Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos

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Describe el desarrollo practico de la Microbiologia de Alimentos, en el area de Veterinaria

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Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos

  1. 1. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León Tema. Microbiología de los Alimentos: Concepto y contenido, historia.• Concepto y contenido de la Microbiología de los Alimentos• Aspectos de los que trata• Historia• Importancia de los microorganismos en relación con los alimentos y la industria alimentaria• Datos sobre las enfermedades transmitidas por alimentos• Importancia de la calidad alimentaria• Concepto – "Ciencia que estudia los microorganismos en relación con los alimentos"• Contenido – Ecología microbiana de los alimentos. – Utilización de microorganismos en la producción de alimentos – Bases metodológicas del análisis microbiológico de los alimentos – Microbiología sanitaria de los alimentos. Microorganismos patógenos, toxinas y metabolitos microbianos transmitidos por los alimentos – Microbiología de los distintos alimentos.• Aspectos de los que trata – Microorganismos presentes, su origen y factores de los que depende su presencia y multiplicación en alimentos – Efectos derivados de su presencia y multiplicación en alimentos – Fundamento y utilidad de las determinaciones microbiológicas – Empleo de microorganismos en la fabricación de alimentos e ingredientes• Bibliografía – Adams, M. R. & Moss, M. O. 1997. Microbiología de los alimentos. Editorial Acribia- Zaragoza. * – Doyle, M.; Beuchat, L. & Montville, T. 2001. Microbiología de los alimentos. Fundamentos y fronteras. Editorial Acribia. Zaragoza.* – ICMSF. 1998. Microorganismos de los alimentos. Características de los patógenos alimentarios 5. Ed. Acribia. * – ICMSF (International Commision on Microbiological Specifications for Foods). 1998. Microorganisms in Foods 6: Microbial Ecology of Food Commodities. Blackie Academic & Professional. * – Microorganisms in Foods 7: Microbiological Testing in Food Safety Management. Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2002. * – ICMSF. 1999. Microorganismos de los alimentos 2. Métodos de muestreo para análisis microbiológicos: Principios y aplicaciones específicas. – Jay, J.M. 2000. Modern Food Microbiology. 6th edn., AVI Book-New York. – Mossel, D.A.A., Moreno, B. y Struijk, C.B. 2003. Microbiología de los alimentos (2ª ed.) Ed. Acribia. – Pascual Anderson, Mª R. y Vicente Calderón Pascual. 2000. Microbiología Alimentaria. Metodología analítica para alimentos y bebidas. Díaz de Santos. * – Varnam, A. H. & Evans, M.G. 1991. Foodborne pathogens. An illustrated text. Wolfe. 1
  2. 2. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Revistas – Food Microbiology – Journal of Applied Microbiology – Trends in Food Science and Technology• Dirección Internet – http://www3.unileon.es/personal/wwdhtmpm/inicio.html• Historia – en relación con procesos de conservación de alimentos – Appert (1795) – Pasteur (1854) – en relación con microorganismos transmitidos por alimentos • Botulismo (s IX AC) • Ergotismo (s XV) • Gaërtner (1888) • Kerner (1793) y Van Ermengen (1896) Fuentes de información• Bibliografía – Adams, M.R. & Moss, M. O. 1997. Microbiología de los alimentos. Editorial Acribia- Zaragoza. – Doyle, M.; Beuchat, L. & Montville, T. 2001. Microbiología de los alimentos. Fundamentos y fronteras. Editorial Acribia. Zaragoza. – Hui, Y. H.; Gorham, J. R.; Murrell, K.D.; Cliver, D. O. 1994. Food Disease handbook. Diseases caused by bacteria. Dekker. – ICMSF.1998. Microorganismos de los alimentos. Características de los patógenos alimentarios. Acribia. – ICMSF. 1999. Microorganismos de los alimentos 2. Métodos de muestreo para análisis microbiológicos: Principios y aplicaciones específicas. – ICMSF (International Commision on Microbiological Specifications for Foods). 1998. Microorganisms in Foods 6: Microbial Ecology of Food Commodities. Blackie Academic & Professional. – Mossel, D. A. A., Moreno, B. y Struijk, C. B. 2003. Microbiología de los alimentos (2ª ed.) Ed. Acribia. – Jay, J.M. 2000. Modern Food Microbiology. 6th edn., AVI Book-New York. – Pascual Anderson, Mª R. y Vicente Calderón Pascual. 1999. Microbiología Alimentaria. Metodología analítica para alimentos y bebidas. Díaz de Santos. – Varnam, A.H. & Evans, M.G. 1991. Foodborne pathogens. An illustrated text. Wolfe.• Revistas – Food Microbiology – Journal of Applied Microbiology – Trends in Food Science and Technology• Direcciones internet – http://www3.unileon.es/dp/dht/dhtmpm/inicio.html – http://www.bact.wisc.edu – http://www.asmusa.org 2
  3. 3. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – http://www.eurosurv.org – http://www.cdc.gov/ – http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-toc.html Importancia de los microorganismos en relación con los alimentos y la industria alimentaria• Aspectos indeseables • Alteración de los alimentos – Causantes de enfermedades: infecciones, intoxicaciones Datos sobre las enfermedades transmitidas por alimentos en EE.UU.• 6,5-33 millones de casos de enfermedad en hombre• hasta 9.000 muertes al año• Más de 40 diferentes patógenos• Seis de ellos – Salmonella spp. – Campylobacter spp. – Escherichia coli – Clostridium perfringens – Staphylococcus aureus – Listeria monocytogenes • El coste conjunto de estos seis es de $2.9-$6.7 miles de millones• Aspectos beneficiosos – Transformación (conversión) de alimentos – Influencia positiva en aspectos de la salud: probióticos • Suplementos microbianos alimenticios destinados a mejorar la salud del consumidor • Mercado mundial de los probióticos – Depuración de aguas residuales – Eliminación de sabores y olores anormales – Obtención de compuestos útiles – Herramientas para el análisis de alimentos Importancia de la calidad microbiológica de los alimentos• Concienciación del consumidor, de la Administración (costes)• Escándalos alimentarios• Incremento objetivo del número de casos de enfermedades de transmisión alimentaria• Factores colaterales – Cambios en los sistemas de producción • Elevada presión por conseguir altos rendimientos • Agricultura, ganadería “orgánica” – Aumento en el comercio internacional Cambio en los procedimientos de inspección y control • – Aparición de nuevos productos 3
  4. 4. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Alimentos en nuevos envases, nuevas formulaciones Comida étnica • – Existencia de grupos de riesgo • Ancianos, deportistas, inmunosuprimidos, embarazadas – Malos hábitos en la cocina – Percepción del riesgo Tema. Microorganismos asociados con los alimentos.• Microorganismos asociados con los alimentos.• Bacterias• Mohos• Levaduras• Virus• Algas• Protozoos• Origen de la contaminación microbiana de los alimentos• Contaminación cruzada• Bacterias – Gram-negativos, aerobias/microaerófilas, móviles, helicoidales, vibrioides • Campylobacter – Gram-negativos, Bacilos, cocos y cocobacilos aerobios Pseudomonas, Moraxella, Psychrobacter, Xanthomonas, Halobacterium y • Halococcus, Acetobacter, Flavobacterium y Alcaligenes, Brucella, Alteromonas, Gluconobacter, Acinetobacter – Bacilos Gram-negativos anaerobios facultativos • Enterobacterias: Escherichia, Salmonella, Shigella, Yersinia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Erwinia, Serratia, Hafnia, Edwarsiella, Proteus Vibrionáceas: Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas • – Cocos Gram-positivos Micrococcus, Kocuria, Staphylococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, • Aerococcus – Cocos y Bacilos Gram-positivos formadores de esporas • Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum – Bacilos Gram-positivos no esporulados, regulares Lactobacillus, Lactococcus, Carnobacterium, Bifidobacterium, Listeria, • Brochothrix, Kurthia – Bacilos Gram-positivos no esporulados, irregulares Brevibacterium, Propionibacterium, Microbacterium, Corynebacterium, • Arthrobacter – Micobacterias – Actinomicetos – Rickettsias y clamidias• Mohos 4
