Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos

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Describe el desarrollo practico de la Microbiologia de Alimentos, en el area de Veterinaria

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  • 1. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León Tema. Microbiología de los Alimentos: Concepto y contenido, historia.• Concepto y contenido de la Microbiología de los Alimentos• Aspectos de los que trata• Historia• Importancia de los microorganismos en relación con los alimentos y la industria alimentaria• Datos sobre las enfermedades transmitidas por alimentos• Importancia de la calidad alimentaria• Concepto – "Ciencia que estudia los microorganismos en relación con los alimentos"• Contenido – Ecología microbiana de los alimentos. – Utilización de microorganismos en la producción de alimentos – Bases metodológicas del análisis microbiológico de los alimentos – Microbiología sanitaria de los alimentos. Microorganismos patógenos, toxinas y metabolitos microbianos transmitidos por los alimentos – Microbiología de los distintos alimentos.• Aspectos de los que trata – Microorganismos presentes, su origen y factores de los que depende su presencia y multiplicación en alimentos – Efectos derivados de su presencia y multiplicación en alimentos – Fundamento y utilidad de las determinaciones microbiológicas – Empleo de microorganismos en la fabricación de alimentos e ingredientes• Bibliografía – Adams, M. R. & Moss, M. O. 1997. Microbiología de los alimentos. Editorial Acribia- Zaragoza. * – Doyle, M.; Beuchat, L. & Montville, T. 2001. Microbiología de los alimentos. Fundamentos y fronteras. Editorial Acribia. Zaragoza.* – ICMSF. 1998. Microorganismos de los alimentos. Características de los patógenos alimentarios 5. Ed. Acribia. * – ICMSF (International Commision on Microbiological Specifications for Foods). 1998. Microorganisms in Foods 6: Microbial Ecology of Food Commodities. Blackie Academic & Professional. * – Microorganisms in Foods 7: Microbiological Testing in Food Safety Management. Kluwer Academic/Plenum Publishers, 2002. * – ICMSF. 1999. Microorganismos de los alimentos 2. Métodos de muestreo para análisis microbiológicos: Principios y aplicaciones específicas. – Jay, J.M. 2000. Modern Food Microbiology. 6th edn., AVI Book-New York. – Mossel, D.A.A., Moreno, B. y Struijk, C.B. 2003. Microbiología de los alimentos (2ª ed.) Ed. Acribia. – Pascual Anderson, Mª R. y Vicente Calderón Pascual. 2000. Microbiología Alimentaria. Metodología analítica para alimentos y bebidas. Díaz de Santos. * – Varnam, A. H. & Evans, M.G. 1991. Foodborne pathogens. An illustrated text. Wolfe. 1
  • 2. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Revistas – Food Microbiology – Journal of Applied Microbiology – Trends in Food Science and Technology• Dirección Internet – http://www3.unileon.es/personal/wwdhtmpm/inicio.html• Historia – en relación con procesos de conservación de alimentos – Appert (1795) – Pasteur (1854) – en relación con microorganismos transmitidos por alimentos • Botulismo (s IX AC) • Ergotismo (s XV) • Gaërtner (1888) • Kerner (1793) y Van Ermengen (1896) Fuentes de información• Bibliografía – Adams, M.R. & Moss, M. O. 1997. Microbiología de los alimentos. Editorial Acribia- Zaragoza. – Doyle, M.; Beuchat, L. & Montville, T. 2001. Microbiología de los alimentos. Fundamentos y fronteras. Editorial Acribia. Zaragoza. – Hui, Y. H.; Gorham, J. R.; Murrell, K.D.; Cliver, D. O. 1994. Food Disease handbook. Diseases caused by bacteria. Dekker. – ICMSF.1998. Microorganismos de los alimentos. Características de los patógenos alimentarios. Acribia. – ICMSF. 1999. Microorganismos de los alimentos 2. Métodos de muestreo para análisis microbiológicos: Principios y aplicaciones específicas. – ICMSF (International Commision on Microbiological Specifications for Foods). 1998. Microorganisms in Foods 6: Microbial Ecology of Food Commodities. Blackie Academic & Professional. – Mossel, D. A. A., Moreno, B. y Struijk, C. B. 2003. Microbiología de los alimentos (2ª ed.) Ed. Acribia. – Jay, J.M. 2000. Modern Food Microbiology. 6th edn., AVI Book-New York. – Pascual Anderson, Mª R. y Vicente Calderón Pascual. 1999. Microbiología Alimentaria. Metodología analítica para alimentos y bebidas. Díaz de Santos. – Varnam, A.H. & Evans, M.G. 1991. Foodborne pathogens. An illustrated text. Wolfe.• Revistas – Food Microbiology – Journal of Applied Microbiology – Trends in Food Science and Technology• Direcciones internet – http://www3.unileon.es/dp/dht/dhtmpm/inicio.html – http://www.bact.wisc.edu – http://www.asmusa.org 2
  • 3. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – http://www.eurosurv.org – http://www.cdc.gov/ – http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-toc.html Importancia de los microorganismos en relación con los alimentos y la industria alimentaria• Aspectos indeseables • Alteración de los alimentos – Causantes de enfermedades: infecciones, intoxicaciones Datos sobre las enfermedades transmitidas por alimentos en EE.UU.• 6,5-33 millones de casos de enfermedad en hombre• hasta 9.000 muertes al año• Más de 40 diferentes patógenos• Seis de ellos – Salmonella spp. – Campylobacter spp. – Escherichia coli – Clostridium perfringens – Staphylococcus aureus – Listeria monocytogenes • El coste conjunto de estos seis es de $2.9-$6.7 miles de millones• Aspectos beneficiosos – Transformación (conversión) de alimentos – Influencia positiva en aspectos de la salud: probióticos • Suplementos microbianos alimenticios destinados a mejorar la salud del consumidor • Mercado mundial de los probióticos – Depuración de aguas residuales – Eliminación de sabores y olores anormales – Obtención de compuestos útiles – Herramientas para el análisis de alimentos Importancia de la calidad microbiológica de los alimentos• Concienciación del consumidor, de la Administración (costes)• Escándalos alimentarios• Incremento objetivo del número de casos de enfermedades de transmisión alimentaria• Factores colaterales – Cambios en los sistemas de producción • Elevada presión por conseguir altos rendimientos • Agricultura, ganadería “orgánica” – Aumento en el comercio internacional Cambio en los procedimientos de inspección y control • – Aparición de nuevos productos 3
  • 4. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Alimentos en nuevos envases, nuevas formulaciones Comida étnica • – Existencia de grupos de riesgo • Ancianos, deportistas, inmunosuprimidos, embarazadas – Malos hábitos en la cocina – Percepción del riesgo Tema. Microorganismos asociados con los alimentos.• Microorganismos asociados con los alimentos.• Bacterias• Mohos• Levaduras• Virus• Algas• Protozoos• Origen de la contaminación microbiana de los alimentos• Contaminación cruzada• Bacterias – Gram-negativos, aerobias/microaerófilas, móviles, helicoidales, vibrioides • Campylobacter – Gram-negativos, Bacilos, cocos y cocobacilos aerobios Pseudomonas, Moraxella, Psychrobacter, Xanthomonas, Halobacterium y • Halococcus, Acetobacter, Flavobacterium y Alcaligenes, Brucella, Alteromonas, Gluconobacter, Acinetobacter – Bacilos Gram-negativos anaerobios facultativos • Enterobacterias: Escherichia, Salmonella, Shigella, Yersinia, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Erwinia, Serratia, Hafnia, Edwarsiella, Proteus Vibrionáceas: Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas • – Cocos Gram-positivos Micrococcus, Kocuria, Staphylococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, • Aerococcus – Cocos y Bacilos Gram-positivos formadores de esporas • Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum – Bacilos Gram-positivos no esporulados, regulares Lactobacillus, Lactococcus, Carnobacterium, Bifidobacterium, Listeria, • Brochothrix, Kurthia – Bacilos Gram-positivos no esporulados, irregulares Brevibacterium, Propionibacterium, Microbacterium, Corynebacterium, • Arthrobacter – Micobacterias – Actinomicetos – Rickettsias y clamidias• Mohos 4
  • 5. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Zygomycetes • Mucor, Rhizopus, Thamnidium – Ascomycetes Byssochlamys, Claviceps, Neurospora • – Deuteromycetes • Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Cladosporium, Fusarium, Geotrichum, Penicillium, Sporotrichum• Levaduras – Ascomycetes • Saccharomyces, Debaromyces, Hansenula, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces – Deuteromycetes • Torulopsis, Brettanomyces, Candida, Cryptococcus, Kloeckera, Rhodotorula, Trichosporum• Virus – Intestinales – Bacteriófagos – Fúngicos• Algas• Protozoos• Priones Origen de la contaminación microbiana de los alimentos• Suelo: – Esporulados, Gram-negativos, mohos y levaduras, streptomyces• Agua: – Bacterias acuáticas. la mayoría Gram-negativos: Pseudomonas, Flavobacterium, Cytophaga, • Acinetobacter. Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio. Gram-positivos: Micrococcus y Bacillus. – Bacterias del suelo y aire arrastradas por la lluvia. – Aguas residuales: enterobacterias, virus, Str. faecalis, Cl. perfringens, protozoos (Cryptosporidium)• Aire: – Esporos Gram-positivos, bacterias Gram-negativas• Piensos y fertilizantes, estiércol: – Vehículo de patógenos• Plantas: – Gram-positivos, Gram-negativos, mohos y levaduras• Animales: Piel, tracto respiratorio e intestinal• Hombre: manipuladores• Equipo: muy variable• Ingredientes: p. ej. especias• Otros alimentos: contaminación cruzada• Material de envasado y empaquetado 5
  • 6. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León Importancia del origen de la contaminación y las vías• Contaminación cruzada• Elementos que participan en la contaminación cruzada Tema. Alteración microbiana de los alimentos• Definición, causas y factores de los que depende la alteración microbiana• Acción sobre los hidratos de carbono, lípidos y proteínas• Otras alteraciones microbianas• Diferencia entre asociación microbiana y sucesión microbiana• Definición• Causas de la alteración de los alimentos – Bióticas • Microorganismos • Insectos y roedores • Enzimas – Abióticas • Cambios químicos no enzimáticos • Cambios físicos• Factores de los que depende la alteración microbiana – Composición del alimento • Origen vegetal • Origen animal – Tipo y número de microorganismos presentes en el alimento – Parámetros que afectan al crecimiento microbiano • Intrínsecos • Extrínsecos • Del procesado • Implícitos Acción microbiana sobre los hidratos de carbono, lípidos y proteínas• Hidratos de carbono – Polisacáridos • Pectina • Almidón • Glucógeno Celulosa • – Monosacáridos • Glucosa->ac. Pirúvico• Lípidos – Degradación hidrolítica – Degradación oxidativa• Proteínas y otros compuestos nitrogenados 6
