Acoplamiento microextracción en fase

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Acoplamiento microextracción en fase

  1. 1. DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICAACOPLAMIENTO MICROEXTRACCIÓN EN FASESÓLIDA-CROMATOGRAFÍACONSUELO CHÁFER PERICÁS UNIVERSITAT DE VALENCIA Servei de Publicacions 2006
  2. 2. Aquesta Tesi Doctoral va ser presentada a Valencia el dia 18 deJuliol de 2006 davant un tribunal format per: - Dª. Amparo Salvador Carreño - Dª. Purificación López Mahia - D. Joan March Isern - D. Xavier Rius Ferrus - Dª. Carmen Molins LeguaVa ser dirigida per:Dª. Pilar Campíns FalcóDª. Rosa Herráez Hernández©Copyright: Servei de PublicacionsConsuelo Cháfer PericásDepòsit legal:I.S.B.N.:978-84-370-6581-6 Edita: Universitat de València Servei de Publicacions C/ Artes Gráficas, 13 bajo 46010 València Spain Telèfon: 963864115
  3. 3. UNIVERSITAT DE VALÈNCIA FACULTAD DE QUÍMICA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICAACOPLAMIENTO MICROEXTRACCIÓNEN FASE SÓLIDA-CROMATOGRAFÍA TESIS DOCTORAL Consuelo Cháfer Pericás Mayo 2006 I
  4. 4. II
  5. 5. UNIVERSITAT DE VALÈNCIA FACULTAD DE QUÍMICA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA La Dra. Dña. Pilar Campíns Falcó, Catedrática del Departamento de QuímicaAnalítica de la Facultad de Química de la Universidad de Valencia, y la Dra. Dña. RosaHerráez Hernández, Titular del Departamento de Química Analítica de la Facultad deQuímica de la Universidad de Valencia,CERTIFICAN: Que la presente Memoria, "Acoplamiento microextracción en fase sólida-cromatografía", realizada en el Departamento de Química Analítica de la Universidad deValencia, constituye la Tesis Doctoral de Dña. Consuelo Cháfer Pericás. Asímismo, certifican haber dirigido y supervisado tanto los diferentes aspectos deltrabajo como su redacción. Y para que conste a los efectos oportunos, firmamos la presente en Valencia a 25de Mayo de 2006.Dra. Pilar Campíns Falcó Dra. Rosa Herráez Hernández III
  6. 6. IV
  7. 7. ALS MEUS PARESV
  8. 8. VI
  9. 9. AGRAÏMENTS• A Pilar i a Rosa, per tots els coneixements que m’han aportat durant aquests anys, per la seua disponibilitat a ajudar-me en qualsevol moment i per la seua amistat.• Als meus pares, pel seu recolçament incondicional i per haver compartit amb mi cada moment d’esta Tesi.• A Pepo, Juan Luis i Pablo, per entendre’m, animar-me i alegrar-se amb mi.• A Adela, Jorge i Carmen, per ajudar-me quan els he necessitat.• A Yolanda, a Susana, a Luis, a Jose Ramón, a Marta, a Juan, a Judit i a Sandra, pels dinars i tots els bons moments compartits, pel recolçament al laboratori quan les coses no ixen bé i per l’amistat que hem creat.• A Ángel pel seu optimisme i la seua ajuda al laboratori.• A Sonia, Sara, Gemma i Virginia per estar sempre al meu costat, pels cinc anys de carrera compartits, i pels que ens queden per compartir.• A Victoria i José que amb la seua experiència i sencillesa m’han ajudat molt.• Als meus amics, pel seu interés i escoltar-me quan els he necessitat. VII
  10. 10. VIII
  11. 11. ÍNDICETÍTULO ...................................................................................................................... IINDICE ....................................................................................................................... IXLISTADO DE FIGURAS .......................................................................................... XVLISTADO DE TABLAS ............................................................................................ XI XLISTADO DE SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS .................................................. XXIOBJETIVOS ............................................................................................................... 11. INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 71.1. Consideraciones sobre el tratamiento de muestras y la extracción deanalitos………………………………………………………………………………. 91.2. Extracción en fase sólida………………………………….…………………… 91.3. Microextracción en fase sólida (SPME)………………….…………………… 10 1.3.1. Evolución de la SPME………............................................................... 10 1.3.2. Fundamentos de la SPME….................................................................. 12 1.3.2.1. SPME en muestras líquidas………........................................ 14 1.3.2.2. SPME en muestras gaseosas................................................... 18 1.3.3. Parámetros que influyen en el proceso de SPME................................... 21 1.3.4. Tipos de SPME y acoplamientos ........................................................... 22 1.3.4.1. SPME con fibras…………………………............................. 22 1.3.4.2. SPME en tubo……………………......................................... 26 1.3.4.3. SPME por sorción sobre barras magnéticas agitadoras ........ 301.4. Características de los analitos estudiados y legislación aplicable a losmismos……………………………………………………………………………….. 33 1.4.1. Análisis medioambiental……………………………………………… 33 1.4.1.1. Análisis de agua..…………………………………………… 33 1.4.1.2. Análisis de aire……………………………………………... 37 1.4.1.3. Analitos y derivatización…………………………………… 41 1.4.2. Análisis clínico………………………………………………………... 48 1.4.3. Legislación aplicable………………………………………………….. 501.5. Bibliografía (Introducción) ................................................................................ 542. REACTIVOS E INSTRUMENTACIÓN……………………………………….. 612.1. Reactivos ………………………………………………………………………... 632.2. Aparatos, montajes, instrumentación y software ………………...…………... 65 IX
  12. 12. 3. RESULTADOS OBTENIDOS Y DISCUSIÓN ................................................... 733.1. SPME acoplada a cromatografía líquida convencional y derivatización ...... 75 3.1.1. Determinación de metilamina ............................................................ 75 3.1.1.1. Análisis de metilamina mediante microextracción en fase sólida y HPLC después de la derivatización sobre la fibra con 9 - fluorenilmetil cloroformiato................................................................ 76 Elección de la fibra ................................................................ 76 Optimización de las condiciones cromatográficas ................ 78 Optimización del proceso de extracción/derivatización ........ 79 Transferencia a la columna analítica ..................................... 81 Características analíticas…………………………………… 83 Aplicación a muestras reales……………………………….. 86 Conclusiones………………………………………………... 86 3.1.2. Determinación de dimetilamina.......................................................... 87 3.1.2.1. Un nuevo método selectivo para el análisis de dimetilamina en agua por cromatografía líquida utilizando microextracción en fase sólida y derivatización en dos etapas con o-ftalaldialdehido y 9- fluorenilmetil cloroformiato................................................................ 88 Derivatización de dimetilamina con FMOC sobre la fibra .... 89 Derivatización de propilamina con OPA-NAC sobre la fibra 91 Determinación de dimetilamina mediante el método de OPA-NAC/FMOC ................................................................. 94 Aplicación a muestras reales de agua .................................... 95 Conclusiones .......................................................................... 96 3.1.3. Determinación de trimetilamina ........................................................ 97 3.1.3.1 Determinación de TMA en agua mediante cromatografía líquida con derivatización en línea...................................................... 98 Derivatización y condiciones de elución ............................... 98 Selectividad………………………………………... ............ 100 Características analíticas ........................................................ 101 Aplicación a muestras reales de agua .................................... 103 Conclusiones ......................................................................... 104 3.1.3.2. Determinación selectiva de TMA en aire mediante cromatografía líquida usando cartuchos de extracción en fase sólida para el muestreo................................................................................... 105 Procedimiento de muestreo……………………………….... 106 Parámetros analíticos ............................................................. 107 Aplicación .............................................................................. 110 Conclusiones ......................................................................... 110 3.1.3.3. Estudio comparativo de la determinación de TMA en agua y aire combinando cromatografía líquida y microextracción en fase sólida con derivatización sobre la fibra............................................... 111 Optimización del procedimiento de X
