GUIA DE PRACTICA DE BIOQUIMICA I
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GUIA DE PRACTICA DE BIOQUIMICA I Document Transcript

  • 1. BIOQUIMICA I 1 Rubén Díaz CabanillasUNIVERSIDAD CATÓLICA LOS ÁNGELES DE CHIMBOTEESCUELA PROFESIONAL DEFARMACIA Y BIOQUÍMICAGUÍA PRACTICA DE BIOQUÍMICA IQ.F: LALO RUBÉN DÍAZ CABANILLASCHIMBOTE – PERÚ2011NOMBRE:………………………………………………………………..
  • 2. BIOQUIMICA I 2 Rubén Díaz CabanillasQ.F: LALO RUBÉN DÍAZ CABANILLAS
  • 3. BIOQUIMICA I 3 Rubén Díaz CabanillasINDICE01.-IDENTIFICACIÓN DE BIOMOLECULAS-------------------------------------------402.-PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LAS PROTEÍNASDETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO------------------------------------603.-FACTORES QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE REACCIONESENZIMATICAS: CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO CONCENTRACIÓN DELA ENZIMA, COFACTORES, pH, TEMPERATURA, TIEMPO.--------------------904.-DETERMINACIÓN DE GLUCOSA EN SANGRE----------------------------------1205.-INDICE DE GLICEMIA-------------------------------------------------------------------1606.-REGULACIÓN HORMONAL DE LA GLUCOSA SANGUÍNEA---------------1907.-CADENA RESPIRATORIA Y FOSFORILACIÓN OXIDATIVA----------------2308.-DIGESTIÓN DE LIPIDOS: EMULSIFICACION DE LAS GRASAS Y ACCIÓNDE LA LIPASA PANCREÁTICA.------------------------------------------------------------2609.-DETERMINACIÓN DE TRIGLICERIDOS EN SUERO --------------------------2910.-DETERMINACIÓN DE COLESTEROL EN SANGRE ----------------------------3211.-DETERMINACIÓN DE UREA EN SANGRE ----------------------------------------3612.-DETERMINACIÓN DE ACIDO ÚRICO EN SANGRE----------------------------39
  • 4. BIOQUIMICA I 4 Rubén Díaz CabanillasPRÁCTICA Nº 01IDENTIFICACIÓN DE BIOMOLECULASOBJETIVOS . En esta práctica se realizarán reacciones químicas y pruebascaracterísticas para identificar la presencia de una o varias biomoléculas en una mezcla ypara cuantificar alguna de ellas.1.- Identificación de glúcidos con poder reductorSobre la mesa hay dos soluciones de glúcidos: GLÚCIDO I y GLÚCIDO II. Hay quedeterminar si son reductores.Procedimiento:1. Poner en un tubo de ensayo 2 ml de glúcido I y en otro tubo 2ml de glúcido II.2. Añadir a cada tubo 0.5 mL de Fehling A y 0.5 mL de Fehling B.3. Calentar a la llama.El reactivo de Fehling consta de :-Fehling A: CuSO4 disuelto en H2O-Fehling B: NaOH y tartrato Na-K disuletos en aguaDespués del Fundamento teórico responder las siguientes preguntas:Cuestiones1. ¿Cúal o cúales son los azúcares reductores?2. ¿Quién se oxida y quién se reduce en la reacción?3. ¿Para qué sirven el tartrato Na-K y el calor?4. ¿Que resultado daría la reacción de Fehling con glucosa? ¿y con sacarosa?2.- Identificación de polisacáridos: identificación de almidón mediante la prueba delLugol.Sobre la mesa hay dos soluciones, solución A y solución B. Hay que identificar cuálde ellas tiene almidón.Procedimiento:1. Poner en un tubo de ensayo 2 mL de la solución A y en otro 2 mL de la solución B.2. Añadir a cada uno de los tubos de ensayo 1 gota de Lugol (solución acuosa de iodo yioduro potásico). Observar el resultado.3. Calentar a la llama el tubo que contiene almidón (teñido de azul con I), hasta quedesaparezca el color azul.4. Enfriar en el grifo y observar la aparición de nuevo de color azul.Después del Fundamento teórico responder las siguientes preguntas:Cuestiones1. ¿Cuál de los dos soluciones contiene almidón?2. ¿El almidón daría positiva la reacción de Fehling?3. ¿La celulosa daría positiva la prueba del Lugol?4. ¿Porqué desaparece el color azul al calentar el tubo que contiene almidón, que tipo dereacción se produce, química o física?5. ¿El azul que aparece tras calentar y enfriar es igual de intenso? ¿Por qué?
  • 5. BIOQUIMICA I 5 Rubén Díaz CabanillasII.RESULTADOSIII.DISCUSIÓN:IV.CONCLUSIONESV.BIBLIOGRAFIA
  • 6. BIOQUIMICA I 6 Rubén Díaz CabanillasPRÁCTICA Nº 02PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LAS PROTEÍNASDETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICOI. INTRODUCCION:El punto isoeléctrico es la concentración de iones hidrogeno en el cual la proteínaes eléctricamente neutra, porque el número total de cargas positivas es igual alnúmero total de cargas negativas contenidas en la proteína.Cada proteína tiene un determinado punto Isoeléctrico (PI).Cuando una proteína se encuentra en diferentes soluciones que tienen valores de pHmenores, igual o mayores al PI, la proteína sufre variaciones en la constitución desus grupos químicos, produciéndose en consecuencia variaciones en su estructuraterciaria o cuaternaria y por lo tanto en su función biológica.A parte de otras propiedades que presentan las proteínas cuando se encuentran enuna solución que tiene pH igual al PI, algunas proteínas son difícilmente solubles yprecipitan. Aprovechando este comportamiento, se puede determinar el PI de unaproteína observando los cambios de solubilidad que se producen cuando la proteínase encuentra en varias soluciones que tienen pH conocidos.En la presente práctica se determinara el PI de una proteína relacionando lasolubilidad mínima con el pH de la solución en que ella se produce, con el fin decontribuir a establecer la importancia de conocer las propiedades de las proteínas.II. REACTIVOS:- Ac. Acético 1N- Sol. de caseína en acetato de sodio 0.1 N.- Sol .de Fenoftaleína-NaOH 10%III. PROCEDIMIENTO:- Marcar una serie de tubos de ensayo del 1 al 9.- En el tubo 1 medir 3.2 ml. de ácido acético 1 N y 6.8 ml. de agua destilada.- Medir 5 ml. de agua destilada en cada uno de los otros 8 tubos.- Sacar 5 ml. de solución del tubo 1 y agregarlos al tubo 2 .MEZCLAR Sacar 5 ml. del tubo 2 y transferir al tubo 3, etc. continuando del mismo modohasta completar la serie. En el tubo 9 una vez efectuada la mezcla se saca 5 ml. de solución que seelimina. Agregar rápidamente 1 ml de solución de caseína en acetato de sodio 0.1 N acada tubo. Mezclar al instante por inversión Observar el efecto inmediato que se produce en la solubilidad de la proteína enlos diferentes tubos. Anotar en el cuadro que sigue: Observar después de 30 minutos. Anotar en el cuadro el pH de cada tubo.(vernota al final).
