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Aplicaciones de la biotecnología en la investigación forense
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Aplicaciones de la biotecnología en la investigación forense

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Exposición dada en el Congreso Internacional Sinergia del Tecnológico de Monterrey, campus Pachuca.

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    Aplicaciones de la biotecnología en la investigación forense Aplicaciones de la biotecnología en la investigación forense Presentation Transcript

    • UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DÉ MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS APLICACIONES DE LA B IBIOTECNOLOGÍA EN LA E N V INVESTIGACIÓN E N FORENSE I D OBIÓL. OMAR RAFAEL REGALADO FERNÁNDEZ S Taller teórico-práctico
    • PROGRAMA DE LA SESIÓNSección (Teórica – Práctica) Tiempo1. Introducción 15min2. Protocolo experimental de RFLP 15min(I)3. Antecedentes teóricos de la 45mintécnica RFLP4. Protocolo experimental de RFLP 20min(II)5. La técnica de RFLP 20min6. Discusiones y conclusiones 35minPreguntas y respuestas 20min
    • 1. INTRODUCCIÓN: LA CIENCIA FORENSE• La criminología es la ciencia que estudia la naturaleza, extensión y causas de un crimen; las características de organizaciones o individuos criminales; la detención y castigo de los delincuentes; estructura de las prisiones y su operatividad; rehabilitación y prevención del delito (Arroyo Zapatero, 1993).
    • 1. INTRODUCCIÓN: LA CIENCIA FORENSE• La ciencia forense estudia las evidencias para inculpar o exculpar a quien ha sido acusado de un crimen, o para identificar al culpable de un crimen dentro de una lista de sospechosos.• Las evidencias son estudiadas bajo la luz de otras ciencias: Biología, Medicina, Antropología, Psicología, Física, Química, etc.• La criminología forense es la ciencia que estudia todo lo relacionado con el estudio de un crimen en su naturaleza y extensión.
    • 1. GENÉTICA FORENSE• Es la rama de la Genética que precisa, con un alto grado de certeza, la relación biológica entre 2 personas, o bien entre la evidencia encontrada en el lugar de los hechos y el probable infractor.
    • 1. GENÉTICA FORENSE• Elementos susceptibles de analizarMuestras hemáticas o Muestras bucales Restos óseos dérmicas Muestras seminales o urinarias
    • 1. REGIONES NO CODIFICANTES DE DNA• El fundamento teórico de esta técnica se relaciona con la existencia de fragmentos del nuestro genoma que no expresan ninguna proteína. Las regiones no codificantes son un hecho de la naturaleza y tienen un propósito (aunque no siempre conocido).
    • 1. REGIONES NO CODIFICANTES DE DNA• Repeticiones cortas en tándem (STRs): • Son altamente polimórficos. • Se distinguen aún en muestras altamente degradadas. • Se pueden amplificar entre 3 y 15 marcadores de una sola vez con una única reacción PCR. • Se ahorra tiempo, material y lo más importante es que la muestra puede ser muy escasa. • Su uso se ha generalizado en laboratorios de todo el mundo. • Un requisito básico para poder aplicar los polimorfismos del DNA es la existencia de una Base de Datos.
    • 1. MÉTODO: DE LA EXTRACCIÓN DEL DNA A LA COMPARACIÓN Comparar el Determinación del resultado de lasExtracción del DNA genotipo de la muestras con los muestra resultados de otras muestras. Si hay coincidencia, comparar el perfilCuantificación del Alelos STR o RFLP de DNA con las DNA bases de datos poblacionales. Generación del Separación yAmplificación por reporte en la detección de los PCR estadística productos del PCR apropiada.
    • 1. ALELOS POLIMÓRIFCOS (SRT)
    • PRUEBA DE PATERNIDAD ¿ES ESTE INDIVIDUO EL PADRE?
