Laporan praktikum mikrobiologi mengenai teknik pewarnaan mikroorganisme. Mahasiswa melakukan pewarnaan gram pada Escherichia coli dan mengamati bentuknya di bawah mikroskop. Hasilnya adalah E. coli berbentuk basil dan berwarna merah setelah pewarnaan gram, menunjukkan bahwa bakteri tersebut termasuk gram negatif.

1. LAPORAN PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI
PERCOBAAN VI
“TEKNIK PEWARNAAN MIKROORGANISME”
Disusun Oleh :
NAMA : RUKMANA
STAMBUK : G 301 12 008
KELOMPOK : III (TIGA)
JURUSAN : KIMIA
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS TADULAKO
2013
97

2. BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Untuk mengamati bentuk atau ciri-ciri suatu mikroba menggunakan
mikroskop dapat digunakan dua cara yaitu mengamati sel mikroba yang
masih hidup tanpa diwarnai dan mengamati sel mikroba yang telah mati
dengan diwarnai. Untuk lebih mudah dilihat sebaiknya bakteri diwarnai
dengan zat warna, beberapa zat yang digunakan untuk mewarnai bakteri
juga dapat digunakan untuk mengamati struktur bagian dalam sel. Dengan
adanya pewarnaan terutama bakteri yang mempunyai sel dengan ukuran
yang retif kecil akan lebih mudah terlihat di bawah mikroskop dengan
menggunakan lensa objektif minyak imersi yang mempunyai tingkat
pembesaran yang relatif tinggi.
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan
sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana.
Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri
hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah
bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat
basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya
bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri
yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan
penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu
zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna
terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer.
Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini
merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies.
98

3. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara
komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang
disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada
komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini
maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Teknik Pewarnaan
bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta
mengikuti aturan dasar yang berlaku. Oleh karena itu yang melatar
belakangi praktek ini yaitu untuk mengetahui teknik pewarnaan
mikroorganisme sehingga mempermudah dalam melihat bagian-bagian
bakteri.
1.2. Tujuan
Adapun tujuan dilakukannya percobaan ini yaitu :
1. Mahasiswa dapat mengetahui dan memahami teknik pewarnaan
mikroba.
2. Membedakan golongan bakteri gram positif dan gram negative.
3. Mengamati bentuk bakteri pada preparat dibawah mikroskop.
99

4. BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri atau mikroba lainya dapat di lihat dengan mikroskop biasa tanpa
yaitu dengan cara-cara khusus, misalnya dengan cara tetesan
bergantung,menggunakan kondensor medan gelap dan lain-lain. Tetapi
pengamatan dari pewarnaan ini lebih sukar dan tidak di pakai untuk melihat
bagian-bagian sel dengan teliti, karena sel bakteri dan mikroba lainya transparan.
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, karena selain
bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil untuk mengatasi hal
tersebut maka di kembangkan suatu teknik pewarnaan bakteri ,sehingga sel dapat
terlihat jelas dan mudah di amati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini
merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi (Dwijoseputro, 2005).
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan
sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak
berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan.
Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk
100

5. diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga
berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding
sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Mikroorganisme sulit dilihat dengan
mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi ataupun membiaskan cahaya.
Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan
membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya
ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel
seperti spora dan bahan infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat.
Pewarnaan yang digunakan untuk melihat salah satu struktur sel disebut
pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan
mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi
kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah
pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi kelompok-
kelompok tahan asam dan tidak tahan asam (Dwidjoseputro, 1998).
Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus
dilakukan pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas. Pada
umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak
bakteri yang tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2004).
Tujuan dari pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk
sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel
bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat
fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Hadiutomo. 1990).
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada
tahun 1884. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu,
bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau
sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan
oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan
pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp
(Lay, 1994).
101

6. Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian
warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam).
Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh
ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut
berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat
asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat
warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna
adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif (Hadiutomo,
1990).
Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada
zat warna basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut
kromofor dan memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian
yang berperan memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna basa
lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan di dinding sel,
membran sel dan sitoplasma sewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat
warna basa akan berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga
mikroorganisme lebih jelas terlihat (Dwidjoseputro, 1998).
Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk
mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai
mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar belakang
sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan negatif ini tidak dapat
berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur sel. Kadangkala zat
warna negatif digunakan untuk mewarnai bagian sel yang bermuatan positif, perlu
diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat warna terhadap struktur sel dapat
berubah bergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses pewarnaan
(Dwidjoseputro, 1998).
Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme
disebut pewarnaan positif dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat
warna basa yang yang bermuatan positif maupun zat warna asam yang bermuatan
negatif. Sebaliknya pada pewarnaan negatif latar belakang disekeliling
102

7. mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan kontras dengan mikroorganisme
yang tak berwarna (Dwidjoseputro,1998).
Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek.
Ulasan ini kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah
cukup banyak sehingga dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati.
Kesalahan yang sering kali dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang
terlalu padat terutama bila suspensi tersebut berasal adari bukan media padat.
Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila terlalu encer, maka akan diperoleh
kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparatnya (Sutedjo, 1991).
Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa,
tetapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif, pada metode ini mikroba
dicampur dengan tinta cina atau nigrosin, kemudian digesekkan diatas kaca
objek.Zat warna tidak akan mewarnai bakteri, akan tetapi mewarnai lingkungan
sekitar bakteri. Dengan mikroskop mikroba akan terlihat tidak berwarna dengan
latar belakang hitam (Lay, 1994).
BAB III
METODOLOGI
3.1. Waktu dan Tempat
Adapun waktu dan tempat dilaksanakannya praktikum ini adalah:
Hari/ Tanggal : Senin, 09 Desember 2013
Pukul : 13.00 WITA - Selesai
Tempat : Laboratorium Biologi Dasar Jurusan Biologi FMIPA
UNTAD
3.2. Alat Dan Bahan
Adapun alat dan bahan yang digunakan pada percobaan ini yaitu :
A. Alat
1. Gelas objek
2. Jarum ose
3. Kaca preparat
4. Bunsen
103

8. 5. Mikroskop
6. Pipet tetes
B. Bahan
1. Biakan murni Escherichia coli
2. Medium NA (Nutrient Agar)
3. Larutan Methylen blue
4. Alkohol 70%
5. Aquades steril
6. Spritus
7. Tissue
3.3. Prosedur Kerja
Adapun prosedur kerja yang dilakukan pada percobaan ini adalah :
1. Mensterilkan kaca preparat dengan alkohol 70%.
2. Mengeringkan (mengelap) dengan tissue.
3. Mengambil inokulum/biakan Escherichia coli dengan jarum ose dan
meletakkan di atas kaca objek.
4. Memfiksasi diatas lampu bunsen , setelah kering , menetesinya dengan
larutan methylen blue, dan membiarkannya selama 1-2 menit.
5. Mencuci objek dengan air yang mengalir hingga zat warnanya hilang.
6. Mengeringkan kaca preparat dengan tissue.
7. Mengamati objek dibawah mikroskop dan mencatat hasil pengamatan.
104

9. BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Pengamatan
No. Objek Bentuk Warna
1.
Biakan murni Escherichia coli
Basil (Batang) Merah
105

10. 4.2. Pembahasan
Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang
dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi
mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa
dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat
digunakan untuk identifikasi awal.
Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram
negative, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau
Kristal violet. Contoh dari bakteri gram positif ialah Clostridium perfringens,
Staphylococcus aureas, sedangkan bakteri gram negative misalnya adalah
Eschericia Coli. Bakteri gram positif adalah bakeri yang mempertahankan zat
warna metal ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis ini akan
berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop sedangkan bakteri gram negatif
akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua
jenis bakteri ini terutama berdasarkan pada perbedaan struktur dinding sel
bakteri. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat
106

11. metal ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram-positif akan
mempertaahankan warna ungu gelap setelah di cuci dengan alkohol. Pada
percobaan ini yang dilakukan hanyalah pengujian pada bakteri gram negative
yaitu Eschericia Coli.
Pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang ditujukan terhadap bakteri
yang sulit diwarnai, dimana bakterinya tidak diwarnai melainkan latar
belakangnya, metode pewarnaan negatif merupakan suatu metode perwarnaan
umum, dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap ke dalam sel-
sel bakteri melainkan melatar belakangi sehingga kelihatan atau nampak
sebagai bentuk-bentuk kosong tak berwarna(negatif).
Prinsip pewarnaan negatif yaitu suatu metode pewarnaan tidak
langsung dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap kedalam
sel bakteri melainkan ke dalam latar belakangnya.
Tujuan dari pewarnaan negatif adalah untuk mengetahui bentuk
mikroba dengan pewarnaan-pewarnaan tidak langsung. Prinsip pewarnaan
negatif adalah cara pengamatan mikrobiologi yang dapat di lakukan untuk
membedakan spesies kecil dan cairan optiknya. Pewarnaan ini merupakan
pewarnaan yang di gunakan untuk melihat secara tidak langsung, karena yang
diwarnai adalah latar belakangnya, sedangkan bakterinya sendiri tidak
mengalami pewarnaan. Pada pewarnaan ini tidak di lakukan fiksasi karena itu
dapat digunakan untuk melihat bentuk-bentuk sel yang sesungguhnya dan
untuk menentukan ukuran bakteri, karena bakteri praktis tidak mengalami
perubahan. Berbeda dengan pewarnaan lain, pewarnaan negatif
memungkinkan bakteri terlihat transparan dan tampak jelas. Fungsi zat
warna: Safranin merupakan pewarnaan tandingan atau pewarna skunder, zat
ini berfungsi untuk mewarnai sel-sel yang telah kehilangan warna utama
dengan kata lain memberikan warna pada bakteri non target.
Proses sterilisasi sangat penting dibutuhkan sebelum memulai maupun
mengakhiri sebuah pekerjaan di laboratorium dengan menggunakan teknik
aseptik. Alkohol 70% yang disemprotkan pada tangan, kaca preparat dan
meja, bahkan tangan pun sebelumnya harus dicuci dengan sabun terlebih
107