  • 7. BIOQUIMICA I 7 Rubén Díaz Cabanillas Calentar ligeramente cada uno de los tubos y apreciar el efecto sobre lasolubilidad. Anotar. Agregar una gota de Fenoftaleína. Mezclar. Agregar NaOH al 10% gota a gota, agitando, hasta la aparición colorrosado y observar el efecto sobre la solubilidad. Anotar:# de tubos 1 2 3 4 5 6 7oo9pH de cada TuboEnturbiamiento mezclarEnturbiamiento o ppdo A 30Solubil. después de calentarSolubil. después de agregarNaOH 10 %Emplear los símbolos siguientes: O = no cambia+ = Opalescenciax = Ppdo.Determinar el tubo que presenta el máximo de precipitación lo cual se producieraen el tubo que tiene un pH próximo a la solubilidad mínima de la proteína.Interpretar los resultados e indicar el PI aproximado de la proteína.NOTA:El pH de las soluciones de los diferentes tubos debe traerse calculado a la Reuniónde Laboratorio y se obtiene por aplicación de la Ecuación de Henderson -Hasselbach:pH = pK + Log. ÁcidoSalpK Ac. Acético = 4.7La concentración de sal es 1 ml. de acetato 0.1 N en cada caso.La concentración de ácido es 1.6 ml de ácido N en el tubo 1 (1.6ml.lN=16ml 0.1 N)En el tubo 2, la concentración de ácido es 8 ml De 0.1N etc. Así en el tubo 3, porejemplo:pH = pK + Log. 41= 4.7 – 0.6 = 4.1IV.RESULTADOS
  • 8. BIOQUIMICA I 8 Rubén Díaz CabanillasV.DISCUSIÓNVI.CONCLUSIONESVII.BIBLIOGRAFIA
  • 9. BIOQUIMICA I 9 Rubén Díaz CabanillasPRÁCTICA Nº 03FACTORES QUE MODIFICAN LA VELOCIDAD DE REACCIONESENZIMATICAS: CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO CONCENTRACIÓN DELA ENZIMA, COFACTORES, pH, TEMPERATURA, TIEMPO.I. INTRODUCCION:En general todas las enzimas, cualquiera sea el tipo de reacción en que intervenga,presentan características comunes, en cuanto a los factores que participanfavoreciendo, retardando o impidiendo su actividad. Dichos factores se investiganteniendo en cuenta la velocidad de acción enzimática sobre un sustrato adecuado yen determinadas condiciones.Tomando una determinada enzima como patrón es posible tener una idea más omenos clara de la influencia de los factores ( tiempo, temperatura, concentración deenzima, pH, etc.); sobre la serie infinita de enzima que se conocen este patróngeneral como se comprenderá varía en forma característica para cada enzima enparticular.Para estudiar cada uno de estos factores es necesario que los otros permanezcanconstantes de tal manera que la investigación del factor variable no se vea afectadopor la variación que puedan sufrir los otros.El objetivo de esta practica es estudiar algunos de los factores que inciden en lavelocidad de una reacción enzimatica, utilizando como ejemplo la amilasa salival,controlando la actividad enzimatica por medio del sustrato no transformado o porlos productos de la reacción formados ( azúcar reductor ).II. REACTIVOS:- Solución de almidón al 1%. - Buffer fosfato 0.1 M pH 6.6.- Buffer acetato 0.1 M pH 4.6. - Buffer borato 0.1 M pH 9.- Solución de cloruro de sodio al 0.2 %. - Amilasa salival al 0.25 % dializada-- Acido clorhídrico 0.05 N.III. PROCEDIMIENTO:COMPONENTES / TUBOS I II III IV V . VI VII VIII.Sol. de almidón 1 % ml. 1 1 1 1 1 2 1 1Buffer Acetato 0.1M pH 4.6 — — 5 — — — — —Buffer Fosfato 0.1M pH 6.6 5 5 — 5 5 5 5Buffer Borato 0.1M pH 9 — — — — 5 — — —Sol. de NaCl 0.2% 1.4 — 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4Agua destilada 2.6 3.4 2.0 2.6 2.0 2.0 1.0 2.0MEZCLAR, colocar los tubos del I al VI al baño de agua a 37° C, por 5; el tubo VIIColocar en baño helado entre 0 °C. y el tubo VIII en baño de 100 °C. a igual tiempo.Agregar la soluc. Enzimática: 0.0 0.6 0.6 0.2 0.6 0.6 0.6 0.6MEZCLAR, continuar la incubación, computar el tiempo desde el momento que elpreparado enzima tico fue agregado.