  • 7. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Proteínas – Dipéptidos – Aminoácidos • Su vía de degradación depende del tipo de microorganismos presentes, tipo de aminoácido, temperatura, O2 disponible e inhibidores • Mecanismos: Desaminación, decarboxilación, oxidación/reducción Otras alteraciones microbianas• Modificaciones en el aspecto – Presencia de células – Limosidad y viscosidad – Color• Otras alteraciones – Degradación de aditivos Asociación microbiana alterante• Asociación microbiana alterante• Clasificación por grupos – fisiológicos psicrotrofos, termodúricos, halófilos, esporulados, osmófilos, pectinolíticos, • acidificantes, proteolíticos, lipolíticos – taxonómicos• Diferencia entre – Asociación microbiana: composición microbiana de un alimento en un momento dado (p.ej. asociación • microbiana alterante) – Sucesión microbiana: • cambios que tienen lugar en las poblaciones microbianas durante el procesado del alimentos Tema. Factores que afectan a la supervivencia y multiplicación de los microorganismos en los alimentos• Factores intrínsecos: actividad de agua (aw), pH y capacidad tampón, Compuestos microbianos naturales, estructuras biológicas, Eh, Contenido en nutrientes• Factores extrínsecos: Temperatura (refrigeración, congelación), Humedad relativa, Concentración de gases en el ambiente• Factores asociados a los tratamientos tecnológicos: Tratamiento térmico, Irradiación, Conservadores químicos, Pascalización, Termomanosonicación• Factores implícitos: Velocidad de crecimiento, Influencias mutuas entre especies: sinergismos, antagonismos Actividad de agua• Importancia del agua• aw=P/P0=HRE/100 • P=Presión parcial del agua de la atmósfera en equilibrio con el sustrato • P0=Presión parcial de la atmósfera en equilibrio con el agua pura a la misma 7
  • 8. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León temperatura• Recursos de la célula – con aw reducida – con aw elevada• Microorganismos – halófilos-halotolerantes – osmófilos-osmotolerantes – xerófilos-xerotolerantes• Factores que influyen sobre la aw en alimentos – solutos en disolución – Fuerzas de capilaridad – Porción del agua total presente ligada a lugares específicos polares en el alimento• Rangos de Aw de diversos alimentos• Influencia sobre el crecimiento microbiano – Fases de la curva de crecimiento: latencia, de crecimiento logarítmico, estacionaria o de reposo, de decadencia o muerte• Influencia sobre la supervivencia – Depende de la temperatura: Tª de refrigeración, ambiente, TT.• Tratamientos tecnológicos que modifican la aw – Desecación, deshidratación – Liofilización – Adición de solutos – Concentración• Rangos de aw – 1-0.95 – 0.95-0.90 – 0.90-0.80 – 0.80-0.60 – <0.60• Velocidades de reacción en alimentos en función de la aw• Utilización conjunta de otros factores en conservación pH• Diferencias entre pH, acidez, capacidad tampón – pH • - log [H+] – Acidez Medida indirecta de la cc de iones H+: por valoración ácido-base • – Capacidad tampón • parámetro que mide la capacidad de un alimento de aceptar un ácido sin modificación del pH• Propiedades del pH y la acidez• Medida del pH y la acidez 8
  • 9. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Tipos de ácidos – fuertes • Acidifican el medio externo y menos el interno • Al mismo pH, tienen menor efecto que los débiles • Poco uso en alimentos – débiles • difusión del ácido no disociado (lipófilo) • alteración funcionamiento membrana • acidificación del medio interno tras ionización • gasto energético para mantener pH interno• Influencia del pH – Mecanismo – sobre el crecimiento • Rangos normales Microorganismos excepcionales • – la supervivencia • Mayor inactivación en alimentos ácidos • Variación depende del tipo de ácido • Existen sinergias con otros factores• Selección de la flora según el pH – pH > 5.6 Alteración por Gram negativos – pH > 4.0 Lactobacilos – pH < 4.0 Mohos y levaduras• Tratamientos tecnológicos – Fermentación – Acidificación• Consideraciones en alimentos tratados térmicamente • pH > 4.5. Permite el crecimiento de Cl. botulinum Tema. Factores intrínsecos (continuación)• Constituyentes naturales antimicrobianos• Potencial de óxido-reducción• Contenido en nutrientes• Estructuras biológicas Constituyentes naturales antimicrobianos•• Actúan sobre • la célula completa • su pared o membrana celular • mecanismo genético • sistemas enzimáticos • secuestrando nutrientes esenciales• Productos 9
  • 10. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Huevo • Lisozima • ovomucoide y ovoinhibidor • conalbúmina • Avidina – Leche y productos lácteos • Lisozima • Lactoperoxidasa • Nisina, bacteriocinas (prods. lácteos) • Ac. grasos libres • Inmunoglobulinas • Lactoferrina • N-acetyl-ß-d-glucosaminidase – Tejidos animales – Productos vegetales • compuestos en especias Potencial de óxido-reducción• Eh: medida de la capacidad de un sistema para ceder o captar electrones – Oxidante + H+ + e- Reductor + – Eh = Eh0 + (RT/nF) Ln ([oxidante][H ]/[reductor])• Su valor en alimentos depende de: – Composición química: pares redox presentes – pH – Presión de O2 en la atmósfera, acceso del alimento al O2 – Actividad metabólica propia del alimento – Actividad microbiana• Efectos del Eh sobre los microorganismos – Microorganismos aerobios estrictos – Microorganismos anaerobios facultativos – Microorganismos anaerobios obligados – Microaerófilos• Empleo del potencial redox en el control de los microorganismos de los alimentos Contenido en nutrientes• Necesidades microbianas – Energía • Carbohidratos • Grasas • Prótidos – Componentes estructurales • Alimentos fuente de nitrógeno • Alimentos fuente de carbono – Otros: vitaminas, minerales 10
  • 11. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• A tener en cuenta: – Casi todos los alimentos proporcionan los nutrientes necesarios para la mayoría de los microorganismos – Algunos alimentos están estructurados nutricionalmente – Existen microorganismos con necesidades específicas – Algunos tratamientos reducen el contenido en vitaminas Estructuras biológicas• piel de frutas, vaina, cutículas, testa de semillas, cáscaras, fascias – Formado por moléculas resistentes a la degradación – Poseen aw reducida – Poseen antimicrobianos (ácidos grasos de cadena corta, aceites esenciales) – Los cortes, golpes, son puertas de entrada a la invasión bacteriana Tema. Factores extrínsecos.• Temperatura de conservación• Humedad relativa del ambiente• Concentración de gases en la atmósfera Temperatura de conservación• Refrigeración y congelación• Tipos de microorganismos según su temperatura óptima de crecimiento – Psicrófilo – Psicrotrofo – Mesófilo – Termófilo Refrigeración• Efectos de la refrigeración y del almacenamiento a refrigeración sobre los microorganismos – Enlentecimiento del crecimiento microbiano • Aumento de la fase de latencia • Reducción en el ritmo de crecimiento (tiempo de generación) – Selección de parte de la flora – Shock por frío – Modificaciones en microorganismos • Morfológicas • de composición • fisiológicas• Resultado final del empleo de tª de refrigeración – Incremento de la vida útil de los alimentos – Detención del crecimiento de la mayor parte de patógenos – Reducción paulatina del nº microorganismos en alimentos funcionales• Aspectos a considerar – Importancia del control de la Tª (mantenimiento de la cadena del frío) – Importancia del nº inicial de microorganismos 11
  • 12. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Mantenimiento de las características organolépticas – Patógenos psicrotrofos Congelación• Efectos de la congelación – Distinta sensibilidad • Gram-negativos > Gram-positivos Más complejidad-mayor sensibilidad • – Efecto mecánico: muerte, daño subletal lethal effects = effects which kill sublethal effects = effects which may be lethal, but from which microorganism may potentially recover – Microorganismos y metabolitos no sensibles • Esporos, toxinas bacterianas, enzimas• Etapas del proceso – Congelación – Almacenamiento (-20ºC/-40ºC) – Descongelación Humedad relativa del ambiente• Intercambio de agua depende de – naturaleza del alimento – Gradiente entre aw y HR – Temperatura – Velocidad del aire• Importante: – Cambios de ambiente bruscos (modificación de condiciones): deshidratación, condensación de agua Concentración de gases en la atmósfera• Sistemas de cambio de la concentración de gases – Almacenamiento en atmósferas controladas – Almacenamiento en atmósferas modificadas – Envasado a vacío – Envasado “inteligente”• CO2 – Utilización en atmósferas modificadas y atmósferas controladas – Efecto bacteriostático. Muy sensibles: Gram-negativos, mohos. Algo resistentes: Gram- positivos (lactobacilos), algunas levaduras (Brettanomyces) – Inhibición debida a: • descenso del pH por disolución del CO2-> Ac. carbónico (CO3H2->iones carbonato y protones) • Actuación como ácidos lipófilos débiles • Interferencia en actuación de enzimas decarboxilasas • Reacción con grupos amino de proteínas, modificando sus propiedades y actividad – Depende su efecto de: 12
  • 13. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • anaerobiosis-aerobiosis • pH • Temperatura (aumenta la solubilidad a Tª baja)• Empleo industrial• CO (monóxido de carbono) Tema. Factores asociados a los tratamientos tecnológicos.• Tratamiento térmico• Radiaciones• Pascalización• Otros procesos Tratamiento térmico• Fundamento – Daño en moléculas blanco • DNA, mecanismos de germinación de esporas, otros (membrana, ribosomas, RNA), proteínas• Cinética de termodestrucción logarítmica – Valores D y z, F0• Cálculo de los tratamientos térmicos• Factores que afectan a la termorresistencia – Factores propios del microoorganismo • Especie, forma (vegetativa, esporulada) – Historia anterior del microorganismo • Edad • Fase de crecimiento • Temperatura de crecimiento Medio de crecimiento • – Ambiente durante el tratamiento • pH • aw • Presencia de azúcares, grasa, proteínas • Sales • Antimicrobianos: antibióticos, sulfitos, nitritos, agua oxigenada, ácidos orgánicos • Intensidad del tratamiento• Termorresistencia de los distintos microorganismos – Forma vegetativa-forma esporulada – psicrófilos-mesófilos-termófilos – Microorganismos con resistencia especial • Termodúricos • Mohos • Esporos • Patógenos • Alterantes 13
  • 14. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Enzimas• Empleo de los tratamientos térmicos en el control de los microorganismos de los alimentos – Importancia de la higiene en la obtención, elaboración – Utilización conjunta de otros factores (ambiente durante el tratamiento) – Mantenimiento de alimentos a Tª elevada (escaldado, precocinado) – Tratamiento térmico de pasterización: Tª<100ºC (60-80) • Objetivo sanitario • Incremento de la vida útil • Objetivo tecnológico – Tratamiento térmico de esterilización: Tª 115ºC-120ºC o superiores • Eliminación de patógenos • Eliminación de alterantes • Obtención de la esterilidad comercial – Empleo conjunto con otros factores Radiaciones• Espectro electromagnético – Radiofrecuencia – Microondas – Infrarrojo – Visible – Ultravioleta – Rayos X y Rayos gamma• Energía – E=hv (h, kte; v, frecuencia)• Microondas – baja frecuencia, alta long. onda – Sistema de calentamiento• Ultravioleta – Poder antimicrobiano: lambda=260 nm – Daños en ácidos nucleicos – Cinética de destrucción logarítmica – G-<G+=lev<esporas b<esporas mohos<virus – Penetración escasa – Limitado a higienización de superficies y aire – Efectos colaterales • productor de ozono (oxidante de grasas) • Irritación ocular• Radiaciones ionizantes – Tipos • Rayos alfa • Electrones de elevada energía (partículas beta) 14