12. dahulu. Hal tersebut berfungsi untuk membunuh mikroorganisme yang tak
diinginkan agar mendapatkan pengukuran yang akurat.
Pada proses pewarnaan gram, harus gelas objek yang bersih.
Pembersihan ini dilakukan supaya gelas obyek bebas lemak dan debu.
Pembersihan biasanya menggunakan alkohol. Setelah di cuci kemudian di
beri satu tetes aquades pada permukaan gelas objek. Kultur bakteri murni
diambil dan diratakan diatas kaca obyek. Pengambilan kultur bakteri tidak
diambil terlalu banyak, karena jika terlalu banyak akan sulit diratakan dan
apabila kultur bakteri tidak dapat diratakan tipis-tipis maka bakteri akan
tertimbun hal ini akan mengakibatkan pemeriksaan bentuknya satu per satu
menjadi tidak jelas.
Apabila sudah kering, dilakukan fiksasi dengan cara melewatkan diatas
nyala api. Proses fiksasi dilakukan supaya bakteri benar-benar melekat pada
kaca objek sehingga olesan bakteri tidak akan terhapus apabila dilakukan
pencucian. Fiksasi adalah proses yang dilakukan untuk pewarnaan yang dapat
berpenetrasi kedalam endospore. Yang perlu diperhatikan dalam proses
fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena
nyala api. Setelah dilakukan fiksasi kemudian ditetesi dengan larutan gram
methylen blue selama 1-2 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan
dibiarkan sampai kering dengan cara dianginkan dan menggunakan tissue
untuk mengeringkan bagian bawah ojek gelas. Pencucian dengan air
bertujuan untuk mengurangi kelebihan zat warna dari methylen blue.
Disisi lain bakteri garam negatif seperti Eschercia coli memiliki sistem
membran ganda di mana membran plasmanya diselimuti oleh membran luar
permeabel. Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal berupa peptidoglikan
yang terletak di antara membran dalam dan luarnya, bakteri ini juga bersifat
patogen yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen
ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding gram negatif
terutama lapisan lipopolisakarida.
Berdasarkan hasil pengamatan di bawah mikroskop, diidentifikasi
bakteri Eschercia coli mempunyai bentuk basil (batang) dan berwarna
108

13. merah. Bakteri ini digolongkan ke dalam bakteri gram negatif, karena
menunjukkan ciri-ciri dari bakteri gram negatif.
BAB V
PENUTUP
5.1. Kesimpulan
Berdasarkan percobaan dan pembahasan dapat disimpulkan bahwa :
1. Pewarnaan gram merupakan pewarnaan difrensial karena dapat
digunakan untuk membedakan antara bakteri gram negatif dan gram
positif. Pewarnaan ini sering digunakan untuk identifikasi dan klasifikasi
bakteri. Komposisi dinding sel bakteri gram positif berbeda dengan
bakteri gram negatif sehingga hasil pewarnaan gram akan berbeda.
2. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan warna
methylene blue sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai
lapisan peptidoglikan yang tebal.
3. Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan warna
methylene blue sewaktu prose pewarnaan gram. Bakteri ini mempunyai
lapisan peptidoglikan yang tipis.
109

14. 4. Bakteri Eschercia coli merupakan bakteri gram negative yang
mempunyai bentuk basil (batang) dan berwarna merah. Bakteri ini
memiliki sistem membran ganda di mana membran plasmanya diselimuti
oleh membran luar permeabel. Bakteri ini mempunyai dinding sel tebal
berupa peptidoglikan yang terletak di antara membran dalam dan
luarnya, bakteri ini juga bersifat patogen yang berarti mereka berbahaya
bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan
komponen tertentu pada dinding gram negatif terutama lapisan
lipopolisakarida.
5.2. Saran
Untuk praktikum selanjutnya dalam pengerjaannya harus lebih teliti
lagi agar diperoleh hasil yang akurat.
Daftar Pustaka
Dwidjoseputro, D., 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi, Djambatan, Jakarta.
Hadiutomo, 1990, Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek, Jakarta : PT. Gramedia.
Lay, B.W., 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium, PT Raja Grafindo Persada,
Jakarta.
Sutedjo, M.,1991, Mikrobiologi Tanah, Rhineka Cipta, Jakartaa.
.
110