  • 10. BIOQUIMICA I 10 Rubén Díaz CabanillasLos controles de la actividad enzimatica se realizaran a los 10 y 30 minutos de acuerdo alos sistemas que a continuación se presentan.Control de la actividad Enzimática:Control del Sustrato no transformado.- Se realiza por la reacción con Iodo.Con este objeto armar dos series paralelas de tubos marcados de igual manera que loscorrespondientes sistemas de incubación enzimatica, una de las series se marcará ademáscon 10 minutos(AI) y la otra con 30 minutos (AII)AI a los 10 minutos I II III IV V VI VII VIIA2 a los 30 minutos I - - - - VI VII -Agregar a ambas seriesHCL 0.05N 5ml. 5ml. 5ml. 5ml. 5ml. 5ml. 5ml. 5ml.1. Control de la actividad enzimática a los 10 minutos de la incubaciónUtilizar la serie de tubos control correspondiente a los 10 minutos:a. Cumplidos los primeros 10 minutos de incubación de los respectivos sistemas deincubación transferir 0.5 ml. del incubado a los correspondientes tubos control,mezclar.b. Agregar a cada tubo control 0.5 ml. de solución Iodada y mezclar.c. Observar y anotar los resultados de las reacciones valorando en forma de cruces:Una disminución ligera del color respecto al patrón 1= + otra algo mas intensa =++, etc., si no hubiera cambio alguno = O.2. Control de la actividad enzimática a los 30 minutos de la incubaciuónUtilizar la serie de tubos control correspondiente a los 30 minutosa. Cumplidos los primeros 30 minutos de incubación de los respectivos sistemas deincubación transferir 0.5 mil del incubado a los correspondientes tubos control,mezclar.b. y c. Son exactamente iguales a los 1 (b) y (c).IV.RESULTADOS
  • 11. BIOQUIMICA I 11 Rubén Díaz CabanillasV.DISCUSIÓNVI. CONCLUSIONESVII.BIBLIOGRAFIA
  • 12. BIOQUIMICA I 12 Rubén Díaz CabanillasPRÁCTICA Nº 04DETERMINACIÓN DE GLUCOSA EN SANGREI. INTRODUCCON:Los hidratos de carbono desempeñan en los organismos vivos diversas funciones.Los animales los emplean de preferencia como combustible para producir energía;cuando se encuentra en exceso se almacena como un polisacárido el glucógeno olos convierten en grasa para ser utilizados en el momento oportuno.Luego de pasar por proceso digestivo y de absorción los monosacaridos sobretodola glucosa pasa al torrente sanguíneo para luego ser utilizada en forma adecuada porel organismo por lo tanto es necesario llevar un control de los niveles de glucosa ensangre ya que probables desviaciones de los rangos normales indicaría algunaalteración en el organismo.En la presente práctica se determinara la glicemia según el método enzimático dela glucosa oxidasa.II. PROCEDIMIENTO:MÉTODO ENZIMATICOSignificaría Clínica.La patología más común relacionada con el metabolismo de los hidratos de carbono es ladiabetes mellitus. El diagnóstico precoz y el control de los pacientes diabéticos, tienen porobjeto evitar la cetoacidosis y las complicaciones de los síntomas resultantes de lahiperglicemia, mediante el tratamiento adecuado.Dado que existen múltiples factores causales de hiper o hipoglicemia, debe considerarse encacln caso la condición fisiológica y/o la patología en y/o paciento en cuestión.Fundamento Del métodoLa glucosa es oxidada enzimáticamente por la glucosa oxidasa (GOD; D-glucosa oxígeno1-óxidorreductasa; a ácido glucónico y agua oxigenada); el agua oxigenada en presencia deperoxidasa (POD; donador: hidrógeno-peróxido óxidorreductasa); produce la copulaciónoxidativa del fenol con la 4-amino fenazona (4-AF) dando lugar a la formación del fenolcon la 4-aminofenazona(4-AF) dando lugar a la formación de un cromógeno rojo-cerezacon absorbancia máxima a 505 nm. El esquema reaccional es el sgte.:GODGOD Glucosa +O2 + H2O --------> Ácido glucónico + H2O2POD2 H2O2 + 4-AF + fenol ----------> 4-(p-benzoquinona-monoimino)-fenazona + 4 H2OReactivos Provistos: Standard: sol. de glucosa 1 g/1. GOD/POD: sol. de glucosa oxidasa (1000 U/ml) y peroxidasa (120 U/ml) Reactivo 4-AF.: sol. de 4-aminofenazona 25 mM en Buffers Tris 0.92 M. Reactivo Fenol: sol. de fenol 55 mol/L. Reactivo de Trabajo: de acuerdo al volumen de trabajo, colocar en una probeta 500partes de agua destilada, 50 partes de Reactivo de 4-AF, 50 partes de Reactivo de Fenol yllevar a 1000 partes con agua destilada. Agregar 3 partes de GOD/POD previamentehomogenizadas. Mezclar por inversión, sin agitar. Rotular y fechar.
  • 13. BIOQUIMICA I 13 Rubén Díaz CabanillasPueden prepararse distintas cantidades respetando las proporciones antedichas. Esimportante además, respetar el orden de agregado de los reactivos y asegurar una perfectahomogenización de los mismos, a fin de que el Reactivo Fenol no deteriore el Reactivo deTrabajo. Mantener en refrigerador (2-10°C) y en frasco color caramelo es estable un mes apartir de la fecha de su preparación.MuestraA) Recolección: se debe obtener suero o plasma de la manera usual. También es posiblerealizar la determinación en líquido cefalorraquídeo.B) Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma, se recomienda el uso deAnticoagulante G de Wiener lab. para su obtenciónC) Sustancias interferentes conocidas: los sueros o plasmas con hemolisis visible o intensadeben ser desproteinizados. Las muestras de líquido cefalorraquídeo hemorrágicasdeben ser centrifugadas antes de procesar. No se observan interferencias por:bilirrubina hasta 200 mg/1, ácido ascórbico hasta 75 mg/1, ácido úrico hasta 200 mg/1,hemolisis ligera.D) Estabilidad e instrucción de almacenamiento: los hematíes y los leucocitos son losresponsables de la destrucción enzimática de la glucosa sanguínea, siendo máxima a37°C, razón por la cual debe de centrifugarse la sangre dentro de las dos horasposteriores a la extracción, hasta obtener un sobrenadante límpido y transferir a otrotuvo para su conservaciónIII. PROCEDIMIENTO:En tres tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco), S (Standard) y DB S DSuero o Patrón -- 10 ul --Muestra -- -- 10 ulReactivo de Trabajo 1.0 ml 1.0 ml 1.0 mlIncubar 10 minutos en baño de agua a 37 ° C. Luego leer en Espectrofotómetro a505 nm. llevando a cero con el Blanco.El color de reacción final es estable 1 hora por lo que la absorbancia debe ser leídadentro de ese lapso.Glucosa mg/dl = D x f. f = Sdlmg /100TAREAS
  • 14. BIOQUIMICA I 14 Rubén Díaz Cabanillas1.-Elabore un esquema del mecanismo de liberación de la insulina en las células betadel páncreas estimulado por glucosa y glibenclamida.2.-Elabore un esquema del mecanismo de interacción de la insulina con su receptor y elmensaje a los GLUT-4.IV.RESULTADOS
  • 15. BIOQUIMICA I 15 Rubén Díaz CabanillasV.DISCUSIÓNVI.CONCLUSIONESVII.BIBLIOGRAFIA
  • 16. BIOQUIMICA I 16 Rubén Díaz CabanillasPRÁCTICA Nº 05INDICE DE GLICEMIAI. INTRODUCCION:La prueba de lía tolerancia a la glucosa es un test que permite establecer larespuesta insulínica a un estímulo fisiológico por glucosa. La rápida absorción deglucosa desencadena la liberación de insulina preformada en las células beta delpáncreas, en cantidad suficiente para cubrir las necesidades que aumenta kcaptación de la glucosa por los tejidos y especialmente por el hígado en donde $**utiliza y almacena como glucógeno.La ingesta de glucosa va seguida de un aumento transitorio en el nivel de laglicemia debido a que la velocidad de absorción intestinal excede a la capacidad delhígado y los tejidos para su utilización. En sujetos normales el nivel máximo deglucosa después de la absorción rara vez pasa de 150 mg/ dl. El organismo vuelveajustar el nivel de la glicemia a los valores del estado de ayuno con un período de 1hora y media a dos horas y media de iniciada la prueba.En condiciones anormales de utilización de glucosa, la elevación y reajuste de ¡aglicemia se aparta del patrón normal teniendo estas variaciones valor diagnóstico yprognóstico. A través de la prueba, la orina de personas aparentemente sanas sepresentan siempre libres de glucosa. La desventaja de esta prueba es que incluye unfactor que no guarda relación con la respuesta insulínica, la velocidad de absorcióna partir del tubo digestivo.La finalidad del trabajo experimental es establecer la capacidad del sistema(organismo) para manejar una dosis fija de glucosa administrada por vía oral eucondiciones standard.Objetivos:- Elaborar una curva de tolerancia a la glucosa.- Establecer las relaciones causa y efecto entre los datos de glucosa en sangre yorina a los 60 y 120 minutos- Demostrar el funcionamiento del páncreas con la respuesta insulínica.II. REACTIVOS:- Reactivo de Trabajo de Glucosa enzimática- Solución de glucosa al 25 %III. PROCEDIMIENTO:El paciente debe ser preparado para esta prueba, indicándole una dieta diaria quecontenga 300 mg de hidratos de carbono durante los tres días anteriores de laprueba.En niños el período de ayuno varía; así en niños menores de cuatro meses hasta unayuno de 4 horas, entre cuatro y ocho meses hacen falta 6 horas de ayuno y entre8 meses y 2 años ocho horas.Obtener una muestra de sangre en ayunas.Administrar por vía oral una solución de 25 por 100 de glucosa , de tal maneraque el paciente ingiere en total 1,75 g de glucosa por kilogramo de peso ( no esnecesario dar más de 100 g en total, si se desea, puede mejorarse el sabor de lasolución con jugo de limón.
