Sistema lactoperoxidasa

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  • @Gus Tavo yyyyyyyyyy ............
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  • Introduccion 1.4.3.1
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  • Introduccion 31
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  • EFECTO DEL SISTEMA LACTOPEROXIDASA SOBRE LA FABRICACION DEL QUESO Y OTROS PRODUCTIOS LACTEOS FERMENTADOS
    13. La activación del sistema lactoperoxidasa permite conservar la leche crudadurante períodos cortos de tiempo a temperatura ambiente, antes de serprocesada.Zalí et al. (1983a y 1983b) fabricaron quesos Cottage y Cheddar a partir deleche conservada durante 8 días con el sistema lactoperoxidasa yposteriormente pasteurizada a 730C/16s. El queso Cottage fabricado a partirde leche tratada produjo un 2% más de rendimiento que el control. Lascaracterísticas organolépticas de los quesos Cottage y Cheddar tratados fuerondiferentes a las de los controles, aunque no fueron defectuosas (Zalí et al., 1983a).El queso Cheddar fabricado a partir de leche tratada presentó una cuajada másdébil y con producción de ácido más lenta que en el control, tardando el suero2 horas más en llegar a la acidez deseable para moler la cuajada (Zalí et al.,1983b).
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  • Tu trabajo es parecido a este otro: http://biblioteca.ucm.es/tesis/19911996/X/3/X3030301.pdf
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Sistema lactoperoxidasa

  1. 1. UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA FACULTAD DE INGENIERÍA INDUSTRIALESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL__________________________________________________________________________________________________________ Siempre adelante Trabajo Encargado “Sistema Lactoperoxidasa” Curso: Microbiología Aplicada Profesor: Mcblgo. Dorothy Torres Alumno: RAGURTOL Piura – Perú I. HISTORIA
  2. 2. En 1924, l-lanssen observó que la leche recién ordeñada resultaba bactericidafrente a Bacillus Typhosa y B. paratyphosa, correlacionando este efecto con lapresencia de enzimas oxidantes en la leche.En 1957 a partir del análisis y aprobación por la FAO, de la posibilidad deutilizar el peróxido de hidrógeno en la conservación de la leche cruda destinadaal consumo humano en condiciones donde fuera imposible practicar larefrigeración, muchos países, de forma oficial o sin la aprobación expresa delas legislaciones nacionales la utilizaron para tal fin.Posteriormente, Wright & Tramer (1958) encontraron que la enzimalactoperoxidasa estaba implicada en la inhibición de estreptococos lácticosutilizados como fermentos en la fabricación del queso.Portman & Auclair (1959) observaron cómo al inactivarse la lactoperoxidasadesaparecía el efecto inhibitorio de la leche, mientras que añadiendolactoperoxidasa pura se restablecía la actividad inhibitoria de la lecheanteriormente inactivada.El empleo del agua oxigenada, fundamentalmente por parte de la industria, haconstituido un medio de evitar la acidificación de grandes volúmenes de leche yposibilitar su posterior tratamiento térmico. Sin embargo, este método requierede una gran cantidad de producto (300-800 mg/L), altera en cierta medida elsabor de la leche (metálico), adiciona algunos contaminantes potencialmentetóxicos y puede producir quemaduras o irritación de la piel, características quedificultan su manipulación en lecherías e industrias lácteas.En los años 60, investigaciones sobre calostro en Suecia llevaron aldescubrimiento de un sistema enzimático natural de conservación de la leche.La enzima es llamada Lactoperoxidasa y, mediante investigación enprofundidad, se desarrolló un sistema de reactivación usando activadoressimples. II. INTRODUCCION
  3. 3. La refrigeración entre 4- 6 grados ºC es el método universalmente reconocidopara conservar la leche cruda. Su amplia aplicación, unido a la implementaciónde las buenas prácticas de ordeño e higiene y de mejores niveles de salud enlos rebaños lecheros, ha posibilitado el establecimiento en los paísesdesarrollados de conteos máximos de bacterias menores de 1x 10 UFC/ml, eincluso menores de 2.5 x 10 4 UFC/ml, así como otras exigencias de calidad endependencia del grado de clasificación de la misma.La calidad de la leche, es un factor muy importante para su aceptación por lasplantas procesadoras. La dispersión geográfica de los núcleos productores,que normalmente se observa, complica y encarece la recolección de la leche,dificultada además por las malas condiciones en el manejo de la leche. Dichasituación afecta la buena conservación de la leche mientras esta llega a lasplantas procesadoras. En áreas remotas donde existe una gran demanda por laleche fresca de buena calidad, el producto puede transportarse sin refrigeraciónhasta 30 km, pero después de cierto