azulado queAgar cetrimida fluoresce al UV y difunde al medio.Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 6 de 110
  8. 8. Descripción de colonias típicas de Escherichia coliMedio Descripción de colonias típicas Colonias rojas habitualmente con halo de bilisagar Mac Conkey precipitada Colonias negras habitualmente con brillo metálicoagar EMB (Levine) verdoso bajo luz reflejadaPruebas para Staphylococcus aureusColoración de Gram: cocos positivos en racimosFermentación de manitol: positivaCatalasa: positivaCoagulasa o DNAsa: positivaPruebas para Pseudomonas aeruginosaColoración de Gram: bacilos negativosOxidasa: positivaCatalasa: positivaCrecimiento a 42 ºC: positivoKing A: pigmento azuladoPruebas para Escherichia coliColoración de Gram: bacilos negativos cortos o cocobacilosOxidasa: negativaCatalasa: positivaOF glucosa: fermentativoIndol: Positivo o negativoRojo metilo: positivoVoges Proskauer: negativoCitrato: negativo5.2 - Salmonella spp.5.2.1 Pipetear 0,1 mL del TSB previamente incubado durante 18 a 24 h a un tubo con 10 mL decaldo Rappaport-Vassiliadis y 1 mL a un tubo con 10 mL de caldo tetrationato.5.2.2 Incubar ambos tubos a 35 ± 1 ºC (el caldo Rappaport-Vassiliadis puede incubarse a 41,5 ±1 ºC) por no más de 24 h.5.2.3 De ambos tubos realizar aislamiento a XLD (agar xilosa lisina desoxicolato) y a por lomenos uno de los siguientes medios sólidos en placa: VB (agar verde brillante) y SS (agarSalmonella Shigella).5.2.4 Incubar las placas a 35 ± 2 ºC durante 24 a 48 h y examinar el desarrollo de coloniastípicas.5.2.5 Si no existen colonias típicas, la muestra cumple la exigencia de ausencia de Salmonellaspp. Si aparecen colonias típicas en alguno de los medios, realizar un reaislamiento de algunascolonias en TSA. Tomar colonias de este medio y realizar luego la coloración de Gram, el ensayoCurso práctico Microbiología General 2009 Pág. 7 de 110
  9. 9. de oxidasa, catalasa, TSI, lisina de Möeller (o LIA) y ureasa (o fenilalanina). Realizar unaidentificación mas completa con sistemas de identificación apropiados y confirmar con el usode antisueros polivalentes de Salmonella.Descripción de colonias típicas de Salmonella spp*Medio Descripción de coloniasAgar xilosa lisina desoxicolato Colonias rojas con o sin centro negro Colonias blancas o rosadas, pequeñas, transparentes,Agar verde brillante con halo rojizoAgar Salmonella Shigella Colonias incoloras o castañas con o sin centro negro*algunas cepas de Salmonella fermentadoras de lactosa pueden dar colonias concaracterísticas diferentes a las descritasPruebas para Salmonella sppColoración de Gram: bacilos negativos cortos o cocobacilosOxidasa: negativaCatalasa: positivaTSI: alcalino/ácido con o sin producción H2S, con o sin gasUreasa y fenilalanina: negativaLisina Möeller: positiva.LIA: pico alcalino/fondo alcalino con o sin producción de H2SCurso práctico Microbiología General 2009 Pág. 8 de 110
  10. 10. ESQUEMA DE BUSQUEDA DE SALMONELLA 10 g PRE- muestra ENRIQUECIMIENTO + TSB 35 ºC 24 h 0,1 mL 1 mL Caldo Caldo ENRIQUECIMIENTO Rappaport tetrationato SELECTIVO 41,5 ºC 35 ºC 24 h 24 h Agar VB Agar XLD 35 ºC 35 ºC 24 h 24 h AISLAMIENTO SELECTIVO Colonias no típicas Colonias típicas AUSENCIA de Reaislamiento de Salmonella sp en varias colonias 10 g IDENTIFICACION Confirmación con pruebas bioquímicas y serológicasCurso práctico Microbiología General 2009 Pág. 9 de 110
  11. 11. RECUENTO DE HETEROTRÓFICOS POR EL MÉTODO DE MEMBRANA FILTRANTE1 - Definiciones1.1 Bacterias heterotróficas. Se considera a las bacterias aerobias y anaerobias facultativas,mesófilas y psicrotróficas, capaces de crecer en un medio de agar nutritivo.1.2 Filtro de membrana. Es un elemento de filtración, delgado, no fibroso, para líquidos y gases,de acetato o nitrato de celulosa que tiene un tamaño de poro medio de 0,45 micras dediámetro, en donde las partículas de mayor tamaño que el del poro son retenidas sobre lasuperficie cuando se aplica succión o presión. No debe contener sustancias inhibitorios delcrecimiento bacteriano.2 - Procedimiento2.1 Agitar vigorosamente la muestra con cuidado de no volcar.2.2 Pipetear 1 mL de la muestra y diluir en 9,0 mL de suero fisiológico (SF) u otro diluyenteapropiado (dilución 1/10 o 10-1).2.3 Pipetear 1 mL de la dilución resultante en un frasco con 10 a 50 mL de suero fisiológico, demanera de mojar toda la superficie de la membrana.2.4 Filtrar el total del volumen resultante (correspondiente a 0,1 mL de la muestra original) porembudo de filtración equipado con filtro de membrana estéril bajo vacío parcial.2.5 Enjuagar el embudo con tres porciones de 50 mL de suero fisiológico.2.6 Colocar la membrana cuidadosamente sobre el medio sólido en placa de Petri (PCA o TSA),evitando la formación de burbujas.2.7 Incubar a 35 ± 2 ºC por 48 h.2.8 Contar las colonias en los filtros de membrana. La densidad óptima de colonias por filtro esentre 20 y 200.Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 10 de 110
  12. 12. RECUENTO DE COLIFORMES FECALES EN AGUA DE PLAYA POR NMP.1 - Ensayo presuntivo de coliformes totales1.1 Colocar en una gradilla nueve tubos con medio caldo lauril triptosa (CLT) simpleconcentración con campana de Durham, para hacer la serie (3-3-3).1.2 Agitar vigorosamente la muestra con cuidado de no volcar.1.3 Pipetear 1 mL de la muestra y diluir en 9,0 mL de suero fisiológico (SF) u otro diluyenteapropiado (dilución 1/10 o 10-1).1.4 Con una pipeta de 1 ó 2 mL sembrar 1 mL de la muestra en cada uno de tres tubos con mediode simple concentración (primera serie), 0,1 mL de la muestra (o 1 mL de la dilución 1/10) enotros tres tubos (segunda serie) y 0,1 mL de la dilución 1/10 (equivalente a 0,01 mL de lamuestra) en otros tres tubos (tercer serie). Rotular adecuadamente los tubos con la diluciónsembrada1.5 Mezclar la muestra con el medio mediante agitación suave.1.6 Incubar los tubos a 35 ± 0,5 ºC. Luego de 24 ± 2 h agitar los tubos suavemente y observar.1.7 Considerar tubos positivos presuntivos a los que presentan turbidez debida debido alcrecimiento bacteriano y gas en la campana.1.8 Reincubar aquellos tubos que no muestran esos cambios y reexaminar luego de otras 24 h.2 - Ensayo de coliformes fecales2.1 Subcultivar con un ansa de cada tubo positivo presuntivo de coliformes totales a un tubocon caldo EC con campana de Durham. Rotular adecuadamente los tubos de caldo EC.2.2 Incubar en baño de agua a 44,5 ± 0,2 ºC por 24 ± 2 h.2.3 Considerar tubos positivos a los que presentan crecimiento y producción de gas a las 24 h.2.4 Calcular el valor de NMP de coliformes fecales a partir del número de tubos positivos delmedio EC.RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN AGUA POTABLE POR NMP.1 - Ensayo presuntivo de coliformes totales1.1 Colocar en una gradilla tres tubos con medio CLT doble concentración, y seis tubos conmedio CLT simple concentración, para hacer la serie (3-3-3). Todos los tubos deben tenercampana de Durham.1.2 Agitar vigorosamente la muestra con cuidado de no volcar.1.3 Con una pipeta de 10 mL estéril sembrar 10 mL de la muestra en cada uno de los tres tuboscon medio de doble concentración.1.4 Con una pipeta de 1 ó 2 mL sembrar 1 mL de la muestra en tres tubos con medio de simpleconcentración y 0,1 mL de la muestra en los otros tres tubos. Rotular adecuadamente lostubos.1.5 Mezclar la muestra con el medio mediante agitación suave.1.6 Incubar los tubos a 35 ± 0,5 ºC. Luego de 24 ± 2 h agitar los tubos suavemente y observar.Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 11 de 110
  13. 13. 1.7 Considerar tubos positivos presuntivos a los que presentan turbidez debida debido alcrecimiento bacteriano y gas en la campana.1.8 Reincubar aquellos tubos que no muestran esos cambios y reexaminar luego de otras 24 h.2 - Ensayo confirmativo de coliformes totales2.1 Someter a la prueba confirmativa todos los tubos que a las 24 ó 48 h presenten reacciónpositiva presuntiva. Si esta reacción positiva aparece a las 24 h, es conveniente pasar a laconfirmación sin dejar transcurrir las 48 h.2.2 Agitar suavemente los tubos.2.3 Subcultivar por medio de un ansa de cada tubo con resultado positivo presuntivo a un tubocon medio caldo lactosa bilis verde brillante (CLBVB) con campana de Durham. Rotular todoslos tubos adecuadamente.2.4 Incubar los tubos de CLBVB por 48 ± 3 h a 35 ± 0,5 ºC.2.5 La producción de gas constituye un resultado positivo confirmado.2.6 Calcular el valor de NMP de coliformes totales confirmados a partir del número de tubospositivos del medio CLBVB.3 - Ensayo de coliformes fecales3.1 Subcultivar con un ansa de cada tubo positivo presuntivo de coliformes totales a un tubocon caldo EC con campana de Durham. Rotular adecuadamente los tubos de caldo EC.3.2 Incubar en baño de agua a 44,5 ± 0,2 ºC por 24 ± 2 h.3.3 Considerar tubos positivos a los que presentan producción de gas a las 24 h.3.4 Calcular el valor de NMP de coliformes fecales a partir del número de tubos positivos delmedio EC.Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 12 de 110
