ANTICUERPOS A PÉPTIDOS C CITRULINADOS <ul><li>Ponente: </li></ul><ul><ul><li>TM Mirtha Hernández Acasiete </li></ul></ul>
¿Qué son los Acs. a péptidos C citrulinados? <ul><li>Son autoanticuerpos presentes en el suero de las personas que padecen...
DATOS HISTÓRICOS <ul><li>En 1964, Nienhuis y Mandema describieron por primera vez los anticuerpos antifactor perinuclear (...
DATOS HISTÓRICOS <ul><li>En 1994, Despres y col. describieron los anticuerpos anti-Sa. Usando técnicas de inmunoblot y ant...
DATOS HISTÓRICOS <ul><li>Fue en 1995 cuando Sebbag  y col. consiguieron demostrar que tanto los  AKA  como los  APF  iban ...
DATOS HISTÓRICOS <ul><li>En 1998, Schellekens y col. publicaron que son necesarios los residuos de  citrulina  para que lo...
ARTRITIS REUMATOIDE <ul><li>DEFINICION: </li></ul><ul><li>La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad sistémica, de etio...
ETIOPATOGENIA <ul><li>FACTORES GENETICOS:   </li></ul><ul><ul><li>miembros de una familia con altos  grados de consanguini...
ETIOPATOGENIA <ul><li>FACTORES INMUNOLOGICOS </li></ul><ul><li>Inmunidad Humoral, tenemos la presencia de inmunocomplejos,...
ETIOPATOGENIA <ul><li>En cuanto a la Inmunidad Celular tenemos el aumento en el tejido sinovial de linfocitos T colaborado...
 
ARTRITIS REUMATOIDE- MORFOLOGIA <ul><li>Localización más frecuente: </li></ul><ul><li>Muñeca. </li></ul><ul><li>Mano </li>...
 
ARTRITIS REUMATOIDE- MORFOLOGIA <ul><li>En el desarrollo de la inflamación de la artritis reumatoide se distinguen tres fa...
PRIMERA FASE <ul><li>1) Edema del estroma sinovial. </li></ul><ul><li>2) proliferación de células sinoviales. </li></ul><u...
PRIMERA FASE <ul><li>4) Exudado fibrinoso en la superficie sinovial y, en menor grado en el estroma. La fibrina puede conv...
SEGUNDA FASE <ul><li>Si la inflamación persiste se desarrolla tejido granulatorio, exuberante, llamado pannus , que se ext...
SEGUNDA FASE <ul><li>1) Desarrollo de tejido granulatorio junto a proliferación de células sinoviales con destrucción dire...
TERCERA FASE <ul><li>En ella se produce deformación e inmovilidad articular. El tejido granulatorio se convierte en tejido...
¿COMO AYUDAMOS AL    DIAGNÓTICO LABORATORIALMENTE?
PRUEBAS SEROLOGICAS
ANTICUERPOS EN AR INESPECÍFICOS Factor Reumatoide Ac. Antinucleares Ac. Contra cardiolipina Ac. contra citoplasma de neutr...
FACTOR REUMATOIDE (FR) <ul><li>Se trata de un anticuerpo de tipo IgM contra la porción Fc de la IgG descrita inicialmente ...
 
AC. ANTIFACTOR PERINUCLEAR (APF) <ul><li>Descubierta en 1964 por Nienhuis y Mandema. </li></ul><ul><li>Estos autoanticuerp...
AC. ANTIQUERATINA (AKA) <ul><li>Descubierta en 1979 por Young. </li></ul><ul><li>Estos autoanticuerpos son detectados medi...
AC. ANTI-Sa <ul><li>Descubierta en 1994. </li></ul><ul><li>Detectados utilizando la técnica de inmunoblot. </li></ul><ul><...
filagrina vimentina APF AKA Anti Sa Proteínas Citrulinadas Anti pcc
Anticuerpos a péptido C citrulinado (Anti Pcc) <ul><li>Los anticuerpos anti-PCC son un grupo de autoanticuerpos, dirigidos...
Anticuerpos a péptido C citrulinado (Anti Pcc) <ul><li>El autoantígeno es una  proteína  que se une a un aminoácido poco c...
Anticuerpos a péptido C citrulinado (Anti Pcc) <ul><li>Pero...  ¿ Qué es la citrulina? </li></ul><ul><li>Es un aa postradu...