  5. 5. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Zygomycetes • Mucor, Rhizopus, Thamnidium – Ascomycetes Byssochlamys, Claviceps, Neurospora • – Deuteromycetes • Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Fusarium, Geotrichum, Penicillium, Sporotrichum• Levaduras – Ascomycetes • Saccharomyces, Debaromyces, Hansenula, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces – Deuteromycetes • Torulopsis, Brettanomyces, Candida, Cryptococcus, Kloeckera, Rhodotorula, Trichosporum• Virus – Intestinales – Bacteriófagos – Fúngicos• Algas• Protozoos• Priones Origen de la contaminación microbiana de los alimentos• Suelo: – Esporulados, Gram-negativos, mohos y levaduras, streptomyces• Agua: – Bacterias acuáticas. la mayoría Gram-negativos: Pseudomonas, Flavobacterium, Cytophaga, • Acinetobacter. Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio. Gram-positivos: Micrococcus y Bacillus. – Bacterias del suelo y aire arrastradas por la lluvia. – Aguas residuales: enterobacterias, virus, Str. faecalis, Cl. perfringens, protozoos (Cryptosporidium)• Aire: – Esporos Gram-positivos, bacterias Gram-negativas• Piensos y fertilizantes, estiércol: – Vehículo de patógenos• Plantas: – Gram-positivos, Gram-negativos, mohos y levaduras• Animales: Piel, tracto respiratorio e intestinal• Hombre: manipuladores• Equipo: muy variable• Ingredientes: p. ej. especias• Otros alimentos: contaminación cruzada• Material de envasado y empaquetado 5
  6. 6. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León Importancia del origen de la contaminación y las vías• Contaminación cruzada• Elementos que participan en la contaminación cruzada Tema. Alteración microbiana de los alimentos• Definición, causas y factores de los que depende la alteración microbiana• Acción sobre los hidratos de carbono, lípidos y proteínas• Otras alteraciones microbianas• Diferencia entre asociación microbiana y sucesión microbiana• Definición• Causas de la alteración de los alimentos – Bióticas • Microorganismos • Insectos y roedores • Enzimas – Abióticas • Cambios químicos no enzimáticos • Cambios físicos• Factores de los que depende la alteración microbiana – Composición del alimento • Origen vegetal • Origen animal – Tipo y número de microorganismos presentes en el alimento – Parámetros que afectan al crecimiento microbiano • Intrínsecos • Extrínsecos • Del procesado • Implícitos Acción microbiana sobre los hidratos de carbono, lípidos y proteínas• Hidratos de carbono – Polisacáridos • Pectina • Almidón • Glucógeno Celulosa • – Monosacáridos • Glucosa->ac. Pirúvico• Lípidos – Degradación hidrolítica – Degradación oxidativa• Proteínas y otros compuestos nitrogenados 6
  7. 7. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Proteínas – Dipéptidos – Aminoácidos • Su vía de degradación depende del tipo de microorganismos presentes, tipo de aminoácido, temperatura, O2 disponible e inhibidores • Mecanismos: Desaminación, decarboxilación, oxidación/reducción Otras alteraciones microbianas• Modificaciones en el aspecto – Presencia de células – Limosidad y viscosidad – Color• Otras alteraciones – Degradación de aditivos Asociación microbiana alterante• Asociación microbiana alterante• Clasificación por grupos – fisiológicos psicrotrofos, termodúricos, halófilos, esporulados, osmófilos, pectinolíticos, • acidificantes, proteolíticos, lipolíticos – taxonómicos• Diferencia entre – Asociación microbiana: composición microbiana de un alimento en un momento dado (p.ej. asociación • microbiana alterante) – Sucesión microbiana: • cambios que tienen lugar en las poblaciones microbianas durante el procesado del alimentos Tema. Factores que afectan a la supervivencia y multiplicación de los microorganismos en los alimentos• Factores intrínsecos: actividad de agua (aw), pH y capacidad tampón, Compuestos microbianos naturales, estructuras biológicas, Eh, Contenido en nutrientes• Factores extrínsecos: Temperatura (refrigeración, congelación), Humedad relativa, Concentración de gases en el ambiente• Factores asociados a los tratamientos tecnológicos: Tratamiento térmico, Irradiación, Conservadores químicos, Pascalización, Termomanosonicación• Factores implícitos: Velocidad de crecimiento, Influencias mutuas entre especies: sinergismos, antagonismos Actividad de agua• Importancia del agua• aw=P/P0=HRE/100 • P=Presión parcial del agua de la atmósfera en equilibrio con el sustrato • P0=Presión parcial de la atmósfera en equilibrio con el agua pura a la misma 7
  8. 8. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León temperatura• Recursos de la célula – con aw reducida – con aw elevada• Microorganismos – halófilos-halotolerantes – osmófilos-osmotolerantes – xerófilos-xerotolerantes• Factores que influyen sobre la aw en alimentos – solutos en disolución – Fuerzas de capilaridad – Porción del agua total presente ligada a lugares específicos polares en el alimento• Rangos de Aw de diversos alimentos• Influencia sobre el crecimiento microbiano – Fases de la curva de crecimiento: latencia, de crecimiento logarítmico, estacionaria o de reposo, de decadencia o muerte• Influencia sobre la supervivencia – Depende de la temperatura: Tª de refrigeración, ambiente, TT.• Tratamientos tecnológicos que modifican la aw – Desecación, deshidratación – Liofilización – Adición de solutos – Concentración• Rangos de aw – 1-0.95 – 0.95-0.90 – 0.90-0.80 – 0.80-0.60 – <0.60• Velocidades de reacción en alimentos en función de la aw• Utilización conjunta de otros factores en conservación pH• Diferencias entre pH, acidez, capacidad tampón – pH • - log [H+] – Acidez Medida indirecta de la cc de iones H+: por valoración ácido-base • – Capacidad tampón • parámetro que mide la capacidad de un alimento de aceptar un ácido sin modificación del pH• Propiedades del pH y la acidez• Medida del pH y la acidez 8
  9. 9. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Tipos de ácidos – fuertes • Acidifican el medio externo y menos el interno • Al mismo pH, tienen menor efecto que los débiles • Poco uso en alimentos – débiles • difusión del ácido no disociado (lipófilo) • alteración funcionamiento membrana • acidificación del medio interno tras ionización • gasto energético para mantener pH interno• Influencia del pH – Mecanismo – sobre el crecimiento • Rangos normales Microorganismos excepcionales • – la supervivencia • Mayor inactivación en alimentos ácidos • Variación depende del tipo de ácido • Existen sinergias con otros factores• Selección de la flora según el pH – pH > 5.6 Alteración por Gram negativos – pH > 4.0 Lactobacilos – pH < 4.0 Mohos y levaduras• Tratamientos tecnológicos – Fermentación – Acidificación• Consideraciones en alimentos tratados térmicamente • pH > 4.5. Permite el crecimiento de Cl. botulinum Tema. Factores intrínsecos (continuación)• Constituyentes naturales antimicrobianos• Potencial de óxido-reducción• Contenido en nutrientes• Estructuras biológicas Constituyentes naturales antimicrobianos•• Actúan sobre • la célula completa • su pared o membrana celular • mecanismo genético • sistemas enzimáticos • secuestrando nutrientes esenciales• Productos 9
  10. 10. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Huevo • Lisozima • ovomucoide y ovoinhibidor • conalbúmina • Avidina – Leche y productos lácteos • Lisozima • Lactoperoxidasa • Nisina, bacteriocinas (prods. lácteos) • Ac. grasos libres • Inmunoglobulinas • Lactoferrina • N-acetyl-ß-d-glucosaminidase – Tejidos animales – Productos vegetales • compuestos en especias Potencial de óxido-reducción• Eh: medida de la capacidad de un sistema para ceder o captar electrones – Oxidante + H+ + e- Reductor + – Eh = Eh0 + (RT/nF) Ln ([oxidante][H ]/[reductor])• Su valor en alimentos depende de: – Composición química: pares redox presentes – pH – Presión de O2 en la atmósfera, acceso del alimento al O2 – Actividad metabólica propia del alimento – Actividad microbiana• Efectos del Eh sobre los microorganismos – Microorganismos aerobios estrictos – Microorganismos anaerobios facultativos – Microorganismos anaerobios obligados – Microaerófilos• Empleo del potencial redox en el control de los microorganismos de los alimentos Contenido en nutrientes• Necesidades microbianas – Energía • Carbohidratos • Grasas • Prótidos – Componentes estructurales • Alimentos fuente de nitrógeno • Alimentos fuente de carbono – Otros: vitaminas, minerales 10