  14. 14. COMPOSICIÓN DE MEDIOS A EMPLEARSUERO FISIOLÓGICOCloruro de sodio 8,5 gAgua 1LTSA (agar tripticasa soja)Digerido Pancreático de Caseína 15,0 gDigerido Papaínico de Harina de Soja 5,0 gCloruro de Sodio 5,0 gAgar 15,0 gAgua 1LTSB (caldo tripticasa soja)Digerido Pancreático de Caseína 17,0 gDigerido Papaínico de Harina de Soja 3,0 gCloruro de Sodio 5,0 gFosfato Dibásico de Potasio 2,5 gGlucosa 2,5 gAgua 1LSDA (agar Sabouraud glucosado)Glucosa 40 gDigerido péptico de tejido animal 5gDigerido pancreático de caseína 5gAgar 15 gAgua 1LAgregar antes de esterilizar 50 mg de cloranfenicol por litro de mediopH después de la esterilización: 5,6 ± 0,2.ALRF (Agar Rojo Fenol Base + lactosa)Digerido pancreático de caseína 10 gCloruro de Sodio 5,0 gAgar 15 gRojo Fenol 0,018 gLactosa 10 gAgua 1LpH final: 7,4 ± 0,2VRBGA (violet red bile glucose agar)Peptona 7,0 gExtracto levadura 3,0 gCloruro de sodio 5,0 gSales biliares 1,5 gGlucosa 10,0 gRojo neutro 0,03 gCristal violeta 2 mgAgar 15,0 gAgua 1LCurso práctico Microbiología General 2009 Pág. 13 de 110
  15. 15. AGAR BAIRD PARKERDigerido Pancreático de Caseína 10,0 gExtracto de Carne Vacuna 5,0 gExtracto de Levadura 1,0 gCloruro de Litio 5,0 gAgar 20,0 gGlicina 12,0 gPiruvato de Sodio 10,0 gAgua 1LEsterilizar y dejar enfriar a una temperatura entre 45° y 50 °C. Agregar 10 mL de solución estéril de telurito depotasio (1 en 100) y 50 mL de emulsión de yema de huevo. MezclarMSA (agar manitol sal)Digerido Pancreático de Caseína 5,0 gDigerido Péptico de Tejido Animal 5,0 gExtracto de Carne Vacuna 1,0 gD-Manitol 10,0 gRojo de Fenol 25 mgCloruro de Sodio 75,0 gAgar 15,0 gAgua 1LAGAR CETRIMIDADigerido Pancreático de Gelatina 20,0 gCloruro de Magnesio 1,4 gSulfato de Potasio 10,0 gBromuro de Cetiltrimetilamonio (Cetrimida) 0,3 gGlicerina 10 mLAgar 13,6 gAgua 1LEMB LEVINE (agar eosina azul de metileno Levine)Digerido Pancreático de Gelatina 10,0 gFosfato Dibásico de Potasio 2,0 gLactosa 10,0 gEosina Y 400 mgAzul de Metileno 65 mgAgar 15,0 gAgua 1LAGAR MAC CONKEYDigerido Pancreático de Gelatina 17,0 gDigerido Pancreático de Caseína 1,5 gDigerido Péptico de Tejido Animal 1,5 gLactosa 10,0 gRojo Neutro 30 mgMezcla de Sales Biliares 1,5 gCloruro de Sodio 5,0 gCristal Violeta 1,0 mgAgar 13,5 gAgua 1LCurso práctico Microbiología General 2009 Pág. 14 de 110
  16. 16. CALDO RAPPAPORT-VASSILIADISPeptona de soja 4,5 gCloruro de magnesio hexahidratado 29,0 gCloruro de sodio 8,0 gFosfato dibásico de potasio 0,4 gFosfato monobásico de potasio 0,6 gVerde de malaquita 0,036 gAgua 1LCALDO TETRATIONATODigerido Pancreático de Caseína 2,5 gDigerido Péptico de Tejido Animal 2,5 gSales Biliares 1,0 gCarbonato de Calcio 10,0 gTiosulfato de Sodio 30,0 gAgua 1LCalentar la solución de los sólidos a ebullición. En el día de su utilización, agregar una solución de 5 g de yoduro depotasio y 6 g de yodo en 20 mL de agua. A continuación, agregar 10 mL de una solución de verde brillante (1 en 1000) ymezclar. No se debe calentar el medio después de agregar la solución de verde brillante.AGAR XLD (agar xilosa lisina desoxicolato)L-Lisina 5,0 gXilosa 3,5 gLactosa 7,5 gSacarosa 7,5 gRojo de Fenol 80 mgCloruro de Sodio 5,0 gExtracto de Levadura 3,0 gDesoxicolato de Sodio 2,5 gTiosulfato de Sodio 6,8 gCitrato Férrico Amónico 800 mgAgar 13,5 gAgua 1LpH final: 7,6 ± 0,2AGAR SALMONELLA SHIGELLAExtracto de carne 5,0 gPeptona 5,0 gLactosa 10,0 gSales biliares 8,5 gCitrato de sodio 8,5 gTiosulfato de sodio 8,5 gCitrato férrico 1,0 gVerde brillante 0,33 mgRojo neutro 25 mgAgar 13,5 gAgua 1LCurso práctico Microbiología General 2009 Pág. 15 de 110
  17. 17. AGAR VERDE BRILLANTEExtracto de Levadura 3,0 gDigerido Péptico de Tejido Animal 5,0 gDigerido Pancre tico de Caseína 5,0 gLactosa 10,0 gCloruro de Sodio 5,0 gSacarosa 10,0 gRojo de Fenol 80 mgAgar 20 gVerde Brillante 12,5 mgAgua 1LCLT (caldo lauril sulfato triptosa)Triptosa 20,0 gLactosa 5,0 gFosfato dipotásico 2,75 gFosfato monopotásico 2,75 gCloruro de sodio 5,0 gLauril sulfato de sodio 0,1 gAgua 1LCLBVB (caldo lactosa bilis verde brillante)Peptona 10,0 gBilis vacuna 20,0 gLactosa 10,0 gVerde brillante 13,3 mgAgua 1LCaldo ECTriptosa 20,0 gLactosa 5,0 gFosfato dipotásico 4,0 gFosfato monopotásico 1,5 gCloruro de sodio 5,0 gSales biliares 1,5 gAgua 1LPCA (agar para recuento en placa)Triptona 5,0 gExtracto de levadura 2,5 gGlucosa 1,0 gAgar 15,0 gCurso práctico Microbiología General 2009 Pág. 16 de 110
  18. 18. TERCER CICLODurante el tercer ciclo (2 clases) se hará el estudio de agentes físicos, químicos y biológicossobre los m.o.OBJETIVOS:Al finalizar el ciclo el estudiante debe ser capaz de:1) Diseñar un ensayo para evaluar la acción de un agente antimicrobiano2) Comprender el uso de la escala de Mac Farland3) Calcular el tiempo de reducción decimal de un agente antimicrobiano4) Calcular la CIM de un antibiótico para una cepa dadaClase Trabajo experimental Material a estudiar Curva de muerte de E. coli a 63 °C. Cálculo de D. Recuentos: determinación de la masa celular, Evaluación de desinfectantes. Ensayo de difusión de turbidimetría, escala de Mac Farland.1 antibióticos y extractos. Control del crecimiento microbiano. Agentes Calcular la CIM para un antibiótico y una cepa dadas físicos, químicos y biológicos2 Lectura y discusión de resultadosESTUDIO DE AGENTESSe evaluará el calor como agente físico frente a una cepa de E. coli. Se realizará el cálculo deltiempo de reducción decimal en suero fisiológico a 63 °C.Se evaluará la acción del hipoclorito (250 ppm u otras) con y sin sustancias interferentes y deletanol 70% sobre una cepa de Staphylococcus aureus, según la norma europea (modificada)EN 1276:1997: “Antisépticos y desinfectantes químicos. Ensayo cuantitativo de suspensiónpara la evaluación de la actividad bactericida de los antisépticos y desinfectantes químicosutilizados en productos alimenticios, en la industria, en el hogar y en colectividad. Método deensayo y requisitos (fase 2, etapa 1)”. Según esta norma, un desinfectante debe ser capaz dereducir por lo menos en 5 órdenes la carga microbiana inicial, luego de 5 minutos de contacto a20 ºC. Para realizar el recuento después del contacto con el agente, es necesario eliminar todoefecto inhibidor del agente, ya que su presencia puede falsear el resultado. Para ello se puedenusar diferentes métodos: dilución, neutralización o filtración. Para el caso del hipoclorito seusará tiosulfato de sodio al 10% como neutralizante, para el caso del etanol se utilizaráfiltración por membrana para eliminar el agente.Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 17 de 110
  19. 19. 1 Agentes Físicos: calor1.1 Preparar una suspensión de Escherichia coli (ATCC 25922) en suero fisiológico, equivalenteal tubo Mac Farland N°4, a partir de un cultivo en tubo inclinado en TSA.1.2 Homogeneizar bien la suspensión en vortex.1.3 Sacar una alícuota y realizar las diluciones necesarias en suero fisiológico.1.4 Realizar el recuento en superficie en placas de TSA secas sembrando tres dilucionessucesivas. Extender con rastrillo estéril y dejar adsorber unos 15 min.1.5 Incubar durante 24 h a 35 ± 2 ºC.1.6 Colocar el resto de la suspensión en baño de agua a 63 °C. y comenzar a registrar el tiempotranscurrido.1.7 Extraer a distintos tiempos alícuotas de 1,5 mL a un tubo vacío estéril y enfriarinmediatamente en baño de hielo.1.8 Realizar el recuento de viables de las alícuotas extraídas a los distintos tiempos sembrandolas diluciones necesarias en superficie en placas de TSA. Extender con rastrillo estéril y dejaradsorber unos 15 min.1.9 Incubar durante 24 h a 35 ± 2 ºC.2.0 Construir tabla de Nº de m.o. sobrevivientes en función del tiempo y la correspondientegráfica de log Nº de sobrevivientes en función del tiempo.2.1 Calcular el valor D.Nota: sabiendo que el tiempo D a 63 ºC en TSB para E. coli ATCC 25922 es de 0,7 minutos,determinar los tiempos y las diluciones necesarias para construir la curva de muerte para elmismo m.o. en suero fisiológico.2 Evaluación de Desinfectantes2.1 Hipoclorito de sodio2.1.1 Preparar una suspensión de Staphylococcus aureus (ATCC 6538) en suero fisiológico,equivalente al tubo Mac Farland N°4, a partir de un cultivo en tubo inclinado de TSA.2.1.2 Homogeneizar bien en vortex.2.1.3 Tomar 1 mL de la suspensión de S. aureus en suero fisiológico y agregar a 9,0 mL de aguadestilada estéril. Esta suspensión es Ni. Realizar luego las diluciones necesarias en SF paraobtener el recuento en placa en TSA (incorporado). El recuento de esta suspensión Nirepresenta el valor a tiempo cero.2.1.4 Agregar 1,0 mL de agua destilada a un tubo con 8,0 mL de solución de hipoclorito de sodio250 ppm. Luego agregar 1 mL de la suspensión de S. aureus en suero fisiológico.2.1.5 Homogeneizar inmediatamente y dejar a una temperatura de 20 °C (ambiente) durante 5minutos. Esta suspensión es Nf.2.1.6 Tomar luego 1 mL de esta suspensión y agregar a un tubo conteniendo 9 mL de solución deneutralizante.2.1.7 Dejar durante 10 minutos, homogeneizar y sembrar 1 mL de esta suspensión en una placade Petri estéril.2.1.8 Agregar 20 mL de TSA fundido y termostatizado a 45 ºC.2.1.8 Comparar el resultado del recuento obtenido para Ni y Nf (luego del contacto durante 5minutos con el agente).Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 18 de 110