  13. 13. extracción/derivatización mediante SPME en muestras acuosas……………………………………………………… 111 Procedimiento de extracción mediante SPME/derivatización en patrones gaseosos............................................................... 114 Características analíticas ........................................................ 115 Muestras de agua……………...…………... 115 Muestras de aire ........................................... 117 Aplicación a muestras reales ................................................. 118 Conclusiones .......................................................................... 119 3.1.4. Determinación de aminas alifáticas ………………………………… 120 3.1.4.1. Evaluación de la microextracción en fase sólida para aminas alifáticas utilizando derivatización con 9-fluorenilmetil cloroformiato y cromatografía líquida………………………………. 121 Comparación de las diferentes aproximaciones de extracción/ derivatización estudiadas………………….…… 122 Optimización del procedimie nto de extracción/derivatización con fibras recubiertas de FMOC... 128 Características analíticas……………………………………. 129 Aplicación a muestras reales de agua………………………. 129 Conclusiones………………………………………………... 130 3.1.5. Determinación de anfetaminas ............................................................ 131 3.1.5.1. Aplicación de la microextracción en fase sólida combinada con la derivatización para la determinación de anfetaminas por cromatografía líquida........................................................................... 132 SPME seguida de la derivatización sobre la fibra…….......... 132 Derivatización en disolución seguida de SPME .................... 135 Aplicación a muestras reales ................................................. 137 Conclusiones .......................................................................... 138 3.1.5.2. Aplicación de la microextracción en fase sólida combinada con la derivatización para la determinación enantiomérica de anfetaminas………………………………………………………….. 140 Optimización del procedimiento de derivatización/SPME ... 140 Características analíticas ........................................................ 145 Comparación con otras aproximaciones de derivatización y tratamiento de muestras ......................................................... 149 Conclusiones .......................................................................... 1523.2. SPME acoplada a cromatografía de gases ........................................................ 153 3.2.1. Determinación de compuestos orgánicos volátiles............................ 153 3.2.1.1. Procedimiento optimizado para la estimación de los principales VOCs legislados en muestras de agua mediante SPME en espaciado de cabeza acoplada a cromatografía de gases y detector de ionización de llama …………………………………….. 154 XI
  14. 14. Optimización del procedimiento SPME-CG……………...... 157 Influencia de la filtración de la muestra……......................... 164 Conclusiones……………………………….......................... 1733.3. SPME en línea acoplada a cromatografía líquida capilar……….................... 175 3.3.1. Determinación de triazinas y compuestos organofoforados............. 175 3.3.1.1. Análisis de screening de triazinas en muestras de agua 176 mediante SPME sobre la fibra y SPME en tubo…………………….. Optimización del proceso de extracción……………………. 180 Características analíticas……………………………………. 184 Aplicación a muestras reales……………………………….. 188 Conclusiones………………………………………………... 193 3.3.1.2. Screening de triazinas y pesticidas organofosforados usando 194 microextracción en fase sólida en tubo acoplada en línea a cromatografía líquida capilar……………………………………….. Eficacia de la extracción ........................................................ 195 Características analíticas…………………………………… 197 Aplicación a muestras reales…………………….................. 200 Conclusiones ......................................................................... 2083.4. Referencias bibliográficas ................................................................................... 2104. CONCLUSIONES FINALES................................................................................ 213 4.1. Conclusiones generales ........................................................................... 215 XII
  15. 15. 5. APÉNDICES……………………………………………………………………… 225Apéndice 1. Analysis of methylamine by solid-phase microextraction and HPLC after on-fibre derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate.Apéndice 2. A new selective method for dimethylamine in water analysis by liquid chromatography using solid-phase microextraction and two-stage derivatization with o-phthalaldialdehyde and 9-fluorenylmethyl chloroformate.Apéndice 3. Liquid chromatographic determination of trimethylamine in water.Apéndice 4. Selective determination of trimethylamine in air by liquid chromatography using solid phase extraction cartridges for sampling.Apéndice 5. Comparative study of the determination of trimethylamine in water and air by combining liquid chromatography and solid-phase microextraction with on-fiber derivatization.Apéndice 6. An evaluation of solid phase microextraction for aliphatic amines using derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate and liquid chromatography.Apéndice 7. Application of solid-phase microextraction combined with derivatization to the determination of amphetamines by liquid chromatography.Apéndice 8. Application of solid-phase microextraction combined with derivatization to the enantiomeric determination of amphetamines.Apéndice 9. An optimized headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-flame ionization detector procedure for the estimation of the main legislated VOCs in water samples.Apéndice 10. On-fibre solid-phase microextraction versus in-tube solid-phase microextraction for the screening analysis of triazines in water samples.Apéndice 11. In-tube SPME-capillary liquid chromatography as a solution to the screening analysis of organophosphorous pesticides in untreated environmental water samples. XIII
  16. 16. XIV
  17. 17. LISTADO DE FIGURASFigura 1. Número de publicaciones sobre SPME en revistas científicas de ámbitointernacional frente a cada año desde 1991 a 2005.................................................................... 11Figura 2. Porcentajes de publicaciones sobre aplicaciones de la SPME a diversas muestras... 11Figura 3. Esquema del dispositivo comercial de SPME............................................................ 12Figura 4. Comparación de los mecanismos de extracción por absorción y adsorción.............. 13Figura 5. Isoterma de Langmuir…………………………………………................................ 17Figura 6. Esquema de la extracción sobre una fibra de SPME revestida con un sólidoporoso…………………………………………………………………………………………. 20Figura 7. Esquema del proceso de SPME acoplada a CL o a CG; (a) inmersión directa; (b)espacio de cabeza; (c) desorción con disolventes; (d) desorción térmica................................... 23Figura 8. Esquema del acoplamiento SPME-CG...................................................................... 24Figura 9. Esquema del acoplamiento SPME en fibra-CL......................................................... 25Figura 10. Esquema de los tres tipos de capilares de extracción en tubo: (A) capilarconvencional, (B) varilla en tubo y (C) fibra en tubo................................................................. 26Figura 11. Esquema del acoplamiento SPME en tubo- CL (en posición de extracción)……... 27Figura 12. Esquema del acoplamiento SPME en tubo- CG………………………..………… 29Figura 13. Esquema del acoplamiento SPME en tubo-EC…………………………………… 30Figura 14. Recuperaciones teóricas de los analitos en SBSE y SPME de una muestra de 10mL en función de su log Ko/w …………………….……............................................................ 31Figura 15. Esquema del sistema de SBSE................................................................................. 32Figura 16. Porcentajes de publicaciones sobre aplicaciones de SPME y derivatización adiferentes analitos……………………………………………………………………………... 44Figura 17. (A) Bomba de aire, (B) Medidor de flujo, (C) Bomba de detección de gases......... 65Figura 18. Interfase de SPME-HPLC comercializada por Supelco........................................... 65Figura 19. Soportes para fibras reemplazablesde SPME aplicada a CG y CL.......................... 66Figura 20. Espectrofotómetro de fila de diodos UV-vis HP 8452 conectado a un PC HewlettPackard Vector XM 5/90............................................................................................................ 66Figura 21. (A) Equipo cromatográfico HP 1100, (B) Detectores UV/vis y fluorímetro........... 67Figura 22. Sistema de cromatografía líquida capilar HP 1100.................................................. 67Figura 23. Sistema de cromatografía de gases Focus GC Termo Finnigan.............................. 68Figura 24. Sistema SPME en fibras-CL utilizado en los Apéndices 1, 2, 5-8 y 10…………... 69Figura 25. Esquema de columnas acopladas empleado en los Apéndices 3 y 4....................... 69Figura 26. Esquema para la volatilización y muestreo de patrones de TMA……….………... 70Figura 27. Esquema para la generación de muestras sintéticas de aire en el Apéndice 4……. 70Figura 28. Esquema de SPM E en tubo con columna empaquetada acoplada a la CL capilarutilizado en el Apéndice 10........................................................................................................ 71Figura 29. Esquema de SPME en tubo con columna abierta acoplada a CL capilar utilizadoen los Apéndices 10 y 11……………………………………………………………...…...….. 71Figura 30. Cromatogramas obtenidos para un blanco de muestra (agua) con (a) fibra dePDMS/DVB de 60 µm, (b) fibra de CW/DVB y (c) fibra de CW/TPR, y (d) cromatogramaobtenido para una disolución estándar de MA (20.0 µg/mL) con la fibra de CW/TPR.Detección: UV a 230 nm…………………………………………….………………………... 77Figura 31. Cromatogramas obtenidos para (a) un blanco (agua), y (b) una disoluciónestándar de MA (40.0 µg/mL). Tiempo de adsorción, 15 min; tiempo de reacción, 2 min;concentración de FMOC, 1mM; tiempo de desorción, 5 min. Sorbente de la fibra, CW-TPR.Detección: fluorimétrica, λexcitación 264 nm y λemisión 313 nm………………………………….. 78 XV