    • … PARECE SER QUE SÍ (-GULP, O –FIÚ)
    • 2. PROTOCOLO DE RFLP (I)El casoEn un bar, una persona mala copa, Silverio, empieza a alterarsecon un grupo de otras cinco personas, todas en estadoalcohólico. De repente se presenta una trifulca, en la que elprimero resulta asesinado por una navaja. En el pleito, todosresultan con heridas producidas por cortadas de vidrio.Los cinco sospechosos huyeron del bar cuando notaron lanavaja en el abdomen del occiso. La navaja presenta sangreen el filo y en la empuñadura.
    • 2. PROTOCOLO DE RFLP (I)El caso (II)Al realizar un análisis de grupos sanguíneos a lasmuestras hemáticas del cuchillo se determinó quepertenecían a dos personas diferentes. Sangre O Rh-Sangre A Rh+
    • 2. PROTOCOLO DE RFLP (I)El casoLa empuñadoratiene la sangre delasesino si nopertenece alocciso. En la mesadonde estaban lasseis personas haycolillas de cigarro,servilletas usadas,vasos, etc., dedonde se puedenobtener muestrasde DNA de loscinco sospechosos.
    • 2. PROTOCOLO DE RFLP (I)El casoSe toman las muestras de sangre correspondientes de loscinco considerados como sospechosos y se identifican lasmuestras obtenidas en la mesa. Hay DNA de las cincopersonas.MH (muestra hemática de la empuñadura del arma)S1 (muestra de DNA de una colilla de cigarro – Arturo)S2 (muestra de DNA de un vaso – Angel)S3 (muestra de DNA de una servilleta – Rubén)S4 (muestra de DNA de sangre encontrada en la mesa –Yahel)S5 (muestra de DNA de un cabello – Jaime)
    • 2. PROTOCOLO DE RFLP (I)El casoAl determinar de quién es la sangre de laempuñadura del arma, sabremos quién es elprincipal sospechoso ¿Quién mató a Silverio?
    • 2. PROTOCOLO DE RFLP (I)El laboratorio1. Marcar los tubos eppendorf de la siguiente manera: 1. MH 2. S1 3. S2 4. S3 5. S4 6. S5
    • 2. PROTOCOLO DE RFLP (I)El laboratorio1. Colocar en cada tubo 10μL de la muestra de DNA y 10μL de la mezcla de enzimas de restricción EcoR1/PstIProvidencia stuartii5’ CTGCAG 3’3’ GACGTC 5’Escherichia coli5’ GAATTC 3’3’ CTTAAG 5’
    • 2. PROTOCOLO DE RFLP (I)El laboratorio1. Mezclar el contenido con pequeños golpes y centrifugar todas las muestras por algunos segundos (10s) a velocidad máxima.2. Digestión enzimática: incubar todas las muestras a 37°C durante 45min. Pregunta clave:¿Por qué a 37°C?La enzima viene de Escherichia coli, una bacteriaintestinal del ser humano.
    • 3. ANTECEDENTES TEÓRICOS• El genoma humano y eucarionte• Genes, alelos y polimorfismos• Enzimas de restricción• Algunas notas sobre mapeo, secuenciación y PCR
    • 3. EL GENOMA EUCARIONTE Y HUMANO• El DNA es la biomolécula con la que la célula almacena y hereda las características que la definen a su sucesora.
    • 3. EL GENOMA EUCARIONTE Y HUMANO• La información genética está almacenada en los genes, que son secuencias lineales de nucleótidos que se emplean para la síntesis de proteínas (transcripción de proteínas).
    • 3. GENOMA EUCARIONTE Y HUMANO
    • 3. GENOMA EUCARIONTE Y HUMANO
    • 3. GENES, ALELOS Y POLIMORFISMOS
    • 3. GENES, ALELOS Y POLIMORFISMOS• Polimorfismo. Existencia de varios alelos dentro de un mismo locus. Cualquier sitio con alelos múltiples con una condición estable dentro de la población es un polimorfismo.• Polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). Al comparar las secuencias de los alelos, solamente un nucleótido cambia entre ellos. Uno de estos cambios ocurre alrededor de 1300pb en el humano. Los SNP son los responsables de nuestra identidad única.