  • 15. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Rayos gamma – Efecto sobre los microorganismos • Muerte de la célula (alteración de la estructura celular y AN) • Lesiones subletales • Mutaciones – Factores que afectan la sensibilidad de los microorganismos • Energía de la radiación • Temperatura • Presencia de Oxígeno en el medio • Contenido en agua • Sustrato • Fase de crecimiento • Tipo de microorganismo – Utilización de las radiaciones ionizantes • Radapertización: Nivel de esterilización (10-50 KGy) • Radurización: Nivel de pasteurización (1-5 KGy) • Radicidación: Nivel de higienización (parásitos, bacterias patógenas) (0,1-8 KGy) – Problemas • Modificación de las características sensoriales, valor nutritivo • Formación de radicales libres • Mutaciones microbianas • Control de los tratamientos (seguridad). • Detección de alimentos irradiados • etiquetado • consumidores • economía – Empleo • Aprobado por FDA, WHO, FAO • Real decreto 348/2001, de 4 de abril, por el que se regula la elaboración, comercialización e importación de productos alimenticios e ingredientes alimentarios tratados con radiaciones ionizantes. – Otras aplicaciones • Inhibición de brotes en bulbos, tubérculos • Retraso de la maduración • Descontaminación de especias • Eliminación de parásitos • Eliminación de insectos Radiación gamma (isótopos radiactivos)• Inconvenientes – Instalaciones – Desechos – control de dosis 15
  • 16. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Ventajas Pasteurización electrónica• Características• Ventajas – evita la recontaminación (producto envasado) – la fuente puede ser apagada/encendida – no hay productos radiactivos – no requiere protección – control• Inconvenientes – Producto en capas finas Pasteurización mediante Rayos-X (pulsos de Rayos X)• Tecnología similar a instalaciones de Rayos X• “Bremsstrahlung”: haces de electrones frenados por una placa de oro• Escasas plantas de procesado• Ventajas – permite el tratamiento de productos irregulares – evita la recontaminación (producto envasado) – la fuente puede ser apagada/encendidano hay productos radiactivosDesventajas – requiere protección Pascalización• Actuación sobre: – enlaces no covalentes • iónicos • puentes de hidrógeno • interacciones hidrofóbicas – Moléculas • proteínas • algunas macromoléculas (almidón) ácidos grasos de la membrana celular • – Tipos de microorganismos • Levaduras, mohos, células vegetativas• Aplicación comercial – Presiones de 4000-6500 atm. (400-650 MPa) – Reducciones de 3-4 ul (higienización) – Productos • ácidos – Combinaciones de tratamientos • pH, Tª Otros procesos• Pulsos eléctricos de alta intensidad 16
  • 17. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Aplicación comercial • Elsteril: tratamiento continuo de alimentos líquidos (higienización) – Fundamento rotura dieléctrica de la membrana (por polarización) • – Sensibilidad • Esporos, enzimas: insensibles • Más sensibles: Levaduras>Gram - negativas> Gram - positivas• Termomanosonicación – Aplicación conjunta de presión, Tª elevada y ultrasonidos – Fundamento • Ultrasonidos en medio líquido: ciclos alternativos de compresión/expansión, generando burbujas que cavitan • Bajo presión y a Tª elevada, el efecto destructor en la burbuja es mucho mayor• Calentamiento óhmico – Proceso – Inconvenientes• Pulsos de luz “blanca” – Pulsos de luz blanca (desde uv hasta IR) – Alta energía (hasta 50 J/cm2) – Aplicación: • esterilización de superficies, envases – Ventajas • Evita el uso de agentes químicos – Mecanismo de acción • similar a luz uv• Campos magnéticos oscilantes – Bien estáticos u oscilantes – En estado experimental – Inactivación microbiana: • se piensa por rotura de enlaces iónicos • reducciones de al menos 2 ulog Conservadores químicos antimicrobianos• Propiedades ideales – Ausencia de toxicidad (comprobación de IDA max) – Fácil de aplicar – No modificación de propiedades sensoriales – No neutralizable – Espectro antimicrobiano amplio – No provocar resistencias – Microbicida mejor que microestático – Económico• Clasificación 17
  • 18. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Acidos orgánicos y sus sales • Acido acético y sus sales • Acido benzoico • Ácidos cítrico y láctico • Acido p-hidroxibenzoico • Ácido propiónico • Ácido sórbico y sus sales Utilización de los ácidos orgánicos para el control de los microorganismos en los • alimentos – Sales del curado y sustancias relacionadas • ClNa • Nitritos y nitratos • Sustancias del ahumado • Ascorbatos • Fosfatos Delta-glucono-lactona • – Antibióticos • Natamicina (piramicina) • Nisina – Gases • CO2 • SO2 (dióxido de azufre y sus sales: sulfito, bisulfito, metabisulfito) • Oxido de etileno • Oxido de propileno • Ozono – Otros • Peróxido de hidrógeno • Percarbonato sódico • Acido bórico • Dietilpirocarbonato • Acido salicílico • Lisozima Tema. Factores implícitos• Características del crecimiento: velocidad• Influencias mutuas entre especies – Sinergismos. Por actuar sobre • Nutrientes • PH • Eh • Aw • Estructuras biológicas • Sustancias antimicrobianas 18
  • 19. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Antagonismos. Por actuar sobre • Nutrientes • pH • Eh • Aw • Sustancias antimicrobianas • Lisis por bacteriófagos• Consecuencias de sinergismos y antagonismos – Indeseables – Beneficiosas Tema. Microbiología predictiva• Definiciones, objetivos• Modelos cinéticos de crecimiento y de destrucción microbiana• Aplicaciones• Desarrollo de modelos matemáticos de crecimiento y destrucción microbiana Definiciones, objetivos• Definición – Consiste en el desarrollo y uso de fórmulas o modelos matemáticos (empíricos o mecanísticos) que describen/estiman los cambios cualitativos y/o cuantitativos que suceden en poblaciones microbianas bajo condiciones definidas (Walker & Jones, 1991)• Objetivos concretos – Describir el fenómeno matemáticamente – Predecir la respuesta del sistema en condiciones no probadas – Simular y optimizar procesos• Curvas de crecimiento y destrucción microbianas – Ritmo de crecimiento o tiempo de generación – Duración de la fase de latencia – Tiempo en alcanzar un determinado nº de células – Valores D y z• Factores que afectan al crecimiento o destrucción microbianos – Parámetros intrínsecos, extrínsecos, Efectos del tratamiento, Efectos implícitos Modelos cinéticos de crecimiento, de inactivación y de destrucción microbiana• Modelos cinéticos – Modelos cinéticos de crecimiento • Gompertz: log (n) = A + C exp(-exp (-b(t-M))) Logística: log (n) = A + C / (1 + exp(-b(t-M))) • – Modelos cinéticos de inactivación microbiana • Ecuaciones bifásicas • Modificaciones de la ecuación de Gompertz• Modelos combinados – Modelos combinados basados en la cinética microbiana 19
  • 20. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Ecuación lineal de Arrhenius • Modelo de Schoolfield • Modelo de la raíz cuadrada • Modelos polinomiales – Modelos de probabilidades• Modelos dinámicos Aplicaciones• Predicción de la vida útil – http://www.dfu.min.dk/micro/ssp (Seafood Spoilage Predictor (SSP) software, Danish Institute for Fisheries Research)• Diseño de nuevos alimentos: valoración de riesgos microbiológicos – http://www.arserrc.gov/mfs/pathogen.htm (Pathogen Modeling Program version 5.1, Microbial Food Safety Research Unit, USDA)• Empleo en esquemas de control de calidad microbiológica: APPCC – análisis de peligros – identificación de puntos críticos – establecimiento de límites en estos puntos críticos – planificación de acciones correctoras cuando las condiciones de procesado se modifican Desarrollo de modelos matemáticos de crecimiento y destrucción microbiana• Diseño experimental – Define los objetivos • Microorganismo • Variable a modelizar • Factores Rango y niveles de los factores • – Establece el diseño matemático adecuado• Observación/recogida de datos• Caracterización de la curva• Modelización – Estabilización de la varianza – Elevada correlación – Simplicidad• Validación• Predicción Tema. Cultivos iniciadores• Introducción• Conservación, control y preparación de los cultivos• Géneros microbianos utilizados• Actuación de los cultivos iniciadores en productos lácteos• Actuación de los cultivos iniciadores en productos cárnicos 20
  • 21. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León Introducción• Qué es un cultivo iniciador? • Son microorganismos seleccionados que influyen positivamente sobre la fermentación y maduración de los alimentos. Se utilizan para controlar los procesos mencionados y reprimir la flora acompañante indeseable, asegurando la salubridad y calidad del producto final• Grupos de bacterias empleadas como cultivos iniciadores – Bacterias acidolácticas, micrococáceas, levaduras y mohos• Tipos de alimentos fermentados – Productos lácteos (yogur, leches fermentadas, queso) – Productos cárnicos (embutidos) – Derivados de la pesca (tiburón, sushi) – Productos vegetales (col, pepinillos, aceitunas) – Otros: bebidas (cerveza, vinagre, vino), productos de panadería• Evolución – aspectos empíricos – científicamente: aislamiento, identificación, estudio y caracterización bioquímica, fisiológica, genética, manipulación, protección (patentes) Conservación, control y preparación de los cultivos• Conservación – Cultivos iniciadores líquidos – Deshidratados – Congelados• Prevención de la inhibición – Antibióticos – Bacteriófagos – Residuos detergentes y desinfectantes – Otros Inhibidores• Preparación de los cultivos iniciadores para su empleo – Sistemas protegidos mecánicamente – Método PRM/PIM Microorganismos responsables de los procesos fermentativos• Productos lácteos: – Queso (BAL+Mohos). – Yoghourt (Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus). – Leches fermentadas. Además, levaduras, mohos. – Bacterias lácticas • Lactococcus lactis, Lc. garviae, Lc. plantarum, Lc. piscium y Lc. raffinolactis • Leuconostoc lactis, L. oenos, L. paramesenteroides, L. citrum, L. amelibiosum, L. gelidum, L. carnosum • Streptococcus thermophilus • Enterococcus faecalis y Ent. faecium 21
  • 22. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus, Lb. delbrueckii spp. lactis, Lb. acidophilus y Lb. Helveticus, L. casei, L. acidophilus • Bifidobacterium longum, B. infantis, B. bifidum, B. breve – Mohos • Penicillium roqueforti, P. camemberti – Levaduras • Candida kefir• Productos cárnicos (embutidos) – Bacterias acidolácticas Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus plantarum, • Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sake, Lact. pentosus, Lact. fermentum, Lact. brevis – Micrococáceas y estafilococáceas • Kocuria varians, Staphylococcus xylosus, S. carnosus – Levaduras • Debaromyces hansenii (Candida famata) – Mohos • Penicillium nalgiovensis, P. camemberti, P. chrysogenum, Streptomyces griseus• Productos vegetales – Bacterias acidolácticas • Leuconostoc mesenteroides, Lact. brevis. Pediococcus acidolactis, Lact. plantarum• Derivados de la pesca• Pan. Vino, sidra, cerveza – Levaduras • Saccharomyces cerevisiae...• Vinagre – Levaduras, Acetobacter y Gluconobacter Clasificación de las bacterias ácido-lácticas (BAL)• Homofermentativos – Lact. bulgaricus, Lact. helveticus – Str. thermophilus• Heterofermentativos – facultativos: Lact. plantarum, Lact. casei, Lact. sake – obligados: Leuconostoc, Lact. brevis, Lact. fermentum, Lact. Kefir• Termófilos – L. bulgaricus, Str. thermophilus• Mesófilos – Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris Actuación de los cultivos iniciadores en productos lácteos• Actuación sobre las proteínas y lípidos – Proteolisis y Lipólisis por producción de enzimas proteolíticas y lipolíticas – Producción de ácidos grasos volátiles y CO2 22
