Fotobioreactor para cultivo micro algas

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Producción de Biocombustibles A partir de Microalgas

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  • 1. Diseño de Foto-Bioreactores para el Cultivo Micro Algas OleaginosasParte 1. Teoría y GeneralidadesReinhardt Acuña TorresIntroducciónLa crisis del petróleo y la dependencia forzadade los países no productores de petróleo, de losque sí lo producen, afecta no solo a la economíade los primeros; sino también, a su autonomía eindependencia alimentaria y productiva. Por esarazón, los biocombustibles alcanzan cada vezuna mayor relevancia como combustiblesalternativos de menor impacto ecológico. Elfitoplancton y una extensa variedad de microalgas fotosintéticas, se caracterizan, aparte de serel alimento de gran parte de la vida marinaanimal, por contener (ciertas familias yvariedades) grandes cantidades de aceites 1- Planta Productora de Biocombustibles A partir de Microesenciales de alto a mediano peso molecular. algas FotosintéticasEstos aceites pueden reformados mediante diferentes métodos para obtener combustibles de alto pesomolecular y potencial energético y flamante, similar al biodiesel. El objeto de este artículo es dar laspautas de diseño y de operación para la construcción de fotobioreactores destinados al cultivo a granescala de esos microorganismos fotosintéticos.El Concepto de un Foto Bioreactor para el Cultivo Micro Algas OleaginosasUn fotobioreactor es un contenedor biológico artificial cuyo ambienteinterno es capaz de generar las condiciones necesarias para que lafotosíntesis de las clorofilas existentes en microorganismos, células otejidos fotosintéticos que en ellos se cultiva, crezca y se desarrollen demanera rápida y eficiente para generar biomasa y los productosmetabólicos que se encuentren dentro de ella. En este sentido, el término fotobioreactor se refiere a sistemas cerrados para el medio ambiente externo; es decir, que no 2- Fotobioreactor Moss con tienen intercambio directo de gases y Physcomitrella patens contaminantes con el medio ambiente externo. Biotecnológicamente este tipo de bioreactor se utiliza para el cultivo de micro algas con el propósito de fijar CO2 para la producción de biomasa, mediante la reacción de la fotosíntesis que se lleva a cabo3- Microalgas fotosintéticas
  • 2. por la clorofila que contienen las microalgas. Las microalgas son microorganismos oxigénicosfotoautotróficos que realizan fotosíntesis mediante la siguiente reacción de síntesis:El CO2 es el reactivo limitante de la velocidad de reacción en los fotobioreactores cuyo propósito deutilización es el cultivo de microalgas.El propósito de diseño de estos fotobioreactores es cultivar microalgas (biomasa) para produciraceites esenciales de alto peso molecular (producto metabólico).Constructivamente existen tres tipos básicos de fotobioreactores para el cultivo de microalgas; siendoque la fotosíntesis es el otro el factor determinante que interviene en el bioproceso, la intensidad de laenergía solar disponible es el parámetro unificador. Los tres tipos básicos de fotobioreactores para elcultivo de microalgas son:Fotobioreactor de Placa: Un bioreactor de la placa consiste en una seriede paneles o placas interconectadas dispuestas vertical u horizontalmente encajas rectangulares; a menudo se divide en dos partes para efecto de unaagitación con recirculación del líquido (cultivo) del bioreactor. Esas conexionesse utilizan también para realizar el proceso de llenado y vaciado, la introducciónde gas (CO2) y el transporte de sustancias nutritivas, fácil. Laintroducción de los gases de combustión se produce por la parte inferior dela caja o panel, para asegurarse de que el dióxido de carbono tienesuficiente tiempo para interactuar con las microalgas en el seno del líquido delreactor. 4- Fotobioreactor panel de platosFotobioreactor Tubular: 5- Fotobioreactor tubular verticalUn bioreactor tubular se compone de una serie tubos dispuestos vertical uhorizontalmente, conectados a un sistema de tuberías. El cultivo eslíquido con biomasa en suspensión (microalgas) y debe ser capaz decircular por la tubería. Los tubos deben estar hechos de materialtransparente como plástico o vidrio y la circulación se mantiene constantepor efecto de una bomba impulsora al final del sistema. El gas (CO2) seintroduce al final y al principio del sistema de tubos; de esta forma seevitan los problemas de difusión que ocasionan deficiencia de dióxido decarbono y alta concentración de oxígeno, al final de la unidad durante lacirculación del fluido (cultivo).Fotobioreactor de Columna de Burbujas:Un bioreactor de columna de burbujas de fotos consiste en la columna vertical cilíndrica, hecha dematerial transparente, que permite la introducción de gas, por la parte inferior de la columna, encondición de flujo turbulento (Re>3000), para un óptimo intercambio de gases.