Anticuerpos a péptido C citrulinado (Anti Pcc) CITRULINACIÓN La citrulinación ocurre en células en proceso de muerte. Cons...
Significado fisiopatológico? <ul><li>Existen algunos datos que pueden sugerir la  </li></ul><ul><li>intervención de los PC...
Significado fisiopatológico? <ul><li>Con la muerte y destrucción de dichas células, enzimas intracelulares como el PAD pas...
Significado fisiopatológico? <ul><li>Esto, a su vez produciría una estimulación de las células T, que a su vez estimularía...
 
Test de ELISA para Anticuerpos a Péptido Citrulinado <ul><li>Esta técnica inmunoenzimática nos ayuda en la detección  in v...
Test de ELISA para Anticuerpos a Péptido Citrulinado <ul><li>Se aplica controles y muestra a los pocillos y se incuba </li...
Test de ELISA para Anticuerpos a Péptido Citrulinado <ul><li>Se realiza el lavado y se añade conjugado HRP (peroxidasa de ...
Test de ELISA para Anticuerpos a Péptido Citrulinado <ul><li>Se lava, se añade un sustrato cromogénico (TMB) y tras incuba...
Test de ELISA para Anticuerpos a Péptido Citrulinado <ul><li>Leer absorvancia de 450 nm  </li></ul><ul><li>La actividad en...
PEPTIDO CITRULINADO CICLICO ANTICUERPOS, SUERO   <ul><li>Un  resultado positivo  indica la  presencia  de anticuerpos anti...
Indicaciones para la prueba <ul><li>Una indicación clínica de AR, pero con resultados dudosos o negativos del Factor Reuma...
Indicaciones para la prueba <ul><li>Un diagnóstico presuntivo de pacientes considerados de alto riesgo de la enfermedad. <...
VENTAJAS ELISA ANTI-PCC  <ul><li>Mayor sensibilidad  </li></ul><ul><li>Es técnica cuantitativa </li></ul><ul><li>Fácil rea...
<ul><li>En un estudio se enfrentaron las pruebas del CCP2 , el anti filagrina citrulinada (AFA), para evaluar sensibilidad...
 
RESUMEN DE HALLAZGOS CLÍNICOS 1 (3%)  29  Otros pacientes  2 (2%)  87  Enfermedad infecciosa  2 (7%)  29  Crioglobulinemia...
CONCLUSIONES <ul><li>Los anticuerpos anti CCP suponen una importante herramienta para el diagnóstico precoz y el pronóstic...
CONCLUSIONES <ul><li>La determinación de anti-CCP combinada con FR-IgM tiene valor adicional sobre la determinación aislad...
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Peptido c _citrulin[1].

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Peptido c _citrulin[1].

  1. 1. ANTICUERPOS A PÉPTIDOS C CITRULINADOS <ul><li>Ponente: </li></ul><ul><ul><li>TM Mirtha Hernández Acasiete </li></ul></ul>
  2. 2. ¿Qué son los Acs. a péptidos C citrulinados? <ul><li>Son autoanticuerpos presentes en el suero de las personas que padecen de artritis reumatoide . </li></ul><ul><li>nos ayuda en el diagnostico temprano de la AR. </li></ul>
  3. 3. DATOS HISTÓRICOS <ul><li>En 1964, Nienhuis y Mandema describieron por primera vez los anticuerpos antifactor perinuclear ( APF ) </li></ul><ul><li>En 1979, Young y col. definieron los anticuerpos antiqueratina ( AKA ). </li></ul><ul><li>Ambos: Especificidad: 95 -98 % </li></ul><ul><li>Sensibilidad: 40 -55 % </li></ul>
  4. 4. DATOS HISTÓRICOS <ul><li>En 1994, Despres y col. describieron los anticuerpos anti-Sa. Usando técnicas de inmunoblot y antígenos de bazo y placenta. </li></ul><ul><li>Igualmente presentaron gran especificidad para la artritis reumatoide (98,9%). </li></ul><ul><li>Igualmente una sensibilidad similar a la de los autoanticuerpos anteriormente citados (42,7%). </li></ul><ul><li>Trabajos posteriores también demostraron una semejanza entre APF , AKA y anti-Sa . </li></ul>