  11. 11. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• A tener en cuenta: – Casi todos los alimentos proporcionan los nutrientes necesarios para la mayoría de los microorganismos – Algunos alimentos están estructurados nutricionalmente – Existen microorganismos con necesidades específicas – Algunos tratamientos reducen el contenido en vitaminas Estructuras biológicas• piel de frutas, vaina, cutículas, testa de semillas, cáscaras, fascias – Formado por moléculas resistentes a la degradación – Poseen aw reducida – Poseen antimicrobianos (ácidos grasos de cadena corta, aceites esenciales) – Los cortes, golpes, son puertas de entrada a la invasión bacteriana Tema. Factores extrínsecos.• Temperatura de conservación• Humedad relativa del ambiente• Concentración de gases en la atmósfera Temperatura de conservación• Refrigeración y congelación• Tipos de microorganismos según su temperatura óptima de crecimiento – Psicrófilo – Psicrotrofo – Mesófilo – Termófilo Refrigeración• Efectos de la refrigeración y del almacenamiento a refrigeración sobre los microorganismos – Enlentecimiento del crecimiento microbiano • Aumento de la fase de latencia • Reducción en el ritmo de crecimiento (tiempo de generación) – Selección de parte de la flora – Shock por frío – Modificaciones en microorganismos • Morfológicas • de composición • fisiológicas• Resultado final del empleo de tª de refrigeración – Incremento de la vida útil de los alimentos – Detención del crecimiento de la mayor parte de patógenos – Reducción paulatina del nº microorganismos en alimentos funcionales• Aspectos a considerar – Importancia del control de la Tª (mantenimiento de la cadena del frío) – Importancia del nº inicial de microorganismos 11
  12. 12. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Mantenimiento de las características organolépticas – Patógenos psicrotrofos Congelación• Efectos de la congelación – Distinta sensibilidad • Gram-negativos > Gram-positivos Más complejidad-mayor sensibilidad • – Efecto mecánico: muerte, daño subletal lethal effects = effects which kill sublethal effects = effects which may be lethal, but from which microorganism may potentially recover – Microorganismos y metabolitos no sensibles • Esporos, toxinas bacterianas, enzimas• Etapas del proceso – Congelación – Almacenamiento (-20ºC/-40ºC) – Descongelación Humedad relativa del ambiente• Intercambio de agua depende de – naturaleza del alimento – Gradiente entre aw y HR – Temperatura – Velocidad del aire• Importante: – Cambios de ambiente bruscos (modificación de condiciones): deshidratación, condensación de agua Concentración de gases en la atmósfera• Sistemas de cambio de la concentración de gases – Almacenamiento en atmósferas controladas – Almacenamiento en atmósferas modificadas – Envasado a vacío – Envasado “inteligente”• CO2 – Utilización en atmósferas modificadas y atmósferas controladas – Efecto bacteriostático. Muy sensibles: Gram-negativos, mohos. Algo resistentes: Gram- positivos (lactobacilos), algunas levaduras (Brettanomyces) – Inhibición debida a: • descenso del pH por disolución del CO2-> Ac. carbónico (CO3H2->iones carbonato y protones) • Actuación como ácidos lipófilos débiles • Interferencia en actuación de enzimas decarboxilasas • Reacción con grupos amino de proteínas, modificando sus propiedades y actividad – Depende su efecto de: 12
  13. 13. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • anaerobiosis-aerobiosis • pH • Temperatura (aumenta la solubilidad a Tª baja)• Empleo industrial• CO (monóxido de carbono) Tema. Factores asociados a los tratamientos tecnológicos.• Tratamiento térmico• Radiaciones• Pascalización• Otros procesos Tratamiento térmico• Fundamento – Daño en moléculas blanco • DNA, mecanismos de germinación de esporas, otros (membrana, ribosomas, RNA), proteínas• Cinética de termodestrucción logarítmica – Valores D y z, F0• Cálculo de los tratamientos térmicos• Factores que afectan a la termorresistencia – Factores propios del microoorganismo • Especie, forma (vegetativa, esporulada) – Historia anterior del microorganismo • Edad • Fase de crecimiento • Temperatura de crecimiento Medio de crecimiento • – Ambiente durante el tratamiento • pH • aw • Presencia de azúcares, grasa, proteínas • Sales • Antimicrobianos: antibióticos, sulfitos, nitritos, agua oxigenada, ácidos orgánicos • Intensidad del tratamiento• Termorresistencia de los distintos microorganismos – Forma vegetativa-forma esporulada – psicrófilos-mesófilos-termófilos – Microorganismos con resistencia especial • Termodúricos • Mohos • Esporos • Patógenos • Alterantes 13
  14. 14. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Enzimas• Empleo de los tratamientos térmicos en el control de los microorganismos de los alimentos – Importancia de la higiene en la obtención, elaboración – Utilización conjunta de otros factores (ambiente durante el tratamiento) – Mantenimiento de alimentos a Tª elevada (escaldado, precocinado) – Tratamiento térmico de pasterización: Tª<100ºC (60-80) • Objetivo sanitario • Incremento de la vida útil • Objetivo tecnológico – Tratamiento térmico de esterilización: Tª 115ºC-120ºC o superiores • Eliminación de patógenos • Eliminación de alterantes • Obtención de la esterilidad comercial – Empleo conjunto con otros factores Radiaciones• Espectro electromagnético – Radiofrecuencia – Microondas – Infrarrojo – Visible – Ultravioleta – Rayos X y Rayos gamma• Energía – E=hv (h, kte; v, frecuencia)• Microondas – baja frecuencia, alta long. onda – Sistema de calentamiento• Ultravioleta – Poder antimicrobiano: lambda=260 nm – Daños en ácidos nucleicos – Cinética de destrucción logarítmica – G-<G+=lev<esporas b<esporas mohos<virus – Penetración escasa – Limitado a higienización de superficies y aire – Efectos colaterales • productor de ozono (oxidante de grasas) • Irritación ocular• Radiaciones ionizantes – Tipos • Rayos alfa • Electrones de elevada energía (partículas beta) 14
  15. 15. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Rayos gamma – Efecto sobre los microorganismos • Muerte de la célula (alteración de la estructura celular y AN) • Lesiones subletales • Mutaciones – Factores que afectan la sensibilidad de los microorganismos • Energía de la radiación • Temperatura • Presencia de Oxígeno en el medio • Contenido en agua • Sustrato • Fase de crecimiento • Tipo de microorganismo – Utilización de las radiaciones ionizantes • Radapertización: Nivel de esterilización (10-50 KGy) • Radurización: Nivel de pasteurización (1-5 KGy) • Radicidación: Nivel de higienización (parásitos, bacterias patógenas) (0,1-8 KGy) – Problemas • Modificación de las características sensoriales, valor nutritivo • Formación de radicales libres • Mutaciones microbianas • Control de los tratamientos (seguridad). • Detección de alimentos irradiados • etiquetado • consumidores • economía – Empleo • Aprobado por FDA, WHO, FAO • Real decreto 348/2001, de 4 de abril, por el que se regula la elaboración, comercialización e importación de productos alimenticios e ingredientes alimentarios tratados con radiaciones ionizantes. – Otras aplicaciones • Inhibición de brotes en bulbos, tubérculos • Retraso de la maduración • Descontaminación de especias • Eliminación de parásitos • Eliminación de insectos Radiación gamma (isótopos radiactivos)• Inconvenientes – Instalaciones – Desechos – control de dosis 15