  • 17. BIOQUIMICA I 17 Rubén Díaz CabanillasExtraer muestra de sangre a los 30, 60, 90 y 120 minutos. Colectar las muestrasde orina a los 60 y 120 minutos.Determinar la concentración de glucosa en cada una de las muestras de sangreobtenidas.En un papel milimetrado, graficar los resultados obtenidos de glicemia en cadamuestra versus tiempo.Durante la prueba el paciente debe permanecer en estado de reposo y no debefumar ni tomar bebidas alcohólicas.El índice de glicemia puede ser modificada por el ejercicio, fiebre, enfermedadesagudas y estados pos-traumáticos.Valores normales de referenciaSuero o plasma: 70-110 mg/dl (Enzimático)DeterminaciónTiempoBasalminutosº Control30 minutos2º Control60 minutos3º Control120 minutosGlucosa ensangre (mg/dlEsquematizar en un papel milimetrado y explicar los mecanismos de cada casoIV.RESULTADOSV.DISCUSIÓN
  • 18. BIOQUIMICA I 18 Rubén Díaz CabanillasVI. CONCLUSIONESVII.BIBLIOGRAFIA
  • 19. BIOQUIMICA I 19 Rubén Díaz CabanillasPRÁCTICA Nº 06REGULACIÓN HORMONAL DE LA GLUCOSA SANGUÍNEAI. INTRODUCCION:La concentración de glucosa en sangre es la resultante de dos factores: Tasa dellegada de glucosa a la sangre b. Tasa de salida de glucosa de la sangre. La glucosasanguínea puede provenir directamente de diversas fuentes: glucógeno hepático,aminoácidos otros carbohidratos y de la glucosa absorbida por el intestino.En condiciones normales en ayunas, la glicemia es muy constante y tiene en elhombre tiene un valor entre 70 a 110 mg /dL. Siendo en la sangre arterial mayorque en la venosa. La glicemia se eleva después de la ingestión de un alimento ricoen hidratos de carbono para luego descender poco a poco de modo que una hora ymedia o dos horas des pues de la ingestión vuelve el nivel de ayunas.La glucosa de la sangre es distribuida a los tejidos pues es utilizada por todas lascélulas para funciones más especializadas por ejemplo glucogenesis lipogenesis yotras. Para poder afrontar con eficiencia las variaciones mas o menos bruscas quepueden afectar a la glucosa sanguínea, el organismo dispone de mecanismosreguladores que de diferentes maneras aceleran o retardan la entrega o el retiro deglucosa desde o hacia los tejidos .Los mecanismo reguladores son nerviosos yendocrinos y es muy posible que los primeros actúan en realidad mediantemodificaciones en la entrega de hormonas por las glándulas de secreción interna demodo que el mantenimiento de la glicemia en niveles normales depende delequilibrio entre la producción y la utilización de la glucosa sanguínea cuyasensibilidad esta regida en medida importante por el balance entre la insulina por unlado y las hormonas suprarrenales y de la adenohipofisis, por el otro.La insulina ejerce profundos efectos sobre el metabolismo de la glucosa y otrosnutrientes. Esta hormona es producida por las células beta de los islotes deLargerhans del páncreas y es secretada en respuesta directa al incremento deglucosa en la sangre. El efecto más importante de una deficiencia insulínica es el deun niel sanguíneo de glucosa extremadamente elevado (híperglicemia), unaexcesiva excreción de glucosa por la orina (glucosuria) y un reducido nivel deglucógeno en el hígado. La administración de insulina va seguida de descenso de laglicemia (hipoglicemia) cuya magnitud depende de la dosis administrada; el efectose debe fundamentalmente a que la hormona favorece la formación de glucógeno enel hígado y en el músculo a la vez que acelera la oxidación de la glucosa endiferentes tejidos. La insulina también favorece la conversión de los hidratos decarbono en ácidos grasos y por otro lado inhibe la gluconeogenesis a partir de losaminoácidos. Se explica así que la falta de insulina determina una hiperglicemiaque es el significado fundamental del cuadro denominado diabetes.La adrenalina, hormona secretada por la médula suprarrenal, tiene acciónhiperglicemiante; ello se debe a que favorece la conversión de glucógeno englucosa (glucogenólisis) en el hígado, además al actuar en el músculo, por laausencia en este de la glucosa 6-fosfatasa, la glucólisis se realiza con la formaciónde glucosa y glucógeno en la célula hepática por los mecanismosgluconeogéneticos. El efecto glucogenolítico de la adrenalina es debido a que activaa la fosforilasa.