    • 3. GENES, ALELOS Y POLIMORFISMOS
    • 3. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
    • 3. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
    • 3. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
    • 3. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
    • 3. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
    • 3. MAPEO• Una mutación puntual que afecta los sitios de restricción se detecta por una diferencia en los fragmentos de restricción.
    • 3. MAPEO• Una diferencia en los mapas de restricción de dos individuos es denominado polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP, restriction fragment length polymorfism).• Los polimorfismos de los sitios de restricción se heredan según las leyes de Mendel. Hay cuatro alelos para un marcador de restricción en todas las combinaciones para pares posibles; la segregación es independiente.
    • La identificación de individuos usando3. MAPEO sitios de restricción se ha denominado huella digital de DNA (fingerprinting). Si un marcador de restricción es asociado a una característica fenotípica, el sitio de restricción debe estar localizado cerca del gen responsable del fenotipo. La mutación que cambia la banda común a los pacientes, está íntimamente relacionada con el gen de la enfermedad.
    • 3. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)1. Ventajas: 1. Alta sensibilidad 2. Alta especificidad 3. Rapidez2. Otras ventajas: 1. Detección a partir de cualquier muestra biológica (sangre, piel, cabellos, saliva, líquido cefaloraquídeo, etc…) 2. No es necesario que la muestra sea estéril 3. Detección de un patógeno en particular aún en presencia de otros patógenos.
    • 3. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)Variantes de PCR:1. RT-PCR: detección de mRNA2. PCR-RFLP: polimorfismo genético3. RAPDs: amplificación con random primers - polimorfismo4. PCR Nested: amplificación de una secuencia dentro de otra previamente amplificada5. PCR Multiplex: varios targets diferentes en forma simultánea6. Inverted PCR: para conocer secuencias flanqueadoras7. Long PCR: amplificación de fragmentos grandes 10 -20 kb.
    • 3. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)El PCR se realiza básicamente en tres pasos:• 1. Desnaturalización. Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla. Típicamente se usa una temperatura de 95˚C - 97˚C; el tiempo depende del tamaño del genoma
    • 3. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)2. Apareamiento o alineamiento: Los “primers”previamente diseñados, reaccionan con la hebra sencilla deDNA y se pegan en lugares específicos porcomplementariedad de bases. Para esto, se baja latemperatura -ej: 55˚C por 30 segundos-. La temperatura y eltiempo pueden variar.
    • 3. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)3. Polimerización o extensión: Una Polimerasa de DNAextiende los “primers”, en el espacio comprendido entre ambos“primers”, y coloca dinucleótidos trifosfatados (dNTP’s) de 5’a 3’leyendo el DNA de 3’a 5’. De estas forma sintetiza la secuenciacomplementaria de las hebras de DNA molde. Se efectúa a 72˚C por1½ minutos (puede variar según sea necesario)
    • 3. ¿CÓMO SE SECUENCIA DNA?Método enzimático de terminación de cadena (método dideoxi de Sanger)• Polimerización interrumpida de DNA• Se lleva a cabo cada polimerización de DNA en presencia de derivados dideoxi que detienen la polimerización en diferente momento, obteniéndose fragmentos de diferente tamaño.• Se examinan en electroforesis, se “lee” secuencia directamente del gel
    • MÉTODO DIDEOXI DE SANGER
    • MÉTODO DIDEOXI DE SANGER (2)
    • 4. PROTOCOLO EXPERIMENTAL DE RFLP (II)De nuevo en el laboratorio…Preparar el gel de agarosa al 1% en amortiguadorTAE 1X, dejar solidificar el gel.Colocar el gel en la cámara de electroforesis yañadir la cantidad de amortiguador (TAE1X)necesaria para cubrir el gel.
    • 4. PROTOCOLO EXPERIMENTAL DE RFLP (II)De nuevo en el laboratorio…Una vez que transcurrió el tiempo de incubación delas muestras digeridas, agregar 5μL de amortiguadorde carga a cada una, se agitan con pequeñosgolpes y se centrifugan por unos segundos (10s) avelocidad máxima.