  20. 20. 2.2 Hipoclorito de sodio con sustancias interferentes2.2.1 Agregar 1,0 mL de sustancia interferente (p. ej. leche descremada diluida) a un tubo con8,0 mL de solución de hipoclorito de sodio 250 ppm (u otra concentración elegida).Homogeneizar bien.2.2.2 Agregar 1 mL de la suspensión de S. aureus preparada en 2.1.2 en suero fisiológico.Homogeneizar inmediatamente y dejar a una temperatura de 20 °C (ambiente) durante 5minutos.2.2.3 Tomar luego 1 mL de esta suspensión y agregar a un tubo conteniendo 9 mL de solución deneutralizante.2.2.4 Dejar durante 10 minutos, homogeneizar y sembrar 1 mL de esta suspensión en una placade Petri estéril.2.2.5 Agregar 20 mL de TSA fundido y termostatizado a 45 ºC.2.2.6 Comparar el resultado del recuento obtenido para el Ni tiempo cero (2.1.3) y Nf, luegode 5 minutos con el agente y la sustancia interferente. ESQUEMA PARA Susp Mac Farland N°4 HIPOCLORITO DE 1 mL 1 mL SODIO Ensayo Ni t=0 8 mL desinf + 1 mL 9 mL de agua agua (o sust. destilada interf.) 5 min. 1 mL Nf t=5 min 1 mL Diluciones en SF 9 mL neutralizante 1 mL Recuento en Recuento en placa TSA placa TSACalcular el efecto de reducción decimal o efecto germicida EG: Log Ni – Log Nfdonde Ni es el resultado del recuento obtenido para el Ni a tiempo cero (1/10 del valor de lasuspensión McFarland Nº4) y Nf es el resultado del recuento obtenido en la suspensión luegodel contacto con el agente (calcular el recuento en contacto con el agente corrigiendo según lasdiluciones sembradas).Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 19 de 110
  21. 21. 2.3 Etanol2.3.1 Preparar una suspensión de Staphylococcus aureus (ATCC 6538) en suero fisiológico,equivalente al tubo Mac Farland N°4, a partir de un cultivo en tubo inclinado de TSA.2.3.2 Homogeneizar bien en vortex.2.3.3 Tomar 1 mL de la suspensión de S. aureus en suero fisiológico y agregar a 9,0 mL de aguadestilada estéril. Esta suspensión es Ni. Realizar luego las diluciones necesarias en SF paraobtener el recuento en placa en TSA (incorporado). El recuento de esta suspensión Nirepresenta el valor a tiempo cero.2.3.4 Agregar 1,0 mL de agua destilada a un tubo con 8,0 mL de solución de etanol al 70% (uotra concentración). Luego agregar 1 mL de la suspensión de S. aureus en suero fisiológico.2.3.5 Homogeneizar inmediatamente y dejar a una temperatura de 20 °C (ambiente) durante 5minutos. Esta suspensión es Nf.2.3.6 Tomar inmediatamente 1 mL de esta suspensión y agregar a 50 mL de suero fisiológico2.3.7 Homogeneizar y filtrar 5 mL mediante embudo con membrana aplicando vacío.2.3.8 Enjuagar la membrana con dos porciones de 50 mL de suero fisiológico2.3.9 Colocar la membrana sobre placa de TSA.2.3.10 Incubar a 35 ± 2 ºC por 48 h.2.3.11 Comparar el resultado del recuento obtenido para el Ni tiempo cero (2.3.3) y Nf, luegode 5 minutos en contacto con el agente. ESQUEMA Susp Mac Farland N°4 PARA ETANOL 1 mL 1 mL Ensayo Ni t=0 9 mL etanol 9 mL de agua destilada Nf t=5 min 5 min. 1 mL 1 mL Diluciones en SF 50 mL SF FILTRAR Y 5 mL ENJUAGAR Recuento en Recuento en placa TSA placa TSACalcular el efecto de reducción decimal o efecto germicida EG: Log Ni – Log NfCurso práctico Microbiología General 2009 Pág. 20 de 110
  22. 22. ControlesA) Efecto bactericida del neutralizanteTomar 1 mL de la suspensión Ni (preparada en 2.1.3) de S. aureus y agregar a 9,0 mL desolución neutralizante. Dejar 10 minutos a temperatura ambiente. Realizar el recuento de estasuspensión en TSA incorporado (realizar las diluciones adecuadas en SF). Verificar que lasolución neutralizante no ejerce efecto bactericida sobre la cepa ensayada.B) Validación de la neutralizaciónTomar 1 mL de agente desinfectante y agregar a 9 mL de solución neutralizante, mezclar bien.Tomar luego 0,1 mL de una dilución de la suspensión S. aureus (preparada en 2.1.1) deconcentración conocida (que contenga alrededor de 1000 células en el volumen a agregar) aesta solución. Dejar 10 minutos a temperatura ambiente. Sembrar 1 mL de esta suspensión enuna placa de Petri estéril y agregar 20 mL de TSA fundido y termostatizado a 45 ºC. Compararel resultado obtenido con el recuento de la suspensión conocida de S. aureus de alrededor de1000 células.Verificar que el neutralizante es efectivo para neutralizar el antiséptico a la concentraciónensayada.3 Evaluación de agentes biológicos3.1 Ensayos de difusión.3.1.1 Prepara una suspensión del m.o. ajustada al 0.5 de la escala de Mc Farland.3.1.2 Hisopar la superficie de dos placas de agar Mueller Hinton.3.1.3 Colocar cuidadosamente sobre la superficie de una placa -a una distancia de 1,5 mm entresí y del borde de la placa- discos de antibióticos de concentración conocida.3.1.4 Colocar sobre la superficie de la otra placa 4 cilindros de metal. Cargar los cilindros con100 μL de las soluciones de antibióticos y extractos.3.1.4 Incubar a 35 °C durante 18 a 20 h.3.1.5 Leer los halos de inhibición.3.2 Ensayo de dilución en medio líquido. Determinación de la concentración inhibitoria mínima.3.2.1 Preparar una suspensión del m.o. en un tubo conteniendo 4.5 mL de caldo Mueller Hinton,a partir de un cultivo de 18 h y ajustar la turbidez a 0,5 de Mac Farland.3.2.2 Realizar dos diluciones seriadas de 1: 10 en caldo Mueller Hinton (para alcanzar unaconcentración de 1 x 106 ufc/mL) (Inóculo).3.2.3 Transferir 1 mL de la suspensión bacteriana de 1x106 ufc/mL a cada uno de los tubosconteniendo 1mL de dilución del antibiótico y al tubo control. Rotular los tubos con laconcentración final de antibiótico.3.2.4 Incubar los tubos inoculados conteniendo las diferentes concentraciones de antibiótico yel tubo control de crecimiento a 35 ºC, durante 16-20 h.3.2.5 Determinar la C.I.M.Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 21 de 110
  23. 23. NORMAS BÁSICAS DE SEGURIDAD EN UN LABORATORIO DEMICROBIOLOGÍA1. Esta prohibido, comer, beber, fumar, tomar mate, almacenar alimentos, aplicarse cosméticos ycambiarse lentes de contacto en el área de trabajo. Los lentes de contacto solo se deben utilizarcuando no se puedan usar otro tipo de lentes.2. Está prohibido pipetear con la boca.3. Se debe lavar las manos al finalizar el trabajo de laboratorio y cada vez que se sospechecontacto con material contaminado.4. Se debe trabajar de manera tal de minimizar la creación de aerosoles.5. Se debe usar túnica y esta debe estar abrochada.6. El pelo largo se debe usar atado.7. Cuando sea necesario se debe usar lentes de seguridad para proteger la cara de salpicaduras,sustancias corrosivas, luz UV y otras radiaciones.8. El laboratorio se debe mantener ordenado y limpio. Se debe minimizar el material que no seapertinente al trabajo en las mesadas.9. Todo material contaminado se debe descontaminar antes de desechar.10. Las superficies de trabajo se deben limpiar y descontaminar con desinfectantes adecuados alfinal del trabajo y en caso de haberse volcado material contaminado.11. Todos los accidentes o vuelcos de material deben ser comunicados al docente encargado degrupo.Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 22 de 110