  18. 18. Figura 32. Efecto de las variables experimentales sobre las respuestas de MA-FMOC: (a)tiempo de adsorción, (b) concentración de FMOC y (c) tiempo de reacción. Concentraciónde MA en las muestras, 5.0 µg/mL. Sorbente de la fibra, CW-TPR. Detección: fluorimétrica,λexcitación 264 nm y λemisión 313 nm……………………………………………………………... 80Figura 33. Cromatogramas obtenidos para la MA (a) transferida directamente desde lainterfase SPME-HPLC a la columna analítica y (b) transferida desde la interfase SPME-HPLC a la precolumna y después a la columna analítica. Concentración de MA, 5.0 µg/mL.Sorbente de la fibra, CW-TPR. Detección: fluorimétrica, λexcitación 264 nm y λemisión 313 nm... 83Figura 34. Cromatogramas obtenidos para disoluciones estándar que contienen mezclas deaminas alifáticas: (a) MA, dimetilamina (DMA) y dietilamina (DEA), (b) n-butilamina(BuA) y n -pentilamina (PenA) y (c) etilamina (EA), propilamina (PA) y trimetilamina.Concentración de cada amina en las muestras, 5.0 µg/mL. Sorbente de la fibra, CW/TPR.Detección: fluorimétrica, λexcitación 264 nm y λemisión 313 nm………………………………….. 85Figura 35. Esquemas de reacción para la derivatización de aminas (a) con FMOC (aminasprimarias y secundarias), y (b) con OPA-NAC (sólo aminas primarias)……………………... 88Figura 36. Optimización de las condiciones de reacción entre la DMA y el FMOC: (a)efecto de la concentración de reactivo, para un tiempo de reacción de 5 min; (b) efecto deltiempo de reacción, para una concentración de FMOC de 5 mM …………...………………... 89Figura 37. Cromatogramas obtenidos para (a) un blanco (agua) y (b) una disoluciónestándar de DMA (5 µg/mL) mediante el método de derivatización con FMOC sobre lafibra. Los picos a 7.1 y 11.6 min corresponden a FMOC no reaccionado y a un producto decondensación, respectivamente. Concentración final de FMOC en la mezcla de reacción 3.3mM; tiempo de reacción, 5 min ……………………………………………………………….. 90Figura 38. Cromatogramas obtenidos para disoluciones estándar conteniendo mezclas de lasaminas alifáticas de cadena corta probadas: (a) etilamina (EA) y PA; (b) n-butilamina (BuA)y n-pentilamina (PenA); (c) metilamina (MA), DMA y dietilamina (DEA). Concentración decada amina en las muestras, 5.0 µg/mL. Concentración final de FMOC en la mezcla dereacción 3.3 mM; tiempo de reacción, 5 min………………………………………….……… 91Figura 39. Efecto de la concentración de OPA-NAC sobre las respuestas obtenidas para laPA. Concentración de PA, 5 µg/mL; tiempo de reacción, 5 min............................................... 93Figura 40. Cromatogramas obtenidos para la PA (5.0 µg/mL) (a) por el método de FMOC,y (b) por el método del OPA-NAC/FMOC; (c) cromatograma obtenido para la DMA (5.0µg/mL) por el método del OPA-NAC/FMOC. Reacción con OPA-NAC: concentración finalde OPA-NAC, 13.5 mM; tiempo de reacción, 5 min. Reacción con FMOC: concentraciónfinal de FMOC 3.3 mM; tiempo de reacción, 5 min……………………………………..…… 93Figura 41. Cromatograma obtenido para una muestra de agua residual mediante el métodooptimizado del OPA-NAC/FMOC……………………………...…………………………….. 95Figura 42. Cromatogramas obtenidos para (a) un blanco (agua) y (b) una disoluciónestándar que contiene 2.5 µg/mL de TMA…………………...……………….......................... 101Figura 43. Cromatogramas obtenidos para (a) agua de mar, y (b) agua de mar fortificadacon 1.0 µg/mL de TMA, después de SPE……………………...……………………………… 104Figura 44. Cromatogramas obtenidos para (a) un blanco de aire, y (b) aire que contiene 11.1mg/m3 de TMA…………………………………………………………………………........... 107Figura 45. (a) Cromatograma obtenido para una mezcla de (1) metilamina, (2) etilamina, (3)propilamina, (4) dimetilamina, (5) butilamina, y (6) dietilamina bajo las condicionespropuestas, y (b) cromatograma obtenido para la misma mezcla inyectando el reactivo 0.1min después de la inyección de la muestra................................................................................. 109Figura 46. Efecto de las variables experimentales sobre las respuestas de TMA-FMOC (lasbarras de error significan ± 1S.D. desde la media de n = 3): (a) concentración de FMOC, (b)pH, (c) tiempo de adsorción de FMOC, (d) tiempo de adsorción de TMA, (e) tiempo de XVI
  19. 19. desorción, y (f) tiempo de volatilización……………………………………………………… 112Figura 47. Cromatogramas obtenidos para: (a) blanco (agua) bajo las condicionesoptimizadas, (b) un patrón de TMA (5 µg/mL) bajo las condiciones optimizadas, y (c) unpatrón de TMA (7.5 µg/mL) por el método de derivatización en disolución…………………. 113Figura 48. Cromatogramas obtenidos para (a) blanco de aire y (b) aire que contiene 200mg/m3 de TMA. ......................................................................................................................... 114Figura 49. Áreas medias de pico obtenidas para las aminas con los tres métodos deSPME/derivatización probados. Método 1: extracción de la amina seguida de laderivatización sobre la fibra; Método 2: derivatización en disolución seguida de laextracción del derivado; Método 3: extracción/derivatización sobre la fibra recubierta dereactivo. Concentración de MA y DMA, 1 mg/L; concentración de TMA, 5 mg/L………….. 125Figura 50. Perfiles de área de pico vs concentración de amina para la MA y la DMAobtenidos mediante el método de extracción/derivatización sobre la fibra recubierta dereactivo………………………………………………………………………………………... 126Figura 51. Cromatogramas obtenidos para: (a) un blanco (agua), (b) una disolución quecontiene 10 mg/L de TMA, y (c) una disolución que contiene una mezcla de MA y DMA (1mg/L, de cada una). El pico de 6.9 min corresponde a FMOC no reaccionado………………. 127Figura 52. Cromatogramas obtenidos para (a) un blanco (agua), y (b) un p atrón quecontiene AP, MA y MDMA (5.0 µg/mL de cada una) por el método de SPME seguida dederivatización sobre la fibra........................................................................................................ 133Figura 53. Cromatogramas obtenidos para (a) un blanco (agua), y (b) un patrón quecontenía AP, MA y MDMA (5.0 µg/mL de cada una) por el método de derivatización endisolución/SPME…………………………………………………………………………….... 136Figura 54. Cromatogramas obtenidos para (a) blanco de orina, y (b) orina fortificada conAP, MA y MDMA (10.0 µg/mL, de cada una) por el método de derivatización endisolución/SPME........................................................................................................................ 138Figura 55. Esquemas de los procedimientos probados de extracción/derivatización: (a)SPME del analito seguida de la derivatización sobre la fibra, (b) extracción/derivatización dela anfetamina con fibras recubiertas de OPA -NAC y (c) derivatización en disolución seguidade SPME de los derivados formados………………………………………………………….. 142Figura 56. Cromatogramas obtenidos para anfetamina racémica (7.5 µg/mL, de cadaisómero) por las diferentes aproximaciones de extracción/derivatización probadas: (a) SPMEdel analito seguida de la derivatización sobre la fibra, (b) extracción/derivatización de laanfetamina con fibras recubiertas de OPA-NAC y (c) derivatización en disolución seguidade SPME de los derivados formados………………………………………………………….. 143Figura 57. Cromatogramas obtenidos con el procedimiento propuesto de derivatización endisolución/SPME para (a) un blanco (agua), (b) anfetamina en agua y (c) una mezcla denorefedrina y MDA en agua (2.5 µg/mL de cada enantiómero) ……………….……………... 144Figura 58. Cromatogramas obtenidos con el procedimiento propuesto de derivatización endisolución/SPME para: (a) blanco de orina y (b) orina fortificada con norefedrina y MDA(7.5 µg/mL, de cada isómero)…………………………………………………………………. 147Figura 59. Cromatogramas obtenidos tras la administración de una dosis de 30 mg dehidrocloruro de norefedrina: sujeto 1 (a) inmediatamente y (b) 4.5 h después de laadministración de la droga; sujeto 2 (c) inmediatamente y (d) 11 h después de laadministración de la droga…………………………………………………………………….. 148Figura 60. Cromatogramas obtenidos para orina bajo diferentes aproximaciones deextracción/derivatización: (a) SPE con un cartucho con fase C18 seguida de derivatización endisolución, (b) derivatización asisitida en soporte sólido en una precolumna empaquetadacon fase C18 , y (c) el método propuesto de derivatización en disolución/SPME……………... 151Figura 61. Cromatogramas obtenidos con C1 para la disolución MIX 2: (a) inyeccióndirecta (2 µL) y (b) HS-SPME (10 min tiempo de adsorción; 2 min tiempo de desorción). XVII