  5. 5. DATOS HISTÓRICOS <ul><li>Fue en 1995 cuando Sebbag y col. consiguieron demostrar que tanto los AKA como los APF iban dirigidos contra moléculas relacionadas con la filagrina y la profilagrina humanas. </li></ul><ul><li>Sin embargo, el entusiasmo inicial decayó cuando se comprobó que los resultados entre los distintos grupos de investigación eran discordantes y dependían del sustrato y de los métodos utilizados para la purificación de la filagrina. </li></ul>
  6. 6. DATOS HISTÓRICOS <ul><li>En 1998, Schellekens y col. publicaron que son necesarios los residuos de citrulina para que los anticuerpos específicos de la artritis reumatoide reconozcan la molécula de filagrina. </li></ul><ul><li>Aquí se inicia la era de los </li></ul><ul><li>anticuerpos contra los péptidos </li></ul><ul><li>citrulinados . </li></ul>
  7. 7. ARTRITIS REUMATOIDE <ul><li>DEFINICION: </li></ul><ul><li>La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad sistémica, de etiología desconocida, en cuya patogenia existe una alteración de la respuesta inmune, que se manifiesta por inflamación crónica de la membrana sinovial, con proliferación de esta, tendiendo a destruir las articulaciones, deformarlas y alterar su capacidad funcional. </li></ul>
  8. 8. ETIOPATOGENIA <ul><li>FACTORES GENETICOS: </li></ul><ul><ul><li>miembros de una familia con altos grados de consanguinidad (gemelos). </li></ul></ul><ul><ul><li>la asociación de la AR con el HLA de clase II esta dado por el HLA-DR4. </li></ul></ul><ul><li>FACTORES INFECCIOSOS: </li></ul><ul><ul><li>*mycobacterias. </li></ul></ul><ul><ul><li>*virus (rubéola, parvovirus, herpes, Epstein </li></ul></ul><ul><li>Barr) </li></ul>
  9. 9. ETIOPATOGENIA <ul><li>FACTORES INMUNOLOGICOS </li></ul><ul><li>Inmunidad Humoral, tenemos la presencia de inmunocomplejos, especialmente factor reumatoideo en la sinovial que junto al complemento pondría en marcha el proceso inflamatorio con la formación de gran cantidad de enzimas hidrolíticas, radicales libres de oxígeno y metabolitos del ácido araquidónico. </li></ul>
  10. 10. ETIOPATOGENIA <ul><li>En cuanto a la Inmunidad Celular tenemos el aumento en el tejido sinovial de linfocitos T colaboradores y T citotóxicos-supresores, con abundantes macrófagos, que actúan como células presentadoras de antígenos, estimulando la producción de anticuerpos y el crecimiento de células de revestimiento endotelial, condrocitos y osteoclastos, que producen sustancias químicas capaces de destruir los tejidos; producción de citoquinas (interleuquina 1, 6 y factor de necrosis tumoral) por linfocitos y macrófagos, con capacidad de producir lesión hística. </li></ul>
  11. 12. ARTRITIS REUMATOIDE- MORFOLOGIA <ul><li>Localización más frecuente: </li></ul><ul><li>Muñeca. </li></ul><ul><li>Mano </li></ul><ul><li>Codo </li></ul><ul><li>Hombro </li></ul><ul><li>Pie </li></ul><ul><li>Rodilla </li></ul>
  12. 14. ARTRITIS REUMATOIDE- MORFOLOGIA <ul><li>En el desarrollo de la inflamación de la artritis reumatoide se distinguen tres fases: </li></ul><ul><li>_ Primera fase (de inflamación sinovial y </li></ul><ul><li>perisinovial) </li></ul><ul><li>_ Segunda fase (de proliferación o de </li></ul><ul><li>desarrollo de pannus). </li></ul><ul><li>_ Tercera fase (de fibrosis y anquilosis). </li></ul>
  13. 15. PRIMERA FASE <ul><li>1) Edema del estroma sinovial. </li></ul><ul><li>2) proliferación de células sinoviales. </li></ul><ul><li>3) gran infiltración de células redondas: linfocitos, que pueden disponerse a manera de folículos linfáticos (cuerpos de Allison-Ghormley), plasmacélulas, monocitos y macrófagos y escasos leucocitos. </li></ul>
