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Medios de cultivo.

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  • 1. INTRODUCCIÓNUno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos esobservar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en ellaboratorio.Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debereunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión deoxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad.El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios decultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica alenfriarse a 40 grados.
  • 2. RECOMENDACIONES GENERALES DE EMPLEO PARA LOS MEDIOS DE CULTIVOPreparación de los Medios de Cultivo Deshidratados Por regla general los ingredientes de los medios de cultivo se disuelven por agitación ycalentando ligeramente en agua destilada. Los medios que contienen agente gelificante sesuelen hervir durante 1 minuto para conseguir su disolución. Aunque en la mayor parte delos medios hay que calentar, hay que evitar sobrecalentamientos innecesarios. Algunosmedios presentan turbidez inevitable o precipitados, por ejemplo la Base de CaldoTetrationato. Al distribuir el medio debe hacerse de forma uniforme, para que elprecipitado quede bien repartido.Posteriormente a la disolución se procede a la esterilización del medio. En algunos casosexisten componentes lábiles que no pueden añadirse en el medio de cultivo deshidratadoy que será necesario su esterilización por separado y una posterior incorporación deforma aséptica para obtener el medio completo. El pH de los medios de cultivo se ajustadurante su fabricación a los valores descritos en cada uno de ellos. Sin embargo, la calidaddel agua que se utiliza en su hidratación, la utilización de medios no recientes etc.Pueden modificar este parámetro por lo que es aconsejable verificarlo y reajustarlo sifuera necesario. En algunos casos se puede ajustar el pH después de la esterilización deforma aséptica y utilizando soluciones ácidas (Acido Clorhídrico) o básicas (SodioHidróxido) estériles. En los medios sólidos la medida se hace a 45-50ºC (el agar todavía noha gelificado) mientras que en los líquidos se hace a temperatura ambiente. Los mediosácidos (pH<5) pueden presentar malas gelificaciones debido a la posible hidrólisis del Agarcon la temperatura. Son medios que no es aconsejable refundirlos, y si es imprescindible,es aconsejable añadirles agar.El método más comúnmente utilizado para la esterilización es el Autoclavado. Sinembargo, hay ingredientes en algunos medios que no mantienen sus propiedades si sesometen a altas temperaturas.EsterilizaciónEn la etiqueta del producto se indican las condiciones de esterilización. De todas formas sedescriben unas pautas de carácter general.Autoclavado: Exposición durante 15 minutos a 121ºC.Con este tratamiento mueren las células vegetativas y las endosporas bacterianas. Sinembargo, los medios que contienen hidratos de carbono, deben esterilizarse a
  • 3. temperaturas no superiores a los 116-118ºC, para prevenir su descomposición y la posibleformación de compuestos tóxicos que inhiban el crecimiento bacteriano.Filtración: Es el medio más habitual cuando existen productos lábiles.Habitualmente el producto a esterilizar se filtra a través de una membrana de acetato decelulosa o nitrocelulosa de un poro de 0,22 μm. Las soluciones de antibióticos, las decarbohidratos, las vitaminas, etc., se suelen esterilizar por este método y añadir al mediode cultivo ya esterilizado, cuando éste está a temperatura no superior a los 45-50ºC.Tindalización: Exposición a 100ºC durante 30 minutos.Con este tratamiento mueren las células vegetativas, pero no las endosporas. Cuando elmedio esta frío, se incuba bajo condiciones de germinación de las endosporas, y si elloocurre, se repite el tratamiento térmico.Precauciones con algunos IngredientesAlgunos medios contienen productos tóxicos. Se deben tomar las medidas de seguridadnecesarias al manipular estos productos. Algunos de estos compuestos son la Fucsinabásica y ácida, la Pararrosanilina, la Azida Sódica, el Sodio Selenito, etc.Conservación de los medios preparadosLo más recomendable es preparar el medio cuando se va a emplear, aunque en muchoscasos por razones obvias una parte del medio preparado se consume y el resto se guardacomo medio preparado. El tiempo de vida del medio preparado dependerá de la propianaturaleza del medio, de la hermeticidad de los recipientes que lo contienen, de latemperatura de conservación y de las condiciones medioambientales. Si la hermeticidades buena y la temperatura baja, 2-8ºC, la vida del medio puede llegar a ser de 4 a 6semanas.De todas formas la refrigeración favorece la deshidratación y en algunos casos, como porejemplo, los medios para anaerobios, la conservación es mejor a temperatura ambienteque en frigorífico. Se deben evitar las condensaciones ya que el depósito de gotas de aguapodrá ser causa de una alteración casi inmediata del medio. Tampoco deben emplearsemedios preparados en los que se observe un efecto de deshidratación.Conservación de los medios deshidratados Como regla general y si no se establecencondiciones particulares los medios deshidratados deben almacenarse en lugar fresco,seco y al abrigo de luz directa del sol.
