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  • 1. CONTROLE DE Staphylococcus aureus EM CHARQUES (JERKED BEEF) POR CULTURAS INICIADORAS1 Marcos Franke PINTO2,*; Eliza H.G. PONSANO2; Bernadette D.G.M. FRANCO3, Massami SHIMOKOMAKI3 RESUMO Jerked beef — JB — é um produto cárneo curado, salgado e seco ao sol, derivado de um típico produto cárneo brasileiro — o charque. Ambos carecem de estudos que orientem seu aprimoramento. Staphylococcus spp. têm sido reportado como o gênero predominante na microbiota do produto, o que evidencia o risco de desenvolvimento de linhagens enterotoxigênicas de S. aureus. Foram empregadas duas linhagens inócuas de estafilococos na elaboração de JB, a fim de avaliar sua influência sobre o desenvolvimento de S. aureus por mecanismo competitivo ou pela produção de bacteriocinas. Os resultados demonstraram que ambas inibiram o desenvolvimento do patógeno tanto in vitro como durante o processamento do produto. Não se observou produção de compostos inibitórios pelas linhagens iniciadoras, ficando a explicação para a inibição observada restrita ao mecanismo competitivo. Este trabalho permitiu demonstrar a possibilidade de aumentar a segurança e padronização de JB pelo emprego de culturas bacterianas selecionadas. Palavras-chave: Staphylococcus aureus, charque, jerked beef, tecnologia, culturas starter, sanidade SUMMARY CONTROL OF Staphylococcus aureus IN CHARQUIS
  • 2. (JERKED BEEF) BY STARTER CULTURES. Jerked beef — JB — is a sun-dried, salted and cured meat product, derived from charqui. There are few studies about JB in the literature, as in charqui. Staphylococcus spp has been reported to be the predominant microrganism present in JB. The presence of this genus reveals a possible hazard for S. aureus growth. Two staphilococci strains commonly used as starter in fermented meat products have been employed with the purpose to inhibiting S. aureus either through competitive action or through the production of bacteriocins. The results demonstrated the inhibition S. aureus growth, probably through a competitive action, as they grow better in the medium. These starters have not produced any inhibitory compound. These informations led us to conclude that it is possible to improve the safety and quality standardization of JB through appropriate starter cultures. Keywords: Staphylococcus aureus, charqui, jerked beef, technology, starter cultures, sanity 1 — INTRODUÇÃO Charque é um produto cárneo salgado e seco ao sol, típico do Brasil e alguns outros países da América do Sul. Embora seja um dos produtos cárneos industrializados mais consumidos no país [27], seu potencial de comercialização está longe de ser completamente explorado, mesmo a nível nacional [11]. A necessidade de ampliar o mercado consumidor fez com que as indústrias buscassem alternativas para melhorar a qualidade e a imagem do produto. Uma tentativa nesse sentido fez surgir o jerked beef — JB, produto que difere do charque em alguns pontos, sendo o principal a adição de sais de cura à matéria prima no início do processamento (Figura 1).