  20. 20. Concentración de cada VOC, 1 µg/mL………………………………..……………………… 157Figura 62. Optimización de los parámetros relacionados con el muestreo en el espacio decabeza, (a) tiempo de adsorción, (b) temperatura de extracción, y (c) volumen de muestra….. 158Figura 63. Cromatogramas obtenidos para los distintos VOCs con C1: (a) MIX 1 con 1µg/mL de cada compuesto, (b) patrón de 0.01 µg/mL de pentaclorobenceno y (c) MIX 2 con0.5 µg/mL de cada compuesto………………………….…………………………………….. 163Figura 64. Cromatogramas obtenidos para los distintos VOCs con C2: (a) MIX 2 con 1µg/mL de cada compuesto, (b) patrón de 0.001 µg/mL de pentaclorobenceno y (c) MIX 1con 1 µg/mL de cada compuesto………….…………………………………………………... 163Figura 65. Representación de log Kow frente al log del tiempo de retención (min) obtenidocon la columna C2 para cada analito: (1) 1,2-dicloroetano, (2) penatclorobenceno, (3)tricloro metano, (4) benceno, (5) tetraclorometano, (6) tricloroetileno, (7) tolueno, (8)tetracloroetileno, (9) clorobenceno, (10) etilbenceno, (11) m,p-xileno, (12) o-xileno, (13)1,3-dicloroetileno, (14) 1,4-dicloroetileno y (15) 1,2-dicloroetileno…………………………. 164Figura 66. Representación del tiempo de filtrado requerido para las dos fracciones ………... 165Figura 67. Cromatogramas obtenidos con la columna C2 para una muestra real de agua (a)fracciones no filtradas y (b) fracciones filtradas, en las condiciones óptimas……..…………. 166Figura 68. Concentraciones determinadas (µg/mL) de VOCs en las diferentes muestras deagua analizadas bajo las condiciones óptimas………………………………………………… 167Figura 69. Cromatogramas obtenidos con el procedimiento de SPME sobre la fibra-CLconvencional para (a) blanco y (b) mezcla con 1 µg/mL de cada triazina; cromatogramasobtenidos mediante la SPME en tubo con una columna empaquetada para (c) blanco y (d)mezcla con 0.1 µg/mL de cada triazina; cromatogramas obtenidos mediante SPME en tubocon columna abierta para (e) blanco y (f) mezcla de 0.1 µg/mL de cada triazina…….………. 181Figura 70. Efecto de la presencia de ácido húmico en la adsorción de triazinas sobre la fibra(1 µg/mL de cada triazina). Tiempo de adsorción 45 min y tiempo de desorción 10 min……. 182Figura 71. Optimización del volumen de muestra para un patrón de 100 µg/L de cadatriazina en el método de SPME en tubo con una columna abierta (a) columna de 0.1 mm ded. i. (C2) y (b) columna de 0.25 mm de d. i (C1)…………………...………………………… 183Figura 72. Concentraciones de triazinas encontradas en diferentes tipos de aguas analizadasen la bibliografía: [68-71, 76, 82] y legislación Europea (columna rayada)………………….. 185Figura 73. Cromatogramas obtenidos para (a) agua residual (S5) diluida 5 veces e inyectadadirectamente, y (b) agua residual (S5) no diluida, analizada mediante el procedimientobasado en SPME sobre la fibra………………………………………………………………... 188Figura 74. Cromatogramas obtenidos mediante el procedimiento de SPME en tubo concolumna abierta de 0.25 µm de espesor de capa para las muestras (a) S15 y (b) S17………... 193Figura 75. Cromatogramas obtenidos en las condiciones óptimas para los compuestosorganofosforados con (a) capilar de 0.1 mm de d.i. y 0.1 µm de espesor de capa, y (b) capilarde 0.25 mm de d.i. y 0.25 µm de espesor de capa; para las triazinas con (c) capilar de 0.1mm de d.i. y 0.1 µm de espesor de capa, y (d) capilar de 0.25 mm de d.i. y 0.25 µm deespesor de capa; y (e) para los PAHs y el nonilfenol con capilar de 0.25 mm de d.i. y 0.25µm de espesor de capa. Concentración de pesticidas organofosforados y triazinas, 0.1 µg/mL(de cada uno); concentración de PAHs y nonilfenol, 0.05 µg/mL………………….………… 197Figura 76. Cromatogramas obtenidos en las condiciones óptimas con el capilar de 0.25 mmde d.i. y 0.25 µm de espesor de capa para (a) dos réplicas de la muestra S10, (b) muestra S10aditivada con los pesticidas organofosforados (0.1 µg/mL de cada uno), y (c) muestra S10aditivada con las triazinas (0.05 µg/mL de cada una)……………...……………..................... 201Figura 77. Cromatogramas obtenidos en las condiciones óptimas para muestras residuales.... 202Figura 78. Gráfico de puntuaciones con dos componentes principales……...……………….. 221Figura 79. Gráfico de puntuaciones con tres componentes principales………………………. 221 XVIII
  21. 21. LISTADO DE TABLASTabla 1. Resumen de las fibras disponibles comercialmente………………………………… 14Tabla 2. Clasificación de contaminantes de las aguas en función de su naturaleza………….. 34Tabla 3. Normativa vigente en materia de aguas……………………………………………... 36Tabla 4. Legislación vigente en materia de contaminación atmosférica……………………... 38Tabla 5. Normativa legal relacionada con la calidad del aire interior………………………... 40Tabla 6. Valores límites ambientales y métodos de referencia para aminas en agua y en aire. 42Tabla 7. Concentraciones máximas legisladas para los parámetros y tipos de muestrasestudiadas……………………………………………………………………………………… 51Tabla 8. Listado de reactivos, casas comerciales y pictogramas de seguridad.......................... 63Tabla 9. Comparación entre los procedimientos utilizados para la extracción yderivatización de MA con los métodos de derivatización sobre la fibra de SPME y dederivatización asistida sobre un soporte sólido……………………………………………….. 81Tabla 10. Exactitud para la determinación de MA mediante los métodos de derivatizaciónsobre una fibra de SPME y de derivatización asistida sobre soporte sólido (n = 3)…………... 84Tabla 11. Exactitud para la determinación de DMA mediante el método optimizado delOPA-NAC/FMOC (n = 3)…………..………………………………………………………… 94Tabla 12. Programa de tiempos y condiciones usadas en la determinación de TMA............... 99Tabla 13. Exactitud para la determinación de TMA (n= 3)…………………………..………. 103Tabla 14. Datos analíticos obtenidos para la TMA en aire……………………………..…….. 108Tabla 15. Procedimiento optimizado para la ex tracción mediante SPME/derivatizaciónsobre la fibra de TMA con FMOC………………………………………………………..…... 113Tabla 16. Datos analíticos para la determinación de TMA………………………………..…. 115Tabla 17. Exactitud para la determinación de TMA en diferentes tipos de muestras……..…. 117Tabla 18. Comparación de las ecuaciones de calibración obtenidas para la MA, la DMA y laTMA por los diferentes procedimientos ensayados…………………………..………………. 127Tabla 19. Optimización del método seleccionado de SPME/derivatización. Los valoressubrayados corresponden a los valores seleccionados en el procedimiento final……………... 128Tabla 20. Datos analíticos para la determinación de MA, DMA y TMA por el métodopropuesto de derivatización sobre la fibra de SPME………………………………………….. 129Tabla 21. Resultados obtenidos del análisis de agua de consumo y agua de río fortificadascon MA, DMA y TMA (n = 3)……………………………………………………….……….. 130Tabla 22. Eficacias de los métodos de SPME/derivatización sobre la fibra y derivatizaciónen disolución/SPME (n= 3)……...……………………………………………………………. 134Tabla 23. Datos analíticos para la determinación de AP, MA y MDMA en agua por elmétodo de SPME/derivatización sobre la fibra……………………………………………….. 135Tabla 24. Datos analíticos para la determinación de AP, MA y MDMA en agua y en orinapor el método de derivatización/SPME...................................................................................... 137Tabla 25. Datos analíticos para la determinación de anfetamina, MDA y norefedrina enagua y en orina por el método de derivatización en disolución/SPME...……………………... 146Tabla 26. Exactitud en la determinación de anfetaminas en orina aditivada………..………... 149Tabla 27. Datos analíticos de las diferentes aproximaciones para determinar anfetaminas enagua y orina………………………………………………………………………………….... 150Tabla 28. Compuestos orgánicos volátiles seleccionados como analitos…………………….. 155Tabla 29. Datos analíticos obtenidos para los VOCs mediante las dos columnas evaluadas … 160Tabla 30. Exactitud para la determinación de VOCs en agua destinada al consumo humano.. 162Tabla 31. Resumen de las concentraciones encontradas (µg/L) en el análisis de muestrasreales (n= 2)………………………………………………………………………………….... 168 XIX