  • 23. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Contribución a los procesos madurativos • Contribución al aroma • Ojos en queso • Aumento en digestibilidad y valor nutritivo• Efecto sobre la lactosa – Producción de ácido láctico->Descenso del pH • Inhibición de patógenos • Coagulación proteínas lácteas • Cambios en la textura • Aumento en digestibilidad y valor nutritivo (intolerancia a la lactosa) – Producción de otros compuestos: ácidos, alcoholes • Contribución al sabor y aroma • Inhibición de patógenos• Producción de otros compuestos – Producción de compuestos antimicrobianos: ácidos orgánicos, H2O2, bacteriocinas, nisina – Efecto inhibidor sobre patógenos y competidores• Competición por nutrientes • Efecto inhibidor sobre patógenos y competidores• Reducción del potencial redox Actuación de los cultivos iniciadores en productos cárnicos• Actuación sobre las proteínas y lípidos – Proteolisis y lipólisis por producción de enzimas proteolíticas y lipolíticas – Producción de ácidos grasos volátiles y CO2• Efecto sobre los azúcares añadidos – Producción de ácido láctico->Descenso del pH – Producción de otros compuestos: ácidos, alcoholes • Cambios en la textura • Contribución al sabor y aroma • Inhibición de patógenos• Producción de compuestos antimicrobianos – Producción de ácidos orgánicos, H2O2, bacteriocinas, nisina • Efecto inhibidor sobre patógenos y competidores• Competición por nutrientes• Reducción del potencial redox• Reducción progresiva de las sales del curado – Formación de nitritos, óxido nitroso • Inhibición de C. botulinum • Cambios organolépticos (aroma sabor, color)• Contribución a desecación progresiva• Contribución al aspecto externo Tema. Probióticos, prebióticos y simbióticos• Definiciones. 23
  • 24. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Requisitos para que una bacteria sea considerada probiótica• Propiedades de los microorganismos empleados como probióticos: Bifidobacterias, Lactobacillus acidophilus, L. casei Definiciones• Probióticos – Suplementos alimenticios microbianos. Mejoran el balance microbiano del hospedador• Prebióticos – Ingredientes alimentarios no digeribles (fructooligosacáridos). Estimulan la actividad de las especies bacterianas residentes en el colon• Simbióticos – Combinación de probióticos y prebióticos. Mejoran la supervivencia del suplemento microbiano en el tracto gastrointestinal, estimulando selectivamente el crecimiento o activando el metabolismo microbiano• Alimentos funcionales – Un alimento es funcional si sus componentes (que pueden ser o no nutritivos) tienen un efecto sobre una o varias funciones del organismo originando un efecto positivo sobre la salud. (International Life Science Institute). Requisitos para que una bacteria sea considerada probiótica• Efectos beneficiosos sobre la salud – Reducción de la intolerancia a la lactosa. – Efecto protector ante infecciones y estimulación del sistema inmune – Reducción del riesgo de cáncer de colon.• Supervivencia en condiciones medioambientales en el lugar donde debe ser activo – pH ácido – Sales biliares• Adhesión a la pared intestinal• Proliferación y/o colonización en el lugar donde actúa• Otros – Ausencia de reacción inmune contra la cepa probiótica – Ausencia de reacción patogénica, tóxica, alérgica, mutagénica o carcinogénica causada por la cepa probiótica, sus productos de fermentación o sus componentes celulares tras la muerte de la bacteria – Estable genéticamente, sin transferencia de plásmidos – Producción fácil y reproducible – Viable durante procesado y almacenamiento Propiedades de los microorganismos usados como prebióticos: Bifidobacterias• Taxonomía cambiante – Cercano a Lactobacillaceae – Especies: B. longum, B. infantis, B. bifidum, B. breve• Requisitos principales de los probióticos – Tránsito en el estómago e intestino – Adhesión y colonización 24
  • 25. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – % supervivencia (30%)• Efectos sobre la flora intestinal – Disminuye los números de clostridia, bacteroides y coliformes – Posiblemente por producción de ácido• Efectos fisiologicos – Reducción del pH – Reducción del tiempo de tránsito – Reducción de la actividad enzimática • glucuronidasa • nitroreductasa – Efectos inmunológicos • Incrementa la producción de IgA (in vitro) Lactobacillus acidophilus• Características – Homofermentativo – Hábitat: Tracto gastrointestinal de hombre, productos lácteos – Grupo acidófilo: compuesto de 6 especies – Crecimiento lento. Baja resistencia al ácido!!• Principales requisitos de los probióticos – Capaz de resistir el tránsito estomacal (pH=1.5) – Capaz de resistir el tránsito intestinal (Bilis cc=2%) – % supervivencia 20% – Buena adherencia a células Caco-2 (in vitro)• Propiedades de promoción de la salud – Promueve el crecimiento – Ayuda a digestión de la lactosa – Aumenta digestión de minerales – Contiene factores anticarcinogénicos (colon) – Estimula respuesta del sistema immunológico (citokinas, IgA, B cells) – Estimula reducción del colesterol en suero sanguíneo – Produce factores antimicrobianos Lactobacillus casei• Características – Presente en numerosos productos (leche fermentada, quesos, productos cárnicos, y tracto gastrointestinal – Compuesto de 4 especies: L. casei, L. paracasei (2 subsp) y L. rhamnosus – Heterofermentativo facultativo• Requisitos principales de los probióticos – Resistencia media al pH (3-7) y bilis – % supervivencia (5-10%) – Capacidad de adhesión: no está clara – Algunos informes de aislamientos de muestras clínicas 25
  • 26. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Propiedades promotoras de la salud – Efectos clínicos sobre la diarrea – Efectos sobre el balance intestinal – Reducción de niveles enzimáticos: glucuronidasa, nitroreductasa – efectos inmunomoduladores 26
  • 27. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León Tema. Aspectos generales sobre el trabajo en el laboratorio de Microbiología de los alimentos• Seguridad en el laboratorio de microbiología de los alimentos• Diseño y necesidades de un laboratorio• Principios de las buenas prácticas de laboratorio• Principios que informan la elección de medios de cultivo en Microbiología de los alimentos• Clasificación de los medios de cultivo• Etapas en la preparación de los medios de cultivo (medios deshidratados)• Técnicas de separación de cultivos mezclados Seguridad en el laboratorio de microbiología de los alimentos• 1. Clasificación de los microorganismos en función del riesgo que suponen – Grupo de Riesgo I Bajo o escaso riesgo individual y colectivo. Leuconostoc, Micrococcus (Kocuria), • Moraxella, Brochothrix, Botrytis, Penicillium – Grupo de Riesgo II Riesgo individual moderado, riesgo colectivo limitado. Erysipelothrix, Vibrio • parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Shigella. – Grupo de Riesgo III Riesgo individual elevado, riesgo colectivo bajo. Clostridium botulinum, Salmonella • typhi, S. paratyphi – Grupo de Riesgo IV • Riesgo individual elevado, riesgo colectivo elevado. Virus• 2. Vías de infección – Digestiva Pipetear, fumar, comer • – Respiratoria • inhalación de aerosoles – Cutánea • pinchazos, cortes y abrasiones de la piel – Conjuntival • salpicaduras que acceden a los ojos• 3. Prevención de las infecciones adquiridas en el laboratorio – Barreras primarias • en torno a los microorganismos, para evitar su dispersión en el laboratorio – Barreras secundarias • en torno al personal para que le protejan si fallan las primarias – Barreras terciarias • en torno al laboratorio, previenen la dispersión a la comunidad cuando fallan las barreras primaria y secundaria Diseño y necesidades de un laboratorio – Locales 27
  • 28. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Almacén • cocina para la preparación de medios de cultivo • sala de siembra • lavadero para descontaminar el material, lavar, esterilizar y preparar todo excepto medios de cultivo • sala con equipamiento especial • zona administrativa – Personal Formado en BPL • – Instrumental o aparatos Frigorífico, congelador, balanza, estufas de cultivo, peachímetro, agitadores • magnéticos, autoclaves, microscopio, baños de agua, homogeneizador, lupa, equipo de filtración, jarras de anaerobiosis – Otro material, medios de cultivo y reactivos • Colección de microorganismos • Medios de cultivo • Reactivos • Agua destilada o desionizada • mecheros, cuchillos, espátulas, sacabocados, asas de platino, pipetas de vidrio, automáticas, material de vidrio, material de plástico desechable, etc. Calidad en los laboratorios de microbiología de alimentos• Legislación – Directiva 88/320/CEE del Consejo de 9 de junio de 1988 relativa a la inspección y verificación de las buenas prácticas de laboratorio (BPL) – R.D. 2043/1994 de 14 de Octubre, sobre la inspección y verificación de buenas prácticas de laboratorio. – R.D. 822/1993 de 28 de Mayo por el que se establecen los principios de buenas prácticas de laboratorio y su aplicación en la realización de estudios no clínicos sobre sustancias y productos químicos (modificado por el Real Decreto 1369/2000).• Principios de las buenas prácticas de laboratorio – Organización y personal del laboratorio – Programa de Garantía de Calidad – Laboratorio – Aparatos, materiales y reactivos – Sistemas experimentales: análisis y resultados – Sustancias a ensayar y de referencia – Procedimientos Normalizados de Trabajo – Especificaciones y normativas concretas para la realización del estudio – Realización del informe a partir de los resultados del estudio – Archivos: almacenamiento y conservación de registros y materiales• Acreditación de los laboratorios – –www.enac.es (Entidad Nacional de Acreditación) 28
  • 29. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León Principios que informan la elección de medios de cultivo en Microbiología de los alimentos• Requerimientos de los microorganismos – agua, – fuente de nitrógeno (proteínas, aminoácidos, nitrógeno inorgánico), – fuente de energía (carbohidratos, proteínas) – minerales – otros factores de crecimiento (aminoácidos, purinas, pirimidinas, vitaminas)• Características generales de los medios de cultivo – Agua – Agente gelificante (medio sólido) – Fuente de nitrógeno (proteína) – Fuente de energía (azúcar) – Vitaminas, minerales Clasificación de los medios de cultivo• Por su origen: – Naturales – Artificiales• Por su composición: – Empíricos – Sintéticos – Semisintéticos• Por su consistencia: – Líquidos – Sólidos – Semisólidos• Por su aplicación: – Generales – Enriquecidos – Selectivos – Diferenciales – De enriquecimiento – Prerreducidos Etapas en la preparación de los medios de cultivo (medios deshidratados)• Leer instrucciones• Pesar• Disolver en agua destilada• Fundir / Ajuste pH• Esterilizar – 121ºC-15, – 115ºC-10-20 con componentes termosensibles 29
  • 30. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Filtración, con componentes termosensibles: filtros 0,45 microm• Reparto – Placas de Petri, tubos de ensayo• Controles – Control de esterilidad – Control de calidad – Control de selectividad (técnica ecométrica) Técnicas de separación de cultivos mezclados• Siembra por agotamiento (estría) en medio sólido• Enriquecimiento en medio líquido (y siembra posterior en medio sólido) – Empleo de medios electivos – Empleo de medios selectivos – Empleo de medios diferenciales Tema. Metodología de la toma de muestras• Muestreo• Muestras• Preparación y dilución de homogeneizados de alimentos para el análisis microbiológico Muestreo• Objetivos del muestreo – Detectar presencia de patógenos – Evaluar el cumplimiento de las normas microbiológicas – Conocer la vida útil del producto – Conocer el estado higiénico de la industria, local, equipo, manipuladores, etc. – Investigar brotes• Otros aspectos – El análisis microbiológico es destructivo (generalmente) – Procedimientos estériles – Tiempo hasta el análisis – Representatividad – Sistemas aleatorios – Cuántas muestras y cómo debe realizarse – Cantidad – Identificación Muestras• Tipos de muestra – Envasadas – Alimentos líquidos – Sólidos • Pulverulentos • no pulverulentos • profundidad 30