  • 20. BIOQUIMICA I 20 Rubén Díaz CabanillasLa secreción de insulina y adrenalina parecen estar condicionadas en formaimportante por el nivel de glicemia, de manera que cada vez que se eleva laglicemia se produce más insulina que tiende a aminorarla por otra parte, se aparecehipoglicemia se segrega más adrenalina (y glucagon) que aceleran la regulación queen forma coordinada debe realizar hígado.El objetivo de la práctica es establecer la técnica de dosaje de glucosa en su sangrey observar las variaciones de la glicemia como consecuencia de la administraciónde insulina y adrenalina.II. REACTIVOS:- Kid de Glucosa enzimáticaIII. PROCEDIMIENTO:A) Efecto de la insulina sobre la Glicemia Animales de experimentación: conejos, que hayan sido alimentados entre6-8 horas de iniciar el experimento. Es necesario determinar el peso de losanimales con la finalidad de calcular la cantidad de insulina a inyectar. (Elpeso mínimo debe ser de 2,5 Kg) Insulina: se utiliza la forma cristalizada libre de combinaciones que retardansu acción. La dosis a inyectar es de 1 UI por Kg. de peso corporal. Una jeringa de tuberculina la cual facilita la medida de solución de insulina.PROCEDIMIENTOa) Extraer una primera muestra de la vena marginal del lóbulo posterior de la orejacon aguja # 21 en capilares heparinizados y sellar el extremo con plastilina.b) Inyectar por vía subcutánea la cantidad calculada de insulina.c) Luego extraer muestra de sangre a los 15, 30 y 60 minutos, lo que hace un totalde muestras posteriores a la inyección de insulina.d) En cada una de las citadas muestras realizar la determinación de glucosa.e) Con los resultados obtenidos construir una gráfica tomando las variaciones de laglicemia en relación con el tiempo.B.- EFECTO DE LAADRENALINA SOBRE LA GLICEMIA.-- Animales de experimentación: conejos, bien alimentados se determinará el pesocorporal de estos animales para calcular la cantidad de adrenalina a inyectar.- Solución de adrenalina: La dosis que debe inyectarse es de 0.025 mg. por cada1000 g de peso corporal, o sea 0.25 ml. de la solución.PROCEDIMIENTOa) Extraer una primera muestra de la vena marginal del lóbulo posterior de la orejacon aguja # 21 en capilares heparinizados y sellar el extremo con plastilina.b) Inyectar por vía subcutánea la cantidad adecuada de adrenalina según el peso delanimal.c) Luego extraer muestras de sangre a los 15 , 30 y 60 minutos los que hacen tresnuestras posteriores a la adrenalina.d) En cada una de las citadas muestras realizar los dosajes de glucosa segúnmétodo enzimático.
  • 21. BIOQUIMICA I 21 Rubén Díaz Cabanillase) Si es posible obtener orina, realizar la investigación de glucosa en ella.f) Con los resultados obtenidos así obtenidos construir una gráfica tomando lasvariaciones de la glicemia en relación con el tiempo. Comparar los resultadosC- DETERMINACIÓN DE GLUCOSAMétodo Enzimático: Utilizar suero o plasma y seguir los mismos pasos que la prácticaanterior.TAREAS1.-Esqematizar la glucogénesis y glucogenólisis .2. Esquematizar los mecanismos de acción de la insulina y adrenalina con sus respectivosefectos en la glicemia.
  • 22. BIOQUIMICA I 22 Rubén Díaz CabanillasIV.RESULTADOSV.DISCUSIÓNVI.CONCLUSIONESVII.BIBLIOGRAFIA
  • 23. BIOQUIMICA I 23 Rubén Díaz CabanillasPRÁCTICA Nº 07Teoria Quimiosmótica1.-Esquematizar y explicar según la teoría quimiosmótica la cadena transportadora deelectrones( CTE) y fosforilación oxidativa (FO).2.-Explicar los mecanismo de todas las sustancias que modifica la CTE y FO
  • 24. BIOQUIMICA I 24 Rubén Díaz CabanillasCuestiones Bioenergética.Desarrollar el cuestionario1. ¿Cómo se puede explicar, de acuerdo con la teoría quimiosmótica, que el 2,4-dinitrofenol estimule indefinidamente el consumo de oxígeno en una suspensión demitocondrias?. ¿Por qué la inyección de 2,4-dinitrofenol a una rata provoca el aumentoinmediato de la temperatura corporal?.2. Si añadimos oligomicina a una suspensión de mitocondrias activas se observa unadisminución del transporte electrónico y de la sítesis de ATP. Si después de estetratamiento con oligomicina se añade 2,4-dinitrofenol, se produce un aumento de lavelocidad del transporte de electrones sin variación en la síntesis de ATP. ¿Qué inhibela oligomicina?. Da una explicación en términos de la teoría quimiosmótica.3. El hongo Bipolaris maydis ocasiona grandes pérdidas en agricultura. Esta enfermedadque causa en las plantas es debida a una toxina que hace que únicamente lamembranainterna mitocondrial resulte permeable a iones y a moléculas pequeñas.a. ¿qué proceso afecta esta toxina?. Explícalo en un esquema.4. El atractilósido, un inhibidor de la translocasa ADP/ATP, bloquea la fosforilaciónoxidativa en mitocondrias, en cambio, en partículas submitocondriales no tiene esteefecto. Por otro lado, los desacopladores, los inhibidores del transporte de electrones yla oligomicina afectan a los dos sistemas. Explica estas observaciones5. ¿Cabe esperar que el NADH añadido a una suspensión de particulassubmitocondriales se oxide?. Y si se añade citocromo c ¿se oxidaría?.6. Una deficiencia en cobre en una célula puede causar una alteración en la fosforilaciónoxidativa, ¿por qué?.7. El tejido adiposo marrón es una forma de tejido adiposo que se encuentra en la partesuperior de la espalda de muchos animales jóvenes. Tienen mayor cantidad demitocondrias este tejido para la síntesis de ATP acoplada a la oxidación del NADH.¿Cuál puede ser la función del tejido adiposo marrón?.8. Si una suspensión de mitocondrias se incuba con un exceso de oxígeno, succinato yfosfato inorgánico:a. ¿Qué cambio se produciría si se añaden 2 mmoles de ADP?b. ¿Qué pasaría si se añade 2,4-dinitrofenol inmediatamente despues de la adición deADP?.c. Una vez consumido todo el ADP añadido, al cabo de un cierto tiempo despues deañadir 2,4-dinitrofenol, resulta que hay 2 mmoles de ADP y, en cambio, nada de ATP.¿Explícalo.9 . ¿Cómo evolucionará el consumo de oxígeno y la síntesis de ATP en una suspensiónde mitocondrias despues de los siguientes tratamientos?:a. adición de antimicinab. adición de oligomicinac. adición de atractilosidod. adición de 2,4-dinitrofenol despues de cada uno de los tratamientos anteriorese. rotura de las membranas por choque hipotónico10. La adición de DCCD (diciclohexilcarbodiimida) a suspensiones de mitocondriasdisminuye la velocidad de síntesis de ATP y también la del transporte electrónico. Siañadimos 2,4-dinitrofenol sólo se restablece el transporte de electrones. Explica estosresultados.