  14. 16. PRIMERA FASE <ul><li>4) Exudado fibrinoso en la superficie sinovial y, en menor grado en el estroma. La fibrina puede convertirse en un material granular (granos de arroz). El líquido sinovial contiene leucocitos y complejos inmunes, </li></ul><ul><li>5) Daño de pequeños vasos (vénulas, capilares y arteríolas) que consiste en tumefacción endotelial, engrosamiento de la pared, infiltración de algunos leucocitos, trombosis y hemorragias perivasculares. </li></ul><ul><li>6) Microfocos de necrosis. </li></ul>
  15. 17. SEGUNDA FASE <ul><li>Si la inflamación persiste se desarrolla tejido granulatorio, exuberante, llamado pannus , que se extiende sobre la superficie articular y se acompaña de vascularización del cartílago. </li></ul><ul><li>El daño del cartílago y de los tejidos vecinos (cápsula, tendones, ligamentos y hueso) se produce por dos mecanismos: </li></ul>
  16. 18. SEGUNDA FASE <ul><li>1) Desarrollo de tejido granulatorio junto a proliferación de células sinoviales con destrucción directa del cartílago articular y </li></ul><ul><li>2) Liberación de enzimas lisosomales de sinoviocitos, polimorfonucleares y macrófagos. </li></ul><ul><li>La depleción de proteoglicanos con pérdida de la metacromasia del cartílago es causada por las proteasas liberadas. </li></ul><ul><li>La prostaglandina PGE2, sintetizada por la sinovial afectada, tiene un papel importante en la reabsorción ósea. También participan enzimas del líquido sinovial. </li></ul>
  17. 19. TERCERA FASE <ul><li>En ella se produce deformación e inmovilidad articular. El tejido granulatorio se convierte en tejido fibroso en la cápsula, tendones y tejido periarticular inflamados, lo que produce gran deformación de la articulación. </li></ul><ul><li>La desaparición del cartílago articular y fibrosis del espacio articular conducen a la inmovilización articular (anquilosis). </li></ul>
  18. 20. ¿COMO AYUDAMOS AL DIAGNÓTICO LABORATORIALMENTE?
  19. 21. PRUEBAS SEROLOGICAS
  20. 22. ANTICUERPOS EN AR INESPECÍFICOS Factor Reumatoide Ac. Antinucleares Ac. Contra cardiolipina Ac. contra citoplasma de neutrófilos Ac. contra colágeno II Ac contra RA33 ESPECÍFICOS Ac. contra Sa Ac. contra la queratina Ac. contra el factor perinuclear Ac. contra la filagrina Ac. contra los péptidos citrulinados
  21. 23. FACTOR REUMATOIDE (FR) <ul><li>Se trata de un anticuerpo de tipo IgM contra la porción Fc de la IgG descrita inicialmente en las pruebas de aglutinación de Látex o en aglutinación de hematíes de carnero sensibilizados; hoy en día existe la posibilidad de realizarla mediante técnicas más sensibles como ELISA, nefelometría, Inmunoturbidimetria. </li></ul><ul><li>Aproximadamente el 80% de los pacientes con AR lo tienen en algún momento de la enfermedad. </li></ul>
  22. 25. AC. ANTIFACTOR PERINUCLEAR (APF) <ul><li>Descubierta en 1964 por Nienhuis y Mandema. </li></ul><ul><li>Estos autoanticuerpos son detectados mediante técnicas de inmunofluorescencia indirecta. </li></ul><ul><li>Sustrato: células de la mucosa bucal. </li></ul><ul><li>Poseen un especificidad de 90-95%. </li></ul><ul><li>Sensibilidad limitada de 40-55% </li></ul>
  23. 26. AC. ANTIQUERATINA (AKA) <ul><li>Descubierta en 1979 por Young. </li></ul><ul><li>Estos autoanticuerpos son detectados mediante técnicas de inmunofluorescencia indirecta. </li></ul><ul><li>Sustrato: criosecciones de esófago de rata. </li></ul><ul><li>Poseen un especificidad de 90-95%. </li></ul><ul><li>Sensibilidad limitada de 40-55%. </li></ul>
  24. 27. AC. ANTI-Sa <ul><li>Descubierta en 1994. </li></ul><ul><li>Detectados utilizando la técnica de inmunoblot. </li></ul><ul><li>Sustrato: utiliza antigenos de bazo y placenta. </li></ul><ul><li>Especificidad 98,9%. </li></ul><ul><li>Sensibilidad 42,7%. </li></ul>