  • 31. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • superficie (Escisión(a), Vehículos inertes(b), Impresión directa(c)) – Muestras de aire• Diferencia entre métodos – Recuperación de células – Muestreo destructivo/no destructivo• Otros aspectos – Posibilidad de diluciones – Expresión de resultados – Microorganismos anaerobios – Cuidados de las muestras antes del análisis • Tiempo • Temperatura • Casos especiales (medios de transporte) – Biofilms en superficies Preparación y dilución de homogeneizados de alimentos para el análisis microbiológico• Homogeneización – Vaso Sorvall – Stomacher• Diluyente – Características – Uso general • Agua de peptona 0,1% • Solución Ringer – Uso especial • Tampón fosfato • Agua destilada • Soluciones para microorganismos osmófilos, anaerobios • Medios con compuestos incorporados (tensoactivos)• Diluciones de factor 10 – Alimentos líquidos – Sólidos pulverulentos – Sólidos no pulverulentos Tema: Recuento de microorganismos de alimentos• Técnicas basadas en la formación de colonias en medio de cultivo sólido• basadas en el recuento directo de células microbianas o en la estimación de la masa celular• basadas en la medición de la actividad metabólica microbiana• basadas en la determinación directa en el alimento de un componente estructural o metabólico de las células microbianas a) Técnicas basadas en la formación de colonias en medio de cultivo sólido• Procedimientos de siembra en la profundidad del medio 31
  • 32. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Recuento estándar en placa – Método del tubo rotatorio – Método de las gotas de agar – Método del asa calibrada – Método de los tubos ovales – Aparato para la siembra en la profundidad del medio: Colworth 2000• Procedimientos de siembra en la superficie del medio – Recuento de siembra por extensión en superficie – Aparato de siembra en espiral en la superficie del medio – Recuento por siembra de gotas en superficie (Drop plate, Miles-Misra)• Procedimientos que utilizan filtros de membrana – Filtración por membrana (procedimiento tradicional) – Método de la rejilla hidrofóbica (Hydrophobic Grid Membrane Filter, Iso-Grid)• Otros procedimientos – Método de las tiras de agar – Método de recuento en placa miniaturizado – Métodos de recuento de microcolonias – Petrifilm, Redigel• Otras automatizaciones – Aparato de siembra por estría en la superficie del medio – Contadores automáticos de colonias. – Preparadores automáticos de medios de cultivo – Diluidores gravimétricos – Diluidores automáticos• Técnica del número más probable (recuento por dilución en tubos) b) Métodos basados en el recuento directo de células microbianas o en la estimación de la masa celular• Recuentos microscópicos – Colorantes clásicos • Método de Breed • Método de Howard – Colorantes fluorescentes • Naranja de acridina • Colorantes específicos – Técnicas • En extensión • Bactoscan • DEFT• Citometría de flujo• Recuentos electrónicos de partículas• Métodos basados en la estimación de la masa celular – Nefelometría 32
  • 33. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Fotometría c) Pruebas basadas en la medición de la actividad metabólica microbiana• Pruebas que miden la actividad metabólica de microorganismos en crecimiento – Pruebas electroquímicas * – Pruebas microcalorimétricas – Pruebas radiométricas – Pruebas cromatográficas – Pruebas fotométricas• Determinación de enzimas microbianas en alimentos – Catalasa – Citocromo c oxidasa – Aminopeptidasa – Termonucleasa• Indicadores de descomposición Pruebas electroquímicas• Reducción de colorantes – Fundamento – Medición – Procedimiento – Tipos de indicadores – Condiciones de su empleo – Utilización en – Ventajas e inconvenientes• Impedancia – Fundamento – Requisitos – Procedimiento – Utilización en – Ventajas e inconvenientes d) Pruebas basadas en la determinación de componentes de las células microbianas• Pruebas de luminiscencia – Quimioluminiscencia • Compuestos porfirínicos – Bioluminiscencia • Fundamento: • ATP + D-Luciferina-luciferasa +MG++ -> AMP + CO2 + Oxiluciferina + Pyrofosfato + luz • Medición del ATP • Niveles de ATP microbiano • Preparación de la muestra 33
  • 34. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Determinación del ATP • Interpretación de los resultados. • Aplicaciones• Prueba del lisado del Limulus – Fundamento – Utilidad e inconvenientes Tema. Clasificación, identificación y tipificación de los microorganismos presentes en los alimentos• Aplicaciones• Definiciones• Metodología• Identificación microbiana por métodos rápidos y automatizados• Métodos de diferenciación de cepas (tipado/tipificación)• Aplicaciones – Microbiología de los alimentos • Alteración, microorganismos beneficiosos, patógenos • Control y garantía de la calidad alimentaria – Epidemiología Investigación de brotes alimentarios • – Taxonomía: Filogenia, evolución, clasificación – Microbiología clínica • Diagnóstico, terapéutica – Microbiología industrial • Screening• Definiciones – Taxonomía – Clasificación: el agrupamiento de individuos en grupos taxonómicos, descritos por un conjunto de propiedades, en base a sus relaciones o similitudes – Identificación: el proceso de asignación de un desconocido a uno de los grupos taxonómicos previamente descritos – Nomenclatura – Tipificación• Metodología – Creación de la base de datos – Aislamiento, purificación – Realización de pruebas (caracterización del desconocido) • Información de tipo fenotípico, quimiotaxonómico y genético – Tratamiento de los datos – Procedimiento de comparación – Claves dicotómicas • Identificación probabilística 34
  • 35. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Taxonomía numérica Identificación microbiana por métodos rápidos y automatizados – Miniaturización de tests bioquímicos y pruebas de sensibilidad a antimicrobianos • Api, Enterotube y oxi-ferm tube, Micro id • Utilización de multiinoculadores Métodos fotométricos: Biolog • – Técnicas radiométricas – Técnicas microcalorimétricas (termogramas) – Técnicas electroquímicas (voltamogramas) – Técnicas cromatográficas: • cromatografía gaseosa de productos volátiles derivados del metabolismo microbiano • cromatografía gaseosa de ácidos grasos bacterianos: MIDI Microbial Identification System • cromatografía de afinidad cromatografía en capa fina para el análisis de metabolitos microbianos • – Técnicas electroforéticas: proteínas bacterianas y enzimas – Pruebas de espectrometría de infrarrojo – Técnicas de pirolisis – Métodos inmunológicos (sig. lección) – Métodos genéticos (sig. lección) Métodos de diferenciación de cepas (Tipado, tipificación)• Método clásico: marcadores fenotípicos – biotipado – serotipado – fagotipado – bacteriocino-tipado• Métodos de tipado molecular – Métodos de análisis de lipopolisacárido o ácidos grasos • Electroforesis del lipopolisacárido en gel SDS (sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide) • Análisis de ácidos grasos libres por GLC – Métodos de análisis de proteínas • Perfiles de proteínas de células enteras y de membrana externa (SDS-page) Multilocus Enzyme Electrophoresis (MEE) • – Métodos inmunológicos (sig. lección) – Métodos genéticos (sig. lección) Tema. Pruebas inmunológicas de utilidad en el análisis microbiológico de los alimentos• Fundamento y utilidad• Técnicas inmunológicas• Utilización de anticuerpos monoclonales en Microbiología de los alimentos 35
  • 36. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Fundamento – Reacción específica entre antígeno y anticuerpo• Utilidad – Detección, identificación, tipificación y cuantificación de microorganismos – Detección y cuantificación de enzimas microbianas y toxinas de origen microbiano Técnicas inmunológicas• Reacciones de precipitación• Reacciones de fijación del complemento• Reacciones de aglutinación-coaglutinación• Técnicas que usan reactivos marcados – luminiscencia – radioinmunoensayo – enzimainmunoensayo • Homogénea: Ag + Ac-Hapteno-Enzima (inactivado) -> Ag-Ac +Hapteno-Enzima (activado) • Heterogénea (ELISA: antígeno o anticuerpo ligado a soporte sólido)• Immunoblotting (western blotting)• Separación inmunomagnética Utilización de anticuerpos monoclonales en Microbiología de los alimentos• Obtención por: – cultivo "in vitro" de linfocitos B productores de anticuerpos y fusión con células de mieloma, produciendo una célula hibrida: hibridoma• Ventajas – especificidad – reproducibilidad – pureza• Utilización – Obtención de anticuerpos específicos para la detección e identificación de microorganismos y metabolitos microbianos Tema. Detección y caracterización de microorganismos en los alimentos mediante técnicas genéticas• Introducción• Herramientas• Procedimientos para la comparación de fragmentos de DNA• Detección mediante técnicas de hibridación de ácidos nucleicos• Secuenciación Introducción• Cómo encontrar diferencias entre fragmentos de DNA bacteriano – Amplificando fragmentos específicos – Rompiendo el cromosoma y separando sus fragmentos 36
  • 37. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Comparando hebras: homologías – Secuenciando los ácidos nucleicos (DNA, RNA) Herramientas• Enzimas de restricción• Programas de ordenador – The science behind sequence matching – Interpreting BLAST search results• Electroforesis• Amplificación del DNA: PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) – Reactivos: • TAQ polimerasa de Thermus aquaticus, nucleótidos, DNA con la región a amplificar, iniciadores o primers – Proceso • Desnaturalización • Hibridación • Elongación – Ventajas e inconvenientes – Variaciones • Nested PCR, Multiplex PCR, real-time PCR, reverse-transcriptase PCR – Empleo• rRNA – 16S rRNA • Moléculas cronógrafas • Mutaciones deletéreas • Subunidad 30S • 1500 pb (560 conservados, 970 variables) • > 16.000 secuencias en bases de datos – 23S • Subunidad 50S • 2900 pb – 5S • Subunidad 50S • 120 pb Procedimientos para la comparación de fragmentos de DNA• PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polimorphism)• RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA), Arbitrarily Primed PCR (AP-PCR)• Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) – Limitaciones del método • Requiere instrumental, técnicos apropiados>24 horas para resultadosRedes epidemiológicas que emplean este método• Ribotipado – Fundamento 37