  16. 16. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Ventajas Pasteurización electrónica• Características• Ventajas – evita la recontaminación (producto envasado) – la fuente puede ser apagada/encendida – no hay productos radiactivos – no requiere protección – control• Inconvenientes – Producto en capas finas Pasteurización mediante Rayos-X (pulsos de Rayos X)• Tecnología similar a instalaciones de Rayos X• “Bremsstrahlung”: haces de electrones frenados por una placa de oro• Escasas plantas de procesado• Ventajas – permite el tratamiento de productos irregulares – evita la recontaminación (producto envasado) – la fuente puede ser apagada/encendidano hay productos radiactivosDesventajas – requiere protección Pascalización• Actuación sobre: – enlaces no covalentes • iónicos • puentes de hidrógeno • interacciones hidrofóbicas – Moléculas • proteínas • algunas macromoléculas (almidón) ácidos grasos de la membrana celular • – Tipos de microorganismos • Levaduras, mohos, células vegetativas• Aplicación comercial – Presiones de 4000-6500 atm. (400-650 MPa) – Reducciones de 3-4 ul (higienización) – Productos • ácidos – Combinaciones de tratamientos • pH, Tª Otros procesos• Pulsos eléctricos de alta intensidad 16
  17. 17. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Aplicación comercial • Elsteril: tratamiento continuo de alimentos líquidos (higienización) – Fundamento rotura dieléctrica de la membrana (por polarización) • – Sensibilidad • Esporos, enzimas: insensibles • Más sensibles: Levaduras>Gram - negativas> Gram - positivas• Termomanosonicación – Aplicación conjunta de presión, Tª elevada y ultrasonidos – Fundamento • Ultrasonidos en medio líquido: ciclos alternativos de compresión/expansión, generando burbujas que cavitan • Bajo presión y a Tª elevada, el efecto destructor en la burbuja es mucho mayor• Calentamiento óhmico – Proceso – Inconvenientes• Pulsos de luz “blanca” – Pulsos de luz blanca (desde uv hasta IR) – Alta energía (hasta 50 J/cm2) – Aplicación: • esterilización de superficies, envases – Ventajas • Evita el uso de agentes químicos – Mecanismo de acción • similar a luz uv• Campos magnéticos oscilantes – Bien estáticos u oscilantes – En estado experimental – Inactivación microbiana: • se piensa por rotura de enlaces iónicos • reducciones de al menos 2 ulog Conservadores químicos antimicrobianos• Propiedades ideales – Ausencia de toxicidad (comprobación de IDA max) – Fácil de aplicar – No modificación de propiedades sensoriales – No neutralizable – Espectro antimicrobiano amplio – No provocar resistencias – Microbicida mejor que microestático – Económico• Clasificación 17
  18. 18. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Acidos orgánicos y sus sales • Acido acético y sus sales • Acido benzoico • Ácidos cítrico y láctico • Acido p-hidroxibenzoico • Ácido propiónico • Ácido sórbico y sus sales Utilización de los ácidos orgánicos para el control de los microorganismos en los • alimentos – Sales del curado y sustancias relacionadas • ClNa • Nitritos y nitratos • Sustancias del ahumado • Ascorbatos • Fosfatos Delta-glucono-lactona • – Antibióticos • Natamicina (piramicina) • Nisina – Gases • CO2 • SO2 (dióxido de azufre y sus sales: sulfito, bisulfito, metabisulfito) • Oxido de etileno • Oxido de propileno • Ozono – Otros • Peróxido de hidrógeno • Percarbonato sódico • Acido bórico • Dietilpirocarbonato • Acido salicílico • Lisozima Tema. Factores implícitos• Características del crecimiento: velocidad• Influencias mutuas entre especies – Sinergismos. Por actuar sobre • Nutrientes • PH • Eh • Aw • Estructuras biológicas • Sustancias antimicrobianas 18
  19. 19. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Antagonismos. Por actuar sobre • Nutrientes • pH • Eh • Aw • Sustancias antimicrobianas • Lisis por bacteriófagos• Consecuencias de sinergismos y antagonismos – Indeseables – Beneficiosas Tema. Microbiología predictiva• Definiciones, objetivos• Modelos cinéticos de crecimiento y de destrucción microbiana• Aplicaciones• Desarrollo de modelos matemáticos de crecimiento y destrucción microbiana Definiciones, objetivos• Definición – Consiste en el desarrollo y uso de fórmulas o modelos matemáticos (empíricos o mecanísticos) que describen/estiman los cambios cualitativos y/o cuantitativos que suceden en poblaciones microbianas bajo condiciones definidas (Walker & Jones, 1991)• Objetivos concretos – Describir el fenómeno matemáticamente – Predecir la respuesta del sistema en condiciones no probadas – Simular y optimizar procesos• Curvas de crecimiento y destrucción microbianas – Ritmo de crecimiento o tiempo de generación – Duración de la fase de latencia – Tiempo en alcanzar un determinado nº de células – Valores D y z• Factores que afectan al crecimiento o destrucción microbianos – Parámetros intrínsecos, extrínsecos, Efectos del tratamiento, Efectos implícitos Modelos cinéticos de crecimiento, de inactivación y de destrucción microbiana• Modelos cinéticos – Modelos cinéticos de crecimiento • Gompertz: log (n) = A + C exp(-exp (-b(t-M))) Logística: log (n) = A + C / (1 + exp(-b(t-M))) • – Modelos cinéticos de inactivación microbiana • Ecuaciones bifásicas • Modificaciones de la ecuación de Gompertz• Modelos combinados – Modelos combinados basados en la cinética microbiana 19
  20. 20. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Ecuación lineal de Arrhenius • Modelo de Schoolfield • Modelo de la raíz cuadrada • Modelos polinomiales – Modelos de probabilidades• Modelos dinámicos Aplicaciones• Predicción de la vida útil – http://www.dfu.min.dk/micro/ssp (Seafood Spoilage Predictor (SSP) software, Danish Institute for Fisheries Research)• Diseño de nuevos alimentos: valoración de riesgos microbiológicos – http://www.arserrc.gov/mfs/pathogen.htm (Pathogen Modeling Program version 5.1, Microbial Food Safety Research Unit, USDA)• Empleo en esquemas de control de calidad microbiológica: APPCC – análisis de peligros – identificación de puntos críticos – establecimiento de límites en estos puntos críticos – planificación de acciones correctoras cuando las condiciones de procesado se modifican Desarrollo de modelos matemáticos de crecimiento y destrucción microbiana• Diseño experimental – Define los objetivos • Microorganismo • Variable a modelizar • Factores Rango y niveles de los factores • – Establece el diseño matemático adecuado• Observación/recogida de datos• Caracterización de la curva• Modelización – Estabilización de la varianza – Elevada correlación – Simplicidad• Validación• Predicción Tema. Cultivos iniciadores• Introducción• Conservación, control y preparación de los cultivos• Géneros microbianos utilizados• Actuación de los cultivos iniciadores en productos lácteos• Actuación de los cultivos iniciadores en productos cárnicos 20
  21. 21. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León Introducción• Qué es un cultivo iniciador? • Son microorganismos seleccionados que influyen positivamente sobre la fermentación y maduración de los alimentos. Se utilizan para controlar los procesos mencionados y reprimir la flora acompañante indeseable, asegurando la salubridad y calidad del producto final• Grupos de bacterias empleadas como cultivos iniciadores – Bacterias acidolácticas, micrococáceas, levaduras y mohos• Tipos de alimentos fermentados – Productos lácteos (yogur, leches fermentadas, queso) – Productos cárnicos (embutidos) – Derivados de la pesca (tiburón, sushi) – Productos vegetales (col, pepinillos, aceitunas) – Otros: bebidas (cerveza, vinagre, vino), productos de panadería• Evolución – aspectos empíricos – científicamente: aislamiento, identificación, estudio y caracterización bioquímica, fisiológica, genética, manipulación, protección (patentes) Conservación, control y preparación de los cultivos• Conservación – Cultivos iniciadores líquidos – Deshidratados – Congelados• Prevención de la inhibición – Antibióticos – Bacteriófagos – Residuos detergentes y desinfectantes – Otros Inhibidores• Preparación de los cultivos iniciadores para su empleo – Sistemas protegidos mecánicamente – Método PRM/PIM Microorganismos responsables de los procesos fermentativos• Productos lácteos: – Queso (BAL+Mohos). – Yoghourt (Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus). – Leches fermentadas. Además, levaduras, mohos. – Bacterias lácticas • Lactococcus lactis, Lc. garviae, Lc. plantarum, Lc. piscium y Lc. raffinolactis • Leuconostoc lactis, L. oenos, L. paramesenteroides, L. citrum, L. amelibiosum, L. gelidum, L. carnosum • Streptococcus thermophilus • Enterococcus faecalis y Ent. faecium 21