  24. 24. UTILIZACIÓN DEL MICROSCOPIO1. Colocar una preparación.2. Abrir el diafragma de la fuente de luz al máximo.3. Abrir el diafragma del condensador al máximo y llevar el condensador al máximo de sutrayectoria.4. Colocar el objetivo de menor aumento ej. 10x.5. Prender la fuente de luz y ajustarla a una intensidad confortable.6. Ajustar los binoculares a la distancia interpupilar y ajustar el foco de cada ocular si elmicroscopio lo permite.7. Enfocar la preparación.8. Gradualmente cerrar el diafragma de la fuente de luz hasta ver una imagen poligonal.9. Bajar el condensador hasta que los bordes del polígono se vean nítidos.10. Ajustar el enfoque.11. Si la imagen poligonal no está en el centro, centrarla utilizando los tornillos del condensador.12. Abrir el diafragma de la fuente de luz hasta que la poligonal apenas salga del campo, no tocarlomás. No tocar más la altura del condensador.13. Elegir el contraste óptimo ajustando el diafragma del condensador.14. Verificar la iluminación quitando los oculares y mirando por el tubo hacia los objetivos ajustar eldiafragma a 2/3 abierto (2/3 del campo iluminado).15. Para cambiar el contraste regular el diafragma del condensador y para ajustar el brillo modificarla intensidad de la fuente luminosa o colocar filtros. No cambiar la distancia del condensador.Al cambiar de objetivo solo modificar el diafragma de la fuente de luz y el diafragma delcondensador a la apertura del objetivo.MANTENIMIENTO DEL MICROSCOPIO DIARIO (cada vez que se usa)Limpiar el aceite de inmersión de lentes y otras superficies del microscopio con papel tissue. Elaceite de inmersión debe conservarse cerrado.Apagar la fuente de luz del microscopioCubrir el microscopio con su funda.Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 23 de 110
  25. 25. CITOLOGÍA Y MORFOLOGÍA DE BACTERIASLas bacterias, junto con los protozoarios, algas microscópicas, hongos microscópicos (incluyendolevaduras) y virus, constituyen los llamados microorganismos (m.o.). El término microorganismo notiene un significado taxonómico preciso sino que agrupa a todos los organismos de dimensionesmicroscópicas (< 0,1 mm) aunque presenten grandes diferencias entre sí. Por ejemplo incluyeorganismos procariotas (bacterias), eucariotas (hongos, protozoarios, algas) y virus. Tambiéndifieren notablemente en el tamaño aunque sean todos microscópicos. En una escala comparativatenemos:Protozoarios > levaduras > bacterias > virusAunque existen miles de especies de bacterias diferentes, los organismos individuales presentanuna de las tres formas generales siguientes: • elipsoidal o esférica • cilíndrica o en forma de bastón • espiral o helicoidalLas bacterias esféricas o elipsoidales se denominan COCOS. Muchas bacterias con esta formapresentan modelos de agrupación que derivan de los diversos planos de división celular. Asítenemos:cocos en pares (diplococos), ej. Neisseriacocos en cadena, ej. Streptococcuscocos en racimo, ej. Staphylococcuscocos en tétradas, ej. Pediococcuscocos en cubos, ej. Sarcinacocos sin distribución especialLas células bacterianas cilíndricas se denominan BACILOS o BASTONES (rod en inglés) ypresentan otros modelos de agrupación. Así tenemos: • bastones en cadena, ej. Bacillus • bastones en letras chinas o empalizadas, ej. Corynebacterium • bastones sin distribución especialLas bacterias helicoidales se presentan en general como células individuales independientes; perolas células de las distintas especies presentan notables diferencias de longitud, número y amplitudde las espiras y rigidez de la pared.OBSERVACIÓN Y EXAMEN MICROSCÓPICOLa observación y examen de las bacterias se puede realizar de dos maneras fundamentales: • observando los microorganismos vivos sin teñir • observando las células fijadas, teñidas con colorantesLas bacterias vivas en suspensión acuosa tienen propiedades ópticas similares a las del agua y,por lo tanto, son difíciles de observar con el microscopio de campo claro debido a la falta decontraste con el medio que las rodea. Este contraste aumenta cuando se las tiñen con un coloranteadecuado. Sin embargo, para muchos fines es preferible evitar la coloración debido a que puedealterar la forma y además mata a las células.Si se quiere observar los m.o. vivos es conveniente usar un microscopio de campo de contraste defases o en su defecto un microscopio de campo claro con iluminación mínima. Ésta se lograbajando el condensador, minimizando la iluminación.Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 24 de 110
  26. 26. El movimiento de traslación de algunas bacterias puede observarse en preparaciones húmedas delmaterial, es decir con los m.o. vivos. Debe distinguirse claramente el movimiento independiente delas bacterias móviles del movimiento por arrastre por corrientes de convección y el movimientobrowniano. Cuando el movimiento se realice por propulsión flagelar, el tipo de movimiento variarácon la disposición de los flagelos en el cuerpo celular.La coloración de las bacterias tiene como fines: • poder visualizarlas para determinar morfología y tamaño. • diferenciar grupos bacterianos por su reacción frente a determinados colorantes. • revelar la presencia de distintas estructuras internas.Los colorantes utilizados son sales en las que el anión o el catión es el responsable del color; en elprimer caso se trata de un colorante ácido o aniónico y en el segundo, básico o catiónico. Cuandoel medio externo tiene un pH cercano a la neutralidad la célula bacteriana tiene una débil carganegativa. Como la diferencia de carga eléctrica es lo que determina la afinidad entre el colorante yla célula, las bacterias tendrán afinidad por los colorantes básicos (ej.: cristal violeta y azul demetileno).Cuando se utiliza un solo colorante básico, el método se denomina coloración simple, mientras quecuando se usan dos o más se llama coloración compuesta. La coloración diferencial es un casoparticular de coloración compuesta.Cuando a una preparación bacteriana se le aplica un colorante ácido tal como eosina, éste no seune a las células cargadas negativamente, pero si se deposita alrededor de ellas, quedando así unfondo coloreado donde contrastan las células incoloras. No es, por lo tanto, una verdadera tinción yse denomina tinción negativa o indirecta.En algunas ocasiones es necesario utilizar un mordiente, es decir, alguna sustancia que contribuyaa la fijación del colorante a la célula, por ejemplo: ácido tánico, sales de Al, Fe, etc.PREPARACIÓN DE UN FROTISComprende las siguientes etapas: 1) extendido del material en un portaobjetos 2) secado 3) fijaciónEl propósito de la fijación es matar los microorganismos, coagular el protoplasma de la célula yadherir la preparación al portaobjetos. Sin el proceso previo de fijación se lavaría la capa de célulasdurante el proceso de tinción.El agente fijador ideal preserva las estructuras de la célula con su forma y posición sin queaparezcan estructuras que no existían en la célula original. El calor es en general el método defijación mas utilizado para la observación de la morfología de células bacterianas. Cuando ademásde los microorganismos interesa la observación de células animales, se utiliza un método químicocomo la fijación por metanol y por formol, que altera menos que el calor la morfología de lascélulas.Coloración simpleConsiste en la aplicación de un colorante luego de fijada la preparación. Pueden emplearse lossiguientes colorantes básicos: azul de metileno, cristal violeta o fucsina fenicada. Estos presentandiferente afinidad por las bacterias y por ello los tiempos de aplicación serán distintos.Coloración de GramLos m.o. difieren física y químicamente entre sí y por eso reaccionan de una manera diferentefrente a un determinado proceso de tinción. Esto constituye el fundamento de las tincionesdiferenciales. La tinción de Gram, la más empleada en bacteriología, es una coloración diferencial.Por este método se clasifican las bacterias en dos grupos: Gram positivos (Gram +) y Gramnegativos (Gram –), en función de su reacción frente a la coloración.Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 25 de 110