  25. 28. filagrina vimentina APF AKA Anti Sa Proteínas Citrulinadas Anti pcc
  26. 29. Anticuerpos a péptido C citrulinado (Anti Pcc) <ul><li>Los anticuerpos anti-PCC son un grupo de autoanticuerpos, dirigidos contra péptidos citrulinados, presentes en el suero de pacientes afectados con artritis reumatoide. </li></ul><ul><li>De esta forma actúan como marcadores altamente específicos y sensibles para esta enfermedad (97%, 76% respect.), su determinación está dada por el test de ELISA. </li></ul>
  27. 30. Anticuerpos a péptido C citrulinado (Anti Pcc) <ul><li>El autoantígeno es una proteína que se une a un aminoácido poco común, citrulina . </li></ul>
  28. 31. Anticuerpos a péptido C citrulinado (Anti Pcc) <ul><li>Pero... ¿ Qué es la citrulina? </li></ul><ul><li>Es un aa postraduccional sintetizado a partir de otros aa como la arginina mediante la intervención de la enzima peptidil arginina deiminasa (PAD); todo este proceso recibe el nombre de citrulinación. </li></ul>
  29. 32. Anticuerpos a péptido C citrulinado (Anti Pcc) CITRULINACIÓN La citrulinación ocurre en células en proceso de muerte. Consiste en la deiminaciòn de los residuos básicos de arginina para convertirlos en residuos neutros de citrulina, los cuales son específicamente reconocidos por autoanticuerpos en pacientes con AR.
  30. 33. Significado fisiopatológico? <ul><li>Existen algunos datos que pueden sugerir la </li></ul><ul><li>intervención de los PCC en la fisiopatología de la AR. </li></ul><ul><li>La aparición precoz de anticuerpo anti PCC mucho antes del inicio sintomático de la enfermedad. </li></ul><ul><li>El posible mecanismo fisiopatológico que presentan Vossenaar y col, indicando que una agresión articular desencadenaría una respuesta inflamatoria en la que se produciría un daño celular y muerte de células del sistema granulocitario. </li></ul>
  31. 34. Significado fisiopatológico? <ul><li>Con la muerte y destrucción de dichas células, enzimas intracelulares como el PAD pasarían al medio extracelular, produciendo la citrulinación de determinadas proteínas. Estas proteínas citrulinadas se comportarían como neoantígenos y serían presentadas por las células presentadoras de antígeno unidas a moléculas del HLADR. </li></ul>
  32. 35. Significado fisiopatológico? <ul><li>Esto, a su vez produciría una estimulación de las células T, que a su vez estimularían las células B para producir autoanticuerpos anti - PCC . Estos anticuerpos se unirían a las proteínas citrulinadas produciendo una estimulación del sistema mononuclear fagocítico que, a su vez, estimularía la presencia de granulocitos. Pequeñas alteraciones en este proceso pueden llevar a una respuesta anómala perpetuando la inflamación, produciendo, en definitiva, una artritis reumatoide. </li></ul>
  33. 37. Test de ELISA para Anticuerpos a Péptido Citrulinado <ul><li>Esta técnica inmunoenzimática nos ayuda en la detección in vitro de Anticuerpos en el suero humano, que reaccionan con péptidos sintéticos que contienen residuos de citrulina, unidos a la superficie de una placa con micropocillos. </li></ul>
  34. 38. Test de ELISA para Anticuerpos a Péptido Citrulinado <ul><li>Se aplica controles y muestra a los pocillos y se incuba </li></ul>
  35. 39. Test de ELISA para Anticuerpos a Péptido Citrulinado <ul><li>Se realiza el lavado y se añade conjugado HRP (peroxidasa de rábano), con anti- IgG humana de cabra a cada pocillo, e incubar. </li></ul>
  36. 40. Test de ELISA para Anticuerpos a Péptido Citrulinado <ul><li>Se lava, se añade un sustrato cromogénico (TMB) y tras incubación, agregar la Solución de parada (Ac. Sulfúrico) a cada pocillo. </li></ul>