  • 38. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Ventajas de las sondas de rRNA • Las sondas rRNA son un sistema universal para todas las especies • Gran conservación de secuencias en los genes rRNA Existen copias múltiples de los operones rRNA • Secuencias estables • Se puede usar el rRNA o fragmentos de genes • La comparación de las bandas puede ser automatizadaLimitaciones del método La discriminación depende de la enzima de restricción y de la sonda usada • – Procedimiento• Análisis de plásmidos – Plásmidos – Limitaciones del método • Requiere especies que contengan plásmidos múltiples y diversos • Puede ser difícil calcular el tamaño de los plásmidos La presencia de plásmidos idénticos puede ser resultado de transferencia • horizontal más que relación taxonómica – Plasmid restriction enzyme analysis• Southern blotting – Procedimiento • Restricción del DNA • Electroforesis • Paso a membrana de nitrocelulosa • Hibridación con sonda de DNA marcada Detección de microorganismos en los alimentos mediante hibridación de ácidos nucleicos• Procedimiento – Cultivar microorganismos – Ligar muestra a soporte sólido – Romper células – Calentar – Añadir sonda – lavar – detectar señal • isótopos radiactivos • enzimas • haptenos Secuenciación• Aislamiento del DNA• Reactivos – Iniciador (cebador) de DNA – Transcriptasa – Dideoxidonucleótidos marcados 38
  • 39. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Desoxinucleótidos Tema. Detección y recuento de microorganismos que han sufrido daño subletal. Otros métodos útiles en Microbiología de los alimentos• Importancia de los microorganismos lesionados• Características de los microorganismos lesionados• Efecto de los distintos tratamientos• Detección y recuento de microorganismos lesionados• Otros métodos útiles en Microbiología de los alimentos• Importancia de los microorganismos lesionados en relación con – Elaboración de alimentos – Conservación de alimentos – Salud pública – Criterios y normas – Análisis microbiológico, conservación de cepas• Características de los microorganismos lesionados – Aspectos generales • Disminución de su resistencia a los agentes o compuestos químicos selectivos • Aumento de la fase de latencia • Alteración de la permeabilidad Aumento de los requerimientos nutritivos • – Alteraciones más frecuentes en la célula • pared celular o su síntesis • membrana -> pérdida de solutos y mayor susceptibilidad a inhibidores • proteínas o su síntesis • ribosomas o síntesis del RNA • DNA• Efecto de los distintos tratamientos – Refrigeración • Disminución constante de la viabilidad • Shock del frío • Shock osmótico del frío – Congelación-descongelación • alteraciones metabólicas: medios con ciertos nutrientes • Aumento de la susceptibilidad a agentes tensoactivos (sales biliares) y antibióticos • Pérdida de componentes celulares de bajo y alto peso molecular • Aumento del período de latencia tras la descongelación Aumento de la susceptibilidad a las radiaciones UV • – Otros tratamientos tecnológicos • Rehidratación de alimentos desecados: velocidad y temperatura • Pascalización 39
  • 40. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Irradiación – Otros procesos que pueden lesionar los microorganismos • almacenamiento y manipulación de los alimentos • ciertos ingredientes de los alimentos, con compuestos químicos inhibidores • técnicas empleadas durante el análisis: Homogenización, agar fundido (Tª de 45ºC en medios no selectivos), tiempo en que los microorganismos están en contacto con el diluyente y su temperatura• Detección y recuento de microorganismos lesionados – Aspectos generales • Reparación del daño celular • La Tª óptima de incubación (25-37ºC) y el tiempo (1-4 h) varían con el tipo de estrés • Las células recuperadas responden a agentes selectivos incluidos en los medios • El proceso de reparación del daño precede a la multiplicación celular – Sistemas empleados: • Reparación en medio líquido de células vegetativas • Recuperación en medio sólido de células vegetativas • Otros métodos de recuperación para células vegetativas • Detección de esporos bacterianos lesionados Otros métodos útiles en Microbiología de los alimentos• Detección de sustancias mutágenas – Pruebas para evaluar la carcinogenicidad de las sustancias • Estudios sobre células de seres inferiores a mamífero • Estudios "in vivo" sobre células de mamíferos • Estudios "in vitro" sobre células de mamífero – Sustancias con posible actividad mutagénica en alimentos • microbianas • contaminantes • del procesado o cocinado del alimento • aditivos, coadyuvantes – Test de Ames – Con mutantes de Salmonella typhimurium auxótrofas para histidina (his-) • Test de Ames para detectar zimógenos • Precauciones en la interpretación de los resultados del test de Ames. Otras modificaciones de las cepas utilizadas: Mutación rfa, eliminación parcial • del gen uvrB, introducción del plásmido pKM101 – Otras pruebas con microorganismos • Inductest Escherichia coli K-12 ó de inducción del profago (células lisogénicas de E. coli) • Test de reparación con Bacillus subtilis (esporas)• Determinación de la tasa de crecimiento de un microorganismo – cultivo en medio líquido o suspensión de células lavadas – inocular en Erlenmeyer con 100 ml con Tª de incubación equilibrada (cc 10^4 g/ml) 40
  • 41. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – tomar 1 ml para diluciones decimales -> recuento de viables/turbidez al comienzo del experimento y a intervalos frecuentes – En la fórmula • A: nº inicial de microorganismos • C: nº de ciclos de crecimiento • B: ritmo de crecimiento máximo • M: tiempo al que el crecimiento es máximo• Aislamiento de bacteriófagos activos frente a E. coli. – Enriquecimiento. – Inoculación – Centrifugación – Preparación de cultivos de fago – Mantenimiento• Ensayos microbiológicos de factores de crecimiento • Cuantificación de sustancias en alimentos Base del ensayo microbiológico: el crecimiento de un microorganismo • (Lactobacillus fermentum, Pediococcus cerevisae) es dependiente y proporcional a la cantidad de un factor o nutriente único – Medición del crecimiento • Métodos de difusión • Métodos turbidimétricos • Métodos de dilución en tubo. Para antibióticos • Métodos acidimétricos • Métodos gravimétricos – Dos procedimientos • Método en tubo y Método en placa – Material • Medios de cultivo, medio de mantenimiento, medio para inóculo, medio para análisis, curvas patrón Tema. Principales géneros de mohos y levaduras de interés en Microbiología de los alimentos: recuento e identificación• Mohos• Levaduras Mohos• Importancia de los mohos en microbiología de los alimentos – Alteración de alimentos – Producción de micotoxinas – Fermentación de alimentos – Obtención de enzimas y antibióticos• Estructura – Hifas, micelio, esclerocio• Reproducción 41
  • 42. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Esporas asexuales. Se producen directamente del micelio. • Esporangiosporas • Conidiósporas. Talosporas: Blastosporas, Clamidosporas y Artrosporas • – Esporas sexuales. Formadas tras fusión de 2 células • Oosporas • Zigosporas • Ascosporas • Basidiosporas• Recuento – Método clásico – Siembra de todo el alimento – Muestreo de superficies – Alimentos líquidos – Otras técnicas• Aislamiento – Medios de cultivo: características – Medios generales – Medios selectivos• Identificación – Morfología macro y microscópica – Cultivo en porta en bloque de agar – Método de cultivo en porta de Johnson Levaduras• Importancia de las levaduras en microbiología de los alimentos – Alteración de alimentos – Elaboración de alimentos – Patógenas – Síntesis de compuestos – Fermentaciones industriales – Modelo en el estudio de procesos metabólicos y bioquímicos. – Alimentación• Estructura citológica – Cápsulas – Pared celular – Membrana citoplásmica – Componentes del protoplasma – Núcleo, mitocondrias, vacuolas...• Reproducción – Gemación – Fisión – Esporulación 42
  • 43. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Fisiología – Metabolismo de azúcares – Metabolismo de nitrógeno – Osmotolerancia – Temperatura de crecimiento – pH• Ecología• Aislamiento – Medios de cultivo• Criterios de Identificación – Morfología – Características de cultivo – Fisiología – Reproducción Tema. Fundamentos de la elección de marcadores y de técnicas analíticas para cada tipo de alimento y para cada microorganismo o grupo de microorganismos• Introducción• Coliformes• Coliformes fecales• Escherichia coli• Otros grupos Introducción• Análisis microbiológico – Información proveniente del mismo • riesgos sanitarios riesgo de alteración • – Inconvenientes del análisis microbiológico de patógenos• Microorganismos marcadores – Definición cualquier grupo taxonómico, fisiológico o ecológico de microorganismos cuya • presencia o ausencia proporciona información indirecta sobre un hecho particular de la historia anterior del alimento – Tipos de microorganismos marcadores • índices: grupo cuya presencia en un alimento indica la posible presencia simultánea de microorganismos patógenos ecológicamente relacionados indicadores: grupo de bacterias que ponen de manifiesto deficiencias en la • calidad microbiológica de un alimento en términos más generales – Condiciones que deben reunir un marcador • existencia de una relación con heces o patógeno • conocimiento perfecto del hábitat y origen del grupo • fácil determinación 43
  • 44. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • similar resistencia a patógenos en medio ambiente y a tratamientos tecnológicos Coliformes – Coliformes totales (C. confirmados, grupo coliaerogenes) • bacilos G- no esporulados, aerobios y anaerobios facultativos, que fermentan la lactosa con producción de gas (Durham) en 24-48h a 35ºC (prod. lácteos a 32ºC) • organismos que producen colonias con brillo verde metálico en agar eosina azul de metileno en 24 h a 35-37ºC (filtración de membrana) – Origen • fecal (predominante) y no fecal distribuidos en: carne, leche, huevo, verduras, moluscos. Suelo y aguas • – Características de crecimiento y multiplicación • cepas psicrotrofas (resistentes a desecación) • persistencia durante tiempo • no resisten pasteurización • inactivados por congelación – Significado de su presencia • Ubicuos • Pueden multiplicarse en hábitat extraintestinal • Existen especies de origen no fecal (Serratia, Enterobacter) • Utiles en alimentos tratados térmicamente – Determinación • Fermentación de la lactosa con producción de gas (caldo LST (presuntos coliformes), caldo LVBB (coliformes confirmados)) • Filtración por membrana Coliformes fecales • bacilos G- no esporulados, aerobios y anaerobios facultativos, que fermentan la lactosa con producción de gas (Durham) en 24h a 44,5ºC (Tª crítica)• Origen – fecal (casi predominante) – distribuidos en: carne, leche, huevo, verduras, moluscos. Suelo y aguas• Características de crecimiento y multiplicación • persistencia durante tiempo • no resisten pasteurización ni cocción • inactivados por congelación (15-30 días)• Significado de su presencia – Más relación con contaminación fecal – Existen unas pocas especies de origen no fecal (Serratia, Enterobacter)• Determinación – A partir de los anteriores: Caldo EC – Filtración por membrana – Otras técnicas rápidas: Ac. fluorescentes, colifagos, etc. 44