  • 3. a. A carne, depois de desossada, é cortada em camadas de 3 a 5 cm, denominadas" mantas". b. A salmoura, contendo cerca de 25% de NaCl e 200 ppm de NaNO2, é injetada automaticamente nas mantas na proporção de 20% (v/p). c. As mantas são utilizadas para formar pilhas de até cerca de 2 metros de altura. Após cerca de 24 horas, essa pilha é invertida. Para isso, as mantas de carne localizadas no topo da pilha inicial são colocadas na base da nova pilha a ser formada. Essas duas primeiras pilhas são formadas alternando camadas de carne e sal grosso. d. Diariamente, as pilhas são invertidas, sem o acréscimo adicional de sal entre as camadas de carne. Esse processo é denominado "tombo" e tem o objetivo de uniformizar a distribuição do sal e a retirada de água entre as diversas mantas. Além disso, permite a visualização de possíveis falhas no processo [12]. São realizados de 3 a 5 tombos. e. A carne é exposta ao sol em varais. Após um dia de exposição ao sol, as mantas são recolhidas, empilhadas sobre plataformas denominadas "pedras" e cobertas com lonas impermeáveis, para que não reabsorvam umidade. Permanecem nessa pilha coberta durante todo o dia seguinte (abafamento), retornando depois aos varais para mais um período de exposição ao sol. Assim, as mantas ficam, alternadamente, cerca de 6-8 horas nos varais e 40-42 horas nas pedras. Geralmente, são empregados 3 períodos de exposição ao sol. FIGURA 1. Fluxograma do processamento de Jerked beef A exemplo do charque, JB também carece de estudos visando assegurar e
  • 4. aprimorar sua qualidade. Um dos pontos principais a serem considerados é a inocuidade do produto, principalmente quanto ao aspecto microbiológico [13]. LEISTNER [19] desenvolveu uma teoria explicando a estabilidade microbiológica de produtos alimentícios — a Tecnologia dos Obstáculos (Hurdle Technology). Segundo o autor, a estabilidade de um produto obtido por esse tipo de tecnologia é conferida por dois ou mais fatores (ou obstáculos) que isoladamente não produziriam esse efeito [20]. Já temos demonstrado que JB se enquadra nessa teoria [24], sendo caracterizado como um produto cárneo de umidade intermediária. Poucos microrganismos são capazes de suplantar os obstáculos que se implantam no JB durante seu processamento. Dentre esses, Staphylococcus aureus merece destaque, por ser uma bactéria halotolerante, anaeróbia facultativa [3, 5] e por produzir uma enterotoxina bastante termoestável que, uma vez presente no alimento, é capaz de resistir às técnicas convencionais de processamento térmico [3]. Quanto à sua capacidade de produção de toxina nas condições do produto, há divergência entre os autores, sendo que SPERBER [29] e LEITÃO et al. [21] citam um valor mínimo de atividade de água (Aa) de 0,93, enquanto BERGDOLL [3] relata a produção mesmo a 0,86. Uma forma de inibir o desenvolvimento de S. aureus é controlar a microbiota do produto, por tratar-se de um microrganismo considerado fraco competidor. Isso pode ser conseguido pela adição de culturas bacterianas selecionadas no início do processamento [2, 9]. Essas culturas são disponíveis comercialmente na forma liofilizada, sendo amplamente utilizadas na elaboração de produtos cárneos, como salames e presuntos curados [14, 15, 22, 28]. Em estudos anteriores, demonstramos que a microbiota de JB é constituida principalmente por estafilococos e micrococos [25], que são os gêneros predominantes em produtos de características semelhantes, como biltong, um produto típico africano [18] e presuntos curados [22, 26]. Isso indica serem estas as culturas mais importantes a serem estudadas como iniciadoras no processamento de JB. Assim, o emprego de linhagens inócuas de micrococáceas na elaboração de JB pode contribuir no controle da sua microbiota, promovendo inocuidade microbiológica e padronização de suas características. 2 — MATERIAL E MÉTODOS