  • 3. Este tipo de bioreactores se construyen con un diámetro máximo de 30 cm(el rango es: 20 cm a 30 cm) con el fin de garantizar el suministronecesario de energía luminosa, ya sea de una fuente natural (luz solar)o de una artificial (luz eléctrica). 6- Fotobioreactor de Columna de BurbujasLos Aspectos Técnicos del DiseñoEl mayor problema cuando se utiliza luz solar es que ésta es muy variableen intensidad; según sea: la región (latitud), el clima (soleado, oscuro) y laestacionalidad del tiempo (estaciones); eso determina que laconstrucción esté limitada al tamaño más pequeño de diámetro. Noobstante, existen métodos para recoger o concentrar la luz del sol como colectores solares en forma decono o parabólicos y la transferencia de luz con cables de fibra de vidrio (fibra óptica) que se adaptenal perfil del bioreactor. En la gran escala, el consumo de energía debido a las bombas y el costo defabricación de CO2, pueden pesar más que el CO2 capturado por el bioreactor.En forma general, el diseño de un fotobioreactor para el cultivo microalgas a gran escala, para usocomo biocombustible, debe considerar los siguientes aspectos: Control preciso de la dinámica de fluidos, Número de Reynolds optimizado, Control retroalimentado “feedback” de las variables de: turbidez, temperatura, pH, DO, DBO, opacidad, colorimetría, espectro radiometría diferencial de aérea y de inmersión, Paneles o fuentes radiadores de flujo lumínico homogéneo de alto rendimiento, bajo consumo, larga vida y bajo coste, Sistemas de microfiltración de fácil limpieza, Automatización del control de flujo de gases (CO2) y adición de nutrientes, Precámaras de mezcla y tolvas para la recogida del producto, Monitorización y control informático computadorizado.Estos aspectos implican 4 diferentes áreas del diseño del fotobioreactor que tienen que ver con: El aprovechamiento de la energía luminosa: ciclos luz-oscuridad, trayectoria de la luz y geometría de fotobioreactores; Los aspectos fisiológicos: fotoinhibición por oxígeno, cultivos de alta densidad celular, ultra alta densidad celular, heterotrofía y mixotrofía; Los aspectos hidrodinámicos: número de Reynolds, estrés hidrodinámico, agitación, mezclado y turbidez; Los fenómenos de transferencia: masa, calor y momentum.Operativamente, un fotobioreactor para el cultivo de microalgas combina en uno solo, 4 tipos debioreactores:
  • 4. Un quimiostato: de ambiente químico estático; es un bioreactor al que continuamente se le agrega medio fresco, a la misma velocidad en el líquido de cultivo, se remueve del sistema, para mantener el volumen de cultivo constante. Su operación está diseñada para que al cambiar la velocidad con que se agrega el medio de cultivo fresco al bioreactor, la tasa de crecimiento del microorganismo se pueda controlar fácilmente. Dado que la tasa de flujo medio se controla para mantener el volumen de cultivo constante, con un flujo continuo, la alimentación (flujo de entrada) y la salida o efluente (flujo de salida), deben ser iguales en un quimiostato. Un turbidoestato es un dispositivo de cultivo continuo similar a7- Bioreactor de tanque un quimiostato; su nombre deriva de turbidez estática (ambiente); enagitado (CSTR) operadocomo un quimiostato. comparación con el quimiostato, este bioreactor tiene una retroalimentación entre la turbidez y la tasa de dilución del recipiente de cultivo. La relaciónteórica entre el crecimiento en un quimiostato y el crecimiento en un turbidoestato es similar, en elsentido de que, ambos técnicamente tienen un volumen fijo y una tasa de flujo fija y por lo tanto, latasa de dilución es fija. En el estado de equilibrio, cuando las células son uniformes, elfuncionamiento de un quimiostato y turbidoestato son idénticos. Es sólo cuando el crecimiento no eshomogéneo que las diferencias se hacen manifiestas; eso ocurre cuando las células en crecimiento seencuentran: fuera de equilibrio, están mutando, o están creciendo a su tasa de crecimiento máximo.En este último caso (cuando las células están creciendo a su tasa de crecimiento máximo) es muydifícil establecer el quimiostato a la tasa de dilución constante adecuada; por esa razón, el turbidoestatoutiliza un espectrofotómetro/turbidómetro para medir la densidad óptica del cultivo que se asocia asu densidad celular, para el control de la tasa de dilución constante adecuada. No obstante, existenotras opciones tales como, la permitividad dieléctrica para medir y controlar tasa de dilución en unturbidoestato.Un auxoestato es un dispositivo de cultivo continuo similar a un turbidoestato, sediferencia de éste en que su funcionamiento utilice la informaciónobtenida por retroalimentación de una cámara de crecimiento celular, paracontrolar: el caudal del medio de cultivo (alimentación fresca), el pH(acidez), la temperatura y el mantenimiento interno (agitación,viscosidad, etc.) a una medida constante. Auxo era la diosa griega delcrecimiento de primavera, y como un prefijo representa nutrientes. El usotípico de los auxoestatos es para controlar la acidez (pH) en un cultivobacteriano con retroalimentación entre la tasa de crecimiento y unmedidor de pH, como se observa en la figura. No obstante, en unauxoestato para el cultivo de microalgas deben medirse y controlarse el flujo yconcentración del CO2, la intensidad y el periodo de iluminación y 8- Auxoestato para el cultivo bacterial porla densidad celular del cultivo celular. control de pH