  22. 22. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus, Lb. delbrueckii spp. lactis, Lb. acidophilus y Lb. Helveticus, L. casei, L. acidophilus • Bifidobacterium longum, B. infantis, B. bifidum, B. breve – Mohos • Penicillium roqueforti, P. camemberti – Levaduras • Candida kefir• Productos cárnicos (embutidos) – Bacterias acidolácticas Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, • Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sake, Lact. pentosus, Lact. fermentum, Lact. brevis – Micrococáceas y estafilococáceas • Kocuria varians, Staphylococcus xylosus, S. carnosus – Levaduras • Debaromyces hansenii (Candida famata) – Mohos • Penicillium nalgiovensis, P. camemberti, P. chrysogenum, Streptomyces griseus• Productos vegetales – Bacterias acidolácticas • Leuconostoc mesenteroides, Lact. brevis. Pediococcus acidolactis, Lact. plantarum• Derivados de la pesca• Pan. Vino, sidra, cerveza – Levaduras • Saccharomyces cerevisiae...• Vinagre – Levaduras, Acetobacter y Gluconobacter Clasificación de las bacterias ácido-lácticas (BAL)• Homofermentativos – Lact. bulgaricus, Lact. helveticus – Str. thermophilus• Heterofermentativos – facultativos: Lact. plantarum, Lact. casei, Lact. sake – obligados: Leuconostoc, Lact. brevis, Lact. fermentum, Lact. Kefir• Termófilos – L. bulgaricus, Str. thermophilus• Mesófilos – Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris Actuación de los cultivos iniciadores en productos lácteos• Actuación sobre las proteínas y lípidos – Proteolisis y Lipólisis por producción de enzimas proteolíticas y lipolíticas – Producción de ácidos grasos volátiles y CO2 22
  23. 23. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Contribución a los procesos madurativos • Contribución al aroma • Ojos en queso • Aumento en digestibilidad y valor nutritivo• Efecto sobre la lactosa – Producción de ácido láctico->Descenso del pH • Inhibición de patógenos • Coagulación proteínas lácteas • Cambios en la textura • Aumento en digestibilidad y valor nutritivo (intolerancia a la lactosa) – Producción de otros compuestos: ácidos, alcoholes • Contribución al sabor y aroma • Inhibición de patógenos• Producción de otros compuestos – Producción de compuestos antimicrobianos: ácidos orgánicos, H2O2, bacteriocinas, nisina – Efecto inhibidor sobre patógenos y competidores• Competición por nutrientes • Efecto inhibidor sobre patógenos y competidores• Reducción del potencial redox Actuación de los cultivos iniciadores en productos cárnicos• Actuación sobre las proteínas y lípidos – Proteolisis y lipólisis por producción de enzimas proteolíticas y lipolíticas – Producción de ácidos grasos volátiles y CO2• Efecto sobre los azúcares añadidos – Producción de ácido láctico->Descenso del pH – Producción de otros compuestos: ácidos, alcoholes • Cambios en la textura • Contribución al sabor y aroma • Inhibición de patógenos• Producción de compuestos antimicrobianos – Producción de ácidos orgánicos, H2O2, bacteriocinas, nisina • Efecto inhibidor sobre patógenos y competidores• Competición por nutrientes• Reducción del potencial redox• Reducción progresiva de las sales del curado – Formación de nitritos, óxido nitroso • Inhibición de C. botulinum • Cambios organolépticos (aroma sabor, color)• Contribución a desecación progresiva• Contribución al aspecto externo Tema. Probióticos, prebióticos y simbióticos• Definiciones. 23
  24. 24. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Requisitos para que una bacteria sea considerada probiótica• Propiedades de los microorganismos empleados como probióticos: Bifidobacterias, Lactobacillus acidophilus, L. casei Definiciones• Probióticos – Suplementos alimenticios microbianos. Mejoran el balance microbiano del hospedador• Prebióticos – Ingredientes alimentarios no digeribles (fructooligosacáridos). Estimulan la actividad de las especies bacterianas residentes en el colon• Simbióticos – Combinación de probióticos y prebióticos. Mejoran la supervivencia del suplemento microbiano en el tracto gastrointestinal, estimulando selectivamente el crecimiento o activando el metabolismo microbiano• Alimentos funcionales – Un alimento es funcional si sus componentes (que pueden ser o no nutritivos) tienen un efecto sobre una o varias funciones del organismo originando un efecto positivo sobre la salud. (International Life Science Institute). Requisitos para que una bacteria sea considerada probiótica• Efectos beneficiosos sobre la salud – Reducción de la intolerancia a la lactosa. – Efecto protector ante infecciones y estimulación del sistema inmune – Reducción del riesgo de cáncer de colon.• Supervivencia en condiciones medioambientales en el lugar donde debe ser activo – pH ácido – Sales biliares• Adhesión a la pared intestinal• Proliferación y/o colonización en el lugar donde actúa• Otros – Ausencia de reacción inmune contra la cepa probiótica – Ausencia de reacción patogénica, tóxica, alérgica, mutagénica o carcinogénica causada por la cepa probiótica, sus productos de fermentación o sus componentes celulares tras la muerte de la bacteria – Estable genéticamente, sin transferencia de plásmidos – Producción fácil y reproducible – Viable durante procesado y almacenamiento Propiedades de los microorganismos usados como prebióticos: Bifidobacterias• Taxonomía cambiante – Cercano a Lactobacillaceae – Especies: B. longum, B. infantis, B. bifidum, B. breve• Requisitos principales de los probióticos – Tránsito en el estómago e intestino – Adhesión y colonización 24
  25. 25. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – % supervivencia (30%)• Efectos sobre la flora intestinal – Disminuye los números de clostridia, bacteroides y coliformes – Posiblemente por producción de ácido• Efectos fisiologicos – Reducción del pH – Reducción del tiempo de tránsito – Reducción de la actividad enzimática • glucuronidasa • nitroreductasa – Efectos inmunológicos • Incrementa la producción de IgA (in vitro) Lactobacillus acidophilus• Características – Homofermentativo – Hábitat: Tracto gastrointestinal de hombre, productos lácteos – Grupo acidófilo: compuesto de 6 especies – Crecimiento lento. Baja resistencia al ácido!!• Principales requisitos de los probióticos – Capaz de resistir el tránsito estomacal (pH=1.5) – Capaz de resistir el tránsito intestinal (Bilis cc=2%) – % supervivencia 20% – Buena adherencia a células Caco-2 (in vitro)• Propiedades de promoción de la salud – Promueve el crecimiento – Ayuda a digestión de la lactosa – Aumenta digestión de minerales – Contiene factores anticarcinogénicos (colon) – Estimula respuesta del sistema immunológico (citokinas, IgA, B cells) – Estimula reducción del colesterol en suero sanguíneo – Produce factores antimicrobianos Lactobacillus casei• Características – Presente en numerosos productos (leche fermentada, quesos, productos cárnicos, y tracto gastrointestinal – Compuesto de 4 especies: L. casei, L. paracasei (2 subsp) y L. rhamnosus – Heterofermentativo facultativo• Requisitos principales de los probióticos – Resistencia media al pH (3-7) y bilis – % supervivencia (5-10%) – Capacidad de adhesión: no está clara – Algunos informes de aislamientos de muestras clínicas 25
  26. 26. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Propiedades promotoras de la salud – Efectos clínicos sobre la diarrea – Efectos sobre el balance intestinal – Reducción de niveles enzimáticos: glucuronidasa, nitroreductasa – efectos inmunomoduladores 26