período comienza a deteriorarse,comenzando el proceso de acidificación.La leche contiene varios factores antibacterianos entre ellos los más conocidosson las inmunoglobinas. La leche también contiene otros factores noespecíficos como la lisozima, La lactoferrina y la peroxidasa. Esta peroxidasa,que recibe el nombre de lactoperoxidasa, es idéntica a la presente en la salivay el jugo gástrico de los mamíferos (FAO, 2000).La lactoperoxidasa no tiene efecto antibacteriano por si misma, perocombinada con tiocianato oxidado (también presente en la leche, así como enla saliva y en el jugo gástrico) y con peroxido de hidrógeno, la reacción químicaresultante crea compuestos antibacterianos. Estos compuestos antibacterianosinterfieren con el metabolismo de las bacterias.Algunas bacterias, como los estreptococos y los lactobacilos, presentes en laflora intestinal normal, quedan inhibidas temporalmente y más tarde serecuperan. Otras mas como Echerichia coli, Salmonella y Pseudomonas spp. ,quedan eliminadas. (FAO, 2000). III. MARCO TEORICO
  4. 4. SISTEMA LACTOPEROXIDASAEl sistema lactoperoxidasa se compone de la enzima lactoperoxidasa, quecataliza la reacción de oxidación del ión tiocianato por el peróxido dehidrógeno. La necesidad del sustrato peróxido de hidrógeno fue establecida porJago & Morrison (1962), y la del ión tiocianato por Reiter et al.  COMPONENTES: 1. LACTOPEROXIDASALa lactoperoxidasa pertenece al grupo de enzimas de las peroxidasas, quejunto con la catalasa y el peróxido dismutasa reducen el peróxido de hidrógenogracias a una variedad de donantes de electrones y protegen a las células delmetabolismo tóxico del oxígeno. Las peroxidasas están ampliamentedistribuidas en los tejidos de los mamíferos, encontrándose en las glándulasmamarias, salivares (Slowey et al., 1968), lacrimales y tiroides, así como en lamucosa intestinal y en el mucus cervical (Shindler et al., 1976).Cuando las ubres están infectadas (>106 leucocitos/mí), aumenta la actividadperoxidasa debido a que los leucocitos liberan mieloperoxidasa y peróxido dehidrógeno.La lactoperoxidasa fue purificada por Theorell & Ákesson (1943). Es unaglicoproteína con un peso molecular de 78000 y un grupo hemo (Theorell &Pedersen, 1944).El contenido en hierro es de 0.068-0.071% y en carbohidrato de 9.9-10.2%(Carlstróm, 1969). El grupo hemo es una protoporfirina IX (Sievers, 1979).Al ser la lactoperoxidasa una proteína cargada positivamente a pH neutro, sepuede aislar por cromatografía de intercambio catiónico (Martín-Hernández)1990; Yoshida & Xiuyun, 1991).La lactoperoxidasa se inactiva parcialmente por pasteurización corta a 74ºC(Wright & Tramer, 1958). Se inactiva totalmente si se calienta durante 15minutos a 75ºC. Sin embargo, si se calienta 15 segundos a 80ºC sólo sereduce su actividad en un 40% (Griffiths, 1986). La lactoperoxidasa resiste la
  5. 5. acidez, hasta un pH igual a 3 (Wright & Tramer, 1958), y la acción proteolíticadel jugo gástrico (Gothefors & Marklund, 1975).En cambio, esta enzima se inactiva irreversiblemente por un exceso deperóxido de hidrógeno (10 mM), al destruir los radicales superóxido e hidroxiloel grupo hemo (Kohler et al., 1986). Igualmente se inactiva por la luz enpresencia de riboflavina y oxígeno (Martín-Hernández et al., 1990) o por uncrecimiento excesivo de microorganismos (Kiermeier & Káiser).La actividad inhibitoria de la lactoperoxidasa se puede revertir añadiendo almedio compuestos con grupos sulfhidrilo (Aune & Thomas, 1977). 2. TIOCIANATOEl ión tiocianato se encuentra ampliamente distribuido en tejidos y secrecionesanimales. Se localiza en las glándulas mamarias, salivares, tiroides, y en elestómago (secretado por las células parietales al igual que el ácido clorhídrico),riñón y fluidos biológicos como el plasma o el líquido cefalorraquideo.Las fuentes de tiocianato son los glucosinolatos y los glucósidos cianogénicos.Las especies del género Brassica (familia Cruciferae) como la coliflor, berza ynabo son ricas en glucosinolatos, que forman tiocianato tras hidrólisis (Wood,1975). Los glucósidos cianogénicos se encuentran en el maíz, la caña deazúcar, los guisantes y las habas. Al hidrolizarse forman cianuro, que reaccionacon grupos tiosulfato y productos metabólicos de aminoácidos azufrados paraconvertirse en tiocianato.Esta reacción de detoxificación es catalizada por la enzima rodanasa que seencuentra en hígado, riñón y tiroides.La cantidad de ión tiocianato depende de la dieta. Tanto en la saliva como en eljugo gástrico del hombre se registran altas cantidades de tiocianato, 50-300ppm y 40-50 ppm, respectivamente. Se han encontrado concentraciones de0.45 mM en el abomaso de terneros aparte de las cantidades ingeridas en laleche, que pueden oscilar entre 0.02 y 0.25 mM si las vacas consumen pastosnaturales en los que hay trébol (contiene cianuro).