  22. 22. Tabla 32. Concentraciones máximas permitidas por la legislación europea y americana paratriazinas en función del tipo de agua………………………………………………………….. 176Tabla 33. Características de los procedimientos de extracción de triazinas descritos en labibliografía…………………………………………………………………………………….. 177Tabla 34. Triazinas seleccionadas como analitos…………………………………….............. 179Tabla 35. Recuperaciones de los procedimientos de SPME sobre la fibra y SPME en tubo.... 184Tabla 36. Características analíticas de los procedimientos estudiados……………………...... 186Tabla 37. Concentraciones encontradas de triazinas y exactitud en diferentes tipos demuestras analizadas mediante los procedimientos estudiados (n= 3)………….……………… 189Tabla 38. Programa de longitudes de onda de excitación y de emisión para el detector defluorescencia…………………………………………………………………………………... 194Tabla 39. Eficacias obtenidas con las dos columnas capilares de CG evaluadas para laSPME en tubo (n= 6)………………………………………………………………………….. 196Tabla 40. Datos analíticos obtenidos con las dos columnas ensayadas para los analitos…….. 198Tabla 41. Resumen de los tiempos de retención y concentraciones encontradas de losanalitos y otros contaminantes potenciales en muestras reales de agua mediante la SPME entubo con el capilar de 0.25 mm de d.i. y 0.25 µm de espesor de sorbente……………………. 203Tabla 42. Principales características de los métodos propuestos en esta Tesis……………..... 215Tabla 43. Ventajas de los métodos propuestos para el análisis de muestras líquidas (a mayornúmero de asteriscos *, mejor condición)…………………………………………………….. 218Tabla 44. Ventajas de los métodos propuestos para el análisis de muestras gaseosas (amayor número de asteriscos *, mejor condición)……………………………….…………….. 222 XX
  23. 23. LISTADO DE SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS %CV Coeficiente de variación (%) %Er Error relativo (%) λem Longitud de onda de emisión λexc Longitud de onda de excitación AP Anfetamina BuA Butilamina Car Carboxen CL Cromatografía Líquida CG Cromatografía de Gases Conc. Concentración CW Carbowax DAD Detector de fila de diodos DEA Dietilamina DER Desviación estándar residual d. i. Diámetro interno DMA Dimetilamina DNB DinitrobenzoiloDns-Cl Cloruro de dansilo d.s.r. Desviación estándar relativa DVB Divinilbenceno EA Etilamina EC Electroforesis Capilar ECD Detector de captura electrónica EPA Agencia de Protección Medioambiental FID Detector de ionización en llamaFMOC 9-Fluorenilmetil cloroformiato HA Ácidos húmicos HPLC Cromatografía líquida de alta resolución HS Espacio de cabeza IL Intervalo linealINSHT Instituto Nacional de Seguridad e Higiene en el Trabajo LDC Límite de cuantificación LDD Límite de detección LLE Extracción líquido-líquidoLLME Microextracción líquido-líquidoLPME Microextracción en fase líquida MA Metanfetamina MA MetilaminaMDMA 3,4-MetilendioximetanfetaminaMEPS Microextracción sobre jeringa empaquetada MIP Polímeros de impresión molecular MS Espectrometría de masas n Número de puntos XXI
  24. 24. NAC N-Acetil-L-cisteinaOPA o-ftaldialdehidoOSHA Administración Ocupacional de la Seguridad y la Salud PA Propilamina PAH Hidrocarburo aromático policíclico PDFS Polidifenilsiloxano PDMS Polidimetilsiloxano PenA Pentilamina QA Química Analítica RPLC Cromatografía líquida de fase inversa s segundo SBSE Extracción por sorción sobre barras magnéticas SDME Microextracción sobre una sola gota SPME Microextracción en fase sólida SPD Dispersión en fase sólida SPDE Extracción dinámica en fase sólida SPE Extracción en fase sólida SRM Material de referencia certificado s/S.D. Desviación estándar SWC Cromatografía con agua en estado subcrítico SWE Extracción con agua en estado subcrítico TEA Trietilamina TMA Trimetilamina TPR Plantilla de resina TSD Detector termoiónico específico UE Unión Europea UV UltravioletaVLA-EC Valor límite ambiental de exposición cortaVLA-ED Valor límite ambiental de exposición diaria VOC Compuesto orgánico volátil W Agua WHO Organización Mundial de la Salud XXII
  25. 25. OBJETIVOS 1
  26. 26. 2
  27. 27. OBJETIVOSOBJETIVOS Los compuestos orgánicos se caracterizan por tener una estructura molecularespecífica partiendo de unos pocos elementos como C, H, O, N, y en algunos casos de S,P y halógenos. Por tanto, es fácil comprender la complejidad que implica ladeterminación individual de los mismos. Por otro lado no son muy numerosos losdetectores disponibles para el análisis de compuestos orgánicos y de ellos muy pocos sonespecíficos. Esto hace que la mayor parte del peso del análisis recaiga en la preparaciónde la muestra, donde se ha de conseguir la separación de los analitos de la matriz y deotras sustancias interferentes. Esta preparación englobará, en general, tres etapas:extracción, preconcentración y limpieza. El análisis de algunos compuestos, por sus propiedades físico-químicas, resultaespecialmente complejo ya sea por su difícil extracción o por no disponer en ellaboratorio de una técnica adecuada que permita su estimación final con los límites dedetección adecuados. E estos casos, el empleo de procesos de derivatización para ntransformarlos en otros compuestos de más fácil análisis es la solución más adecuada. La demanda actual de métodos analíticos rápidos, de coste adecuado, limpios ysuficientemente sensibles para poder controlar la contaminación en medioambiente yestablecer las concentraciones requeridas en análisis clínicos, es significativa. Esta Tesis va dirigida al estudio del acoplamiento microextracción en fase sólida(SPME)-cromatografía. El grupo de investigación en el momento de plantearse lapresente investigación tenía una larga tradición en extracción en fase sólida, y encromatografía convencional y de columnas acopladas, por lo que el paso a lamicroextracción se orientó a la miniaturización, que era uno de los objetivos de laQuímica Analítica de aquel momento y del presente. La SPME nació en la década de los90 de la mano del profesor Pawliszyn y todavía presenta un crecimiento exponencial enel número de publicaciones científicas (Figura 1, pág. 11 del Capítulo 1-Introduccción).La Tesis abarca aspectos poco tratados en la bibliografía como se verá en el capítulo deIntroducción: formación de derivados en la fibra y acoplamiento SPME-cromatografíalíquida (CL). Se estudian las configuraciones SPME con fibras-CL convencional y SPMEen tubo-CL capilar. También aborda el acoplamiento más utilizado SPME-cromatografíade gases con el objeto de contrastarlo con los estudiados. Los analitos han sido elegidos por sus propiedades de toxicidad y por revestirinterés clínico y/o medioambiental. 3
  28. 28. TESIS DOCTORAL Los proyectos concedidos al grupo de investigación y las becas disfrutadas, hansido el marco de esta Tesis:• Proyecto PPQ2000-01641 concedido por el Ministerio de Ciencia y Tecnología:“Métodos totales de análisis de aminas en matrices de interés medioambiental”. Períodode vigencia: 28-12-2000 a 27-12-2003.• Proyecto BQU2003-06138 concedido por el Ministerio de Ciencia y Tecnología:“Métodos totales de análisis de amoníaco, aminas y triazinas en matrices de interésambiental: convencional, micro y nano”. Período de vigencia: 15-11-2003 a 14-11-2006.• Proyecto CTQ2004-03088/BQU concedido por el Ministerio de Educación y Ciencia:“Métodos enantioselectivos para el control analítico de pesticidas: aplicación a laestimación del impacto ambiental y al desarrollo de nuevos productos”. Período devigencia: 13-12-2004 a 13-12-2005.• Beca predoctoral FPU (2003-2006) concedida por el Ministerio de Educación yCultura de España. Los objetivos específicos desarrollados se ajustan al siguiente esquema:1. Microextracción en fase sólida acoplada a cromatografía líquida convencional y derivatización: 1.1. Análisis de metilamina mediante microextracción en fase sólida y cromatografía líquida después de su derivatización sobre la fibra con 9 -fluorenilmetil cloroformiato ( Apéndice 1). 1.2. Un nuevo método selectivo para el análisis de dimetilamina en agua por comatografía líquida utilizando microextracción en fase sólida y derivatización en dos etapas con o-ftalaldialdehido y 9-fluorenilmetil cloroformiato (Apéndice 2). 1.3. Determinación de trimetilamina en agua mediante cromatografía líquida (Apéndice 3 1.4. Determinación selectiva de trimetilamina en aire mediante ). cromatografía líquida usando cartuchos de extracción en fase sólida para el muestreo (Apéndice 4). 1.5. Estudio comparativo de la determinación de trimetilamina en agua y aire combinando microextracción en fase sólida y cromatografía líquida con derivatización sobre la fibra (Apéndice 5). 1.6. Evaluación de la mic roextracción en fase sólida para aminas alifáticas utilizando derivatización con 9-fluorenilmetil cloroformiato y cromatografía líquida (Apéndice 6). 1.7. Aplicación de la microextracción en fase sólida combinada con la derivatización para la determinación de anfetaminas por cromatografía líquida (Apéndice 7). 1.8. Aplicación de la microextracción en fase sólida combinada con la derivatización para la determinación enantiomérica de anfetaminas (Apéndice 8).4