  27. 27. Las células previamente fijadas se tiñen con solución de cristal violeta, se lavan y se tratan conlugol. El yodo del lugol forma un complejo con el cristal violeta que sirve para fijar éste a la célula.Luego se agrega un agente decolorante (alcohol, acetona o mezclas de ambos) en el cual elcomplejo yodo-cristal violeta es soluble.Algunos microorganismos son decolorados (los Gram –) mientras que otros no (los Gram +). Luegode la decoloración se aplica un colorante de contraste, generalmente safranina, que hace visibleslas bacterias Gram – que habían sido decoloradas. Las bacterias Gram + se ven de color azul-violeta y las Gram – se ven rosadas.Las bacterias Gram + poseen paredes gruesas de peptidoglicano, que cuando se deshidratan porel alcohol provoca que se cierren los poros de la pared, impidiendo que el complejo yodo-cristalvioleta se escape. En las bacterias Gram –, la fina capa de peptidoglicano no evita el pasaje delsolvente y el escape del complejo yodo-cristal violeta de la célula.Las levaduras, que poseen una pared celular gruesa pero de una composición química totalmentediferente, generalmente se tiñen como Gram +. En este caso no son los constituyentes químicos,sino la estructura física de la pared lo que le confiere su coloración como Gram +.Coloración de ácido resistentesLa tinción de ácido-resistentes es una tinción diferencial que demuestra la resistencia de la célula aser decolorada por los álcalis, ácidos y alcohol. En algunos microorganismos de los génerosMycobacterium y Actinomyces la propiedad ácido resistente está relacionada con su alto contenidoen lípidos.Coloración de estructurasEsporasCiertas especies bacterianas, en particular de los géneros Bacillus y Clostridium, producenelementos de resistencia denominados esporas o endoesporas debido a que se forman dentro dela célula, a razón de una por célula. A diferencia de la célula vegetativa que la produce, la esporaes muy resistente a condiciones adversas tales como alta temperatura, baja humedad, radiacionesy agentes químicos. Es una forma de vida latente que puede permanecer largos períodos como taly cuando desaparecen las condiciones adversas puede germinar. También puede inducirse esagerminación mediante, por ejemplo, un shock térmico, es decir un calentamiento a 80ºC.Las esporas son altamente impermeables a los colorantes, de manera que con las técnicas decoloración comunes aparecerán como regiones sin teñir dentro de las células coloreadas. Por lotanto, para teñir las esporas específicamente, deben usarse métodos de coloración especiales. Losdatos importantes que se obtienen como resultado de esta coloración son: • presencia o ausencia de esporas • deformación o no del cuerpo celular • posición dentro del cuerpo celularEn base a la posición de la espora dentro de la célula se las clasifica en: terminales, centrales ysubterminales (posición intermedia).FlagelosMuchas bacterias son móviles y su capacidad para moverse en forma independiente se debegeneralmente a la presencia de estructuras especiales, los flagelos. Son apéndices largos,delgados, de forma helicoidal, libres en un extremo y unidos a la célula por otro. Son tan delgadosque solo se pueden ver al microscopio común luego de una coloración especial que hace uso deun mordiente. Este promueve la fijación de las moléculas de colorante al flagelo dando lugar a laformación de un precipitado a lo largo del flagelo, haciéndolo visible.La célula bacteriana puede tener uno o más flagelos dispuestos en distinta manera y en base a esose clasifican en: polar (flagelo en un extremo del cuerpo celular), anfitrica (flagelos en ambosCurso práctico Microbiología General 2009 Pág. 26 de 110
  28. 28. extremos), lofotrica (penacho de flagelos en un extremo) y peritrica (flagelos alrededor de toda lacélula sin distribución).CápsulaCiertas bacterias segregan en su superficie materiales gomosos compuestos por polisacáridos,polipéptidos o complejos glucoproteicos. Cuando este material se dispone de una maneracompacta alrededor de la superficie celular se denomina cápsula. La mejor forma de observarla escon tinción negativa, aunque existen técnicas especiales, para la coloración específica de lacápsula.Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 27 de 110
  29. 29. TÉCNICASMANIPULACIÓN ASÉPTICA DE CULTIVOS • Tomar el tubo de cultivo con la mano izquierda, de modo que el fondo del tubo toque la palma de la mano y probar (con la mano derecha) que el tapón esté libre, girándolo sin destapar. • Tomar el ansa con la mano derecha, con los dedos pulgar, índice y mayor, dejando libres el anular y el meñique. Quemar el ansa introduciendo la punta en el cono frío de la llama del mechero, en posición vertical y luego ir levantándola hasta que quede toda al rojo. • Pasar el ansa por la llama en un ángulo de 60º con la vertical, manteniéndola siempre en posición paralela al cuerpo. • Flamear el metal adyacente al ansa. • Trabajando cerca del mechero, tomar el tapón de algodón del tubo con los dedos anular y meñique de la mano derecha y quitarlo girando el tubo; flamear la boca del tubo. • Introducir el ansa tocando la pared fría dentro del tubo (sin soltar el tapón de algodón) para que se enfríe el ansa y luego introducirla en el cultivo líquido o deslizarla sobre la superficie del cultivo sólido de abajo hacia arriba, para tomar las células a transferir (inóculo). • Sacar el ansa así cargada del tubo, flamear la boca del tubo y taparlo. Transferir el inóculo, ya sea a un portaobjetos para hacer un frotis o a otro medio de cultivo. Quemar nuevamente el ansa.Siempre que se vaya a tomar una muestra de un cultivo con cualquier finalidad debe procedersesegún técnica aséptica descrita, con el fin de no introducir contaminación en el cultivo o en lamuestra.OBSERVACIÓN DE UN PREPARADO FRESCO (para observar movilidad, forma, etc)Método de la gota pendienteColocar una gota de muestra usando técnica aséptica en el centro de un cubreobjetos limpio.Invertirlo cuidadosamente y colocarlo sobre la depresión de una lámina excavada, de manera queno deslice la gota por el cubreobjeto. La gota no debe tocar el fondo de la depresión.Aplicar unas gotas de agua a los bordes del cubre para sellarlo y mantenerlo en su lugar. Observarcon el lente seco de mayor aumento.Método de lámina-laminillaColocar una gota de la muestra usando técnica aséptica sobre un portaobjetos limpio y cubrir conun cubreobjetos. Para prevenir las corrientes de convección y el secado de la preparación, sepuede sellar poniendo en los bordes del cubreobjetos vaselina sólida o esmalte de uñas. Observarigual que el anterior. En caso de disponer de microscopio de contraste de fases la visión es muchomejor.PREPARACIÓN DE UN FROTIS1) Colocar con un ansa una gota de muestra -si es líquida- sobre un portaobjetos limpio. Si lamuestra proviene de un cultivo en medio sólido, colocar primero una gota de agua sobre el porta,tomar la muestra con el ansa, tocar la gota, quemar el ansa y luego de enfriada, mezclar bien conel agua para lograr una suspensión homogénea.Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 28 de 110
  30. 30. 2) Secar al aire. Puede acelerarse el secado, manteniendo la lámina encima de la llama delmechero a 15 cm o más de distancia.3) Fijar. Con el frotis seco, pasar el porta tres veces por la llama del mechero para fijar.Coloración simplePreparar un frotis según la técnica habitual antes descrita. Colocar el porta sobre un soporte paratinciones. Cubrir la preparación con 2 o 3 gotas de solución de azul de metileno o de cristal violetay dejar 1 minuto. Lavar con agua. Secar encima de la llama del mechero. Observar al microscopiocon lente de inmersión (100x) y determinar forma, disposición y relación de tamaños de lasdistintas bacterias.Coloración de Gram (Técnica de Hucker)Preparar un frotis según la técnica antes descrita. Colocar el porta sobre un soporte para tinciones.Cubrir con solución de cristal violeta y dejar actuar 1 min. Lavar suavemente con agua de la canilla.Cubrir con lugol y dejar actuar 1 min. Lavar de la misma manera. Cubrir con etanol 95% y dejar 30seg. moviendo suavemente la lámina. Seguir lavando con etanol hasta que este no arrastre máscolorante. Lavar con agua. Cubrir con solución de safranina y dejar 15 seg. Lavar y secar.Observar por inmersión. Las bacterias Gram + se verán de color azul-violeta y las Gram - rosadas.Coloración de esporasPreparar un frotis pasando 10 veces por la llama para fijar. Colocar la lámina sobre una planchapara tinciones. Cubrir con pequeños trozos de papel de filtro, impregnar éstos con solución deverde de malaquita y calentar durante 5 min. con el mechero. Mantener el papel siempre saturadocon verde de malaquita mediante agregado de solución. Lavar suave pero abundantemente conagua. Dar contraste con solución de safranina durante 30 s. Lavar con agua y secar. Observar porinmersión.Se verán las esporas verdes y los cuerpos celulares rosados. Si se dispone de un microscopio concontraste de fases, se puede observar la endospora sin teñir como una estructura densa, blancadentro de la célula.MICROSCOPIA DE FLUORESCENCIALa microscopía de fluorescencia se basa en los mismos principios de óptica que la microscopíacomún, con diferencias en el manejo y el diseño relacionadas con la generación y transmisión delongitudes de onda adecuadas a los fluorocromos que se quieren visualizar, ya sean propios de lamuestra o de la coloración utilizada.Los procesos de excitación generalmente requieren longitudes de onda cortas, en el UV cercano(lámpara de halógeno-cuarzo, arcos de mercurio, etc.). Las lentes deben ser de algún material(generalmente fluorita) que transmita esas longitudes de onda y el aceite de inmersión de ser nofluorescente.Se encuentran diversos ejemplos de fluorocromos naturales tales como algunas vitaminas,esteroides, porfirinas, etc. Un ejemplo de estudio de bacterias por visualización directa defluorocromos naturales es la observación de bacterias metanogénicas con luz UV. Estas fluorescencon luz UV en preparaciones sin coloración debido al la presencia de coenzimas fluorescentes F420 y F 350, relacionadas con el metabolismo del C y la metanogénesis.Otros compuestos que fluorescen (rodamina, auramina, fluoresceína, colorantes de acridina) seutilizan en distintas técnicas de tinción; por ejemplo la tinción de microorganismos ácido-resistentescon auramina-rodamina en muestras de tejido y esputo.También se utilizan las técnicas de inmunofluorescencia que consiste en la aplicación a la muestra,de una solución de un anticuerpo marcado con una sustancia fluorescente; si la muestra tiene elantígeno que se busca, este reaccionará y así se localizará. Tal es el caso, por ejemplo, de ladetección de Salmonella con anticuerpos marcados con fluoresceína.Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 29 de 110
  31. 31. CITOLOGIA Y MORFOLOGIA DE HONGOSINTRODUCCIÓNLos hongos constituyen un grupo muy heterogéneo de organismos eucariotas, heterótrofos nofotosintéticos y con pared celular. Basándose en la apariencia macroscópica de la colonia sepueden diferenciar dos tipos de hongos: si producen colonias opacas, cremosas o pastosas sedenominan levaduras; si producen crecimientos aéreos, velludos, algodonosos o pulverulentos sellaman hongos filamentosos o mohos.Existe un tercer grupo que se desarrolla como levaduras cuando crece a 37ºC y como hongofilamentoso a 25ºC. Este fenómeno se denomina dimorfismo.El conjunto de elementos que constituyen un hongo se denomina talo. El talo puede ser unicelular(en levaduras). En hongos filamentosos el talo incluye una parte vegetativa, el micelio, compuestopor hifas y una parte reproductora.Las hifas son tubos que contienen núcleos y citoplasma. Pueden presentar septos (miceliotabicado) (fig.1) o no (micelio no tabicado) (fig.2).Los septos presentan poros que conectan los distintos segmentos de la hifa. A veces las levadurasconstituyen cadenas de células denominadas pseudomicelio (fig.3).Pueden existir elementos de resistencia como los esclerotes que son masas endurecidas demicelio presentes en algunos géneros de Ascomycetes y Basidiomycetes.Los hongos se pueden reproducir asexuada y sexualmente. En algunas especies coexisten las dosformas de reproducción en el mismo organismo que se denomina entonces holomorfo. Elholomorfo tiene a la vez una forma de multiplicación asexuada, el anamorfo o estado imperfecto yuna sexuada, el teleomorfo o estado perfecto.La reproducción asexuada puede ocurrir por propagación vegetativa a partir de fragmentos demicelio, o por formación de esporas de distinto tipo (conidios, esporangiosporas, etc.).La reproducción sexuada se caracteriza por la unión de dos núcleos que dan lugar a esporassexuadas (zigosporas, ascosporas, etc.).Los hongos pueden ser homotálicos si poseen en el mismo micelio núcleos complementarios quepueden conjugarse o heterotálicos cuando requieren núcleos provenientes de micelios diferentes.En general la reproducción asexuada es más importante para la propagación de la especie. Enmuchos hongos la reproducción sexuada se da solo una vez al año. Hay un grupo de hongos a losque no se les conoce reproducción sexuada. Existe otro grupo que no forma esporas de ningúntipo y solo se reproduce por fragmentación del micelio.ZYGOMYCETESEstructuraHongos filamentosos con micelio no tabicado, cenocítico. Pueden presentar órganos de fijación:rizoides, típicos de Rhizopus.ReproducciónASEXUADA:Clamidosporas: células vegetativas que se rodean de una pared gruesa constituyendo a la vezelementos de resistencia (fig.4) y que luego dan origen al micelio.Esporangiosporas: esporas producidas endógenamente dentro de un esporangio. A veces, comoen Mucor sp., el esporangio puede presentar una columela (fig. 5). La columela es una vesícula oparte central del esporangio que es continua con el esporangióforo (hifa que genera el esporangio).SEXUADA:Zigotes o zygosporas: cuerpos marrones o negros, con paredes gruesas que frecuentemente estácubierto por espinas, que son formados por la fusión de dos gametangios (fig. 6).Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 30 de 110
  32. 32. Ej.: zigote heterotálico: Absidia coerula, zigote homotálico: Mucor baciliformisASCOMYCETESEstructuraHongos filamentosos con micelio tabicado y levaduras.ReproducciónASEXUADA:Gemación (o fisión ) en levaduras (fig.7). Conidios formados en conidióforoSEXUADA:Ascosporas contenidas en un asco que se forma frecuentemente por kariogamia de 2 núcleosdistintos. Generalmente se forman 8 aunque pueden formarse 2 o 4. Los ascos pueden estarincluídos o no dentro de un ascocarpo.GRUPO FORMAS DE REPRODUCCION Asexuada Sexuada Fig EjemploHemiascomycetes gemación Ascos sin ascocarpo 8 SaccharomycesEuascomycetes conidios Ascos cleistotecio 9 Emericella en peritecio 10 Sordaria ascocarpo apotecio 11 PyronemaBASIDIOMYCETESEstructuraHongos filamentosos con micelio tabicado y algunas levaduras.ReproducciónASEXUADA: crecimiento vegetativo, rara vez forman esporas.SEXUADA: basidiosporas formadas sobre basidios.DEUTEROMYCETES O FUNGI IMPERFECTIEstructuraHongos filamentosos con micelio tabicado y levaduras.Se agrupan aquí los hongos a los que no se les conoce forma de reproducción sexuada. Sepresume que éstos son estados no sexuados o anamorfos de Ascomycetes (o másraramente Basidiomycetes) cuyos estados sexuados o teleomorfos no han sido descubiertos.Si se observa el estado sexuado de una especie de Deuteromycetes, ambos estados se transfierenal grupo al que pertenece el teleomorfo.ReproducciónConidios formados en células especializadas, las células conidiógenas que pueden encontrarse enuna hifa especializada: el conidióforo.Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 31 de 110
  33. 33. La clasificación dentro de este grupo se basa en la observación del aparato conidiógeno. La formaen que se produzca la conidiogénesis dará lugar a la formación de conidios solitarios, en racimos oen cadenas.En algunos géneros las células conidiógenas no se diferencian del resto de la hifa, ej.:Aureobasidium (fig.12).En otros, las células conidiógenas se alargan denominándose fiálides, ej.: Penicillium (fig.13), seramifican, ej. Botrytis (fig.14), o el extremo se dilata, ej.: Aspergillus (fig.15).Algunos géneros forman artrosporas por fragmentación de la hifa, ej.: Geotrichum (fig.16) y otrosclamidosporas.Pueden ser unicelulares o contener dos o más células: macroconidias, ej. Alternaria (fig.17) oFusarium (fig. 18).Las células conidiógenas pueden estar contenidas dentro de pycnidios, ej.: Phoma, (fig.19). Lospycnidios son cuerpos de fructificación globosos, con forma de matraz y poseen una aperturaapical llamada ostioloPARTE PRÁCTICAEn la identificación de hongos filamentosos juega un rol muy importante las característicasmorfológicas macro y microscópicas.Observación microscópicaEl micelio se debe describir según: • su situación: aéreo (razante a la superficie o elevado) o profundo • su morfología: velludo, glabro, rugoso, etc. • su coloración • produzca o no pigmentos que difundan al medioSe debe tratar de observar las estructuras lo más intacta posible. Puede observarse directamente la placa de Petri con bajo aumento. Las preparaciones se hacenentre lámina y laminilla. Se coloca en un portaobjeto una gota de solución aclarante de KOH al 10% o de una solución colorante de azul de metileno. Se corta, con el ansa, una pequeña porción delmaterial a estudiar. Para disminuir el daño, se puede utilizar un trocito de cinta adhesiva que sepresiona suavemente sobre el cultivo. Se coloca el material o el trozo de cinta en la gota, se cubrecon un cubreobjeto y se presiona suavemente. Se observa con bajo aumento.BIBLIOGRAFIASamson, R.A and col.; "Introduction to Food-Borne Fungi",, 1995.Stanier and col.; The Microbial World, 5ta ed., Prentice-Hall, 1986, p.536-544.Lennette and col.; Manual of Clinical Microbiology, 4ta Ed., American Society for Microbiology, 1985,cap.46.Pelczar and Reid; Microbiology, McGraw-Hill Book Cy., 1972, caps.14 y 15.Guiraud, J. and Galzy, P.; Lanalyze microbiologique dans les industries alimentaires, Editions deLusine, 1981, cap.2.Alexopoulos,C.J. and Mims, W.; Introducción a la Micología, Ed. Universitaria de Buenos Aires,1977.Moore-Landecker, E.; Fundamentals of The Fungi, 2nd ed., Prentice-Hall, 1982.Pitt, J. & Hocking, A., Fungi and food spoilage, Academic Press, London, 1985FIGURAS DE HONGOSCurso práctico Microbiología General 2009 Pág. 32 de 110