  27. 27. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León Tema. Aspectos generales sobre el trabajo en el laboratorio de Microbiología de los alimentos• Seguridad en el laboratorio de microbiología de los alimentos• Diseño y necesidades de un laboratorio• Principios de las buenas prácticas de laboratorio• Principios que informan la elección de medios de cultivo en Microbiología de los alimentos• Clasificación de los medios de cultivo• Etapas en la preparación de los medios de cultivo (medios deshidratados)• Técnicas de separación de cultivos mezclados Seguridad en el laboratorio de microbiología de los alimentos• 1. Clasificación de los microorganismos en función del riesgo que suponen – Grupo de Riesgo I Bajo o escaso riesgo individual y colectivo. Leuconostoc, Micrococcus (Kocuria), • Moraxella, Brochothrix, Botrytis, Penicillium – Grupo de Riesgo II Riesgo individual moderado, riesgo colectivo limitado. Erysipelothrix, Vibrio • parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Shigella. – Grupo de Riesgo III Riesgo individual elevado, riesgo colectivo bajo. Clostridium botulinum, Salmonella • typhi, S. paratyphi – Grupo de Riesgo IV • Riesgo individual elevado, riesgo colectivo elevado. Virus• 2. Vías de infección – Digestiva Pipetear, fumar, comer • – Respiratoria • inhalación de aerosoles – Cutánea • pinchazos, cortes y abrasiones de la piel – Conjuntival • salpicaduras que acceden a los ojos• 3. Prevención de las infecciones adquiridas en el laboratorio – Barreras primarias • en torno a los microorganismos, para evitar su dispersión en el laboratorio – Barreras secundarias • en torno al personal para que le protejan si fallan las primarias – Barreras terciarias • en torno al laboratorio, previenen la dispersión a la comunidad cuando fallan las barreras primaria y secundaria Diseño y necesidades de un laboratorio – Locales 27
  28. 28. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Almacén • cocina para la preparación de medios de cultivo • sala de siembra • lavadero para descontaminar el material, lavar, esterilizar y preparar todo excepto medios de cultivo • sala con equipamiento especial • zona administrativa – Personal Formado en BPL • – Instrumental o aparatos Frigorífico, congelador, balanza, estufas de cultivo, peachímetro, agitadores • magnéticos, autoclaves, microscopio, baños de agua, homogeneizador, lupa, equipo de filtración, jarras de anaerobiosis – Otro material, medios de cultivo y reactivos • Colección de microorganismos • Medios de cultivo • Reactivos • Agua destilada o desionizada • mecheros, cuchillos, espátulas, sacabocados, asas de platino, pipetas de vidrio, automáticas, material de vidrio, material de plástico desechable, etc. Calidad en los laboratorios de microbiología de alimentos• Legislación – Directiva 88/320/CEE del Consejo de 9 de junio de 1988 relativa a la inspección y verificación de las buenas prácticas de laboratorio (BPL) – R.D. 2043/1994 de 14 de Octubre, sobre la inspección y verificación de buenas prácticas de laboratorio. – R.D. 822/1993 de 28 de Mayo por el que se establecen los principios de buenas prácticas de laboratorio y su aplicación en la realización de estudios no clínicos sobre sustancias y productos químicos (modificado por el Real Decreto 1369/2000).• Principios de las buenas prácticas de laboratorio – Organización y personal del laboratorio – Programa de Garantía de Calidad – Laboratorio – Aparatos, materiales y reactivos – Sistemas experimentales: análisis y resultados – Sustancias a ensayar y de referencia – Procedimientos Normalizados de Trabajo – Especificaciones y normativas concretas para la realización del estudio – Realización del informe a partir de los resultados del estudio – Archivos: almacenamiento y conservación de registros y materiales• Acreditación de los laboratorios – –www.enac.es (Entidad Nacional de Acreditación) 28
  29. 29. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León Principios que informan la elección de medios de cultivo en Microbiología de los alimentos• Requerimientos de los microorganismos – agua, – fuente de nitrógeno (proteínas, aminoácidos, nitrógeno inorgánico), – fuente de energía (carbohidratos, proteínas) – minerales – otros factores de crecimiento (aminoácidos, purinas, pirimidinas, vitaminas)• Características generales de los medios de cultivo – Agua – Agente gelificante (medio sólido) – Fuente de nitrógeno (proteína) – Fuente de energía (azúcar) – Vitaminas, minerales Clasificación de los medios de cultivo• Por su origen: – Naturales – Artificiales• Por su composición: – Empíricos – Sintéticos – Semisintéticos• Por su consistencia: – Líquidos – Sólidos – Semisólidos• Por su aplicación: – Generales – Enriquecidos – Selectivos – Diferenciales – De enriquecimiento – Prerreducidos Etapas en la preparación de los medios de cultivo (medios deshidratados)• Leer instrucciones• Pesar• Disolver en agua destilada• Fundir / Ajuste pH• Esterilizar – 121ºC-15, – 115ºC-10-20 con componentes termosensibles 29
  30. 30. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Filtración, con componentes termosensibles: filtros 0,45 microm• Reparto – Placas de Petri, tubos de ensayo• Controles – Control de esterilidad – Control de calidad – Control de selectividad (técnica ecométrica) Técnicas de separación de cultivos mezclados• Siembra por agotamiento (estría) en medio sólido• Enriquecimiento en medio líquido (y siembra posterior en medio sólido) – Empleo de medios electivos – Empleo de medios selectivos – Empleo de medios diferenciales Tema. Metodología de la toma de muestras• Muestreo• Muestras• Preparación y dilución de homogeneizados de alimentos para el análisis microbiológico Muestreo• Objetivos del muestreo – Detectar presencia de patógenos – Evaluar el cumplimiento de las normas microbiológicas – Conocer la vida útil del producto – Conocer el estado higiénico de la industria, local, equipo, manipuladores, etc. – Investigar brotes• Otros aspectos – El análisis microbiológico es destructivo (generalmente) – Procedimientos estériles – Tiempo hasta el análisis – Representatividad – Sistemas aleatorios – Cuántas muestras y cómo debe realizarse – Cantidad – Identificación Muestras• Tipos de muestra – Envasadas – Alimentos líquidos – Sólidos • Pulverulentos • no pulverulentos • profundidad 30
  31. 31. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • superficie (Escisión(a), Vehículos inertes(b), Impresión directa(c)) – Muestras de aire• Diferencia entre métodos – Recuperación de células – Muestreo destructivo/no destructivo• Otros aspectos – Posibilidad de diluciones – Expresión de resultados – Microorganismos anaerobios – Cuidados de las muestras antes del análisis • Tiempo • Temperatura • Casos especiales (medios de transporte) – Biofilms en superficies Preparación y dilución de homogeneizados de alimentos para el análisis microbiológico• Homogeneización – Vaso Sorvall – Stomacher• Diluyente – Características – Uso general • Agua de peptona 0,1% • Solución Ringer – Uso especial • Tampón fosfato • Agua destilada • Soluciones para microorganismos osmófilos, anaerobios • Medios con compuestos incorporados (tensoactivos)• Diluciones de factor 10 – Alimentos líquidos – Sólidos pulverulentos – Sólidos no pulverulentos Tema: Recuento de microorganismos de alimentos• Técnicas basadas en la formación de colonias en medio de cultivo sólido• basadas en el recuento directo de células microbianas o en la estimación de la masa celular• basadas en la medición de la actividad metabólica microbiana• basadas en la determinación directa en el alimento de un componente estructural o metabólico de las células microbianas a) Técnicas basadas en la formación de colonias en medio de cultivo sólido• Procedimientos de siembra en la profundidad del medio 31