  • 5. 2.1 - Culturas bacterianas S. aureus — FRI 722 Linhagem enterotoxigênica, produtora de toxina A, proveniente da Universidade de Wisconsin, USA, cedida pelo Depto. de Tecnologia de Alimentos e Medicamentos da Universidade Estadual de Londrina — PR. Culturas iniciadoras Staphylococcus carnosus — Linhagem Floracarn S® Staphylococcus xylosus — Linhagem Floracarn SX® Linhagens bacterianas cedidas pela Ha-La do Brasil — Chr. Hansen Ind. e Com. Ltda., localizada em Valinhos, Estado de São Paulo, comercializadas na forma liofilizada para a elaboração de embutidos fermentados e como culturas aceleradoras de cura e maturação para produtos cárneos em geral. 2.2 - Meios de cultivo Foram utilizados os meios caldo de soja tripticaseina (CST) e caldo de carne. Esse último, obtido segundo procedimento descrito por BIER [4], foi utilizado devido à impossibilidade de adicionar meios microbiológicos comerciais ao produto, pois isso interferiria em suas características organolépticas. Para sua elaboração, misturou-se carne moida e solução fisiológica (0,9% NaCl) na razão de 1:2. Essa mistura foi aquecida até a ebulição e filtrada 2 vezes, sendo em seguida esterilizada em autoclave a 121oC por 15 minutos. 2.3 - Elaboração do produto Para avaliação do comportamento das culturas em condições semelhantes às que ocorrem em situação real, durante as etapas de processamento de JB, foi empregado o músculo supraespinoso ("peixinho"). O preparo do músculo para receber o inóculo foi baseado no procedimento descrito por JACKSON et al. [17], realizado em ambiente asséptico — fluxo laminar. As peças foram embebidas em álcool e, em seguida, inflamadas. A camada queimada foi retirada com o auxílio de bisturi estéril. Essa operação foi repetida duas vezes. A peça de carne restante foi submetida ao processamento de JB em um sistema modelo. Para isso, foi utilizada salmoura esterilizada em autoclave a 121oC por 15 minutos. As linhagens iniciadoras foram inoculadas na carne misturadas nessa salmoura. As etapas de salga e ressalga foram realizadas em recipientes de alumínio estéreis. O sal empregado nessas etapas, bem como os recipientes, foram esterilizados em estufa a 230oC por 2 horas. Após a ressalga, o excesso de sal foi retirado, sempre de forma asséptica, e as peças permaneceram nos recipientes fechados por mais 3 dias. Depois disso, as peças foram
  • 6. expostas ao sol no próprio recipiente, recoberto por filme de polietileno. Após cada período de 8 horas de exposição ao sol, as peças foram colocadas em sacos plásticos, e permaneceram ao abrigo da luz no dia subsequente. Após 3 períodos de exposição ao sol, o produto foi embalado a vácuo. 2.4 - Comportamento de S. aureus em meio de cultura quando cultivado isoladamente e juntamente com as linhagens iniciadoras Foi avaliada a influência das linhagens comerciais de estafilococos sobre o desenvolvimento da linhagem de S. aureus. Para isso, todas as linhagens foram cultivadas em CST por 48 horas a 37oC. Em seguida, as diferentes espécies de estafilococos foram inoculadas ao nível de 1% em frascos contendo CST, isoladamente e também associando a espécie patogênica com cada uma das espécies iniciadoras. Os frascos foram incubados a 37oC e após 0, 6, 24 e 48 horas de cultivo foram tomadas amostras para realização de contagem. Para isso, alíquotas de 0,1 ml de diluições decimais foram inoculadas na superfície (spread plate) de placas contendo ágar Baird Parker. Para diferenciar a espécie patogênica das iniciadoras, cerca de 30 colônias presentes em placas que apresentaram o crescimento de 30 a 300 colônias foram tomadas aleatoriamente e inoculadas em tubos contendo CST. Após incubação a 37oC por 24 horas, foi realizado o teste para determinação da produção de coagulase. A porcentagem de cada espécie observada na amostra de colônias isoladas foi então estendida para o total de colônias presentes na placa selecionada. 