  • 25. BIOQUIMICA I 25 Rubén Díaz Cabanillas11. El síndrome de Luft está causado, posiblemente, por una alteración de lapermeabilidadde la membrana mitocondrial interna a los protones. Explicad los síntomas observados enesta enfermedad: hipertermia, respiración aumentada y debilidad muscular.12. Las subunidades c del componente F canal iónico a través de la membrana interna.Cuando alguno de los residuos esenciales de glutámico o de aspártico de la subunidad creacciona con diciclohexilcarbodiimida (DCCD) la subunidad es incapaz de participar enel transporte de H+.a. ¿Cómo afectará el DCCD al transporte electrónico mitocondrial?b. ¿Qué se podría esperar que pasara cuando se le añade un desacoplador (DNF) a lasmitocondrias tratadas con DCCD?.c. ¿Cómo se vería afectada la síntesis de ATP en los casos anteriores?. Razona la respuesta.
  • 26. BIOQUIMICA I 26 Rubén Díaz CabanillasPRÁCTICA Nº 08DIGESTIÓN DE LIPIDOS: EMULSIFICACION DE LAS GRASAS Y ACCIÓN DELA LIPASA PANCREÁTICA.I. INTRODUCCION:Los lípidos ingeridos con los alimentos no sufren modificaciones en la boca, puesla saliva carece de enzimas que actúan sobre ellos. Al llegar al duodeno se mezclancon la bilis y el jugo pancreático iniciándose el ataque hidrolítico de la lipasapancreática, que es activada por las sales biliares. La acción combinada de la lipasapancreática, una isomerasa y la lipasa intestinal dan como resultados ácidos grasoslibres monoglicéridos y glicerol formas en que son absorbidas. Como la grasaneutra original y los ácidos grasos son insolubles, en agua es necesario,mecanismos que permitan su emulsificación y facilitan su digestión y absorción,ello se logra en el intestino por la presencia de las sales biliares y ácidos biliares.Contenidos en la bilis; que a causa del acentuado poder que tienen para disminuir latensión superficial de las soluciones, favorecen la emulsión ayudando en gran partea la digestión y absorción de las grasas en el intestino y probablemente porcombinaciones análogas, intervengan en la absorción de la colesterina, vitaminasliposolubles y otras sustancias.Objetivos:1. Demostrar el efecto emulsificante de las sales biliares sobre las grasas.2. Demostrar el efecto que tienen las sales biliares sobre la lipasa pancreática.3. Demostrar la acción que tiene la lipasa pancreática sobre los triglicéridoscontenidos en el aceite vegetal.4. Demostrar la presencia de lipasa en el extracto pancreático.II. PROCEDIMIENTO:COMPONENTES/TUBOS I II III IVAceite vegetalEmulsión de aceite vegetalBuffer fosfato 0.1 M pH 8.06.0Solución de sales biliaresSolución de extracto pancreático3.0-4.0--3.0-4.02.0--3.02.0-2.0-3.0-2.02.0a) Agitar fuertemente los tubos Dejar en reposo. Observar los resultados.b) Clocar al baño de agua a 37°C durante 30, agitando de vez en cuando.c) Al finalizar el tiempo de incubación, retirar los tubos del baño y agregar a cada uno IVgotas de fenolftaleína, mezclar bien y titular.d) Titulación: De una pipeta graduada de 1 ml. Dejar caer gota a gota NaOH 0.1 N en elfondo de cada tubo del sistema, hasta la aparición de un color rosado tenue. Anotar la
  • 27. BIOQUIMICA I 27 Rubén Díaz Cabanillascantidad de NaOH gastado en cada uno de ellos. La actividad lipásica está dada por losmililitros de NaOH 0.1 N gastados sustrayendo el blanco respectivo.e) Anotar los resultados.1ml NaOH 0.1 N ……………………………….0.0283 mg de acido oleicoTAREAS:Esquematizar la emulsión, digestión y absorción de los diferentes lípidosIII.RESULTADOS
  • 28. BIOQUIMICA I 28 Rubén Díaz CabanillasIV.DISCUSIÓNV.CONCLUSIONESVII.BIBLIOGRAFIA
  • 29. BIOQUIMICA I 29 Rubén Díaz CabanillasPRÁCTICA Nº 09DETERMINACIÓN DE TRIGLICERIDOS EN SUEROI. INTRODUCCION:Los triglicéridos son lípidos absorbidos en la dieta y también producidos en formaendógena a partir de los carbohidratos. Su medición es importante en el diagnósticoy manejo de las hiperlipidemias. Estas enfermedades pueden tener origen genéticoo ser secundarias a otras tales como nefrosis, diabetes mellitus y disfuncionesendocrinas.. El aumento de triglicéridos se ha identificado como un factor de riesgoen enfermedades ateroscleróticas.Fundamento del MétodoEl esquema de la reacción es el siguiente :Triglicéridos -----Lipasa-----> glicerol + ácidos grasosGlicerol + ATP ---glicerolcinasa---> glicerol-1-P + ADPGlicerol-1-P + O2 + H2O—GPD------>DHAP+ H2O22 H2O2 + 4-AF + fenol-----POD------> quinonimina roja + 4 H2OII. REACTIVOS PROVISTOS Enzimas: viales con LPL, GK; GPO; POD; ATP y 4-AF. Standard: 200mg/dl Reactivo de TrigliceridosIII. PROCEDIMIENTOa) Recolección: Previo ayuno de 12 a 14 horas. Obtener suero o plasmab) Sustancias interferentes conocidas: la hemolisis intensa y la bilirrubina mayorde 50 mg/ 1. produce resultados erróneos .MétodosEn tres tubos de fotocolorímetro marcados B (Blanco), S (Standard) y D(Desconocido), colocarB S DMuestraStandardRvo de Trabjo--1.0 ml--10 ul1.0 ml10 ul--1.0 ml Incubar 15 minutos en baño de agua a 37 ° C. Luego leer en Espectrofotómetro a505 nm. llevando a cero con el Blanco. El color de reacción final es estable 2 horas por lo que la absorbancia debe serleída dentro de ese lapso.200mg/dl.Tg = D x F F=-------------S
  • 30. BIOQUIMICA I 30 Rubén Díaz CabanillasEsquematizar el transporte y oxidación de triglicéridosIV.RESULTADOS
  • 31. BIOQUIMICA I 31 Rubén Díaz CabanillasV.DISCUSIÓNVII.CONCLUSIONESVII.BIBLIOGRAFIA