  • 5. Operación Continua y Cultivo de Microalgas en un FotobioreactorOperación ContinuaPara un componente “i” cualquiera de un cultivo celular, incluida la biomasa, se puede plantear elsiguiente balance de materia en el bioreactor: d(VCi)/dt = F1Ci1 – F2Ci + Vrfi – Vrci (1)Donde V es elvolumen de cultivo, F1 es caudal de alimentación, F2 el de salida, Ci1 la concentración del componente"i" en la alimentación y Ci la concentración en el caudal de salida; rfi y rci son la velocidad de formación(f) y la velocidad de consumo (c) del componente "i" respectivamente. Bajo el supuesto de que, elcultivo está perfectamente mezclado (mezcla perfecta), se puede asumir que Ci es idéntica a laconcentración que hay dentro del bioreactor. En una operación continua, el volumen varía con en eltiempo, de acuerdo a la ecuación: dV/dt = F1 – F2 (2). En un quimioestato, los caudales o flujos deentrada y de salida son iguales y dado que el volumen es constante; la ecuación 1 se reduce a: VdCi/dt = F (Ci1 – Ci) + V(rfi – rci) (3).Bioreactor de Inóculo 10- Esquema de un bioreactor "fed batch"Para iniciar un cultivo continuo a gran escala, se debe realizar previamente elinóculo del bioreactor a gran 9- Esquema de un quimioestato escala, desde un bioreactor a pequeña,dedicado exclusivamente, al cultivo por lotes “batch”. Lasmicroalgas son organismos fotosintéticos autótrofos por lo que, además de luz de calidad para realizarla fotosíntesis, necesitan CO2 como substrato limitante de la velocidad de crecimiento para poderdividirse. Un bioreactor de inóculo para el cultivo de microalgas debe ser por lo tanto, unfotobioreactor alimentado “fed batch” por una corriente S de CO2 comosubstrato limitante de la velocidad de crecimiento. Una vez establecido el inóculo, secomienza a alimentar con medio fresco a un caudal F, la entrada y a recolectar labiomasa o producto, por un rebalse o lavado; para que se mantenga el volumenconstante. En un bioreactor alimentado, el caudal de salida es nulo (F2 = 0) porlo que, el volumen aumenta con el tiempo y en función del caudal de entrada(F1). Las condiciones de operación del bioreactor de inóculo son: F1 = F; dV/dt = F(4) y V dCi/dt = F (Ci1) + V(rfi – rci) (5).El Tiempo de ResidenciaEl volumen V permanece dentro del operador diferencial pues varía con el tiempo. Por ese motivo, uncultivo alimentado tiene duración limitada en el tiempo que se conoce como tiempo de residencia, yaque, el volumen no puede incrementarse más allá del volumen útil que tiene el bioreactor. El tiempode residencia (τ) es la cantidad promedio de tiempo que pasa una célula dentro del bioreactor. Estamedida varía directamente con la cantidad de sustancia en el sistema y en su forma genérica está dadopor la ecuación: τ = V/F (6). En el caso de “sistemas vivos”, la cantidad de substancia debetransformarse y modificarse por concentración para adaptarse al concepto de sistema biológico, coneso, la ecuación 6 se transforma en: C = Co exp (-kτ) (7). Donde; C = Concentración, Co = concentración
  • 6. inicial, exp = exponencial, k = constante de velocidad de reacción, τ = tiempo de residencia delbioreactor.Ecuaciones y Balances de Materia en el Cultivo ContinuoEn el estado estacionario la tasa de crecimiento específico (μ) de un microorganismo es igual a la tasade dilución (D).La tasa de dilución se define como la tasa de flujo promedio entre el volumen del cultivo delbioreactor: D = F/V (8).Balance General de Materia: V dCi/dt = F (Ci1 – Ci) + V(rfi – rci) (3)Balance Materia del Componente X (Biomasa): V dX/dt = -FX + V rfx (9)Balance Materia del Substrato Limitante de la Velocidad S: V dS/dt = F (S1 – S) - V(rs) (10)Balance de Materia del Producto P: V dP/dt = -FP + V rp (11)Cinética y Crecimiento Bacteriano 11- Fases del crecimiento bacterianoCada microorganismo que crece en un sustrato enparticular tiene una tasa máxima de crecimientoespecífico (μm) que se alcanza después de la faseexponencial de crecimiento, al llegar la faseestacionaria de crecimiento. Dado que, tasa dedilución se define como la tasa de flujo promedioentre el volumen del cultivo del bioreactor, Ddefine el comportamiento operacional delbioreactor; si se elige una tasa de dilución mayorque μm, habrá acumulación y eventualmente, elvolumen del cultivo llegará a ser mayor que elvolumen del bioreactor; el cultivo no podrá sostenerse a sí mismo en el bioreactor y habrálavado; es decir, se removerán las células del cultivo, a mayor velocidad de lo crecen o sereproducen. Cuando la tasa de dilución menor que μm, la acumulación será negativa, las células y elcultivo estarán siempre en su fase exponencial y no se alcanzará nunca el estado estacionario. Bajocondiciones controladas, las cianobacterias pueden duplicar su población cuatro veces al día.Ecuaciones Cinéticas en el Estado EstacionarioEl caudal de salida o lavado contiene células maduras y medio de cultivo parcialmente agotado. Enbase a la ecuación de balance general de materia (ecuación 3), se pueden establecer los balances demateria para: la biomasa X, el substrato limitante de la velocidad S y el producto P.En el estado estacionario: rX = μm (12). Resulta: F / V = D = μm (13).La concentración media del substrato limitante de la velocidad S` en estado estacionario es: S` =KsD / μm – D (14).La velocidad de consumo de substrato en el estado estacionario es: rs = D (S1 – S`) (15).