2.5 - Comportamento de S. aureus no produto, isoladamente e na presença das linhagens iniciadoras A fim de avaliar a influência das culturas iniciadoras no desenvolvimento de S. aureus quando presentes na carne empregada na elaboração de JB, as linhagens foram cultivadas em caldo de carne por 48 horas a 37oC. Em seguida, adicionou-se NaCl e NaNO2 aos níveis de 25% e 200 ppm, respectivamente. Essas salmouras foram inoculadas em peças do músculo supraespinoso. Nas peças em que foram inoculadas as linhagens iniciadoras juntamente com a linhagem de S. aureus, foi empregado um nível de inóculo de 10% para cada uma das linhagens. Nas peças em que as linhagens foram inoculadas isoladamente, foi utilizado o mesmo nível de inóculo para a salmoura preparada com o caldo de cultura, e adicionalmente foi inoculada 10% de salmoura estéril. As amostras de carne foram submetidas ao processamento em sistema modelo. Durante
  • 7. diversas etapas do processamento, foram tomadas amostras para avaliação do comportamento das linhagens inoculadas. Para isso, as amostras foram adicionadas de água peptonada na razão de 1:10 (p/v) e homogeneizadas em aparelho Stomacher 400. Dessa primeira diluição foram tomadas alíquotas para a realização das demais diluições decimais. 2.6 - Teste de antibiose Para avaliar a capacidade das culturas iniciadoras de produzirem compostos inibitórios sobre S. aureus, realizou-se teste de antibiose baseado no procedimento descrito por HOULE et al. [16]. As linhagens iniciadoras foram cultivadas em CST por 48 horas a 37oC. Em seguida, a cultura de S. aureus foi transferida ao nível de 10% em ágar soja tripticaseina — AST — fundido e resfriado a 45oC. Esse ágar foi transferido para placas de Petri e, após solidificação, discos de papel de filtro estéreis de 10 mm de diâmetro foram embebidos com 0,1 ml de caldo de cultivo de S. carnosus e de S. xylosus e colocados sobre a superfície do ágar. Após incubação a 37oC por 48 horas, verificou-se a presença de halos de inibição. 2.7 - Análise estatística Os resultados foram submetidos à análise estatística através das técnicas de análise de variância e análise de regressão clássica [6, 10]. 3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO Em estudos anteriores [23], demonstramos que em fases bastante precoces da fabricação de JB já se instalam no produto condições que inibem o desenvolvimento da maioria dos microrganismos patogênicos. Por outro lado, ficou também evidenciado que essas condições selecionam a microbiota, favorecendo principalmente os estafilococos [25]. As espécies pertencentes ao gênero Staphylococcus caracterizam-se por sua halotolerância e capacidade de desenvolvimento em baixos valores de Aa [3, 5, 29], o que reforça a preocupação de que S. aureus possa suplantar os obstáculos do produto. Conforme apresentado na Tabela 1, S. aureus cultivado isoladamente em CST apresentou um desenvolvimento semelhante ao das culturas iniciadoras. Quando cultivado em conjunto com as espécies inócuas, seu desenvolvimento foi menor. S. carnosus apresentou o desenvolvimento mais rápido, tanto em cultivo isolado como em conjunto com S. aureus, o que refletiu-se numa maior inibição dessa última.
  • 8. Essa tendência observada em caldo foi mais evidente quando as bactérias foram inoculadas no produto. A Tabela 2 mostra que o desenvolvimento de S. carnosus foi mais rapido também nessa situação, resultando numa inibição mais eficaz de S. aureus. Enquanto no produto inoculado com S. xylosus foi constatada a presença do patógeno por 48 horas, naquele inoculado com S. carnosus não foi possível detectar células viáveis de S. aureus 24 horas após o inóculo. Isso demonstrou a possibilidade de inibição dessa bactéria por mecanismo competitivo, através da utilização de culturas iniciadoras.