  34. 34. Fig. 1 Fig. 2 Fig. 3 Micelio no tabicado Micelio tabicado Pseudomicelio Fig. 4 Clamidosporas Fig. 6 Zygote Fig. 5 Fig. 8 Fig. 7 Ascos desnudos Gemación Fig. 9 Cleistotecio Fig. 11 Fig. 10 Apotecio PeritecioCurso práctico Microbiología General 2009 Pág. 33 de 110
  35. 35. Fig. 12 Aureobasidium Fig. 13 Penicillium Fig. 14 Fig. 15 Fig. 16 Botrytis Aspergillus Geotrichum Fig. 18 Fusarium Fig. 19 Phoma Fig. 17 AlternariaCurso práctico Microbiología General 2009 Pág. 34 de 110
  36. 36. SIEMBRA Y AISLAMIENTO - BÚSQUEDASIEMBRASembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medioadecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. Luego de sembrado el medio de cultivo debeincubarse a una temperatura adecuada para el crecimiento de los m.o. La siembra puederealizarse en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando punta, ansa, hisopo o pipeta estéril.Cultivo en medio líquidoHabitualmente se realiza en tubos o en matraces. El crecimiento se puede manifestar por apariciónde turbidez, formación de velo o película o sedimento.Cultivo en medio sólidoPuede ser en tubos con medio sólido o placas.Tubos con agar inclinado. Para sembrarlos, se mueve el ansa o la punta suavemente sobre lasuperficie del agar con un movimiento en zigzag desde el fondo hasta la parte superior, cuidandode no dañar el agar.Tubos sin inclinar. Se siembran introduciendo una punta en el centro del agar. También se llamasiembra por picadura.Siembra en placas. Puede ser en superficie o incorporada.En superficie • Se colocan 0,1 mL de la dilución de la muestra con pipeta estéril en el centro de la placa, y se distribuye con un rastrillo estéril. • Se siembra con un ansa para aislar, como se explica más adelante. • Se siembra con un hisopo.Incorporada • Se coloca 1 mL de la muestra en una placa estéril vacía, en el centro de la misma. Sobre ella se agregan 20 mL de medio de cultivo sólido fundido y termostatizado a 45ºC; luego se mueve suavemente la placa para que la muestra se mezcle con el agar y se deja solidificar.En medio sólido cada célula viable dará origen a una colonia y por lo tanto la siembra en placas sepuede utilizar, no solo para cultivar microorganismos, sino además para contar y aislar.Cuando se quieren tener colonias aisladas a partir de un material determinado, puede sernecesario diluir la muestra con un diluyente estéril como suero fisiológico.AISLAMIENTOAislar es separar un microorganismo a partir de una población que los contiene de varios tipos. Enecosistemas naturales raramente encontramos a los microorganismos en cultivo puro o axénico (unsolo tipo de microorganismo), por lo tanto es necesario hacer algún procedimiento de aislamientopara separar los distintos tipos de microorganismos presentes para luego así poder identificarlos.El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra cuando el o losmicroorganismos están en una proporción adecuada.Para aislar se utiliza alguno de los siguientes procedimientos:a) aislamiento por estrías.b) aislamiento por diluciónCurso práctico Microbiología General 2009 Pág. 35 de 110
  37. 37. Aislamiento en placa por estríasExisten distintas técnicas, el objeto es obtener colonias aisladas.Consiste en cargar el ansa con la muestra y hacer estrías paralelas en lacuarta parte de la superficie de la placa; se quema el ansa, se enfría, segira la placa 90º y se vuelve a estriar tocando 3 o 4 veces el área sembradainicialmente y cubriendo otro cuarto de placa. Por último, sin quemar elansa, se estría el resto de la superficie sin sembrar.Aislamiento por dilución en medio sólidoSe emplean tanto el método de siembra incorporada como el de siembra en superficie. Suele sernecesario diluir la muestra usando suero fisiológico o algún otro diluyente.AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOSPara aislar microorganismos anaerobios que son rápidamente destruidos por exposición aloxígeno, las placas pueden ser preparadas en la forma usual, y luego de sembradas, incubadas enrecipientes cerrados en atmósfera sin oxígeno. También se puede sembrar diluciones en tubos conagar fundido y termostatizado que luego se tapan con una capa de vaselina-parafina para evitar elacceso de aire. Con anaerobios más sensibles al oxígeno, se trabaja en cámaras anaeróbicas, otambién usando la técnica del "roll-tube", que es un tubo en el que el agar se deposita en lasparedes al hacerlo girar mientras se enfría; se trabaja gaseando el tubo continuamente con gaslibre de oxígeno mientras el tubo está destapado.BÚSQUEDACuando el microorganismo que se desea aislar e identificar se encuentra en baja proporción enuna muestra, se lleva a cabo un procedimiento llamado búsqueda, que involucra una primera etapade aumento del número del tipo de microorganismo que se desea aislar. Luego se aísla por elmétodo de estrías o por dilución y se identifica.Una búsqueda generalmente implica los siguientes pasos: 1) enriquecimiento 2) aislamiento selectivo (medios selectivos y/o diferenciales) 3) reaislamiento (medio no selectivo) 4) identificaciónEl objetivo de la etapa de enriquecimiento es aumentar el número del microorganismo que sedesea determinar y en algunas ocasiones puede subdividirse en dos: preenriquecimiento yenriquecimiento selectivo. El preenriquecimiento o enriquecimiento no selectivo suele hacersesolamente cuando los microorganismos buscados están debilitados o dañados y se usan siempremedios nutrientes líquidos no selectivos. El enriquecimiento selectivo se realiza incubando lamuestra en medios líquidos selectivos, ya sea en presencia de agentes químicos o biológicos quesuprimen el crecimiento de otros m.o. no deseados y permiten el desarrollo en particular del o delos microorganismos buscados.Luego de cumplida la etapa de enriquecimiento se lleva a cabo la etapa de aislamiento, empleandola técnica de estrías en superficie en medios sólidos generalmente selectivos y diferenciales. Enestos medios deben examinarse las colonias típicas para el tipo de m.o. que estamos buscando.Las colonias deben describirse por examen macroscópico en función del tamaño, la forma, elborde, la elevación, la transparencia y el color. Esto resulta a veces muy útil en la identificación.En el caso de medios selectivos las colonias aisladas deben aislarse nuevamente en un medio noselectivo por el método de estrías. Esto se conoce como reaislamiento y es necesario paraasegurar la obtención de un CULTIVO PURO del microorganismo de interés, ya que en los mediosCurso práctico Microbiología General 2009 Pág. 36 de 110
  38. 38. de aislamiento selectivos puede ocurrir que una colonia característica del m.o. que estamosbuscando pueda contener como contaminantes –en muy bajo número- otros microorganismos queno hayan crecido en este medio por estar inhibidos, pero al subcultivarlos en condicionesfavorables puedan crecer. El examen microscópico de una colonia de un cultivo puro de unmicroorganismo debe mostrar células razonablemente semejantes respecto al Gram y a lamorfología. El informe de una búsqueda se hace siempre expresando PRESENCIA o AUSENCIAen los gramos o mL de muestra sembrados en la primera etapa del procedimiento(enriquecimiento).DESCRIPCIÓN DE COLONIAS DE BACTERIAS Y LEVADURASLas colonias de muchos m.o. se pueden describir teniendo en cuenta el tamaño, color, superficie,etc. Esta descripción no incluye hongos filamentosos.Tamaño:Grande: diámetro mayor a 1 mmMediana: diámetro aproximadamente igual a 1 mmPequeña: diámetro menor a 1 mmColorBlanco, Crema, Amarillo limón, Negro, etcSuperficieBrillante, Lisa, Granular, RugosaConsistenciaViscosa, Mantecosa, Friable (se disgrega al tocarla)Densidad (con luz a través de la colonia)Opaca, Transparente, TraslúcidaFORMA Puntiforme Circular Filamentosa Irregular Rizoide LanceoladaELEVACIÓN Chata Elevada Convexa Cúpula Umbonada UmbilicadaMARGEN Entero Ondulado Lobado Ondeado FilamentosoCurso práctico Microbiología General 2009 Pág. 37 de 110