  • 7. El rendimiento celular de biomasa se define como la relación entre la biomasa producida y elsustrato consumido (usualmente la fuente de carbono y energía): Yx/s = -dX/dS (16).Por la ecuación (16) la velocidad de consumo de substrato en función del rendimiento celular debiomasa en el estado estacionario es: rs = μmX / Yx/s (17).La concentración de biomasa en función del rendimiento celular de biomasa en estado estacionarioes: X` = Yx/s (S1 – S`) (18).La velocidad de dilución crítica Dc en el estado estacionario es: Dc = μm S1 / Ks + S1 (19).Ks se conoce como constante de saturación; el valor de Ks está inversamente relacionado con laafinidad del microorganismo por el sustrato. Cuando la afinidad del microorganismo por el sustratoes muy alta como ocurre en el cultivo de microalgas, S1 » Ks y Dc = μm, lo cual es un criterio útil paraelegir un valor de D apropiado.La ecuación de formación de producto en estado estacionario es: P` = rp / D (20). O bien: P` = qpX` / D(21). P es la concentración de producto en estado estacionario.El rendimiento de producto se define como la relación entre el producto obtenido y el sustratoconsumido (usualmente la fuente de carbono y energía): Yx/s = -dP/dS (22).El Cultivo de MicroalgasEl cultivo de algas es una forma de acuicultura que se ocupa del cultivo de especies de algas,mayoritariamente, microalgas, organismos fotosintéticos autótrofos que forman parte del fitoplanctontambién denominadas micrófitas. El combustible de algas es un biocombustible de tercerageneración, fabricado a partir de los productos oleaginosos de microalgas; por esa razón, lainvestigación sobre algas para la producción masiva de aceite se centra principalmente sobre esasespecies. Sus principales representantes son las diatomeas y las cianobacterias. La mayoría de lasdiatomeas son unicelulares , aunque pueden existir como colonias en forma de filamentos o cintas (porejemplo, Fragillaria ); las diatomeas son los principales productores en la cadena alimentaria; su rasgocaracterístico es que están encerrados dentro de una pared de célula única Clasificación científicahecha de sílice (dióxido de silicio hidratado) llamado frustule. A pesar de sergrandes productoras de aceites, el frústule, más bien, la sílice del que está Cianobacteriashecho, es un serio inconveniente para una producción industrial debiocombustible, razón por la cual, las diatomeas no son utilizadas para ese Reino: Bacteriabioproceso industrial. Filo: CyanobacteriaCianobacterias 12- Cianobacterias: Lyngbya Órdenes Las cianobacterias (Cyanobacteria, gr. κυανός kyanós, "azul") sonun filo del reino Bacteria (único del dominio del mismo nombre) quecomprende las bacterias capaces de realizar fotosíntesis oxigénica y a sus  Gloeobacteralesdescendientes, los plastos, por endosimbiosis. Las cianobacterias fueron  Chroococcalesconsideradas durante mucho tiempo como cianófitas (Cyanophyta,literalmente "plantas azules") o cianofíceas (Cyanophyceae, literalmente  Pleurocapsales"algas azules"), castellanizándose el nombre como algas verdeazuladas.  Oscillatoriales  Nostocales13- Cianobacterias:  StigonematalesCroococales
  • 8. Cuando se descubrió la distinción entre célula procariota y eucariota se constató que taxonómicamente son las únicas "algas" procariotas y los únicos procariotas que llevan a cabo fotosíntesis; y el término "Cianobacteria" empezó a ganar preferencia. Actualmente, las cianobacterias son un filo de bacterias que obtienen su energía a través de la fotosíntesis por lo que, también se les denomina oxifotobacterias (Oxyphotobacteria); los análisis genéticos han venido a situar a las cianobacterias entre las bacterias gramnegativas. La taxonomía de las cianobacterias está actualmente en revisión y dista mucho de ser definitiva. Las croococales (Chroococcales) son un orden de cianobacterias unicelulares que se agrupan en colonias y forman falsos filamentos; no tienen heterocistes por lo tanto, son incapaces de fijar nitrógeno; con frecuencia poseen revestimientos gelatinosos. Las oscilatoriales (Oscillatoriales) son un orden de cianobacterias filamentosas sin ramificación, o con falsa ramificación; son carentes 14- Cianobacterias: Oscillatoria de heterocistes y acinetos. Las oscilatoriales incluyen numerosos géneros entre los que destacan Oscillatoria y Spirulina. Oscillatoria es un género de cianobacterias antiguamente incluido en la división Cyanophyta que, junto a la división Prochlorophyta formaban un grupo de procariotas autótrofos. Establecimiento de Cultivos de Microalgas Se han desarrollado diversos métodos para obtener cultivos monoespecíficos (de una sola especie) y axénicos (libres de contaminantes) de microalgas, que en síntesis se pueden resumir bajo el siguiente esquema. Aislamiento Los métodos básicos de aislamiento para microalgas son: Filtración Diluciones Sucesivas16- Aislamiento y purificación de microalgas por el método de dilucionessucesivas y subcultivos repetidos. Purificación 15- Método de filtración a través de una columna empacada con algodón.