  • 9. Segundo GEISEN et al. [14], a competição por nutrientes ocorre quando uma quantidade limitada é importante para o desenvolvimento de dois ou mais microrganismos competidores. Nesse caso, o microrganismo capaz de se desenvolver mais rapidamente, ou seja, o mais adaptado ao substrato, prevalecerá. As culturas iniciadoras são comercializadas para emprego em produtos cárneos. Sendo assim, elas são selecionadas por sua capacidade de se desenvolver nesse meio específico, o que aumenta sua eficácia no controle de S. aureus. Também foi avaliada a presença de compostos capazes de inibir o desenvolvimento de S. aureus no caldo de cultivo das linhagens iniciadoras. Essa preocupação fundamentou-se na possibilidade de que essas linhagens produzam bacteriocinas ativas contra a espécie patogênica. CANTONI et al. [7] descrevem a produção de bacteriocinas por Micrococcaceae, efetivas principalmente contra S. aureus. Bacteriocinas são proteinas ou complexos proteicos com atividade bactericida, geralmente ativas contra espécies intimamente relacionadas com a bactéria produtora [1]. As bacteriocinas produzidas por bactérias gram-positivas apresentam um espectro de ação mais amplo do que as produzidas por gram negativas [7]. O emprego dessas substâncias em alimentos tem sido estudado pelo fato de serem quebradas em aminoácidos no trato gastrointestinal. Assim, ao contrário dos antibióticos, elas não são absorvidas pelo organismo na sua forma ativa, nem interferem com a
  • 10. microbiota intestinal [14]. Conforme demonstrado na Tabela 3, neste trabalho não foi observada a produção de compostos inibitórios pelas linhagens iniciadoras. Diante do exposto, este trabalho permitiu demonstrar que as culturas iniciadoras de estafilococos, embora não tenham apresentado capacidade de produção de compostos ativos contra S. aureus, inibiram o desenvolvimento desse patógeno, provavelmente por mecanismo competitivo, constituindo-se num obstáculo adicional, capaz de contribuir na garantia de inocuidade do produto. 4 — REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] AHN, C., STILES, M.E. Antibacterial activity of lactic acid bacteria isolated from vacuum-packaged meats. J. Appl. Bacteriol., v. 69, n. 3, p.302-310, 1990. [2] BARTHOLOMEW, D.T., BLUMER, T.N. Inhibition of Staphylococcus by lactic acid bacteria in country-style hams. J. Food Sci., v.45, p.426-430, 1980. [3] BERGDOLL, M.S. Staphylococcus aureus. In: DOYLE, M.P. (ed.) Foodborne Bacterial Pathogens. New York:Marcel Dekker, 1989 cap.11, p. 463-523. [4] BIER, O. Bacteriologia e imunologia. 16 ed. São Paulo:Melhoramentos, 1975 1056p. [5] BUCHANAN, R.E., GIBBONS, N.E., (ed.) Bergey's manual of determinative bacteriology. 8 ed. Baltimore:Williams e Wilkins, 1974. [6] BUSSAB, W.O., MORETTIN, P.A. Estatística básica. 4 ed. São Paulo:Atual, 1987. 321 p. [7] CANTONI, C., BERSANI, C., COMI, G. Bacteriocin formation by Micrococcaceae. Ind. Aliment., v.31, n.306, p.660-665, 1992. [8] CEZARI, D.L., NASCIMENTO, E.R. Manual de análise de perigos e
  • 11. pontos críticos de controle. 2 ed. Campinas:Sociedade Brasileira de Ciência e Tecnologia de Alimentos, 1995. 28 p. [9] DALY, C., LA CHANCE, M., SANDINE, W.E., ELLIKER, P.R. Control of Staphylococcus aureus in sausage by starter cultures and chemical acidulation. J. Food Sci., v.38, p.426-430, 1973. [10] DRAPER, N.R., SMITH, H. Applied regression analysis. 2 ed. New York:John Wiley, 1981. 709 p. [11] FAYRDIN, A. Modernidade e tecnologia chegam à industria de charque. Rev. Nac. Carne, ano XVI, n.144, p.3-4, 1991. [12] FORTUNATO, D.M.N. Diferenças tecnológicas entre carne de sol e charque. Rev. Nac. Carne, ano XVII, n.190, p.34-35, 1992. [13] FRANCO, B.D.G.M., LANDGRAF, M., SHIMOKOMAKI, M., AZEVEDO, C.H.M. Condições higiênico-sanitarias do charque comercializado em São Paulo, Brasil. Rev. Microbiol., v.18, n.1, p.98- 102, 1987. [14] GEISEN, R., LÜCKE, F.K., KRÖCKEL, L. Starter and protective cultures for meat and meat products. Fleischwirtschaft, v.72, n.6, p.894- 898, 1992. [15] GENIGEORGIS, C.A. Quality control for fermented meats. J. Am. Vet. Med. Assoc., v.169, n.11, p.1220-1228, 1976. [16] HOULE, J.-F, LAFRANCE, M., JULIEN, J.-P., BROCHU, E., CHAMPAGNE, C.P. Selection of mixed cultures for meat fermentation. J.Food Sci., v.54, n.4, p.839, 1989. [17] JACKSON, T.C., ACUFF, G.R., SHARP, T.R., SAVELL, J.W. Volatile compounds on sterile pork loin tissue inoculated with Lactobacillus plantarum and Lactobacillus fermentum. J. Food Sci., v.57, n.3, p.783-784, 1992. [18] KOTZEKIDOU, P. Identification of staphylococci and micrococci isolated from an intermediate moisture meat product. J. Food Sci., v.57, n.1, p.249-251, 1992. [19] LEISTNER,L. Hurdle technology applied to meat products of the shelf stable products and intermediate moisture foods types. In: MULTON, J.L.(ed.), Properties of water in foods. Dordrecht:Martinus Niyhoff, Netherlands, 1985, p.309-329. [20] LEISTNER,L. Shelf stable products and intermediate moisture foods based on meats. In: ROCKLAND, L.B., BEUCHAT, L.R.(ed.), Water activity: theory and application to foods. New York:Marcel Dekker, 1987, p.295-327.