    • 4. PROTOCOLO EXPERIMENTAL DE RFLP (II)De nuevo en el laboratorio…En el primer carril del gel de agarosa colocar 10μLdel marcador de peso molecular DNA de λ/HindIII.En los demás carriles colocar: Carril 2. MH El marcador λ/HindIII se obtiene a partir del DNA del fago λ digerido con Carril 3. S1 HindIII hasta generar bandas entre Carril 4. S2 0.125Kb y 23Kb aptas para ser marcadores de peso molecular en Carril 5. S3 geles de agarosa. Este marcador se compone de 8 fragmentos de DNA Carril 6. S4 individuales purificados (en pb): Carril 7. S5 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 y 125.
    • 4. PROTOCOLO EXPERIMENTAL DE RFLP (II)De nuevo en el laboratorio…Cerrar la cámara de electroforesis, conectar loselectrodos a la fuente de poder asegurándose deque los electrodos se encuentren en la posicióncorrecta, electrodo negativo (negro), electrodopositivo (rojo).Encender la fuente de poder y graduar el selectorde voltaje hasta 100V durante 40min.
    • 5. EXTRACCIÓN DE DNA¿Cómo extraer DNA de algo vivo en casa?Primero necesitamos algo a lo que podamosextraerle DNA. Espinacas Hígado de pollo Fresas Brócoli
    • 5. EXTRACCIÓN DE DNA¡Locura con la licuadora!Pon en una licuadora:½ taza de chícharos (100mL)1/8 de cuchara para té con sal (menos de 1mL)1 taza de agua fría.Licúa en máximo por 15s. La licuadora separa lascélulas de chícharo, así que esto genera una sopade células de chícharo.
    • 5. EXTRACCIÓN DE DNA¡Chícharos en caldo!Vierte esta sopa de chícharo a través de un colador enotro contenedor (una tacita medidora).Adiciona 2 cucharadas de detergente líquido (30mL) yagita hasta mezclar.Deja la mezcla asentar por 5-10minVierte la mezcla en tubos de ensayo o pequeñoscontendedores de vidrio, cada uno cerca de 1/3 delvolumen.
    • 5. EXTRACCIÓN DE DNAPoder enzimáticoAdiciona un poco de enzimas al tubo de ensayo yagita suavemente (¡ten cuidado! Si agitasdemasiado duro se puede romper el DNA).Enzimas: Suavizador de carne Jugo de piña Solución limpiadora para lentes de contacto
    • 5. EXTRACCIÓN DE DNASeparación alcohólicaLadea el tubo de ensayo y adiciona lentamente etanol al70-95%. Debe formar una capita sobre la sopa dechícharos. Vaciar hasta que la cantidad de alcoholiguale la cantidad de sopa de chícharo.Espera un tiempo y verás formarse en la fase alcohólicaunos pequeños hilos blancos en forma de grumos…Voilà… ¡Habrás separado DNA!
    • 5. TÉCNICA DE RFLP Supongamos que de un alelo polimórfico tenemos tres variantes: V1, V2, V3. En este alelo hay cuatro posibles dianas de restricción: d1, d2, d3, d4, situadas alrededor del segmento en cuestión. Segmento de DNA clonadoSi se trata con el enzima de restricción el DNA aislado de un individuo con elalelo V1, aparecerán secuencias correspondientes al segmento de DNAclonado en fragmentos de 300pb.
    • 5. TÉCNICA DE RFLP Supongamos que de un alelo polimórfico tenemos tres variantes: V1, V2, V3. En este alelo hay cuatro posibles dianas de restricción: d1, d2, d3, d4, situadas alrededor del segmento en cuestión. Segmento de DNA clonadoSi se trata con el enzima de restricción el DNA aislado de un individuo quepresente la variante V2, aparecerán secuencias correspondientes al segmentode DNA clonado en fragmentos de 300 y 400 pb.