  • 9. Los métodos básicos purificación para microalgas son:Pipeteo Capilar: se utiliza para separar microalgas mayores de 10μ: se usa una pipeta de tubo capilarcomo instrumento para capturar microalgas, a través del microscopio óptico; luego se separanlas células en pequeñas gotas con solución de nutrientes y se colocan alrededor de unaCaja de Petri o en portaobjetos escavados para que formencepas. Las cepas seleccionadas sonpurificadas por cultivos sucesivos.Rayado de Placas de Agar: seutiliza para separar microalgasmenores de 10μ: 17- Purificación de cepas de microalgas mayores de 10µ mediante el método de micropipeta (pipeteo capilar) y cultivos sucesivos. se transfieren pequeñas gotas de plancton con un asa de siembra, extendiendo porestrías (rompiendo un poco el agar). Este agar se prepara conuna solución nutritiva para microalgas y con unarelación de 1–1.5% w/v de agar disuelto 18- Método de purificación de colonias de microalgas por rayado enen el medio nutritivo, se incuba la placa placa de agar.bajo iluminación a 18–20°. De esteprimer crecimiento se transfiere a tubos con agar inclinado sembrando por estrías o bien, se transfiere amedios líquidos en subcultivos sucesivos para su purificación, de tal manera que en cada dilución sereduzca el número de organismos en una gota, es recomendable combinar la técnica de diluciones conla de transferencia en placa de agar o tubo inclinado para obtener cultivos clonajes (de una sola coloniao célula) y poder establecer el cultivo mono específico. Después de 10 días, pequeñas colonias aparecensobre la superficie del agar, que se pueden transferir mediante el Método de Hocking o de lamicropipeta a medios líquidos.Control BacteriológicoPara prevenir el desarrollo bacteriológico en los cultivos de Preparación del Medio de Zobell:microalgas es necesario determinar la concentración óptima de Tripticasa 1.0 grantibiótico que inhibe el crecimiento de cepas contaminantes; así Extracto de levadura 1.0 grcomo el antibiótico ideal para dicho propósito. Para eso, primero Fosfato Férrico 5 mges necesario preparar un medio de cultivo como el siguiente: Agar 15.0 grEn Cajas de Petri, con tapa no muy gruesa. Con un asa de Platino Agua envejecida (3 meses) 1 litropicar el agar con la muestra que se desea analizar y colocar a la luz pH = 7.0 – 7.2o en una incubadora con iluminación apropiada por un periodo de2 a 3 días para observar si hay crecimiento bacteriano.Si el cultivo presenta bacterias se debe realizar un TUBO 1 2 3 4 5ensayo factorial, sometiendo a la acción combinada Volumen ml 3.0 2.0 1.0 0.5 0.25 Penicilina µg/ml 12.000 8.000 4.000 2.000 500 Estreptomicina µg/ml 8.000 4.000 2.000 1.000 250