  6. 6. Las vacas alimentadas con piensos dan menores cantidades de tiocianato en laleche (Reiter & Hárnulv, 1984). Según estos mismos autores, se hacomprobado que las ubres infectadas (≥10 6 leucocitos/ml) tienen más cantidadde tiocianato en la leche al difundir éste desde el plasma sanguíneo (Korhonen,1973).Un exceso de tiocianato en el organismo puede producir bocio al interferir conel metabolismo del iodo, Sin embargo, tanto la cantidad de leche ingerida comola concentración de tiocianato en la leche no llegan al límite necesario parapoder afectar a la función tiroidea. Se requerirían dosis de 400 mg de tiocianatopara poder producir alteraciones en dicha función. Igualmente, se necesitaríancantidades superiores a 20 ppm en el plasma humano para interferir con elmetabolismo del iodo (IDE., 1988).Por otra parte, el tiocianato eleva los niveles de nitrosaminas, a pH <3.5, enpresencia de nitritos y aminas. Como el pH del jugo gástrico aumenta con laingestión de la leche gracias a su capacidad tampón, no hay peligro deformación de tumores. 3. PEROXIDO DE HIDROGENOEl peróxido de hidrógeno es un agente oxidante, con efecto bactericida contraE. Coli a concentraciones de 10-20 mM. En cambio, sólo se necesitanconcentraciones de 0.01-0.02 mM para catalizar la oxidación del ión tiocianato,bromuro o ioduro por el sistema lactoperoxidasa.La leche no contiene peróxido de hidrógeno, ya que las cantidades del ordende nanomoles generadas por los leucocitos polimorfonucleares y difundidas ala leche son rápidamente inactivadas por acción de la catalasa y peroxidasa(Reiter & Hárnulv, 1984). La xantina oxidasa, presente en la leche, puedeproducir peróxido de hidrógeno, pero los substratos (purinas, aldehídos yNADH2) se encuentran en pequeñas cantidades.Las fuentes naturales de peróxido de hidrógeno son los leucocitospolimorfonucleares y el metabolismo de las bacterias lácticas, Gram positivas ycatalasa negativa, como lactobacilos, lactococos y estreptococos, queproducen en condiciones aerobias suficiente peróxido de hidrógeno como para
  7. 7. activar el sistema lactoperoxidasa y autoinhibirse (Carlsson et al., 1983).Aunque es difícil de comprobar b presencia de peróxido de hidrógeno en lasaliva y el jugo gástrico, debido a su rápida utilización, hay bacterias que loproducen en ambos casos (Marshall el al., 1982).Para activar el sistema lactoperoxidasa hay que añadir exógenamente elperóxido de hidrógeno. Este se puede aportar químicamente, diluido o en formasólida. Los peróxidos metálicos de sodio, magnesio o calcio no son estables yliberan e] peróxido de hidrógeno aún conservados en atmósfera inerte,inactivando la enzima (Monnom et al., 1989).El peróxido de hidrógeno se puede aportar también enzimáticamente gracias ala acción de enzimas como la glucosa oxidasa o la xantina oxidasa. La primeracataliza la siguiente reacción:El peróxido de hidrógeno se consume rápidamente gracias al sistemalactoperoxidasa y no excede la concentración de 10 Um.  MODO DE ACCIÓN DEL SISTEMA LACTOPEROXIDASA1. PRODUCTOS DE OXIDACION DEL ION TIOCIANATOLa acción antimicrobiana del sistema lactoperoxidasa se atribuye a productosintermedios de la oxidación del tiocianato. Estos productos son,fundamentalmente, el ión hipotiocianito (OSCN -) y los aniones de mayoroxidación como el del ácido cianosulfliroso (HO2SCN) y el del ácidocianosulfúrico (HO3SCN).El metabolito principal es el hipotiocianito (Aune & Thomas, 1977),encontrándose en equilibrio con el ácido hipotiocianoso, con pk=5.3.El ión hipotiocianito es bactericida en concentraciones de umol/l,comprobándose su acumulación en la reacción de oxidación del tiocianatocatalizada por la lactoperoxidasa.