    • 5. TÉCNICA DE RFLP Supongamos que de un alelo polimórfico tenemos tres variantes: V1, V2, V3. En este alelo hay cuatro posibles dianas de restricción: d1, d2, d3, d4, situadas alrededor del segmento en cuestión. Segmento de DNA clonadoSi se trata con el enzima de restricción el DNA aislado de un individuo quepresente la variante V3, aparecerán secuencias correspondientes al segmentode DNA clonado en fragmentos de 600 pb.
    • 5. TÉCNICA DE RFLPDetección de polimorfismo por Southern Blotting
    • 6. DISCUSIONES Y CONCLUSIONESAnalicemos la muestra…Apagar fuente de poder. Retirar la placa de gel deagarosa 1% y colocarla sobre una charola.Observar el bandeo.¿Alguna banda de sospechosos (S1,S2,S3,S4,S5)coincide con MH? ¿Quién asesinó a Silverio?
    • 6. DISCUSIONES Y CONCLUSIONESTamaño de los fragmentos de DNA digeridos. Fragmento Tamaño Porcentaje Masa (ng/0,5μg) 1 23130 47.7 238.4 2 9416 19.4 97.1 Nota bene. Los 3 6557 13.5 67.6 extremos de los fragmentos 1 y 4 4 4361 9.0 45.0 pueden unirse entre ellos y formar un 5 2322 4.8 23.9 fragmento de 27491 6 2027 4.2 20.9 pb. De aparecer 7 bandas, se quita la 7 564 1.2 5.8 banda 4 y se suma a la banda 1. 8 125 0.3 1.3Con regla de tres determinar el tamaño en pb de los fragmentos obtenidos en los carriles(la distancia recorrida en mm es proporcional al tamaño de la muestra del marcador.
    • 6. DISCUSIONES Y CONCLUSIONESMapeo de las bandas¿Cuántos fragmentos se obtuvieron al cortar losfragmentos con EcoR1 y PstI?¿Cómo se relacionan esos fragmentos?¿Cómo se diferencian los fragmentos?¿Cuáles podrían ser los sitios de restricción que tienenlas diferentes variables alélicas?¿Qué información nos hace falta para realizar elmapeo, si nos hace falta?
    • 6. DISCUSIONES Y CONCLUSIONESAnalicemos la muestra…¿Es suficiente esto para condenar al asesino de Silverio?Deberíamos analizar otras cuestiones:1. ¿cómo fue la pelea?2. ¿por qué inició la pelea?3. ¿había motivos en particular?4. ¿hay otras posibles teorías por las cuales se explique que la sangre del asesino de Silverio esté en la empuñadura del arma?5. ¿Cómo se puede llegar a la identidad del asesino de manera certera?
    • 6. DISCUSIONES Y CONCLUSIONESConclusionesNaturaleza y extensión del crimen: homicidio en riñatumultuosa.Los seres humanos tienen identidad única debido ala existencia de los polimorfismos.Los polimorfismos son múltiples alelos contenidos enel mismo locus.
    • 6. DISCUSIONES Y CONCLUSIONESConclusionesLa segregación de los alelos polimórficos esindependiente y va acorde a las leyes de Mendel.El mapeo mediante sitios de restricción evita el tener querealizar la secuencia completa de un genoma paradetectar la identidad de una persona.La técnica de PCR permite ampliar fragmentos de DNA,pero con una eficiencia que oscila entre 80-90% y quedepende de la cantidad de DNA clonado.
    • 6. DISCUSIONES Y CONCLUSIONESConclusionesEl mapeo de polimorfismos requiere de una serie de pasos queva de la extracción del DNA hasta la obtención de la placa deSouthern Blotting.La técnica de Southern Blotting es en placa de agarosa y sirvepara detectar fragmentos de DNA.La secuenciación por el método de Sanger es importante paratipificar la secuencia del gen del alelo ya determinado.Las enzimas de restricción son importantes para laBiotecnología del DNA recombinante y sus aplicaciones handemostrado ser cada vez más extensas.
    • PREGUNTAS Y RESPUESTASDe antemano, gracias por su invitación yparticipación en este proyecto.