  • 10. de al menos dos tipos diferentes de antibióticos, se recomiendan tres, en cinco diferentesconcentraciones; por ejemplo:Medios de Cultivo para MicroalgasSe han desarrollado diferentes medios de cultivo para microalgas cuyas fórmulas tienen diferentesusos o propósitos: Enriquecer el agua de mar natural, Enriquecer el agua dulce natural, Medios artificiales para: • Agua de mar • Agua dulce Medios específicos para: especies específicas, Medios selectivos para especies seleccionadas.Los medios artificiales permiten resultados constantes en contraste con, los medios para enriquecerque tienen resultados variables debido a, entre otros factores, que dependen del lugar y lascaracterísticas del agua donde se colectan y el tiempo de almacenamiento de la misma. El fitoplanctonse desarrolla y multiplica en relación de las condiciones fisicoquímicas del medio; en términosgenerales los macronutrientes son los factores limitantes del crecimiento y dirigen el metabolismobasal o primario mientras que, los micronutrientes se requieren en cantidades menores y sonindispensables para el metabolismo secundario. Los macronutrientes son: el Carbono, Nitrógeno,Fósforo, Silicio, Magnesio, Potasio y Calcio; en tanto que, los micronutrientes son: Hierro, Manganeso,Cobre, Zinc, Sodio, Molibdeno, Cloro y Cobalto. Algunos medios de cultivo para microalgas son.* Se recomienda usar el agua filtrada ypasteurizada y adicionar los ingredientes. MEDIO ENRIQUECIDO MEDIO MIGUEL (ALLEN-NELSON, 1910) MEDIO DE YASHIMA Solución A: KNO3 20. 2 g Para cultivo masivo de clorofíceas marinas H2O 100 ml Sulfato de Amonio (para Solución B: la 100 g/t Na2HPO412H2O 4g agricultura 21%) 15 g/t CaCl26H2O 4g Superfosfato de Calcio (para la HCl15 g/t conc. 2 ml agricultura 21%) 30–50 FeCl3 2 ml Urea (para la agricultura 21%) g/t HO 2 80 ml Clewat 32 Agregar 2 ml de la Solución A y 1 ml de la Solución B Componentes de Clewat litro de agua de mar natural, calentar a 70°C por 20 min. En un 32: MEDIO ERD-SAHREIBER ENRIQUECIDO (FOYN, 1934a,b) NaNO3 10 mg Na2HPO412H2O 2 mg Extracto de suelo 5 ml Agua de mar 100 ml MEDIO ERD-SCHREIBER *Agua de mar 1 litro Extracto de suelo 50 ml NaNO3 0.2 g Na2HPO4.12H2O 0.03 g
  • 11. FeCl2 (como fuente de Fe) 0.385% ZnCl2 (como fuente de Zn) 0.166% MnCl2 (como fuente de Mn) 0.775% CoCl2 (como fuente de Co) 0.017% CuSO4 (como fuente de Cu) 0.007% (NH4)6Mo7O24 (como fuente de 0.632% Mo) H3 BO3 (como fuente de B) 2.470% EDTA 0.005% MEDIO DE YASHIMA MODIFICADO (HIRATA, 1975) Medio de Yashima (en la misma concentración) Peptona 50 g/t Peptidasa 0.005% Diaminasa 0.005% (recomendado para cultivos axénicos)MEDIO DE CULTIVO STEIN PARA AGUA DULCE (Guillard, In: Stein, 1979) b. Micronutrientes: c. Vitaminas: Na2EDTA 4.36 g/l Tiamina HCl 0.1 mg/l FeCl3.6H2O 3.15 g/l Biotina 0.5 g/l CuSO4.5H2O 0.01 g/l Cianocobalamina 0.5 g/l ZnSO4.7H2O 0.022 g/l CoCl2.6H2O 0.01 g/l MnCl24H2O 0.18 g/l De la solución a se obtiene 1ml y se adiciona a 1l de Na2MoO4.2H2O 0.006 g/l agua esterilizada. De la solución b se obtiene 1ml y se adiciona a 1l de agua esterilizada.De la solución c se obtiene 1ml y se adiciona a 1l de agua esterilizada. d. Tris:De la solución d se obtiene 2 ml y adiciona a 1l de agua Hidroximetil Amino metano 50g/200 ml H2O dest.esterilizada. Nota: Una vez preparado el medio decultivo, debe ajustarse de pH a 7.2 con HCl para noobtener un pH ácido.