  • 45. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León Escherichia coli – El más importante de los c. fecales• Origen – tracto intestinal de hombre y animales homeotermos – Considerado por algunos el único índice fecal – 10^8-10^10 células en heces• Características de crecimiento y multiplicación – no resisten pasteurización ni cocción – inactivados por congelación (15-30 días). Depende de alimento y Tª – Similar resistencia que Salmonella al calor y frío• Significado de su presencia – Completa relación con contaminación fecal – Su no aislamiento no asegura ausencia de patógenos• Determinación – A partir de caldo EC, confirmación en agar eosina-azul de metileno – Esquema IMViC (indol, rojo metilo, Voges-Proskauer, citrato) – ISO-Grid: LMA (24 h a 35ºC) y BMA (2h a 35ºC) Otros grupos• Enterobacteriáceas • Fundamento: las bacterias entéricas no fermentadoras de lactosa (salmonella) son más importantes para la salud pública • Pero existen muchas más enterobacteriáceas de origen no fecal (más que coliformes no fecales) – Origen • variado. abundantes en medio ambiente – Significado de su presencia indicador en alimentos tratados térmicamente • – Determinación • Siembra directa en placa de VRBGA• Recuento de flora aerobia viable – Significado de su presencia • calidad sanitaria: almacenamiento, manipulación inadecuados, • Sin valor en alimentos madurados y fermentados – Determinación • Siembra directa en PCA • Termófilos= 45ºC, Mesófilos=35ºC, Psicrotrofos, 5ºC (aerobiosis o anaerobiosis)• Estreptococos fecales y enterococos (pertenecientes al grupo D de Lancefield) • Str. faecalis, Str. faecium: enterococos • Str. bovis, suis, equinum, avium – Origen • tracto intestinal de hombre y animales homeotermos (elimina 10^4-10^9) – Características de crecimiento y multiplicación 45
  • 46. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Gran resistencia en medio ambiente crecen en amplio rango de Tª, pH, bilis, y ClNa • – Significado de su presencia • Indicadores de contaminación fecal • Calidad higiénica del alimento • Su presencia no se puede relacionar con contaminación fecal reciente (no patógenos) • implicación como patógeno aislado de muchos alimentos • – Determinación • Caldo o agar KAA (kanamizina azida esculina) • Agua: caldo glucosa fosfato azida (NMP) y glucosa fosfato azida violeta de etilo (confirmación)• Otros indicadores – Clostridios sulfito-reductores – Recuentos microbianos directos – Flora psicrófila – Flora anaerobia – Colifagos – Pruebas de reducción de colorantes (indicador) • Azul de metileno Resazurina • – Pruebas enzimáticas • Fosfatasa alcalina: leche y queso • Amilasa: huevo Tema. Control de la calidad microbiológica de los alimentos. Bases de los programas de muestreo para el análisis microbiológico de los alimentos• Necesidad de garantizar la calidad microbiológica de los alimentos• Calidad• Planes de muestreo• Criterios microbiológicos• Necesidad de garantizar la calidad microbiológica de los alimentos – Antiguamente, sistema represivo: • toma de muestras de alimentos (producto final) • análisis microbiológico: presencia de patógenos y nº de alterantes • adopción de medidas, en el caso de resultados desfavorables – Actualmente • GMP y HACCP • Control de calidad • Garantía de calidad • Calidad total 46
  • 47. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Calidad – Definición de calidad desde un punto de vista estadístico – Control de calidad – Calidad microbiológica. Compuesta de • Inocuidad • Aceptabilidad/Vida comercial • Estabilidad – Definición de calidad desde un punto de vista estadístico: Planes de muestreo• Muestreo – Objetivos – Ventajas – Diferencia entre población y muestra – Propiedades deseables en muestra y muestreo • Muestra representativa • condiciones idénticas hasta el momento del análisis • Muestreo aleatorio • No debe interrumpir el proceso productivo • No modificar las características del producto No producir costes prohibitivos • – Causas de variación en y entre muestras: clases – Tamaño de muestra• Curvas Características de Operación (OC) – Curva característica operativa Sirven para conocer la sensibilidad de nuestro procedimiento de control de • calidad. Qué probabilidades hay de detectar errores? – Hipótesis nula y alternativa • Nula (H0): pensar que la variable cumple las especificaciones Alternativa (H1): pensar que hay desviación de las especificaciones por un cierto • valor – Probabilidad de errores Alpha y Beta (Errores de 1ª y 2ª especie) • Error Alpha: rechazar H0 (rechazar el lote) porque erróneamente concluimos que el producto se desvía de las especificaciones fijadas-> riesgo del proveedor • Error Beta: no rechazar H0 (aceptar el lote), cuando en realidad el producto se desvía de las especificaciones fijadas-> riesgo del comprador Criterios microbiológicos (ICMSF: International Commission on Microbiological Specifications for Foods)• Criterios microbiológicos: necesarios para la evaluación de la calidad microbiológica de un alimento • Patrón microbiológico: criterio establecido por ley • Especificación microbiológica: criterio utilizado para el comercio • Pauta microbiológica: utilización con fines consultivos 47
  • 48. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Aspectos a incluir en un criterio microbiológico – declaración del alimento al que se aplica el criterio – declaración del microorganismo o toxina – métodos analíticos – número (n) y tamaño de muestras a recoger – límites (m, M) y número de muestras aceptables (c) • Para patógenos: • Para alterantes: • Índices e indicadores• Tipos de planes de muestreo – Planes de muestreo basados en medidas y atributos – Planes de muestreo de 2 y 3 clases• Desarrollo de un plan de muestreo – Se considera el peligro potencial del producto, basándose en • microbiología del producto • categorías de la ICMSF – Se decide qué plan se emplea: entre 2-3 clases – Se fija valor microbiológico de referencia (VMR): (m, M) – Se fija una Pa (probabilidad de aceptación o error beta) satisfactoria – Se selecciona n y c• Elección del tipo de plan de muestreo • Tipo de microorganismo: Patógenos (DMI), Alterantes (NMA), Indicadores • forma de tratar a un alimento durante la distribución, almacenamiento y previo al consumo • tipo de consumidor Tema. Análisis del riesgo. Evaluación del Riesgo Microbiológico (Microbiological Risk Assessment).• Concepto de peligro y riesgo – El peligro es un agente biológico, químico o físico o una condición en un producto que causa o puede causar un dañoEl riesgo es una estimación de la probabilidad y severidad de un efecto adverso de la salud en poblaciones expuestas como consecuencia de un peligro en un producto Etapas del análisis de riesgos• Evaluación del riesgo – La evaluación científica de los efectos para la salud conocidos o potenciales• Comunicación del riesgo – El intercambio de información entre todas las partes interesadas• Gestión del riesgo – La evaluación, selección y puesta en funcionamiento de medidas para minimizar o eliminar el riesgo Etapas de la evaluación del riesgo• identificación del peligro 48
  • 49. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• caracterización del peligro• evaluación de la exposición / dosis-respuesta• caracterización del riesgo Principio de precaución – Factores del principio de precaución. – Propiedades aplicables al principio de precaución • Proporcionalidad • No discriminación • Coherencia • Examinar los costes y los beneficios • Estudio de la evolución científica • Designar a quien le incumbe aportar pruebas científicas 49
  • 50. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León Tema. Intoxicaciones e infecciones alimentarias• Concepto y aspectos epidemiológicos• Importancia de las enfermedades transmitidas por alimentos• Intoxicaciones e infecciones alimentarias• Procedimiento a seguir en la investigación laboratorial y epidemiológica de un brote alimentario Concepto y aspectos epidemiológicos – Epidemiología: "ciencia que se ocupa de estudiar los estados de salud y enfermedad de una colectividad estudiando los factores y causas de estos estados, así como de la distribución y frecuencia de los mismos" – Usos y fines. • Describir una enfermedad en la comunidad • Instrumento de predicción • Identificar los grupos más vulnerables • Evaluación de las medidas sanitarias adoptadas • Completar el cuadro clínico de una enfermedad • Identificar síndromes clínicos nuevos Identificación de factores etiológicos responsables de un proceso • – Método epidemiológico • Epidemiología descriptiva • Epidemiología analítica • Epidemiología comparativa Epidemiología experimental • – Estudios en Epidemiología • Estudios transversales o de prevalencia Estudios longitudinales: 1. Retrospectivos (estudios de casos y controles). 2. • Prospectivos – Expresiones y medidas • Tasa de incidencia • Tasa de prevalencia • Tasa de ataque • Riesgo relativo • Riesgo atribuible • Odds ratio Importancia de las enfermedades transmitidas por alimentos• Enfermedades y riesgos para la salud humana asociados con el consumo de alimentos – Infecciones alimentarias – intoxicaciones – zoonosis – alergias (reacción inmunológica) – alteraciones metabólicas (deficiencias genéticas) • procesos que afectan únicamente a individuos concretos (enfermedades 50
  • 51. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León idiosincrásicas)• Subestimación de la realidad• Gastos por enfermedad de infecciones e intoxicaciones Intoxicaciones e infecciones alimentarias• Infección alimentaria – toxiinfección, toxicoinfección – Infección invasiva• Intoxicación – productos metabólicos microbianos – tóxicos naturales • Plantas • animales – tóxicos añadidos accidental o voluntariamente al alimento (productos químicos) Procedimiento a seguir en la investigación laboratorial y epidemiológica de un brote alimentario• 1. Formular una hipótesis y determinar si nos encontramos ante un brote y el tipo: establecer una relación enfermedad-consumo de alimentos – Hipótesis • ¿Qué microorganismo? • ¿Qué producto? • ¿Quién puede enfermar? ¿Qué falló? • – Tipo I: Asociado con reuniones sociales • Población diana es identificable • La exposición está representada por un suceso conocido (la fuente específica puede ser desconocida) • El patógeno es desconocido – Tipo II: Asociado con la distribución comercial de alimentos • Detectado por un buen sistema de vigilancia epidemiológica • Población diana es desconocida • La exposición es desconocida (la distribución geográfica puede dar pistas) • El patógeno es conocido• 2. Desarrollar una definición de caso – Descripción clínica: periodo de incubación, signos, síntomas, duración de la enfermedad y respuesta a la terapia – Criterios de laboratorio para la diagnosis: aislamiento de organismo o toxina del alimento/s, vómito y heces de pacientes/casos • Centers for Disease Control. Case definitions for public health surveillance. MMWR 1990;39(No. RR-13):1-43• 3. Recogida de datos y muestras – Visita al establecimiento/industria • Sistema de preparación/fabricación • Sistema de almacenamiento 51
  • 52. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Información sobre los menús • Procedencia de materias primas, etc, etc. Manipuladores: estudio si fuera necesario • – Toma de muestras • Precauciones en tipo de muestra, manejo, transporte, tiempo, temperatura, cantidad, información aportada • Tipos de muestra • Instrumentos – Encuesta a pacientes • Registro de alerta • Datos clínicos • Historia alimentaria • Resumen de los casos • Registro recogida muestras clínicas • Registro recogida muestras alimentos y ambientales • Registro revisión preparación del alimento • Tabla de tasa de ataque específica por alimentos• 4. Realización del análisis laboratorial – Objetivo: identificación, tipificación del agente patógeno• 5. Análisis de los datos: determinar las asociaciones tiempo, lugar y relación entre personas – Empleo de curvas epidémicas – Empleo de la lista diferencial de enfermedades producidas por los alimentos (inicio, duración, síntomas que aparecen primero o predominan): • Síntomas del aparato gastrointestinal superior: náusea, vómitos • síntomas respiratorios, garganta inflamada • síntomas del aparato gastrointestinal inferior (calambres abdominales, diarrea) • síntomas neurológicos (disturbios visuales, vértigo, zumbidos, parálisis) • síntomas alérgicos (enrojecimiento facial, picores) • síntomas de infección generalizada (fiebre, escalofríos, malestar, postración, dolor, ganglios linfáticos hinchados) síntomas gastrointestinales y/o neurológicos - (toxinas de los moluscos) • – Determine la historia alimentaria de individuos enfermos y sanos – Determínese qué alimento(s) pueden ser responsables del brote y compruebe la significación estadística de sus resultados• 6. Averiguar el origen de la contaminación, posibilidad de supervivencia de los patógenos y potencial de multiplicación bacteriana• 7. Suministrar la información a los organismos competentes (servicios de salud, CNE, red de alerta alimentaria, FoodNet, PulseNet)• 8. Realización del control y puesta en marcha de medidas correctoras y preventivas – Identificación de lotes contaminados – Corrección de factores responsables de contaminación – Medidas higiénicas de prevención 52