  • 32. BIOQUIMICA I 32 Rubén Díaz CabanillasPRÁCTICA Nº 10DETERMINACIÓN DE COLESTEROL EN SANGREI. INTRODUCCION:El colesterol es un compuesto típico de los organismos animales, pero en el reinovegetal existen moléculas de estructura semejante. Se ha comprobado que sonprecursores de la molécula del colesterol a partir de fragmentos pequeños, como elacetato y aceto acetato. Las unidades de "isopreno" que proviene de éstos, sonelementos formadores importantes en animales y vegetales. En los vegetales estasunidades se condensan y forman terpenos, carotenoides y caucho. En los animalesla condensación produce escualeno hidrocarburo no saturado precursor delcolesterol.En el hombre el intestino es la fuente principal del colesterol del plasma, en éste seencuentra en forma libre o combinada con ácidos grasos, en la forma de esteres delcolesterol 75 %, ambos en asociación con lipopr o teínas. Los tejidos extrahepáticossintetizan su propio colesterol pero hay un equilibrio importante entre el colesteroldel plasma y el de los tejidos en el ser humano.En el hombre el colesterol plasmático total es de 150 -250 mg. por 100 mi.,elevándose con la edad. La lesión hepática acentuada a menudo causa unadisminución en la concentración de colesterol incluyendo las fracciones libres yesterificadas. Se encuentra en niveles elevados (hipercolesterolemia) en laateroesclerosis, de diabetes mellitus, en enfermedades obstructivas del árbol biliar,en el hipotiroidismo.II. REACTIVOS: Standard: sol. de colesterol 2 g/1. CHOD/POD: sol. de colesterol oxidasa (60 U/1) y peroxidasa (4000 U/1) Reactivo 4-AF.: sol. de 4-aminofenazona 25 mM en Buffers Tris 0.92 M.Reactivo Fenol: sol. de fenol 55 mmol/L. Reactivo de Trabajo: de acuerdo al volumen de trabajo, colocar en una probeta50 partes de agua destilada, 5 partes de Reactivo de 4-AF, 5 partes de Reactivode Fenol y llevar a 100 partes con agua destilada. Agregar 2 partes deCHOD/POD previamente homogenizadas. Mezclar por inversión, sin agitar.Rotular y fechar. Pueden prepararse distintas cantidades respetando las proporciones. Se debeagregar los reactivos según el orden y mezclar suavemente. Mantener enrefrigerador (2-10°C) y en frasco color caramelo es estable un mes a partir de lafecha de su preparación.III. PROCEDIMIENTO:2. MÉTODO ENZIMÁTICOFundamento: El colesterol es oxidado enzimáticamente por la colesterol oxidasaprevia hidrólisis enzimática de los esteres mediante una lipasa de origen fungal.El agua oxigenada en presencia de peroxidasa (POD; donador: hidrógeno-peróxido óxidorreductasa); produce la copulación oxidativa del fenol con ía 4-
  • 33. BIOQUIMICA I 33 Rubén Díaz Cabanillasamino fenazona (4-AF) dando lugar a la formación del fenol con la 4-aminofenazona(4-AF) y forma un cromógeno rojo-cereza con absorbanciamáxima a 505 nm. La reacción es :Esteres de colesterol Lipasa ----> colesterol + ácidos grasosColesterol + O2 + H2O GOD ----> colester-3-ona + H2O22 H2O2 + 4-AF + fenol POD 4->(p-benzQquinona-monoimino)-fenazona+4H2OMezclaRecolección: se debe obtener suero o plasma de la manera usual. También esposible realizar la determinación en líquido cefalorraquídeo.Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma, se recomienda el usode Anticoagulante G de Wiener lab. para su obtenciónSustancias interferentes conocidas: los sueros o plasmas con hemolisis visibleo intensa producen valores falsamente aumentados.. En sueros hiperlipémicoshay turbidez entonces diluir el volumen de reacción a 1/2 o a 1/3 con blanco dereactivos y multiplicar el resultado por el factor de lución. No interferencias conbilirrubinaMétodoEn tres tubos marcados B (Blanco), S (Standard) y P (Problema), colocar:B S PEstándar o Patrón - 10 ul. -Muestra de Suero - - 10 ul.Reactivo de Trabajo 1,0 ml 1,0 ml. 1,0 ml.Incubar 15 minutos en baño de agua a 37 ° C. Luego leer en Espectrofotómetro a505 nm. llevando a cero con el Blanco. El color de reacción final es estable 2horas por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de ese lapso.CÁLCULOS:Colesterol g/1 = D x f. f = Sdlmg /200VALORES NORMALES:Hasta 150 mg/dl
  • 34. BIOQUIMICA I 34 Rubén Díaz Cabanillas1.-Esquematizar el transporte y regulación de la síntesis de colesterol2.-Esquematizar el perfil lipídico y el factor de riesgo de infarto de una personanormal.
  • 35. BIOQUIMICA I 35 Rubén Díaz CabanillasIV.RESULTADOSV.DISCUSIÓNVI.CONCLUSIONESVII.BIBLIOGRAFIA
  • 36. BIOQUIMICA I 36 Rubén Díaz CabanillasPRACTICA Nº 11DETERMINACIÓN DE UREA EN SANGREI. INTRODUCCION:Es el principal producto final del catabolismo proteico y es excretado en la orina enmayor cantidad que cualquier otra sustancia o sea que es la forma bajo la cual seelimina por la orina la mayor parte del nitrógeno de las proteínas, dada su grandifusibilidad puede decirse que se distribuye, salvo raras excepciones, en todos losfluidos del organismo, manteniendo una concentración muy similar a la de lasangre que es vehículo que la transporta. Su contenido y las variaciones normalesdependen de: a) el contenido proteico de la dieta y b) De la diuresis (la urea es undiurético natural y ejerce efecto continuo sobre el flujo de la orina). Cualquieralteración de la función renal origina un aumento en la concentración de la ureasanguínea.La urea constituye la fracción de nitrógeno no proteico más importante en lamayoría de los líquidos biológicos. En el hombre es el principal producto final delmetabolismo proteico. Se produce en el hígado y es excretada por la orina a travésde los riñones.Una elevación de la concentración sérica de urea? se interpreta generalmente comouna posible disfunción renal. Sin embargo, no debe dejarse de lado el hecho de quelos valores séricos de urea se encuentran íntimamente relacionados con la dieta y elmetabolismo proteico, por lo que cualquier alteración en estas variables se traduciráen un cambio de la concentración de urea en suero.La determinación de la urea se realiza por reacciones de descomposición: la ureapor acción de diversos agentes: calor, reactivos químicos (Ac. Nitroso) y enzimas,es susceptible de descomponerse, originando la formación de ciertos compuestosque se utilizan en su valoración. Así la enzima ureasa (que se encuentra en la soya)acelera su conversión en carbonato de amonio. Se ha supuesto que la acción es decarácter hidrolítico y se representa por:CO(NH2)2 + UREASA 2 H2O ---> CO3 + (NH4)2La presente práctica tiene como finalidad: Determinar las concentraciones séricas de la urea Evaluar e interpretar los resultadosII. REACTIVOS Y EQUIPOS: Reactivo 1: contiene fenol 532mM, niüoferricianuro de sodio 0,85 mM yetilén-bis-ditiocarbamato manganoso 0,3 mM. Reactivo 2: contiene Hipoclorito de sodio concentrado 36,6 mM y p-toluén sulfoncloramida 0,12 mM en Hidróxido de sodio 0,625 M. Standard : solución de urea 0.60 g /1. - Ureasa: Enzima. Espectrofotómetro RA-50* spcctronic 20, Refrigeradora.