  8. 8. Además, el ión hipotiocianito no enziínático inhibe a Streptococcus mutans. Losotros iones de mayor nivel de oxidación se forman cuando el peróxido dehidrógeno se encuentra en mayor proporción que el tiocianato y son aún menosestables que el hipotiocianito. Todos estos iones, producto de la oxidación deltiocianato, resultan ser termolábiles y se descomponen por calor a 60ºC,durante 15 minutos.2. ACCION SOBRE LA CELULA BACTERIANALos productos intermedios de oxidación del tiocianato tienen los siguientesefectos sobre la célula bacteriana: • Inhiben el crecimiento. • Inhiben la toma de oxígeno. • Inhiben la producción de ácido láctico. • Inhiben la acción enzimática de la hexoquinasa y de la gliceraldehido-3- fosfato deshidrogenasa.La lactoperoxidasa inhibe la actividad lipasa lipoproteínica y, en consecuencia,la lipólisis en la leche.Se ha comprobado que el hipotiocianito, en concentraciones comparables a lasproducidas por la lactoperoxidasa, tiene los mismos efectos; la cisteína reviertela inhibición de los microorganismos gram positivos, catalasa negativos, comoestreptococos y lactobacilos, se autoinhiben en ambiente aerobio al producirperóxido de hidrógeno. El sistema lactoperoxidasa resulta para ellosbacteriostático. Marshall & Reiter (1980) comprobaron que la pared celular delos estreptococos es una barrera protectora más eficaz a la penetración dehipotiocianito que la membrana externa de E. cotí.Los microorganismos Gram negativos, catalasa positiva, como Pseudomonas,coliformes, Salmonella y Shigella, mueren en presencia del sistemalactoperoxidasa si el peróxido de hidrógeno se suministra química oenzimáticamente. Esta acción bactericida depende del pH del medio, deltiempo de incubación y de la temperatura. Oram & Reiter (1966) encontraron
  9. 9. que en las cepas de estreptococos resistentes es más alta que en las cepassensibles la actividad de la enzima NADH2 oxidasa, que cataliza la oxidaciónde NADH2 por el ión hipotiocianito dando tiocianato.3. APLICACIONES DEL SISTEMA LACTOPEROXIDASAPara activar el sistema lactoperoxidasa son suficientes unas concentracionestan bajas de tiocianato y de peróxido de hidrógeno como 12 ppm y 8 ppmrespectivamente, lo que lleva a una concentración equimolar óptima de 0.25mM de estos dos compuestos.Las aplicaciones del sistema lactoperoxídasa son las siguientes: • Mantener la calidad microbiológica de la leche. • Aumentar la producción animal. • Mejorar la higiene bucal en el hombre.Se puede mantener la calidad microbiológica de la leche tanto refrigerada comoen malas condiciones de recogida, a temperatura ambiente. En el primer caso,la Lactoperoxidasa evita el crecimiento de psicrotrofos, principalmentePseudomonas, género productor de lipasas y proteasas resistentes a lapasteurización que alteran la calidad del queso.En cuanto a la producción animal, Reiter et al. (1981) comprobaron el aumentode peso de los terneros alimentados con leche cruda a la que se le habíaañadido tiocianato y peróxido de hidrógeno. Se piensa que la lactoperoxidasapuede favorecer la colonización del intestino por la flota láctica, en detrimentode bacterias patógenas como E. coli, Salmonella o Campylobacter.EL SISTEMA LACTOPEROXIDASA EN LA MEJORA DE LA CALIDADMICROBIOLÓGICA DE LA LECHE Y DE LOS PRODUCTOS LÁCTEOS
  10. 10. En 1957, la FAO (57/11/8655, Roma) estableció el uso del peróxido dehidrógeno, en cantidades de 300-500 ppm, para conservar la leche cruda. Sinembargo, el manejo del peróxido de hidrógeno requiere grandes precauciones,ya que es un agente oxidante potente.Se ha comprobado que afecta, en esas cantidades, a ciertas propiedades de laleche y que altera el sabor y la textura del queso, con pérdidas en el valornutritivo de Las proteínas. En muchos países está prohibida la adición deperóxido de hidrógeno a la leche. o Mejora de la calidad microbiológica de la leche crudaLa eficacia del sistema lactoperoxidasa en la mejora de la calidadmicrobiológica de la leche cruda depende de varios factores: - Número y tipo de microorganismos. - Naturaleza de la alimentación y del entorno ambiental. - Concentraciones molares de tiocianato/peróxido de hidrógeno. 1. Temperatura de la lecheTiempo de aplicación del sistema después del ordeño. Actividad catalasapositiva de los microorganismos. El efecto antibacteriano del sistemalactoperoxidasa es inversamente proporcional a la temperatura y directamenteproporcional a la calidad microbiológica inicial de la leche.El mayor efecto antibacteriano del sistema lactoperoxidasa a bajastemperaturas puede deberse a que el producto de oxidación del tiocianato esmás estable. 2. Leche cruda refrigerada Entre los microorganismos psicrotrofos capaces de multiplicarse a 7ºC y a temperaturas inferiores predomina el género Pseudomonas. Su crecimiento limita el almacenamiento de la leche cruda a temperaturas de refrigeración. Mientras que estos microorganismos son sensibles a la pasteurización, no lo son sus enzimas lipolíticas y proteoliticas.