  • 12. [21] LEITÃO, M.F. Microbiologia de alimentos. In: ROITMAN, I., TRAVASSOS, L.R., AZEVEDO, J.L.(ed.) Tratado de microbiologia. São Paulo:Manole, 1988. v.1, p.3-81. [22] MOLINA, I., SILLA, H., FLORES, J., MONZO, J.L. Study of the microbial flora of dry-cured ham. 2. Micrococcaceae. Fleischwirtschaft, v.69, n.9, p.1433-1434, 1989. [23] PINTO,M.F. Culturas iniciadoras — starters — no processamento de jerked beef, um derivado do charque. São Paulo, USP, 1996. 96 p. Tese (Doutorado)— Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, 1996. [24] PINTO, M.F., PONSANO, E.H.G., SHIMOKOMAKI, M., FRANCO, B.D.G.M. Charque e sucedâneos são produtos cárneos obtidos por processos combinados (Hurdle Technology). Revista Nacional da Carne, ano XVII, n.195, maio, p.66, 1993. [25] PINTO, M.F., PONSANO, E.H.G., SHIMOKOMAKI, M., FRANCO, B.D.G.M. Flora microbiana desejável em Jerked Beef. Revista Nacional da Carne, ano XVII, n.198, agosto, p.44-47, 1993. [26] ROSA, M.C., MOHINO, M.R., MOHINO, M., MOSSO, M.A. Characteristics of micrococci and staphylococci isolated from semi- preserved meat products. Food Microbiol., v.7, p.207-215, 1990. [27] SHIMOKOMAKI, M., FRANCO, B.D.G.M., CARVALHO Jr., B.C. Charque e produtos afins:tecnologia e conservação — uma revisão. Bol. Soc. Bras. Ciênc. Tecnol. Aliment., v.21, n.1, p.25-35, 1987. [28] SMITH, J.L., PALUMBO, S.A. Use of starter cultures in meats. J. Food Prot., v.46, n.11, p.997-1006, 1983. [29] SPERBER, W. Influence of water activity on foodborne bacteria — a review. J. Food Prot., v.46, n.2, p.142-150, 1983. 5 — AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à CAPES pela bolsa de Doutorado a MFP e à Ha-La do Brasil — Chr. Hansen Ind. e Com. Ltda, pelas amostras das culturas iniciadoras. BDGMF e MS são pesquisadores científicos do CNPq. 1 Recebido para publicação em 12/02/98. Aceito para publicação em 10/07/98. 2 Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal, Curso de Medicina Veterinária, Unesp, Campus de Araçatuba, Rua Clóvis Pestana, 793, Caixa Postal 341, CEP 16050- 680, Araçatuba, SP, Brasil 3 Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental, Faculdade de Ciências
  • 13. Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil 4 Departamento de Tecnologia de Alimentos e Medicamentos, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Estadual de Londrina, Caixa Postal 6001, CEP 86051-970, Londrina, PR, Brasil * A quem a correspondência deve ser enviada.