  32. 32. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Recuento estándar en placa – Método del tubo rotatorio – Método de las gotas de agar – Método del asa calibrada – Método de los tubos ovales – Aparato para la siembra en la profundidad del medio: Colworth 2000• Procedimientos de siembra en la superficie del medio – Recuento de siembra por extensión en superficie – Aparato de siembra en espiral en la superficie del medio – Recuento por siembra de gotas en superficie (Drop plate, Miles-Misra)• Procedimientos que utilizan filtros de membrana – Filtración por membrana (procedimiento tradicional) – Método de la rejilla hidrofóbica (Hydrophobic Grid Membrane Filter, Iso-Grid)• Otros procedimientos – Método de las tiras de agar – Método de recuento en placa miniaturizado – Métodos de recuento de microcolonias – Petrifilm, Redigel• Otras automatizaciones – Aparato de siembra por estría en la superficie del medio – Contadores automáticos de colonias. – Preparadores automáticos de medios de cultivo – Diluidores gravimétricos – Diluidores automáticos• Técnica del número más probable (recuento por dilución en tubos) b) Métodos basados en el recuento directo de células microbianas o en la estimación de la masa celular• Recuentos microscópicos – Colorantes clásicos • Método de Breed • Método de Howard – Colorantes fluorescentes • Naranja de acridina • Colorantes específicos – Técnicas • En extensión • Bactoscan • DEFT• Citometría de flujo• Recuentos electrónicos de partículas• Métodos basados en la estimación de la masa celular – Nefelometría 32
  33. 33. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Fotometría c) Pruebas basadas en la medición de la actividad metabólica microbiana• Pruebas que miden la actividad metabólica de microorganismos en crecimiento – Pruebas electroquímicas * – Pruebas microcalorimétricas – Pruebas radiométricas – Pruebas cromatográficas – Pruebas fotométricas• Determinación de enzimas microbianas en alimentos – Catalasa – Citocromo c oxidasa – Aminopeptidasa – Termonucleasa• Indicadores de descomposición Pruebas electroquímicas• Reducción de colorantes – Fundamento – Medición – Procedimiento – Tipos de indicadores – Condiciones de su empleo – Utilización en – Ventajas e inconvenientes• Impedancia – Fundamento – Requisitos – Procedimiento – Utilización en – Ventajas e inconvenientes d) Pruebas basadas en la determinación de componentes de las células microbianas• Pruebas de luminiscencia – Quimioluminiscencia • Compuestos porfirínicos – Bioluminiscencia • Fundamento: • ATP + D-Luciferina-luciferasa +MG++ -> AMP + CO2 + Oxiluciferina + Pyrofosfato + luz • Medición del ATP • Niveles de ATP microbiano • Preparación de la muestra 33
  34. 34. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Determinación del ATP • Interpretación de los resultados. • Aplicaciones• Prueba del lisado del Limulus – Fundamento – Utilidad e inconvenientes Tema. Clasificación, identificación y tipificación de los microorganismos presentes en los alimentos• Aplicaciones• Definiciones• Metodología• Identificación microbiana por métodos rápidos y automatizados• Métodos de diferenciación de cepas (tipado/tipificación)• Aplicaciones – Microbiología de los alimentos • Alteración, microorganismos beneficiosos, patógenos • Control y garantía de la calidad alimentaria – Epidemiología Investigación de brotes alimentarios • – Taxonomía: Filogenia, evolución, clasificación – Microbiología clínica • Diagnóstico, terapéutica – Microbiología industrial • Screening• Definiciones – Taxonomía – Clasificación: el agrupamiento de individuos en grupos taxonómicos, descritos por un conjunto de propiedades, en base a sus relaciones o similitudes – Identificación: el proceso de asignación de un desconocido a uno de los grupos taxonómicos previamente descritos – Nomenclatura – Tipificación• Metodología – Creación de la base de datos – Aislamiento, purificación – Realización de pruebas (caracterización del desconocido) • Información de tipo fenotípico, quimiotaxonómico y genético – Tratamiento de los datos – Procedimiento de comparación – Claves dicotómicas • Identificación probabilística 34
  35. 35. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Taxonomía numérica Identificación microbiana por métodos rápidos y automatizados – Miniaturización de tests bioquímicos y pruebas de sensibilidad a antimicrobianos • Api, Enterotube y oxi-ferm tube, Micro id • Utilización de multiinoculadores Métodos fotométricos: Biolog • – Técnicas radiométricas – Técnicas microcalorimétricas (termogramas) – Técnicas electroquímicas (voltamogramas) – Técnicas cromatográficas: • cromatografía gaseosa de productos volátiles derivados del metabolismo microbiano • cromatografía gaseosa de ácidos grasos bacterianos: MIDI Microbial Identification System • cromatografía de afinidad cromatografía en capa fina para el análisis de metabolitos microbianos • – Técnicas electroforéticas: proteínas bacterianas y enzimas – Pruebas de espectrometría de infrarrojo – Técnicas de pirolisis – Métodos inmunológicos (sig. lección) – Métodos genéticos (sig. lección) Métodos de diferenciación de cepas (Tipado, tipificación)• Método clásico: marcadores fenotípicos – biotipado – serotipado – fagotipado – bacteriocino-tipado• Métodos de tipado molecular – Métodos de análisis de lipopolisacárido o ácidos grasos • Electroforesis del lipopolisacárido en gel SDS (sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide) • Análisis de ácidos grasos libres por GLC – Métodos de análisis de proteínas • Perfiles de proteínas de células enteras y de membrana externa (SDS-page) Multilocus Enzyme Electrophoresis (MEE) • – Métodos inmunológicos (sig. lección) – Métodos genéticos (sig. lección) Tema. Pruebas inmunológicas de utilidad en el análisis microbiológico de los alimentos• Fundamento y utilidad• Técnicas inmunológicas• Utilización de anticuerpos monoclonales en Microbiología de los alimentos 35
  36. 36. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Fundamento – Reacción específica entre antígeno y anticuerpo• Utilidad – Detección, identificación, tipificación y cuantificación de microorganismos – Detección y cuantificación de enzimas microbianas y toxinas de origen microbiano Técnicas inmunológicas• Reacciones de precipitación• Reacciones de fijación del complemento• Reacciones de aglutinación-coaglutinación• Técnicas que usan reactivos marcados – luminiscencia – radioinmunoensayo – enzimainmunoensayo • Homogénea: Ag + Ac-Hapteno-Enzima (inactivado) -> Ag-Ac +Hapteno-Enzima (activado) • Heterogénea (ELISA: antígeno o anticuerpo ligado a soporte sólido)• Immunoblotting (western blotting)• Separación inmunomagnética Utilización de anticuerpos monoclonales en Microbiología de los alimentos• Obtención por: – cultivo "in vitro" de linfocitos B productores de anticuerpos y fusión con células de mieloma, produciendo una célula hibrida: hibridoma• Ventajas – especificidad – reproducibilidad – pureza• Utilización – Obtención de anticuerpos específicos para la detección e identificación de microorganismos y metabolitos microbianos Tema. Detección y caracterización de microorganismos en los alimentos mediante técnicas genéticas• Introducción• Herramientas• Procedimientos para la comparación de fragmentos de DNA• Detección mediante técnicas de hibridación de ácidos nucleicos• Secuenciación Introducción• Cómo encontrar diferencias entre fragmentos de DNA bacteriano – Amplificando fragmentos específicos – Rompiendo el cromosoma y separando sus fragmentos 36
  37. 37. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Comparando hebras: homologías – Secuenciando los ácidos nucleicos (DNA, RNA) Herramientas• Enzimas de restricción• Programas de ordenador – The science behind sequence matching – Interpreting BLAST search results• Electroforesis• Amplificación del DNA: PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) – Reactivos: • TAQ polimerasa de Thermus aquaticus, nucleótidos, DNA con la región a amplificar, iniciadores o primers – Proceso • Desnaturalización • Hibridación • Elongación – Ventajas e inconvenientes – Variaciones • Nested PCR, Multiplex PCR, real-time PCR, reverse-transcriptase PCR – Empleo• rRNA – 16S rRNA • Moléculas cronógrafas • Mutaciones deletéreas • Subunidad 30S • 1500 pb (560 conservados, 970 variables) • > 16.000 secuencias en bases de datos – 23S • Subunidad 50S • 2900 pb – 5S • Subunidad 50S • 120 pb Procedimientos para la comparación de fragmentos de DNA• PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polimorphism)• RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA), Arbitrarily Primed PCR (AP-PCR)• Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) – Limitaciones del método • Requiere instrumental, técnicos apropiados>24 horas para resultadosRedes epidemiológicas que emplean este método• Ribotipado – Fundamento 37