  • 12. Cultivo de Microalgas en FotobioreactoresTABLA 1 CARACTERISTICAS DE ALGUNAS DE LAS ESPECIES DE Crecimiento CelularMICROALGAS UNICELULARES UTILIZADAS EN ACUACULTURA(COLL-MORALES J., 1983) El crecimiento y la división celular CICLO DE TEMPERATURA DIAMETRO de las microalgas son afectados por laGENERO LUZ OPTIMA MEDIO intensidad de la luz y el fotoperíodoPhaeodactylum (diatomea) 10 h 25°C 10.4µ (horas de iluminación y obscuridad) en relación con la temperatura comoSkeletonema (diatomea) 13.1 h 18°C >20µ muestra la Tabla 1. La duración delDunaliella (cloroficea) 24 h 16°C 17.8µ ciclo de luz así como la temperatura óptima son susceptibles deChlorella (cloroficea) 7.7 h 25°C 5µ variación de acuerdo con la selecciónTetraselmis (cloroficea) 18 h 18°C 18.4µ de la variedad (especie).Monochrysis (crisoficea) 15.3 h 20–25°C 10µ Crecimiento en BiomasaIsochrysis (crisoficea) 30.2 h 20°C 10.2µ El crecimientofotosintético en plantas requiere luz, dióxido de carbono, agua y salesinorgánicas para que éstas desarrollen sus sistemas tisulares y cumplandiversas funciones metabólicas. En el caso de las microalgas, casi toda lasuperficie del microorganismo realiza la función fotosintética, por loque se obtiene un mayor rendimiento en la función fotosintética(transformación de la energía lumínica a energía química). Estocoloca a las microalgas en la base de la cadena trófica, transmitiendola energía al resto de escalones.El crecimiento medio de las microalgas precisa una serie deelementos inorgánicos básicos y carbono (C) como elementoorgánico principal para constituir la célula. Los denominadoselementos esenciales son: carbono (C), nitrógeno 19- Esquema piramidal de la cadena trófica(N), fósforo (P), metales; y en algunos casos silicio(Si).Requerimientos Principales de los Cultivos de Microalgas
  • 13. TABLA 2 REQUERIMIENTOS PRINCIPALES DE LOS CULTIVOS DE MICROALGAS La tabla 2 recoge los principales requerimientos REQUERIMIENTOS COMPUESTOS QUIMICOS VALORES físicos y de nutrición en losFísicos Luz 2,000 – 4,000 lux cultivos de microalgas, en Temperatura 15 – 22°C valores aproximados. En cada caso particular Salinidad 0.37‰ (especie) se deben pH 7–9 establecer las necesidades Redox particulares de la especieNutritivos que se vaya a cultivar; en CO2CO3≃ las condiciones concretas C g/100 ml de cultivo que se van a utilizar; para determinar la condición optima de O, H O2H2O g/100 ml crecimiento. Ciertos N N2NH4+ NO3 g/100 ml nutrientes como el fósforo deben ser suministrados PO4≃ en exceso debido a que, en P g/100 ml la mayoría de sus formas, se encuentra como complejos metálicos por lo SO4≃ que, no todo el fósforo es S g/100 ml bioasimilable. Si se utiliza agua del mar como soluto, ésta puede ser Na, K, Ca, Mg Sales g/100 ml suplementada con Fe, Zn, Mn, B, Br, Si Sales mg/100 ml fertilizantes comerciales Cu, Co, Cl, I, Sr, Rb, Al Sales µg/100 ml nitrogenados y fosforados; Vitaminas B12, tiamina, biotina µg/100 ml y con pequeñas cantidades de otros micronutrientes.Control de pH y Dosificación de CO2 20- Sistema de inyección de CO2En un sistema continuo de cultivo de microalgas el CO2 debeser suministrado de manera continua; durante losfotoperiodos de horas de luz y controlando sudosificación mediante sensores de pH que minimicen laspérdidas y regulen la acidez. En bioreactores tubulares elpH al final del tubo (reactor) se eleva al disminuir laconcentración de CO2 debido a su alto consumo por partede los microorganismos algales. La concentración deCO2 disuelto (COD) puede ser controlada mediante suinyección en las zonas de estancamiento; es decir,
  • 14. donde la concentración ya no permite obtener una capacidad máxima fijadora. El pH se debecontrolar junto con el COD debido al que el equilibrio del CO2 con el agua depende tanto de latemperatura de la acidez del medio de cultivo.Fotosíntesis Oxigénica y Eficiencia FotosintéticaLa eficiencia fotosintética (EF) se define como la fracción de energía de luz que se fija como energíaquímica durante el crecimiento foto autotrófico. En la fotosíntesis de las plantas, como mínimo serequieren 10 fotones de luz (cuantos) para producir un mol de O 2 .Los requerimientos nutricionalesmínimos para el metabolismo celular de la mayoría de especies de bacterias pueden ser estimadosusando la siguiente aproximación a la formula molecular de su biomasa: C 0.48 - H 1.83 - N 0.11 - P0.01 (23). No obstante, las microalgas por ser microorganismos autótrofos fotosintéticos, poseen unmetabolismo diferente y su composición representativa de la biomasa debe representarse por lasiguiente fórmula: CH 1.78 - O 0.36 - N 0.12 (24) que corresponde a los 14 cuantos de fotonesnecesarios para fijar un mol de CO2 en la biomasa, sobre la base de amonio como fuente denitrógeno. En esa misma base, un mol de CO2 fijado resulta en un Cmol de biomasa (= 21,25 g de pesoseco) con una entalpia de combustión de 547,8 × Cmol kJ -1. En la fotosíntesis normal sólo la luz delongitudes de onda entre los 400nm y 700nm son aprovechables por la planta; esto representa el42,3% de la energía