  11. 11. Según Bjórck (1978), la leche cruda (sin activar el sistema lactoperoxidasa),con buena calidad microbiológica, se mantiene 48 horas a 50C sincrecimiento de psicrotrofos. Cuando se activa el sistema lactoperoxidasa,ajustando las concentraciones de tiocianato y de peróxido de hidrógeno a0.25 mM, se consigue alargar el período de almacenamiento de la lechecruda a 40C hasta los 5 días, sin crecimiento de la flora psicrotrofa.El sistema lactoperoxidasa es bactericida contra Fseudomonas fluorescens yE. cotí en la leche. A 5ºC, E. Fluorescens no se multiplica hasta pasadas 72horas.Zajac et al. (1983a) mantuvieron la leche cruda durante 104 horas a 4ºC sinincremento en los niveles de bacterias totales, coliformes y psicrotrofos, trasactivar el sistema dos veces, a las 48 y 96 horas después del ordeño.Martínez et al. (1988) almacenaron la leche cruda a 4ºC durante 4, 6 y 8días; posteriormente la pasteurizaron y la volvieron a almacenar a 8 y 16ºC.En todos los casos, la leche tratada con el sistema lactoperoxidasa activadoa las 48 horas del ordeño y después de la pasteurización, se mantenía mástiempo sin alterarse. La vida media de la leche pasteurizada, cuando elalmacenamiento de la leche cruda sobrepasaba los dos días, se prolongógracias al sistema lactoperoxidasa.La activación del sistema lactoperoxidasa, unido a la pasteurizacióninmediata de la leche a 630(7/30 minutos, alarga a 20 días la vida media dela leche almacenada a 10ºC. Mientras que en la leche control el crecimientode la flora superviviente comienza a los 4 días de la pasteurización, en laleche tratada no lo hace hasta los 12 días.Finalmente, las propiedades fisico-quimicas de la leche no se ven afectadaspor el sistema laetoperoxidasa. No se produce resistencia de Ps. fluorescensa repetidos tratamientos, ni se ha detectado acumulación alguna de cepasresistentes. 3. Leche cruda a temperatura ambiente
  12. 12. La mejora de la calidad microbiológica de la leche cruda mediante activacióndel sistema lactoperoxidasa, en condiciones adversas de recogida y transportey a temperatura ambiente de hasta 380C, se ha probado en varios países:Pakistán, India, Egipto, Méjico, China y Kenia.El efecto bactericida del sistema lactoperoxidasa es dependiente de latemperatura y perdura 4 horas a 300C (Bjórck et al., 1975). Realizaronexperimentos con leche cruda de vaca, en el laboratorio y en el campo, enKenia.La activación del sistema lactoperoxidasa, llevando la concentración detiocianato a 15 ppm y añadiendo 7.5 ppm de peróxido de hidrógeno, permitíaun mayor tiempo de almacenamiento de la leche a temperatura ambiente. Elefecto antibacteriano del sistema lactoperoxidasa permitió almacenar la lechecruda durante 7 u 8 horas, a 30ºC. Estos resultados concuerdan con losobtenidos por Kamau & Kroger (1984).Por debajo de esta temperatura el efecto es más duradero, de tal manera queunido a un sistema de refrigeración por agua permitiría almacenar la lechedurante una noche, si se consigue bajar la temperatura a 15-20ºC.  EFECTO DEL SISTEMA LACTOPEROXIDASA SOBRE LA FABRICACION DEL QUESO Y OTROS PRODUCTIOS LACTEOS FERMENTADOS
  13. 13. La activación del sistema lactoperoxidasa permite conservar la leche crudadurante períodos cortos de tiempo a temperatura ambiente, antes de serprocesada.Zalí et al. (1983a y 1983b) fabricaron quesos Cottage y Cheddar a partir deleche conservada durante 8 días con el sistema lactoperoxidasa yposteriormente pasteurizada a 730C/16s. El queso Cottage fabricado a partirde leche tratada produjo un 2% más de rendimiento que el control. Lascaracterísticas organolépticas de los quesos Cottage y Cheddar tratados fuerondiferentes a las de los controles, aunque no fueron defectuosas (Zalí et al., 1983a).El queso Cheddar fabricado a partir de leche tratada presentó una cuajada másdébil y con producción de ácido más lenta que en el control, tardando el