  38. 38. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Ventajas de las sondas de rRNA • Las sondas rRNA son un sistema universal para todas las especies • Gran conservación de secuencias en los genes rRNA Existen copias múltiples de los operones rRNA • Secuencias estables • Se puede usar el rRNA o fragmentos de genes • La comparación de las bandas puede ser automatizadaLimitaciones del método La discriminación depende de la enzima de restricción y de la sonda usada • – Procedimiento• Análisis de plásmidos – Plásmidos – Limitaciones del método • Requiere especies que contengan plásmidos múltiples y diversos • Puede ser difícil calcular el tamaño de los plásmidos La presencia de plásmidos idénticos puede ser resultado de transferencia • horizontal más que relación taxonómica – Plasmid restriction enzyme analysis• Southern blotting – Procedimiento • Restricción del DNA • Electroforesis • Paso a membrana de nitrocelulosa • Hibridación con sonda de DNA marcada Detección de microorganismos en los alimentos mediante hibridación de ácidos nucleicos• Procedimiento – Cultivar microorganismos – Ligar muestra a soporte sólido – Romper células – Calentar – Añadir sonda – lavar – detectar señal • isótopos radiactivos • enzimas • haptenos Secuenciación• Aislamiento del DNA• Reactivos – Iniciador (cebador) de DNA – Transcriptasa – Dideoxidonucleótidos marcados 38
  39. 39. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Desoxinucleótidos Tema. Detección y recuento de microorganismos que han sufrido daño subletal. Otros métodos útiles en Microbiología de los alimentos• Importancia de los microorganismos lesionados• Características de los microorganismos lesionados• Efecto de los distintos tratamientos• Detección y recuento de microorganismos lesionados• Otros métodos útiles en Microbiología de los alimentos• Importancia de los microorganismos lesionados en relación con – Elaboración de alimentos – Conservación de alimentos – Salud pública – Criterios y normas – Análisis microbiológico, conservación de cepas• Características de los microorganismos lesionados – Aspectos generales • Disminución de su resistencia a los agentes o compuestos químicos selectivos • Aumento de la fase de latencia • Alteración de la permeabilidad Aumento de los requerimientos nutritivos • – Alteraciones más frecuentes en la célula • pared celular o su síntesis • membrana -> pérdida de solutos y mayor susceptibilidad a inhibidores • proteínas o su síntesis • ribosomas o síntesis del RNA • DNA• Efecto de los distintos tratamientos – Refrigeración • Disminución constante de la viabilidad • Shock del frío • Shock osmótico del frío – Congelación-descongelación • alteraciones metabólicas: medios con ciertos nutrientes • Aumento de la susceptibilidad a agentes tensoactivos (sales biliares) y antibióticos • Pérdida de componentes celulares de bajo y alto peso molecular • Aumento del período de latencia tras la descongelación Aumento de la susceptibilidad a las radiaciones UV • – Otros tratamientos tecnológicos • Rehidratación de alimentos desecados: velocidad y temperatura • Pascalización 39
  40. 40. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Irradiación – Otros procesos que pueden lesionar los microorganismos • almacenamiento y manipulación de los alimentos • ciertos ingredientes de los alimentos, con compuestos químicos inhibidores • técnicas empleadas durante el análisis: Homogenización, agar fundido (Tª de 45ºC en medios no selectivos), tiempo en que los microorganismos están en contacto con el diluyente y su temperatura• Detección y recuento de microorganismos lesionados – Aspectos generales • Reparación del daño celular • La Tª óptima de incubación (25-37ºC) y el tiempo (1-4 h) varían con el tipo de estrés • Las células recuperadas responden a agentes selectivos incluidos en los medios • El proceso de reparación del daño precede a la multiplicación celular – Sistemas empleados: • Reparación en medio líquido de células vegetativas • Recuperación en medio sólido de células vegetativas • Otros métodos de recuperación para células vegetativas • Detección de esporos bacterianos lesionados Otros métodos útiles en Microbiología de los alimentos• Detección de sustancias mutágenas – Pruebas para evaluar la carcinogenicidad de las sustancias • Estudios sobre células de seres inferiores a mamífero • Estudios "in vivo" sobre células de mamíferos • Estudios "in vitro" sobre células de mamífero – Sustancias con posible actividad mutagénica en alimentos • microbianas • contaminantes • del procesado o cocinado del alimento • aditivos, coadyuvantes – Test de Ames – Con mutantes de Salmonella typhimurium auxótrofas para histidina (his-) • Test de Ames para detectar zimógenos • Precauciones en la interpretación de los resultados del test de Ames. Otras modificaciones de las cepas utilizadas: Mutación rfa, eliminación parcial • del gen uvrB, introducción del plásmido pKM101 – Otras pruebas con microorganismos • Inductest Escherichia coli K-12 ó de inducción del profago (células lisogénicas de E. coli) • Test de reparación con Bacillus subtilis (esporas)• Determinación de la tasa de crecimiento de un microorganismo – cultivo en medio líquido o suspensión de células lavadas – inocular en Erlenmeyer con 100 ml con Tª de incubación equilibrada (cc 10^4 g/ml) 40
  41. 41. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – tomar 1 ml para diluciones decimales -> recuento de viables/turbidez al comienzo del experimento y a intervalos frecuentes – En la fórmula • A: nº inicial de microorganismos • C: nº de ciclos de crecimiento • B: ritmo de crecimiento máximo • M: tiempo al que el crecimiento es máximo• Aislamiento de bacteriófagos activos frente a E. coli. – Enriquecimiento. – Inoculación – Centrifugación – Preparación de cultivos de fago – Mantenimiento• Ensayos microbiológicos de factores de crecimiento • Cuantificación de sustancias en alimentos Base del ensayo microbiológico: el crecimiento de un microorganismo • (Lactobacillus fermentum, Pediococcus cerevisae) es dependiente y proporcional a la cantidad de un factor o nutriente único – Medición del crecimiento • Métodos de difusión • Métodos turbidimétricos • Métodos de dilución en tubo. Para antibióticos • Métodos acidimétricos • Métodos gravimétricos – Dos procedimientos • Método en tubo y Método en placa – Material • Medios de cultivo, medio de mantenimiento, medio para inóculo, medio para análisis, curvas patrón Tema. Principales géneros de mohos y levaduras de interés en Microbiología de los alimentos: recuento e identificación• Mohos• Levaduras Mohos• Importancia de los mohos en microbiología de los alimentos – Alteración de alimentos – Producción de micotoxinas – Fermentación de alimentos – Obtención de enzimas y antibióticos• Estructura – Hifas, micelio, esclerocio• Reproducción 41
  42. 42. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Esporas asexuales. Se producen directamente del micelio. • Esporangiosporas • Conidiósporas. Talosporas: Blastosporas, Clamidosporas y Artrosporas • – Esporas sexuales. Formadas tras fusión de 2 células • Oosporas • Zigosporas • Ascosporas • Basidiosporas• Recuento – Método clásico – Siembra de todo el alimento – Muestreo de superficies – Alimentos líquidos – Otras técnicas• Aislamiento – Medios de cultivo: características – Medios generales – Medios selectivos• Identificación – Morfología macro y microscópica – Cultivo en porta en bloque de agar – Método de cultivo en porta de Johnson Levaduras• Importancia de las levaduras en microbiología de los alimentos – Alteración de alimentos – Elaboración de alimentos – Patógenas – Síntesis de compuestos – Fermentaciones industriales – Modelo en el estudio de procesos metabólicos y bioquímicos. – Alimentación• Estructura citológica – Cápsulas – Pared celular – Membrana citoplásmica – Componentes del protoplasma – Núcleo, mitocondrias, vacuolas...• Reproducción – Gemación – Fisión – Esporulación 42

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