  • 37. BIOQUIMICA I 37 Rubén Díaz CabanillasIII. PROCEDIMIENTO:A) TÉCNICA EN SUERO O PLASMAEn tres tubos marcados B (Blanco), S (Standard) y P (Problema). Colocar una odos gotas de agua y agregar:Tubos de ensayo B S PEstándar -- 10 ul --Suero o plasma -- -- 10 ulUreasa+ Reactivo 1 1 ml 1ml 1mlMezclar por agitación suave e incubar a 37°C por 5 minutosReactivo 2 1 ml 1ml 1 mlMezclar por agitación suave e incubar a 37°C por 5 minutos y leer a 570 nmCÁLCULO DE LOS RESULTADOSSuero o plasma: Urea ( g /l) = D x Factor Factor = 0,60 g /1SVALORES DE REFERENCIASuero o plasma: los valores normales de urea entre 0,10 g/l -- 0,45 g/1.Esquematizar las reacciones de transaminación, desaminación oxidativa y ciclo de la urea
  • 38. BIOQUIMICA I 38 Rubén Díaz CabanillasIV.RESULTADOSV.DISCUSIÓNVII.CONCLUSIONESVII.BIBLIOGRAFIA
  • 39. BIOQUIMICA I 39 Rubén Díaz CabanillasPRACTICA Nº 12DETERMINACIÓN DE ACIDO ÚRICOI. INTRODUCCION:El ácido úrico es el producto final del catabolismo de los núcleo-proteínas,específicamente de los nucleósidos Adenosina y Guanosina compuestos que tienenen su constitución a la Adenina y a la Guanina que son derivados púricos y querepresentan las bases nitrogenadas púricas de los Ácidos ribonucleicos ydesoxirribonucleicos.El ácido úrico, en solución acuosa se presenta bajo dos formas: Lactámica yLactímico, según se encuentra los carbones 2, 6 y 8 unidos a la función cetónica ofunción alcohólica por migración de los hidrógenos a los grupos carboxilosadyacentes, se piensa que estas formas estarían en equilibrio y que el predominio deuna sobre la otra depende de la concentración de los iones hidrógeno del medio, asípor ejemplo. Si la acidez aumenta, predomina la forma Lactámica; en cambio, laforma Lactímica es más soluble a un pH 7.4 que la forma Lactámica, es así, que elpH fisiológico el 9 % del contenido de ácido úrico del organismo está en forma deurato de sodio.Habitualmente la concentración de ácido úrico en suero varía de un individuo a otrode acuerdo a diversos factores tales como: sexo, dieta, origen étnico, constitucióngenética, embarazo. Los niveles anormales de ácido úrico en suero son índice dedesorden en el metabolismo de las sustancias que lo originan o de defectos en sueliminación.Los valores normales en suero oscilan entre 2 A 4 mg. 5 pudiéndose encontrarvalores elevados en la gota, en enfermedades con grandes destrucciones de materialprotoplasmático del tipo de la leucemias, al final de procesos infecciosos como lapulmonía, en disminución de la función renal o después de la ingestión dealimentos ricos en nucleoproteínas por ejemplo hígado, riñones.Los niveles de ácido úrico en orina son en general un reflejo de la descomposiciónde ácido nucleico endógeno y de la cantidad de purinas ingeridas en la dieta,amenos que la hiperuricemia se deba a disminución de la eliminación de ácidoúrico, en genera! va acompañada de aumento de los niveles de ácido úrico en orina.Normalmente se elimina 250 a 750 mg por 24 horas en una dieta media en purinas,más de 1 gm. Por 24 horas con dieta rica en purinas.En general los procedimientos empleados para el dosaje de ácido se agrupa en dos:a) Enzimáticos: Cuando se utiliza la Uricasa (enzima específica para el ácidoúrico).b) Químicos: Que a su vez pueden ser directos e indirectos. Se utiliza el de FolinDenis.El objetivo de la práctica es demostrar el catabolismo de las nucleoproteínasmedíante la determinación de ácido úrico en sangre.II. REACTIVOS Y EQUIPOS: Standard: Sol. Ácido úrico 100 mg/1 - Uricasa: (UOD) mayor o igual a 3 U/1 Reactivo 4-AF/POD contiene 100 U de POD, 12,5mM de Buífer fosfatos pH7,3 y 3 mM de 4-AF.
  • 40. BIOQUIMICA I 40 Rubén Díaz CabanillasIII. PROCEDIMIENTO:Método Enzimático: El ácido úrico es oxidado por la uricasa a alantoína yperóxido de hidrógeno. La reacción es la siguiente:Ácido úrico -H O: + 2 H2O UOD alantoína + H2O 2 + CO22 H2O2 + 4-AF + clorofenol POD quinonimina roja + 4 H2OCOMPONENTES/TUBOS B S PMuestra (suero .0 plasma) 20ulStandard 20ulReactivo de trabajo l.0ml l.0ml l.0ml Incubar 15 minutos en baño de agua a 37 ° C. Leer en el espectrofotómetro a 505 nm o fotocolorímetro con filtro verde (490 -530nm) llevando a cero con el blanco. El color de reacción final es estable 45 minutospor lo que la absorbancia debe ser leída dentro de ese lapso.CÁLCULOS:100,0 mg/1Ácido úrico mg/l= D x factor f = SVALORES NORMALES Hombres : 25 a 60 mg/1 - Mujeres : 20 a 50 mg/1Esquematizar la formación y regulación de ácido úrico.
  • 41. BIOQUIMICA I 41 Rubén Díaz CabanillasIV.RESULTADOSV.DISCUSIÓNVI.CONCLUSIONESVII.BIBLIOGRAFIA