suero2 horas más en llegar a la acidez deseable para moler la cuajada (Zalí et al.,1983b).En la fabricación de queso fresco, Lara et al. (1987) encontraron que el tiempode coagulación de la leche tratada fue mayor que el de la leche control, debidoa una menor acidificación.El rendimiento en humedad y extracto seco fue mayor para el queso de lechetratada que para el control, ya fuera fabricado a partir de leche cruda o de lechepasteurizada. Los niveles de totales, pH y apariencia del queso de lechetratada fueron aceptables. Estos resultados concuerdan con los obtenidos porZalí et al.  EFECTO DEL SISTEMA LACTOPEROXIDASA SOBRE LOS FERMENTOS LACTICOS
  14. 14. Mientras que la leche pasteurizada durante 30 minutos a 95”C eslactoperoxidasa negativa, cuando se pasteuriza a temperatura más baja ytiempo corto (72 “(7/15 s) permanece el 55% de la actividad lactoperoxidasa,resultando inhibitoria para la mayor parte de los fermentos lácticos.Las distintas cepas pueden tener una sensibilidad diferente al sistemalactoperoxidasa, resultando unas claramente inhibidas, mientras que otras sonresistentes o incluso son estimuladas por él (IDF, 1991).La inhibición del sistema lactoperoxidasa sobre los fermentos lácticos dependede:  La cantidad de peróxido de hidrógeno producido por las distintas cepa  La composición de la leche.Se sabe que la producción de peróxido de hidrógeno por los lactococosdepende de la relación entre la actividad de enzima NADITI oxidasa, quegenera peróxido de hidrógeno, y la actividad de NADH peroxidasa, que lodestruye.Al activar el sistema lactoperoxidasa de la leche cruda, añadiendo tiocianato yperóxido de hidrógeno, se redujo la actividad de un cultivo mixto de cepastermófilas, retrasándose 4.5 horas el tiempo de coagulación (Valdez et al.,1988). Roginski u al. (1984a) encontraron que la leche de verano inhibe menosque la de invierno, debido a que tiene más compuestos con grupos SHtermolábiles que contrarrestan el efecto del sistema lactoperoxidasa.Por otro lado, no se sabe si existe una relación directa entre la cantidad detiocianato en la leche y la inhibición por el sistema lactoperoxidasa. Roginski etal. (1984b) encontraron, incluso, un efecto estimulador del tiocianato sobre elcrecimiento de los fermentos lácticos mesófilos cuando se encontraba enconcentraciones molares mayores que las del peróxido de hidrógeno. IV. PROBLEMÁTICA
  15. 15. Encontrar los métodos y concentraciones exactas para aplicar el sistemalactoperoxidasa.Buscar una leche con baja carga microbiana para obtener un resultado precisoy de calidad.La dificultad que fuimos encontrando en el camino con respecto a losmateriales y la falta de apoyo en los laboratorios. V. OBJETIVOS  OBJETIVO GENERAL:Los objetivos del presente trabajo fue evaluar la conservación de la leche crudamediante la activación del sistema lactoperoxidasa.OBJETIVOS ESPECIFICOS:  Evaluar la calidad microbiológica de la leche cruda de vaca mediante la prueba de reducción de azul de metileno.  Investigar la influencia de la activación del sistema lactoperoxidasa sobre la supervivencia de microorganismos causantes de alteraciones a través del método de RT. Asi también determinar los RT en la leche no tratada con SLP.  Realizar luego de 24 horas la prueba de azul de metileno a las dos muestras de leche, tratada y sin tratar para comparar su calidad.  Así mismo, realizar también una prueba casera a la leche tratada con el sistema lactoperoxidasa y a la leche sin tratar y comparar los resultados VI. HIPÓTESIS