  39. 39. MEDIOS DE CULTIVOGENERALIDADESSi se desea recuperar determinados m.o. de sus ecosistemas naturales (agua, tierra, alimentos,etc.) puede recrearse en el laboratorio un medio ambiente artificial que favorezca el crecimiento deellos frente a otros m.o. que los acompañen en ese ecosistema. Se puede emplear un medio decultivo y condiciones de incubación (atmósfera, temperatura, pH) considerando las característicasfisiológicas del m.o. buscado, para otorgarle ventajas frente al resto de m.o. de ese ecosistema.Pretendemos inhibir la mayor cantidad posible de m.o. no deseados, de manera que estos nointerfieran durante el aislamiento de los que sí interesan.Un esquema general para el enriquecimiento, aislamiento e identificación de m.o. es el siguiente: Fuente de inóculo Caldo de enriquecimiento Aislamiento IdentificaciónDebemos realizar las siguientes consideraciones si deseamos detectar y aislar un determinado tipode m.o. y simultáneamente minimizar la interferencia de otros:MuestraElegir la muestra adecuadamente. El m.o. que se está buscando debe ser factible de estarpresente, ya sea si lo estamos buscando per se, o como contaminante.Debemos considerar si es útil someter la muestra a un tratamiento previo. Cuanto mayor selecciónse realice en este paso inicial, menos selectivos deberán ser los medios de cultivo a utilizar.¿Debemos comenzar con un enriquecimiento o aislar la muestra directamente? Si el m.o. quedeseamos aislar está en un bajo número, se siembra la muestra en un caldo de cultivo quefavorezca su multiplicación (enriquecimiento). Cuando un enriquecimiento se realiza en un medioformulado para frenar el desarrollo de m.o. acompañantes no deseados, se denominaenriquecimiento selectivo. Cuando el m.o. deseado está en alto número, no se necesita realizar unenriquecimiento, y se puede sembrar la muestra en un medio sólido adecuado directamente.Medio de cultivoTodo medio de cultivo debe contener los nutrientes esenciales para el crecimiento de una o variasespecies microbianas y dar condiciones tales como pH, presión osmótica, oxígeno disuelto, etc.adecuados para el crecimiento.Debemos utilizar una formulación de los medios de cultivo adecuados al tipo de m.o. a cultivar. Engeneral en las primeras etapas se utilizan medios de cultivo selectivos (agregando un inhibidor dela flora acompañante), o utilizando un medio de cultivo restrictivo al incluir un nutriente que sólo elm.o. deseado sea capaz de utilizar o utilizando condiciones de incubación particulares.Debemos utilizar las condiciones de incubación adecuadas: temperatura, luz, atmósfera (aerobia oanaerobia, atmósfera con concentración de CO2, etc.).Los componentes del medio de cultivo que se pueden manejar son: • Fuente de carbono. A modo de ejemplo, se podrían quitar todos los compuestos orgánicos para permitir el crecimiento de m.o. autótrofos que son capaces de obtener su fuente de carbono del CO2 (que difunde de la atmósfera al medio o por agregado de bicarbonato). O incluir exclusivamente una fuente de carbono particular, por ej, fenol si queremos aislar degradadores de ese compuesto.Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 38 de 110
  40. 40. • Fuente de nitrógeno. Generalmente se agrega como sales de amonio o peptonas. Se puede omitir el agregado de fuente nitrogenada (orgánica u inorgánica) para permitir el crecimiento de fijadores libres de nitrógeno, que son capaces de obtener su fuente de nitrógeno del N2 atmosférico. • Fuente de energía. Si no se agrega ningún compuesto capaz de ser utilizado como fuente de energía y se incuba a la luz, sólo crecerán los m.o. fotosintéticos que usan la luz como fuente de energía. • Se pueden agregar o no compuestos que sean utilizados como factores de crecimiento (vitaminas, aminoácidos, ácidos nucleicos, ácidos grasos, etc.) según se necesiten o no.PeptonasLas peptonas son uno de los constituyentes principales de los medios de cultivo en microbiología.Se preparan por hidrólisis de proteínas y por lo tanto están constituidas por mezcla de polipéptidos,péptidos de diverso peso molecular y aminoácidos. Las peptonas de uso microbiológico sonmezcla de varios productos resultantes de la hidrólisis proteica: bases nitrogenadas, salesinorgánicas y trazas de minerales y compuestos varios. Algunas fuentes comunes de peptonasson: carne (fresca, deshidratada o congelada), pescado (fresco o deshidratado), caseína, gelatina,proteína de soja, microorganismos (levaduras, algas), sangre, albúmina de huevo, etc. La hidrólisispuede ser en medio ácido o alcalino o a presión superior a la atmosférica para lograr más altastemperaturas. Las peptonas resultantes en este proceso tienen en general bajo contenido devitaminas y aminoácidos porque son destruidos en el proceso. Sin embargo la hidrólisis tambiénpuede ser enzimática (con papaína, pancreatina, pepsina) y es realizada a mas bajastemperaturas, y por lo tanto las peptonas del proceso tienen más elevado contenido deaminoácidos y vitaminas que las de la hidrólisis ácida o alcalina.Infusiones y extractosLas fracciones solubles en agua de materiales como hígado, células de levadura, extracto de maltay músculo tienen bajo contenido en péptidos pero contienen sustancias valiosas para un medio decultivo como vitaminas, metales traza y carbohidratos complejos. Ejemplos de ellos son losextractos de carne (ricos en compuestos nitrogenados, vitaminas, aminoácidos), levadura (ricos envitaminas del complejo B, aminoácidos y compuestos carbonados y nitrogenados), malta (rica encarbohidratos, especialmente maltosa y otros nutrientes) y corazón de buey.Según la finalidad del medio de cultivo podemos encontrar distintos tipos:1) Medios nutrientes (no selectivos)Son medios de propagación que permiten el desarrollo de varios tipos de microorganismos. Nocontienen inhibidores. Como ejemplos de medios nutrientes comunes tenemos agar nutriente, agartripticasa soja, caldo nutriente, etc. A veces estos medios se enriquecen con ciertos productos talescomo sangre, yema de huevo, etc. para permitir el crecimiento de microorganismos exigentes:tendríamos entonces un medio de cultivo rico o enriquecido; ej. agar sangre, agar chocolate (elmedio contiene sangre hemolizada).También pueden contener indicadores de pH u otros para diferenciar la reaccion de los m.o.; talesmedios se llamarían medios diferenciales, por el. agar lactosa rojo fenol (indicador de pH rojofenol), caldo tioglicolato (indicador de potencial redox resazurina).2) Medios selectivos o inhibitoriosSon medios que contienen además de los nutrientes, ciertas sustancias que inhiben el desarrollode algunos microorganismos permitiendo el crecimiento de otros, por ej. agar cetrimide.Estos medios también pueden contener indicadores para diferenciar los distintos tipos demicroorganismos que puedan crecer en él; tal medio sería selectivo y diferencial, por ej. MacConkey, Baird Parker, EMB, etc. Los medios de enriquecimiento selectivo son medios selectivosCurso práctico Microbiología General 2009 Pág. 39 de 110
  41. 41. líquidos que contienen inhibidores, ej., sales biliares, altas concentraciones de cloruro de sodio,etc.3) Medios diferencialesContienen sustancias que permiten diferenciar las distintos tipos de m.o. por ej por suspropiedades bioquímicas (producción de ácido de un carbohidrato, producción de pigmentos,hidrólisis de un compuesto, etc) , ej: agar lactosa rojo fenol, agar Mac Conkey, agar Baird Parker(contiene yema de huevo que permite ver la producción de lipasas). Pueden ser selectivos o no.Para referirse a otras generalidades de los medios de cultivo, sus constituyentes, preparación en ellaboratorio, control de calidad y almacenamiento se pueden consultar los manuales de medios decultivo comercialesPreparación de medios de cultivoCuando el medio va a repartirse en placas, se esterilizan por separado el medio de cultivo(generalmente por autoclavado) y las placas de Petri (en horno); luego el medio termostatizado a45 ºC se reparte en placas, usando técnica aséptica.Cuando el medio va a repartirse en tubos, se reparte antes de su esterilización, colocando en cadatubo un determinado volumen según el tamaño del tubo y si queremos o no que quede fondo.Cada tubo se tapa con algodón (o también con capuchón de metal, plástico o tapón de rosca).Cuando alguno de los constituyentes del medio de cultivo es termolábil se esteriliza por filtración yse agrega al medio base luego de autoclavado.Esterilización de material de vidrio:Placas de Petri: se preparan en paquetes de 8 a 10 placas según el tamaño, envolviéndolas conpapel. Tubos: se tapa cada uno con un tapón de algodón y se envuelven con papel en paquetesPipetas: se coloca un algodón en la parte superior de la pipeta y se envuelve con papel. Seesterilizan en horno a 160 (2 h) o a 180 ºC (1 h).Curso práctico Microbiología General 2009 Pág. 40 de 110

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