  37. 41. Test de ELISA para Anticuerpos a Péptido Citrulinado <ul><li>Leer absorvancia de 450 nm </li></ul><ul><li>La actividad enzimática presente en el pocillo es proporcional a la intensidad de color desarrollado. </li></ul>
  38. 42. PEPTIDO CITRULINADO CICLICO ANTICUERPOS, SUERO <ul><li>Un resultado positivo indica la presencia de anticuerpos anti-CCP IgG y sugiere la posibilidad de la artritis reumatoide. </li></ul><ul><li>Un resultado negativo indica la ausencia de anticuerpos anti-CCP IgG o niveles inferiores al punto de corte del ensayo. </li></ul>Negativo : Inferior a 20 UI Positivo débil : Entre 20 - 39 UI Positivo moderado: Entre 40 - 59 UI Positivo fuerte : Superior o igual a 60 UI Valores de referencia Enzimoinmunoensayo. (ELISA) Método 1 mL Suero (Recomendada) Muestra
  39. 43. Indicaciones para la prueba <ul><li>Una indicación clínica de AR, pero con resultados dudosos o negativos del Factor Reumatoide. </li></ul><ul><li>Factor Reumatoide falso positivo presuntivamente o la investigación más profunda de una Artritis Reumatoide posible. </li></ul><ul><li>Monitoreo de la actividad de la enfermedad y pronóstico. </li></ul>
  40. 44. Indicaciones para la prueba <ul><li>Un diagnóstico presuntivo de pacientes considerados de alto riesgo de la enfermedad. </li></ul><ul><li>En la literatura se describe la prevalencia y significado clínico de la presencia de Anticuerpos contra el Péptido Cíclico Citrulinado en la artritis juvenil Idiopática. Anti CCP puede ser detectado en niños con Artritis Idiopática Juvenil pero es menos frecuente presente que en adultos con Artritis Reumatoide. </li></ul>
  41. 45. VENTAJAS ELISA ANTI-PCC <ul><li>Mayor sensibilidad </li></ul><ul><li>Es técnica cuantitativa </li></ul><ul><li>Fácil realización y gran reproducibilidad, lo que permite su estandarización y así, lograr su aplicación en la clínica diaria. </li></ul>
  42. 46. <ul><li>En un estudio se enfrentaron las pruebas del CCP2 , el anti filagrina citrulinada (AFA), para evaluar sensibilidad y especificidad. </li></ul><ul><li>  </li></ul>60% 70% FR 48% 98% AFA 65% 96% CCP Especificidad Sensibilidad Pruebas
  43. 48. RESUMEN DE HALLAZGOS CLÍNICOS 1 (3%) 29 Otros pacientes 2 (2%) 87 Enfermedad infecciosa 2 (7%) 29 Crioglobulinemia 9* (8%) 109 Otras enfermedades reumáticas 0 (0%) 38 Síndrome de Sjögren 10* (12%) 86 Escleroderma 10* (10%) 103 Lupus eritematoso sistémico 29 (9%) 336 Enfermedad reumática 28 (40%) 69 Artritis reumatoide FR- 165 (90%) 183 Artritis reumatoide FR+ 193 (76%) 252 Artritis reumatoide 2* (1%) 216 Donantes de sangre al azar CCP IgG ELISA No. ≥ 20 Unidades (%) No. Grupos de pacientes
  44. 49. CONCLUSIONES <ul><li>Los anticuerpos anti CCP suponen una importante herramienta para el diagnóstico precoz y el pronóstico de la Artritis Reumatoide. </li></ul><ul><li>Los anti-PCC son los anticuerpos más específicos en la AR, de manera que sólo los presentan entre el 2-5% de los pacientes afectados por otras enfermedades reumáticas distintas de la AR, así como sujetos sanos. </li></ul><ul><li>Los pacientes anti-CCP desarrollan daño radiológico más severo que los pacientes anti-CCP negativos. </li></ul>
  45. 50. CONCLUSIONES <ul><li>La determinación de anti-CCP combinada con FR-IgM tiene valor adicional sobre la determinación aislada de FR en pacientes con poliartritis temprana. </li></ul><ul><li>La mayoría de los positivos para los anti - PCC también lo son para el FR, sin embargo, hasta una tercera parte de los enfermos afectados de AR con FR negativo son positivos para el PCC . </li></ul>
  46. 51. Gracias...
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