  16. 16. A partir de componentes químicos como lo son tiocianato de potasio y peróxidode hidrogeno se efectuara el sistema lactoperoxidasa como un sistema deconservación para la leche cruda. Para la activación de dicho sistema seadicionaran las concentraciones necesarias de los reactivos.La muestra de leche a utilizar será de ganado vacuno de un establo de la zona.Como es de conocimiento el sistema lactoperoxidasa, se activara en base a lacalidad microbiológica de la leche a usar. Para que este procedimiento seaposible, se realizara antes del ensayo la prueba de reducción de azul demetileno con fin de determinar el estado de aceptación de la leche. VII. MATERIALES  Material Biológico: - Pipetas - Leche orgánica. - Probeta - Tiocianato de potasio - Tubos de ensayo con tapa rosca - Peróxido de hidrogeno 3% - Vasos de precipitado - Azul de metileno - Gradillas - Agua destilada - Olla - Solución salina fisiológica  Equipos de laboratorio: - Agar nutritivo - Cocina  Material de laboratorio: - Incubadora - 6 placas petri - Autoclave - 6 tubos de ensayo - Balanza analítica VIII. PROCEDIMIENTO
  17. 17.  PRUEBA DEL AZUL DE METILENO A LA MUESTRA DE LECHE INICIALContamos con 1.5 litros de leche de vaca como muestra inicial.Extrajimos 30ml de dicha muestra para hacer la prueba del azul de metileno.El tubo número 2 se puso como el tubo número 3. En conclusión nos demostrómediante esta prueba que la leche duro de 3 horas a más y por ende la lechees de muy buena calidad.  ACTIVACION DEL SISTEMA LACTOPEROXIDASA (S.L.P.) PARA LA PRIMERA MUESTRATomamos 1/2 de leche de la muestra inicial para la aplicación del sistemalactoperoxidasa y 1/2 litro para una muestra control. 1. Procedimos a realizar el sistema. En el recipiente estéril agregamos el litro de leche. 2. Pesamos 7mg de tiocianato de potasio en la balanza analítica. 3. Realizamos en calculo del peróxido de hidrogeno al 3%. 1.5gr ----------------- 50ml 1500mg ------------- 50ml 15 mg ------------- x X= 0.5ml 4. Agregamos 7 mg de tiocianato de potasio en medio litro de leche y procedimos a agitar por un minuto. 5. Con una pipeta tomamos 0.5 ml del peróxido de hidrogeno y lo agregamos a la muestra de leche y lo agitamos por 3 minutos. 6. Aplicado el sistema lactoperoxidasa, esperamos dos horas para realizar RT.
  18. 18.  REALIZAMOS RECUENTO TOTAL DE LA MUESTRA ACTIVADA AL SISTEMA LACTOPEROXIDASAS.L.P. -1 -2 -3 10 10 10 1ml 1ml 1ml 1 2 3 LECHE 0.5ml 0.5ml -1 -2 -3 10 10 10 A.N A.N A.NSe incubaron las placas a 37ºC por 24 horas.  PRUEBA DEL AZUL DE METILENO A LA MUESTRA ACTIVADA AL SISTEMA LACTOPEROXIDASA
  19. 19. 24 horas después, aplicamos la prueba de azul de metileno a la lechecontenida en el primer recipiente la cual fue activada al sistemalactoperoxidasa.  PRUEBA CASERA REALIZADA A LA MUESTRA ACTIVADA AL SISTEMA LACTOPEROXIDASAConsistió en hacer hervir las 2 muestras de leche del control y s.l.p.En matraces diferentes y los llevamos a cocción  PREPARACION DE LA MUESTRA CONTROL
  20. 20. Tomamos 1/2 litro de leche de la muestra inicial y procedemos a usarlo comoleche control sin adicionar ningún reactivo.  REALIZAMOS RECUENTO TOTAL A LA MUESTRA CONTROLRealizamos diluciones en solución salina. Luego a las placas correspondientesse les adiciona Agar nutritivo.CONTROL -1 -2 -3 10 10 10 1ml 1ml 1ml 1 2 3 LECHE 0.5ml 0.5ml -1 -2 -3 10 10 10 A.N A.N A.NLas placas se incubaron a 37ºC por 24 horas.  PRUEBA DE AZUL DE METILENO A LA MUESTRA CONTROL
  21. 21. Aplicamos 24 horas después la prueba de azul de metileno a la leche contenidaen el segundo recipiente la cual fue tomada como muestra control.  PRUEBA CASERA REALIZADA A LA MUESTRA CONTROLConsistió en hacer hervir las 2 muestras de leche del control y s.l.p.En matraces diferentes y los llevamos a cocción IX. RESULTADOS
  22. 22.  PRUEBA DEL AZUL DE METILENOA LA MUESTRA DE LECHE INICIALObservamos que la leche a utilizar es de buena calidad.  MUESTRA APLICADA EN EL SISTEMA LACTOPEROXIDASA:Mantuvo sus características organolépticas 24 horas y con olor natural. - RECUENTO TOTALRealizamos las lecturas de las placas en el cuenta colonias. 10-1 10 -2 10-3 SLP 381 5656x2x103=1.12x105 UFC/ml - PRUEBA DEL AZUL DE METILENONos duro 6 minutos y luego comenzó a cortarse, emitir mal olor y observamosla separación líquido sólido.  MUESTRA CONTROL:
  23. 23. Presentó olor agrio, fuerte, el líquido cortado, manteniendo las característicasde una leche en mal estado (malograda). - PRUEBA DE AZUL DE METILENO - RECUENTO TOTAL DE LA MUESTRA CONTROLRealizamos las lecturas de las placas en el cuenta colonias. 10-1 10 -2 10-3 CONTROL 612 9292x2x103=1.84x105 UFC/mlNos duro 3 minutos comenzó a cortarse mal olor y separación líquido sólidoTESTIMONIO FOTOGRAFICO: X. DISCUSION
  24. 24. La lactoperoxidasa no tiene efecto antibacteriano por si misma, perocombinada con tiocianato oxidado (también presente en la leche, así como enla saliva y en el jugo gástrico) y con peroxido de hidrógeno, la reacción químicaresultante crea compuestos antibacterianos de la manera siguiente:Lactoperoxidasa + CSN¯ + H2O2 = Compuestos antibacterianosEl efecto del sistema LP de conservación dura entre seis y ocho horas. Si sepuede enfriar la leche a 15–20 º C, el sistema LP mantendrá la leche de latarde durante toda la noche, permitiendo su recogida la mañana siguiente porel recolector de leche (FAO, 2000).Según FAO (2000) si se utiliza correctamente, el sistema LP mejora la calidadhigiénica de la leche cruda y prolonga su tiempo de conservación varias horas.Este tiempo adicional es muy ventajoso para los pequeños agricultores,particularmente los que viven en zonas alejadas de una planta procesadora.La aplicación en la leche con deterioro de su calidad inicial no produce mejoría,aunque puede detener el proceso de deterioro pero por un tiempo menor quecuando se aplica en la leche fresca. En las leches que no son frescas conporcentaje de acidez por encima de 0.16% (Ácido Láctico) y tiempo dereducción del azul de metileno menor de una hora o clasificadas como de muymala calidad, pero que aún no han rebasado los aceptadas por el consumohumano, el producto puede ser utilizado pero sin la misma eficacia en lechefresca (Ponce et. al. 1992). XI. CONCLUSIONES
  25. 25.  La activación del SLP se ha concebido como un medio para prevenir el deterioro de la leche cruda por acción de las bacterias durante su obtención, recogida y tratado. El sistema lactoperoxidasa es un sistema antibacteriano natural. Constituye un medio eficaz más no rendidor. Se inactiva parcialmente por pasteurización a 75ºC. XII. RECOMENDACIONES Utilizar el sistema lactoperoxidasa es recomendable en lugares donde no existe luz eléctrica ni sistemas de frió para el transporte de la leche, también para lugares con ubicación geográfica dificultosa, malas vías de comunicación, distancias largas de la planta de procesamiento y donde el nivel económico de los productores es bajo para la adopción de tecnologías costosas. Un exceso de tiocianato en el organismo puede producir bocio al interferir con el metabolismo del yodo. Sin embargo, tanto la cantidad de leche ingerida como la concentración de tiocianato en la leche no llegan al límite necesario para poder afectar a la función tiroidea. Se requerirán 274 gr de tiocianato para poder producir alteraciones en dicha función. XIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
  26. 26.  Codex Alimentarius, 1990. Comité Mixto de Expertos Gubernamentales sobre el código de principios referentes a la leche y los productos lacteos. 22ª Periodo de sesiones, CX/MDS 90/10 Apéndice III. Roma, Italia. p. 7-8.  FAO-OMS. 1991. Comisión del Codex Alimentarius. Informe de XIX periodo de sesiones. 1 al 10 de Julio. Documento Alinorm 91/40. Acuerdos 228, 229, 232 y 234. Roma, Italia. p. 39-40.  FAO. 2000. Manual sobre el uso del sistema lactoperoxidasa en la manipulación y conservación de la leche. Dirección de producción y sanidad animal de la FAO. Roma, Italia. 31p.Referencia fotografica
  27. 27. sin slp
  28. 28. con slpsin slp 10-1
  29. 29. con slp 10-1sin slp 10-2
  30. 30. con slp 10-2

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