  29. 29. OBJETIVOS2. Microextracción en fase sólida acoplada a cromatografía de gases: 2.1. Procedimiento optimizado para la estimación de los principales VOCs legislados en muestras de agua mediante SPME en espaciado de cabeza acoplada a cromatografía de gases y detector de ionización de llama (Apéndice 9).3. Microextracción en fase sólida acoplada en línea a cromatografía líquida capilar: 3.1. Análisis de screening de triazinas en muestras de agua mediante SPME sobre la fibra y SPME en tubo con columna empaquetada y abierta (Apéndice 10). 3.2. Screening de triazinas y pesticidas organofosforados mediante SPME en tubo con columna abierta (Apéndice 11). 5
  30. 30. TESIS DOCTORAL6
  31. 31. 1. INTRODUCCIÓN 7
  32. 32. 8
  33. 33. Capítulo 1. INTRODUCCIÓN1.1. CONSIDERACIONES SOBRE EL TRATAMIENTO DEMUESTRAS Y LA EXTRACCIÓN DE ANALITOS Los métodos analíticos generalmente requieren un paso de extracción ypreconcentración antes de llevar a cabo la detección de compuestos orgánicos presentes anivel de trazas en matrices medioambientales y biológicas. El pretratamiento de lamuestra mejora la sensibilidad y reduce las interferencias de la matriz. En análisismedioambiental y biomédico se utilizan una gran variedad de técnicas de extracción ypreconcentración, incluyendo la extracción líquido-líquido (LLE) [1], la extracción enfase sólida (SPE) [2], la extracción líquido-gas [3] y el equilibrio líquido-gas (como elespaciado de cabeza estático) [4] entre las más habituales. Una tendencia actual en Química Analítica es la miniaturización. Las técnicasminiaturizadas para el tratamiento de las muestras son: la microextracción líquido –líquido (LLME) [5], la SPE utilizando discos o cartuchos [6, 7], la SPE en línea [8, 9], laSPE sobre una fibra colocada dentro de un tubo [10, 11], la microextracción en fasesólida (SPME) [12], la SPME en tubo [13], la extracción dinámica en fase sólida (SPDE)[14], la microextracción sobre una jeringa empaquetada (MEPS) [15], la microextracciónen fase líquida (LPME) [16], la microextracción sobre una sola gota (SDME) [17], laextracción por sorción sobre barras magnéticas agitadoras (SBSE) [18] y la extracciónsobre una membrana [19]. Estas técnicas permiten que los análisis sean más rápidos,presentando una mayor capacidad de procesamiento de muestras, un menor consumo dedisolvente y muestra, un menor coste por unidad de muestra y una mejora de lasensibilidad. En general, la reducción en el consumo de disolventes contribuye a unareducción significativa de costes. Algunas de estas técnicas permiten realizar análisis decampo. En muchos casos, las técnicas miniaturizadas de preparación de muestras puedenautomatizarse y operar en línea con el instrumento de medida. El acoplamiento en líneaentre extracción y análisis aumenta la sensibilidad y minimiza las posibles pérdidas deanalito.1.2. EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA En la actualidad la SPE es la técnica de preconcentración más utilizada debido aque el consumo de disolventes orgánicos es reducido, los tiempos requeridos para laextracción son cortos y la manipulación de la muestra es pequeña. Además todo elproceso de medida puede automatizarse conectando la SPE en línea con la cromatografíade gases (CG) [20] o con la cromatografía líquida (CL) [21]. La SPE se basa en elprincipio de la diferente afinidad del analito entre una fase sólida que es el sorbente, y unalíquida que es la muestra. Existen diferentes tipos de sorbentes que se seleccionan enfunción de los analitos que se quieran determinar, y se comercializan en forma de discoso cartuchos. Se pueden diferenciar cinco tipos: de sílices entrelazadas, de carbón [22],poliméricos [23-25], inmunosorbentes, y polímeros de huella molecular [26]. Los analitosretenidos se desorben generalmente con volúmenes pequeños de un disolvente orgánicocuando la SPE se realiza fuera de línea combinada con la CG [27] o con la CL [28], y con 9
  34. 34. MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDAla fase móvil cromatográfica cuando la SPE se acopla en línea con la CL [26]. La SPE esel precedente de la microextracción en fase sólida. En algunos casos la formación de derivados de los analitos puede mejorar lascaracterísticas analíticas del procedimiento [29]. El procedimiento de derivatización en elinterior de cartuchos de SPE propuesto por el grupo de investigación en 1996, consiste enretener los analitos de la muestra en el soporte sólido y a continuación pasar el reactivo asu través; se dejan reaccionar durante un tiempo determinado, y finalmente se eluyen losderivados en un volumen pequeño [30]. En esta Tesis se ha propuesto un procedimientopara la determinación de trimetilamina (TMA) en agua (Apéndice 3) mediantederivatización en el interior de una precolumna empaquetada con fase C18 y conectadaen línea a la columna analítica de CL. Los métodos tradicionales para determinar las concentraciones de compuestosaromáticos y alifáticos en el aire se basan en el muestreo activo. Este tipo de muestreo serealiza mediante bombas que pasan el aire a través de soportes sólidos a un flujodeterminado. A continuación se lleva a cabo la desorción térmica o química. Laaproximación más usada consiste en el empleo de un adsorbente apropiado como gel desílice [31], o un relleno ácido de tipo XAD-7 [32]. Otra posibilidad es el uso deborboteadotes que contiene disoluciones ácidas [33], pero la tendencia es reemplazar losmétodos de muestro en disolución por técnicas de extracción sin disolventes. El empleode cartuchos de SPE es una alternativa rápida y simple para retener las aminas volátiles.En esta Tesis se describe un método para el análisis de TMA en aire, que se basa en elempleo de cartuchos de SPE con fase de tipo C18 para retener el analito y de CL(Apéndice 4).1.3. MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA1.3.1 EVOLUCIÓN DE LA SPME En los años 80 los químicos analíticos dieron mucha importancia a las técnicas depreparación de muestras sin disolventes, las cuales se basaban en la extracción porsorción sobre una base de goma. A mediados de los años 80 se investigó la extracción decompuestos orgánicos de una fase acuosa o gaseosa mediante trampas tubulares, abiertasy revestidas con capas gruesas de polidimetilsiloxano (PDMS). Sin embargo, suaplicación quedó limitada debido a su pequeña capacidad de muestreo y a los pequeñosvolúmenes de autoelución. En 1989, Arthur y Pawliszyn desarrolla ron un método demicroextracción basado en la sorción sobre PDMS al que llamaron microextracción enfase sólida [34]. Se propuso para solucionar algunos de los problemas relacionados conlos métodos tradicionales, por ejemplo, la formación de emulsiones, el elevado consumode disolventes, efectos de memoria y las altas señales del blanco. Debido a su simplicidady rendimiento, la SPME despertó un gran interés como técnica de extracción por sorción.Desde su introducción esta técnica se ha extendido mucho, lo que queda reflejado en elnúmero de publicaciones en revistas científicas de gran prestigio que, según la base dedatos Web del Conocimiento (Ciencias) desde 1991 hasta 2005, es del orden de 220010
  35. 35. Capítulo 1. INTRODUCCIÓNpublicaciones. La Figura 1 refleja el crecimiento exponencial en el número depublicaciones en los últimos 15 años. Se han presentado aplicaciones en diferentescampos, incluyendo el medioambiental, el farmacéutico, el biomédico y elagroalimentario [35] como se observa en la base de datos mencionada anteriormente. LaFigura 2 muestra el porcentaje de publicaciones para cada campo, destacando que el másestudiado es el alimentario. 400 350 300 Nº Publicaciones 250 200 150 100 50 0 1990 1995 2000 2005 Año Figura 1. Número de publicaciones sobre SPME en revistas científicas de ámbito internacional frente a cada año desde 1991 a 2005. medioambiental agroalimentario biológico Figura 2. Porcentajes de publicaciones sobre aplicaciones de la SPME a diversas muestras. 11