  • 4. Existen unos medios en concreto, que requieren un almacenamiento entre 2-8°C, que son:414703 Selenito Verde Brillante, Caldo414680 Marino, Agar413824 Selenito, Base de Caldo414698 Marino, Caldo413809 Selenito y Cistina, Caldo414722 Emulsión Yema de Huevo414723 Emulsión Yema de Huevo-Telurito414724 Potasio Telurito solución 3,5%En la manipulación de los frascos se debe procurar que las aperturas y cierres sean losmenos posibles y que el tiempo durante el cual el frasco permanece abierto sea elmínimo. De lo contrario el medio se irá rehidratando, con lo que comenzará acompactarse y endurecerse, ya que son generalmente higroscópicos. Incluso podría llegara tener lugar un crecimiento bacteriano en superficie. En estas condiciones debedesecharse el producto.Conservación de los medios preparados listos para su uso. Los medios preparados listos para usar tienen un tiempo limitado de conservación, que esde varios meses si las condiciones de almacenamiento y transporte son las adecuadas. Serecomienda su almacenamiento por regla general por debajo de los 20ºC y protegidos dela luz.Algunos medios deben conservarse entre 2-8ºC, siendo este requisito especificado en laetiqueta del producto. Los medios de cultivo con Agar no deben guardarse por debajo de0ºC, ya que se alteraría la estructura del gel. La pérdida de agua puede provocarprecipitados o hacer que cristalicen ciertas sustancias del medio de cultivo, así comooriginar grietas en las placas preparadas.En los medios de cultivo que deben mejorarse y que deben contener aditivos lábiles, sesuministra el medio basal preparado y según la necesidad se deben añadir los aditivos deforma estéril.Destrucción y desinfecciónUna vez realizados los cultivos, el medio debe ser autoclavado a 121ºC durante 30minutos antes de su desecho definitivo. De igual manera se debe proceder con el materialde laboratorio empleado en los cultivos antes de su lavado y nuevo uso.
  • 5. MEDIOS DE CULTIVOS
  • 6. LOS MEDIOS DE CULTIVO SE CLASIFICAN BASÁNDOSE SEGÚN SU COMPOSICIÓNQUÍMICAMedios sintéticos o químicamente definidos. Llevan fuente de carbono, fuente denitrógeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca), otros elementos como sonestimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella abortus) pero siempre aconcentraciones conocidas.Medios complejos o de composición indefinida. Estos medios llevan ingredientes comoextracto de levadura, peptona, infusión de cerebro, extracto de carne, etc. Que contienennutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composición cualitativa nicuantitativa de estos nutrientes.Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con aditivosadicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos(particularmente heterótrofos exigentes). Ejemplo: adicción de sangre, suero o extractosde tejidos de animales y plantas.Medios selectivos. Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento específico deun microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es de gran utilidad para elaislamiento de microorganismos a partir de una población microbiana mixta. Ejemplo:CO2 como fuente de carbono es selectivo para autótrofos; adicionando cristal violeta seinhibe el crecimiento de los Gram. (+); Utilizando maltosa como única fuente de carbonosólo crecerán los que usen maltosa.Medios diferenciales. Son aquellos destinados a facilitar la discriminación demicroorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento endichos medios. Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolíticos de no hemolíticos; McConkeydiferencia lactosa (+) de lactosa (-).F.- Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya que elcrecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células. Ejemplo: alañadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen ácidos, acidificándose elmedio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento.
  • 7. AGAR NUTRITIVOMedio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento demicroorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos.Su uso está descrito en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas yotros materiales de importancia sanitaria. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Pluripeptona 5.0 Suspender 31 g de polvo por litro de agua destilada. Mezclar y dejar reposar 5 Extracto de carne 3.0 minutos. Calentar suavemente agitando y Cloruro de sodio 8.0 hervir 1 o 2 minutos hasta su disolución. Distribuir y esterilizar a 121 C durante 15 Agar 15.0 minutos. pH final: 7.3-0.2FUNDAMENTOEs un medio usado para el cultivo de microorganismo poco exigente en los requerimientosnutricionales. No contiene inhibidores de crecimiento microbiano. La Pluripeptona es lafuente de carbono y nitrógeno para el crecimiento microbiano.El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero u otrassustancias para facilitar el cultivo de microorganismos exigentes.CARACTERISTICAS DEL MEDIO:Ámbar claro a medio ligeramente opalescente.
  • 8. AGAR EMB (Eosina Azul de Metileno).Se emplea como medio diferencial para el aislamiento y diferenciación de bacteriasentéricas Gram-negativas, de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permiteel desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae. Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona 10.0 Suspender 36 g del polvo en un litro de Lactosa 5.0 agua destilada. Reposar 5 minutos; mezclar, calentando a ebullición durante 1 Sacarosa 5.0 o 2 minutos hasta su disolución. Esterilizar Fosfato dipotasico 2.0 en autoclave a no más de 121C durante 15 Agar 13.5 minutos. Enfriar a 45C y distribuir agitando Eosina 0.4 suavemente. Azul de metileno 0.065 pH final: 7.2 -0.2FundamentoPor la combinación de estos dos colorantes y los dos hidratos de carbono se puedendistinguir algunos géneros. Las bacterias lactosa-negativas y sacarosa negativas(Salmonella y Shigella) dan colonias incoloras, mientras que las lactosa y/o sacarosa-positivas dan colonias púrpura-violetanegruzco con o sin un centro oscuro y quedanrodeadas de una zona incolora.La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y sacarosa, ya aquellosque son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno;
  • 9. éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. También esposible la identificación de Candida albicans.Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. Presentan un característico brillometálico.Modo de empleoSembrar en la superficie del medio, Incubar entre 35º y 37ºC de 18 a 24 horas.Resultados Microorganismos Tipo de Colonia Verdosas con brillo metálico y centro negro Escherichia coli azulado Klebsiella pneumoniae Mucosas, rosa púrpura, confluentes Proteus mirabilis Incoloras Enterococcus faecalis Incoloras, pequeñas, puntiformes Shigella flexneri Incoloras Salmonella typhimurium IncolorasControl de Calidad Control físico-químicoAspecto: polvo fino. Solubilidad:opalescente con precipitado.Color: púrpura rosado. pH: 7,2 ±0,2Características del medio
  • 10. Standard Plate Count (SPC)Se utiliza para el examen microbiológico de alimentos, agua y productos lácteos. Composición Concentración del medio gr/litro Triptona 5.0 Dextrosa 1.0 Extracto de levadura 2.5 Agar 12.0 pH final: 7.2- 0.2

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