del espectro total de luz solar y se llama radiación fotosintética activa (PAR); elcontenido promedio de energía de los cuantos de luz en ese rango del espectro es de 218 kJ/molcuanto. En cultivos de microalgas, la combinación activa de todos los elementos, se calcula que comomáximo el 9% de la energía solar disponible (teniendo en cuenta todas las longitudes de onda) sepuede en convertir en energía química con producción de biomasa nueva; eso significa que el rangode PAR la eficiencia es del 21,4%. La fotosíntesis oxigénica es lamodalidad de fotosíntesis en la que el agua es el donante primariode electrones y que, por lo tanto, libera oxígeno (O2) como subproducto.La fotosíntesis oxigénica es propia de las cianobacterias y de susdescendientes por endosimbiosis.El FotoperiodoEl fotoperiodo es un factor que regula la división celular, en diatomeasla reproducción asexual (división) ocurre durante el período de luz y éstees acelerado bajo iluminación continua. En contraste las especiesformadoras de auxoesporas (esporas sexuales) como las cianobacterias,forman células del mismo tamaño durante el período de obscuridad.Por tanto, el fotoperiodo o período de iluminación debe ajustarse deacuerdo con los objetivos del cultivo; así como, con el espécimen y lavariedad que se cultiva. Un fotoperiodo continuo de iluminaciónprolongada puede producir el crecimiento rápido del cultivo, peropuede afectar a formación de auxoesporas. Un fotoperiodo normal, conhoras de luz y obscuridad semejante al fotoperiodo solar, mantiene uncrecimiento normal y saludable. En condiciones controladas, un 21- Fotobioreactor vertical en fotoperiodo activo
  • 15. fotoperiodo de 16/8 horas luz/oscuridad ha mostrado ser óptimo para cultivos de cianobacterias, engran variedad de especies.La Curva Dosis-Respuesta a la Energía LuminosaNo toda la radiación lumínica (luz) puede seraprovechada por o en el cultivo de organismos foto-autotróficos. La tasa de fotosíntesis celular (F) es lacapacidad de captación de fotones que tiene una célulafotosintética y depende de la energía luminosa (E) quereciben las células. La radiación fotosintéticamenteactiva (F/E) es la cantidad de radiación integrada del rangode longitudes de onda que son capaces de producir actividadfotosintética en plantas y otros organismos fotosintéticoscomo microalgas y bacterias. Ese rango está comprendidoentre los 400nm y los 700nm y corresponde tambiénaproximadamente con el espectro visible por el ojo humano. 22- Respuesta de un ojo humano tipo a la luzEl aprovechamiento de la energía radiantedurante la fotosíntesis está relacionado con lacurva dosis-respuesta que describe esarelación como una respuesta típica delcrecimiento celular respecto a laintensidad luminosa. A bajos niveles deintensidad luminosa la rapidez de lafotosíntesis aumenta con la intensidad deluz; pero cuando el nivel de energíaincidente supera cierto valor crítico (Ek) laactividad fotosintética decae y solo induce 23- Curva Dosis-Respuesta a la Energía Luminosapequeños cambios en F. La constante Ek esespecífica y característica para cada organismo, e indica el nivel de energía luminosa al quecomienza a saturarse el fotosistema del microorganismo. Cuando la energía incidente supera el nivelcrítico, el efecto causa la inhibición de los fotosistemas celulares; lo cual, puede ocasionar el deteriorodel cultivo celular e incluso causar un daño irreversible.Eficiencia y Eficacia LuminosaLa eficacia luminosa de la radiación (κ) mide la parte de energía electromagnética que se usa parailuminar y se obtiene dividiendo el flujo luminoso (F) entre el flujo radiante (φ), κ = F/φ (25). En elsistema internacional SI la eficacia luminosa se expresada en lúmenes por vatio (lm/W). La eficacialuminosa tiene un valor máximo posible de 683 lm/W que para el caso de la luzmonocromática corresponde a una longitud de onda de 555 nanómetros (verde).
  • 16. La eficacia luminosa de una fuente de luz (η) o rendimiento luminoso mide la parte de energíaeléctrica que se usa para iluminar y se obtiene dividiendo el flujo luminoso emitido (F) entre la potencia(P) eléctrica consumida, η = F/P (26).Por otro lado, la eficiencia luminosa (F/E) mide la eficiencia con la que la luz incidente es utilizadapor la célula o el microorganismo fotosintético; es decir, la fracción de energía luminosa incidenteque es convertida a energía química por el fotosistema. Unidades de fotometría del SI Símbo AbreMagnitud Unidad del SI Notas lo v. A veces se usa la denominación talbot, ajenaEnergía luminosa Qv lumen segundo lm·s al SIFlujo luminoso F lumen (= cd·sr) lm Medida de la potencia luminosa percibidaIntensidad Iv candela (= lm/sr) cd Una unidad básica del SIluminosa candela por metro cd/mLuminancia Lv A veces se usa la denominación nit, ajena al SI cuadrado 2 Usado para medir la incidencia de la luz sobreIluminancia Ev lux (= lm/m2) lx una superficieEmitancia Usado para medir la luz emitida por una Mv lux (= lm/m2) lxluminosa superficieEficacia lm/ η lumen por vatio razón entre flujo luminoso y flujo radianteluminosa W