  36. 36. MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA1.3.2. FUNDAMENTOS DE LA SPME La SPME es una técnica de extracción de los analitos de la matriz de la muestraque se caracteriza por ser rápida, barata, limpia y versátil, y que puede acoplarse a la CGo a la CL. Utiliza fibras de sílice fundida revestidas con un polímero para extraer losanalitos de las muestras. El pequeño diámetro de la fibra y su geometría cilíndricapermiten incorporarla en una jeringa. De esta forma se facilita su manipulación y seprotege la fibra cuando no se utiliza. En la Figura 3 se muestra un dispositivoconvencional de SPME. Su diseño hace de ésta una técnica adecuada para el análisis decampo. Émbolo Tambor de la jeringa Tornillo de retención Ranura en forma de Z Cuerpo central Aguja Figura 3. Esquema del dispositivo comercial de SPM E. Esta técnica presenta una serie de ventajas respecto a las técnicas depreconcentración mencionadas anteriormente ya que es una técnica de extracción que noutiliza disolventes y que requiere pequeños volúmenes de muestra. Con sólo tres tipos demateriales adsorbentes se cubre una gran variedad de analitos a determinar en muestraslíquidas [36], sólidas [37] o gaseosas [38]. Como inconveniente se puede mencionar quedebido a la limitada capacidad de extracción de las fibras (la cantidad de fase estacionariaes muy pequeña) la sensibilidad que puede alcanzarse es también limitada, sobre todo sise acopla a la CL [39]. Existen dos tipos de mecanismos de extracción en función de los distintossorbentes de SPME disponibles comercialmente. El más usado es el polidimetilsiloxano(PDMS), que es líquido. Las fibras de PDMS y las de poliacrilato (PA) extraen losanalitos por absorción, disolviéndolos. El resto de sorbentes, incluyendo PDMS-DVB(divinilbenceno), Carbowax-DVB, Carbowax-TPR (plantilla de resina) y Carboxen (Car)-PDMS, son mezclas de capas, en las que la fase primaria de extracción es un sólido12
  37. 37. Capítulo 1. INTRODUCCIÓNporoso, y los analitos se extraen por adsorción. Los fundamentos de la adsorción y de laabsorción son diferentes. La Figura 4 presenta los estados inicial y de equilibrio deambos procesos de extracción. Independientemente de la naturaleza del sorbente, lasmoléculas de los analitos alcanzan su superficie. El hecho de que migren hacia el interiordel sorbente o se queden en la superficie depende de la magnitud del coeficiente dedifusión del analito en el sorbente. La difusión de las moléculas orgánicas en PDMS esrelativamente rápida, por tanto la difusión en PDMS se produce por absorción. Sinembargo, los coeficientes de difusión de las moléculas orgánicas en DVB y Car son tanpequeños que, en el tiempo de análisis de la SPME, todas las moléculas permanecen en lasuperficie del sorbente. Estas moléculas orgánicas deberían permanecer en contacto conla capa durante un largo tiempo (días o semanas) para que difundieran hacia el interior delsorbente (distancias muy cortas). Esto se manifestaría durante el análisis en un persistenteefecto memoria, difícil de eliminar incluso después de varias desorciones. Algunas fases se comercializan con espesores diferentes (PDMS 7, 30 y 100 µm)y esto afecta tanto al tiempo de equilibrio como a la sensibilidad del método. El uso deuna fibra gruesa requiere un tiempo de extracción más largo pero las recuperaciones songeneralmente mayores. El tiempo de extracción para que se alcance el equilibrio esindependiente de la concentración de analito en la muestra. Soporte Analito Relleno Absorción A d s o r c i ó n- p o r o s g r a n d e s A d s o r c i ó n- p o r o s p e q u e ñ o s Figura 4. Comparación de los mecanismos de extracción por absorción y adsorción. En la Tabla 1 se enumeran los sorbentes poliméricos más comunes que estándisponibles comercialmente. Las fases estacionarias están inmovilizadas sin enlaces, obien están parcialmente o muy entrelazadas. Las fases no enlazadas son estables enalgunos disolventes orgánicos miscibles con agua; sin embargo puede producirse unaligera hinchazón si se usa con disolventes no polares. Las fases enlazadas soncompatibles con la mayoría de los disolventes orgánicos excepto con los no polares. Las 13
  38. 38. MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDAfases parcialmente entrelazadas son estables en la mayoría de los disolventes miscibles enagua. Las fases muy entrelazadas son equivalentes a las parcialmente entrelazadas,excepto en que tienen algunos enlaces con el centro de la fibra [40]. Tabla 1. Resumen de las fibras disponibles comercialmente. Sorbente de la Espesor Polaridad Descripción Máxima Técnica Compuestos a fibra de la de la fase Temp. de analizar capa trabajo (µm) (ºC) PDMS 100 No polar No enlazada 280 CG/HPLC Volátiles PDMS 30 No polar No enlazada 280 CG/HPLC No polares - semivolátiles PDMS 7 No polar Enlazada 340 CG/HPLC Poco polares - semivolátiles PDMS-DVB 65 Bipolar Entrelazada 270 CG Polares volátiles PDMS-DVB 60 Bipolar Entrelazada 270 HPLC General PDMS-DVB a 65 Bipolar Entrelazada 270 CG Polares- volátiles PA 85 Polar Entrelazada 320 CG/HPLC Polares- semivolátiles Carboxen-PDMS 75 Bipolar Entrelazada 320 CG Gases y volátiles Carboxen-PDMSa 85 Bipolar Entrelazada 320 CG Gases y volátiles Carbowax-DVB 65 Polar Entrelazada 265 CG Polares Carbowax-DVB a 70 Polar Entrelazada 265 CG Polares Carbowax-TPR 50 Polar Entrelazada 240 HPLC Tensioactivos DVB-PDMS- 50/30 Bipolar Entrelazada 270 CG Volátiles Carboxen a Tipo Stableflex se encuentra sobre una fibra de 2 cm de longitud.1.3.2.1. SPME EN MUESTRAS LÍQUIDASAbsorción El princip io en el que se basa la SPME es la partición de los analitos entre lamatriz de la muestra y el recubrimiento de la fibra cuando se alcanza el equilibrio entreambas fases. La absorción es un proceso no competitivo. Existen básicamente dos modos de extracción en SPME, introduciendo la fibradirectamente en la muestra, o bien en el espacio de cabeza de la muestra. El modelomatemático que explica la dinámica del proceso de absorción cuando la fibra se introducedirectamente en la muestra, indica que existe una relación lineal entre el número de molesabsorbidos sobre la fibra (n) y la concentración de analito en la fase acuosa (C0 ) [41], talcomo se recoge en la siguiente ecuación: Kfs Vf C0 Vs (1) n= Kfs Vf + Vs14
  39. 39. Capítulo 1. INTRODUCCIÓNdonde Kfs es el coeficiente de partición entre la fibra y la muestra, y Vf y Vs son losvolúmenes de fibra y de muestra, respectivamente. Si en la ecuación anterior se asumeque generalmente el volumen de la fibra es mucho más pequeño que el de la muestra(Vf<<Vs ): n = Kfs V f C o (2) Esta aproximación no es válida en el caso de que los analitos tengan elevadaafinidad por la fibra y se utilicen volúmenes de muestra pequeños. El modelo matemático para la SPME cuando los analitos se extraen del espaciode cabeza tiene en cuenta una tercera fase gaseosa [42]. La cantidad de analito extraída enel sorbente está relacionada con el equilibrio de los analitos en las tres fases. La cantidadtotal de analito debe mantenerse constante durante la extracción: (3) Co V 2 = C1∞ V 1 + C2 V 2 + C 3 V 3 ∞ ∞donde C0 es la concentración inicial del analito en la muestra acuosa; C1 ∞, C2 ∞, C3 ∞ sonlas concentraciones en el equilibrio del analito en el sorbente, en la solución acuosa y enel espacio de cabeza, respectivamente; V1 , V2 , V3 son los volúmenes de sorbente, de lasolución acuosa y del espacio de cabeza, respectivamente. Se define el coeficiente departición sorbente/gas como K1 = C1 ∞/C3 ∞ y el coeficiente de partición gas/agua como K2 =C3 ∞/C2 ∞. K es el coeficiente de partición entre la fibra y la disolución. La cantidad deanalito absorbida sobre el sorbente (n) puede expresarse como: C0 V1 V2 K n= (4) KV1 + K 2 V3 + V 2Comparando la ecuación (4) con la ecuación (1), observamos que exceptuando el término ∞extra de K2 V3 , el cual está relacionado con la capacidad ( C3 V 3 ) del espacio de cabeza,las dos ecuaciones son idénticas. Para la mayoría de los analitos K2 es relativamentepequeña y el muestreo en el espacio de cabeza no afectará la cantidad de analito retenidaen el sorbente si el volumen del espacio de cabeza es mucho menor que el volumen de lasolución acuosa (V 3 <<V2 ). Asumiendo también que V1 <<V2 resulta la expresión: n = K V 1 Co (5)Concluyendo, en las ecuaciones (2) y (5) la cantidad de analito adsorbida sobre la fibra(n) depende de la concentración inicial en la muestra (C0 ). La cinética del proceso es otra cuestión a tener en cuenta en SPME. Los analitosdeben transportarse desde la matriz de la muestra hasta el sorbente en el muestreo porinmersión, o desde la matriz de la muestra al espacio de cabeza y de allí a la fibra en elmuestreo en espacio de cabeza. Algunos compuestos con elevado coeficiente de partición 15
  40. 40. MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDAentre el sorbente y la fase acuosa requieren tiempos largos de muestreo. Esto es debido aque un gran número de moléculas de analito tienen que atravesar una capa estática deagua con un coeficiente de difusión muy bajo para llegar al sorbente. Esta limitacióncinética se puede solucionar mediante técnicas de agitación eficaces como la sonicación.Los tiempos de muestreo pueden reducirse sustancialmente mediante el muestreoindirecto en el espacio de cabeza, ya que la difusión de los analitos en la fase gaseosa es 4órdenes de magnitud mayor que en la fase acuosa. El equilibrio entre la fase acuosa y lafase gaseosa se puede conseguir rápidamente mediante agitación constante de la muestraacuosa, de modo que continuamente se esté generando una superficie nueva. El muestreoen el espacio de cabeza permite aplicar la SPME a muestras con matrices más complejas[43].Adsorción La adsorción es el otro proceso físico-químico de muestreo que se produce alutilizar fibras revestidas con fases sólidas porosas. En este proceso se establece unacompetencia entre los analitos por los sitios disponibles en la fibra para la adsorción, yaque éstos son limitados. Por tanto, la relación entre la concentración de un analito en lamuestra y la cantidad extraída con la fibra no mantiene la linealidad para un intervalomuy amplio de concentraciones. El modelo matemático se desarrolló para las fibras PDMS-DVB, Carbowax-DVBy Carbowax-TPR [44]. La dependencia entre la concentración en el equilibrio de unanalito asociado a un adsorbente y su concentración en disolución obedece a la isotermade adsorción de Langmuir, como podemos ver en la Figura 5. En este modelo, elsorbente tiene un limitado número de sitios de adsorción. Se aplican las siguientessuposiciones: 1) la molécula se adsorbe en un estado inmóvil; 2) todos los sitios sonequivalentes; 3) en cada sitio sólo se une una molécula, y 4) no hay interacciones entre lasmoléculas adsorbidas en sitios contiguos, es decir, la constante de equilibrio esindependiente del número de moléculas adsorbidas. La ecuación que define el proceso de extracción por adsorción es la siguiente: K D Vf C 0 Vs (C f max − C f ) n= fs (6) K fs Vf + Vs (C f max − C f )donde K fsD es el coeficiente de distribución del analito entre la muestra y la superficie dela fibra, Cf es la concentración final de analito en la superficie de la fibra y Cf max es laconcentración máxima de analito en la superficie de la fibra. Los demás parámetros sonlos mismos que aparecen en la ecuación (1).16
  41. 41. Capítulo 1. INTRODUCCIÓN Concentración de analito adsorbido Concentración de analito libre Figura 5. Isoterma de Langmuir Las fibras empleadas en esta Tesis son de CW-TPR y de PDMS-DVB, y por tantosu mecanismo de extracción se basa en la adsorción. Se estudió la determinación demetilamina en agua mediante SPME con fibras de CW-TPR. Este procedimiento se hacomparado con los resultados obtenidos mediante la derivatización sobre un soportesólido (Apéndice 1). La determinación selectiva de dimetilamina utilizando doblederivatización también se llevó a cabo en muestras reales de agua por inmersión directade las fibras de CW-TPR (Apéndice 2). En el campo medioambiental también se estudióla determinación de trimetilamina en muestras de agua mediante la inmersión de la fibrade CW-TPR, previamente cargada con el reactivo derivatizante, en la muestra de agua(Apéndice 5). Las fibras de PDMS-DVB se han utilizado para la extracción de triazinasde muestras de agua también mediante inmersión directa, los resultados se hancomparado con otros dos procedimientos de extracción (Apéndice 10). En el campo del análisis clínico se ha abordado la determinación de anfetaminasen muestras de orina y en preparados farmacéuticos mediante SPME por inmersión defibras de CW-TPR en las muestras (Apéndice 7), y como complemento a este trabajo seha estudiado la determinación enantiomérica de anfetaminas empleando las mismasfibras (Apéndice 8). La SPME por adsorción también puede llevarse a cabo por inmersión directa dela fibra en la muestra como hemos visto anteriormente o por exposición de la fibra alespacio de cabeza. En el segundo tipo de muestreo el balance de masas tiene en cuenta lastres fases, como ya se vió en la ecuación (3). La concentración de analito en la fibra en elequilibrio (C fA∞) se determina aplicando el modelo de Langmuir y la concentración deanalito en el espacio de cabeza de la muestra (ChA ∞) se determina mediante la ley deHenry (KHA ). Ambas concentraciones se sustituyen en la ecuación (3) y se deduce lacantidad de analito extraída con la fibra una vez alcanzado el equilibrio: K A C 0A Vs Vf (C f max − C ∞ ) n = C ∞ Vf = fA (7) Vs + Vh K H + K A Vf (C f max − C ∞ ) fA A fA 17
  42. 42. MICROEXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDAdonde Vh es el volumen del espacio de cabeza. Esta ecuación tiene un término adicionalen el denominador (Vh KHA ). En el equilibrio, la cantidad de analito extraída del espaciode cabeza de la muestra puede ser igual o menor a la cantidad extraída directamente de lamuestra. Por tanto, es obvio que la sensibilidad obtenida mediante el muestreo en espaciode cabeza será igual o menor a la del muestreo directo. Para minimizar la pérdida desensibilidad, el volumen del espacio de cabeza debe ser lo menor posible. Por otro lado,el muestreo en espacio de cabeza reduce los problemas relacionados con la matriz de lamuestra, y además suele ser más rápido. La forma de la ecuación obtenida mediante el proceso de adsorción es muysimilar a la obtenida mediante absorción. La principal diferencia es la presencia de untérmino de concentración de la fibra (Cf max – Cf) en el numerador y denominador de laecuación (6), y que el significado de K en (6) es el de constante de equilibrio de fsadsorción, mientras que en la ecuación (1) es el de coeficiente de partición. Paraconcentraciones muy bajas de analito sobre la fibra y analitos con baja afinidad por lafibra, se puede considerar C max >> Cf. De este modo se observaría una relación de fdependencia lineal para la ecuación (6). Sin embargo, si la cantidad de analito sobre lafibra no es despreciable comparada con el total de sitios activos, la dependencia no puedeconsiderarse lineal. La cantidad de analito extraída de una muestra que contiene más de un compuestoserá menor que n de la ecuación (6), ya que se reduce el número de sitios disponibles.Además como Cf max es menor para el analito, la no linealidad se hace significativa aconcentraciones bajas si lo comparamos con el caso de que no existan compuestosinterferentes. Estos efectos se minimizan si el compuesto interferente se encuentra aconcentraciones muy bajas y si se caracteriza por tener baja afinidad por el sorbente. En esta Tesis se ha propuesto un procedimiento para la determinación decompuestos orgánicos volátiles (VOC) presentes en muestras de agua, basado en elmuestreo en el espacio de cabeza de la muestra sobre una fibra de PDMS-DVB(Apéndice 9).1.3.2.2. SPME EN MUESTRAS GASEOSASAbsorción El muestreo de aire mediante SPME tiene una serie de ventajas respecto a losmétodos tradicionales, en muestreo tanto activo como pasivo, y tiene muchasaplicaciones, desde estudios ambientales a estudios de calidad del aire en sitios cerrados.El PDMS es el sorbente más utilizado para extraer los analitos volátiles de muestrasmedioambientales mediante el proceso de absorción. La relativa facilidad de control deeste proceso de extracción y el hecho de que la absorción no sea un proceso competitivohan impulsado el desarrollo de los métodos de muestreo sobre PDMS. Bajo condicionesde muestreo estático, los analitos se absorben sobre el PDMS y finalmente se alcanza elequilibrio. El tiempo necesario para alcanzar el equilibrio depende de las cinéticas delproceso conjunto por el cual el analito alcanza la fibra. Este proceso depende de la18
  43. 43. Capítulo 1. INTRODUCCIÓNvelocidad de difusión del analito en el aire y del coeficiente de distribución del analitoentre el aire y el sorbente. El valor de K a una determinada temperatura para un analito en equilibrio entre lafibra y el aire se define como: (8) K = C fibra C aire n fibra (9) C aire = Vfibra Ksiendo nfibra el parámetro que se mide analíticamente. La relación lineal entre K y latemperatura viene dada por la ecuación de Clausius-Clapeyron: ∆H v   RT  ∆H v  log K = + log −  2 .303 RT *  (10) 2.303 RT   γ i P *    Esta ecuación puede adoptar la siguiente forma general. log K = a / T + b (11)Por sustitución de la ecuación (11) en la ecuación (9) quedaría: n fibra 10 − ( a / T + b ) (12) C aire = VfLa ecuación (12) permite determinar la concentración de un analito en el aire, ya que lasconstantes a y b, así como la temperatura de muestreo son conocidas [45, 46].Adsorción Según los datos bibliográficos la sensibilidad de los sorbentes de SPME formadospor mezcla de fases, como PDMS/DVB y Car/PDMS, es mayor que la obtenida conPDMS para la extracción de VOCs [47]. Un sorbente de PDMS/DVB puede extraermayores cantidades de VOCs, sobretodo para tiempos cortos de muestreo y condicionesde no equilibrio. Se ha desarrollado una teoría que explica la extracción de un analito encondiciones de equilibrio utilizando fibras de polímeros porosos [44]. Las cinéticas deadsorción y saturación de un adsorbente delgado de SPME se han descrito utilizando unmodelo límite [48]. Sin embargo, estas condiciones no se ajustan al muestreo real de aire,donde pueden encontrarse varios analitos presentes. 19

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