  • 53. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León Redes epidemiológicas• Foodnet• Pulsenet• Enter-net• Salm-gene Tracto gastrointestinal. Diarrea – 1. Anatomía y características generales del tracto gastrointestinal – 2. Fisiopatología de las infecciones del tracto gastrointestinal Diarrea aguda – Definición Y Epidemiología – Etiología – Mecanismos patogénicos de la diarrea infecciosa – Fisiopatología de la diarrea – Diagnóstico – Complicaciones – Conducta – Tratamiento • Plan A • Plan B • Prioridades en el manejo del niño con diarrea y deshidratación grave (Plan C.): – Prevención – Bibliografía Tema. Clostridium botulinum• Aspectos generales• Factores de los que depende la germinación, multiplicación bacteriana y producción de toxinas• Toxina botulínica• Botulismo. Signos clínicos, tratamiento y pronóstico• Pruebas laboratoriales de detección e identificación• Ecología y epidemiología• Prevención y control Aspectos generales• Introducción• Características generales – Clostridios: bacilos Gram-positivos, catalasa negativos, anaerobios obligados y formadores de endosporas (esporo subterminal) – Esporas termorresistentes, ubicuas – Las células vegetativas producen una potentísima neurotoxina• Síndromes – Botulismo de origen alimentario 53
  • 54. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Botulismo infantil Colonización del tracto intestinal y producción de la toxina in vivo en niños (<12 • meses) – Botulismo indeterminado – Botulismo de las heridas • Infección de heridas y producción de toxina• Tipos de Cl. botulinum – Tipo I: cepas proteolíticas productoras de toxinas A, B o F – Tipo II : no proteolíticas productoras de las toxinas B, E y F – Tipo III: no proteolíticas productoras de toxinas C y D – Tipo IV: no proteolíticas, productoras de toxina G • • Los tipos I y II causan el botulismo en hombre • El tipo III en animales (aves, visones, vacuno) • El tipo IV no se ha visto implicado Factores de los que depende la germinación, multiplicación bacteriana y producción de toxinas – Composición del alimento • Necesidades nutritivas complejas. Fuente de carbohidratos – Eh alimentos envasados en vidrio, hojalata, películas flexibles. Masas grandes • (jamones) – Contenido en sales • ClNa: 10% tipo I y 5% tipo II – Nitritos y nitratos: límites en legislación (nitrosaminas) Conservantes, hasta un máximo de 50 (nitritos) y 250 ppm (nitratos): Prod. • cárnicos crudos. – Límites de Tª para el crecimiento • Tipo I. 10-48ºC. Tipo II: 3,3-45ºC – pH • Límite: pH=4,5. Tipo I: 4,6. Tipo II: 5,0. • Cuidado con alimentos contaminados (pueden alterar el pH inicial) – HR y aw del alimento Límites inferiores: tipo I: 0,94. Tipo II: 0,97 • – Tratamiento térmico • Tipo I: D121= 1,21 min • Tipo II mucho menos termorresistente Toxina botulínica• Características – Dosis letal mínima: entre 0,1 y 1,0 microgramos – Ocho tipos distintos de toxinas botulínicas (A, B, C1, C2, D, E, F, G) – Antigénicamente distintas pero comparten propiedades estructurales y farmacológicas 54
  • 55. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Naturaleza proteica. Estructura – Única cadena polipeptídica de 155 Kdaltons – Se hidroliza al liberarse – dos cadenas polipeptídicas unidas por puente disulfuro • ligera A (55 Kd) • pesada B (100 Kd)• Modo de acción de la toxina – A nivel de las terminaciones nerviosas, bloqueando la liberación de acetilcolina – Consta de 3 fases: • Etapa de unión: la cadena pesada se liga a un receptor de la superficie externa del nervio • Etapa de translocación: proceso activo de transporte de la cadena ligera hacia el interior (pinocitosis) • Etapa lítica: bloqueo de la liberación de acetilcolina por la endopeptidasa Botulismo. Signos clínicos, tratamiento y pronóstico• Diagnosis – Aparición de los primeros síntomas: • 12-36 h tras la ingestión del alimento (variable desde 2h hasta 6 días) – Síntomas: • Síntomas neurológicos: • Síntomas digestivos: • Síntomas gastrointestinales: parálisis respiratoria • – Diagnóstico diferencial • Enfermedad cerebrovascular • Neuropatías post-infecciosas (Guillain-Barré, Miller-Fisher) • Miastenia gravis• Tratamiento y pronóstico • Administración de anti-toxina botulínica, apoyo respiratorio • Precauciones: se desaconseja usar la antitoxina en ciertos casos • Mortalidad: Hasta 1949, la mortalidad del botulismo era del 60%; ahora no alcanza el 10% Pruebas laboratoriales de detección e identificación• Detección de la toxina – Muestra (refrigerada): heces, alimento, sangre, fluido cerebroespinal – Precauciones – Preparación de la muestra – División de la muestra y tratamiento • Tripsinización • Calentamiento – Metodología • Inyección intraperitoneal 55
  • 56. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Técnicas inmunológicas • Genéticas• Detección del microorganismo (aislamiento e identificación) – Homogeneización (a. sólidos) – Enriquecimiento – Siembra en tubo (distintos medios) (Medio de carne cocida, TPGYE) • Tratamiento térmico • Incubación en anaerobiosis – Examen microscópico – Siembra en medio sólido • agar sangre, agar infusión cerebro, agar hígado, carne de ternera, yema de huevo• Otros usos de la toxina botulínica (terapéuticos, militares) Ecología y epidemiología• Hábitat de las esporas• Características de los brotes• Alimentos implicados – Alimentos típicos: alimentos no desecados, de pH>4,6, en condiciones anaerobias, que sufran TT que destruya la flora acompañante – Conservas caseras, tanto de carnes como de verduras, inadecuadamente procesadas – Productos cárnicos: jamones curados, embutidos – Productos lácteos: queso madurado de poca acidez, yogures – Pescado: ahumados, envasados en películas flexibles – Productos vegetales: setas escabechadas con poca acidez – Alimentos infantiles: Solamente los productos con miel (papillas) Prevención y control• Prevenir errores en el procesado de los alimentos. – Deficiencias en tratamiento térmico – Deficiencias en curado – Deficiencias en acidificación• Productos elaborados en el hogar – Esterilización de las conservas en autoclaves, con respeto a combinaciones tiempo-Tª – Acidificación-curado correcto – Calentamiento antes del consumo• A nivel industrial – Sistema APPCC – Limpieza cuidadosa de la materia prima, higiene en manipulación – Respeto a los tratamientos de esterilización y concentraciones de sal – Control del agua de enfriamiento – Control de la temperatura en almacén de productos preparados – Controles bacteriológicos del producto final – Vigilancia en la distribución 56
  • 57. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Termodestrucción en bacterias Tema. Staphylococcus aureus• Aspectos generales• Factores que afectan al crecimiento y multiplicación de S. aureus y la producción de toxina• Toxinas estafilocócicas• Síndrome estafilocócico• Epidemiología y ecología• Aislamiento e identificación Aspectos generales• Intoxicación alimentaria: ingestión de la toxina en el alimento• Asociada a higiene inadecuada en manipulación: manipuladores infectados• Microorganismo – Familia Staphylococcaceae – Cocos Gram-positivos, anaerobios facultativos – DNAsa (termonucleasa), coagulasa positivos – Ubicuo, presente en animales sanos (piel, mucosas) y enfermos (ubre)• Otras especies implicadas – S. epidermidis – S. intermedius – S. hyicus Factores que afectan al crecimiento y multiplicación de S. aureus y la producción de toxina – Composición del alimento: no es fundamental – Temperatura • Crecimiento: 10-35-47 • Producción de toxina: 25-37-40 – pH • Crecimiento: 4,5-7-9,4 • Producción de toxina: 5,5-7-9 – aw • Crecimiento: >0,86 Producción de toxina: >0,90 • – Atmósfera: Mejor aerobiosis – ClNa: Resistente (10%) – Flora competidora Toxinas estafilocócicas• Toxinas formadas en el alimento: enterotoxinas (no típicas)• Ocho tipos serológicos: A, B, C1, C2, C3, D, E y F• Actuación sobre receptores en el intestino- nervio vago-centro del vómito en el cerebro 57
  • 58. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Síntesis durante la fase exponencial (> 10^6 ufc/gr)• Propiedades – Proteínas de 28-35 Kd. – Termorresistentes (30 min a 100C) – Resistentes a enzimas proteolíticas (tripsina, renina, papaína) – Codificadas en cromosoma• Otros productos de virulencia • Coagulasa • DNAsa termoestable o termonucleasa • Fosfatasa • Fibrinolisina • Hialuronidasa • Lipasa • Otras toxinas Síndrome estafilocócico• Factores necesarios para que se presente la enfermedad – En el entorno de la producción, procesado o preparación del alimento debe haber una fuente contaminada con cepa toxinogénica de S. aureus. – El microorganismo debe transferirse de dicha fuente al alimento. – El alimento debe contaminarse con miles de S. aureus/g o, más corrientemente, debe haberse tratado por el calor antes de su contaminación, o debe tener concentraciones altas de sal o azúcar – El microorganismo debe sobrevivir en el alimento. – El alimento debe soportar el desarrollo de S. aureus. – El alimento debe permanecer en el rango de Tª favorable un tiempo suficiente para la multiplicación y producción de enterotoxina – Debe ingerirse una cantidad suficiente del alimento que lleva la enterotoxina para superar el umbral de sensibilidad a la enterotoxina de las personas que lo ingieran• Síntomas: 1-6 horas tras la ingestión del alimento. Depende de – cantidad de toxina ingerida – Sensibilidad individual• Duración: 24 h• Autolimitante. 10% de casos requieren hospitalización• Parte superior aparato digestivo – Náuseas, vómitos, dolor abdominal, postración – Diarrea frecuente, fiebre infrecuente – Síntomas graves: mareos, hipotensión Epidemiología y ecología• Comensal de piel y mucosas (fosas nasales, heridas infectadas)• Habitual en leche no pasterizada (agente de mamitis)• 20-50% portadores• Proceso – Contaminación del alimento por un portador (por manipulación o por contaminación cruzada)-> 58
  • 59. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León crecimiento del microorganismo en el mismo y producción de toxina-> ingestión de la toxina• Enfermedad – Mayor incidencia en verano – Bajo % de declaración• Alimentos implicados – alimentos cocinados consumidos fríos: carnes cocinadas, huevos preparados, salsas, natillas, helados (ausencia de competidores) – Japón: bolas de arroz – España: ensaladillas, tartas, natas, embutidos loncheados Aislamiento e identificación• Aislamiento y recuento en alimentos – Distintos ag. selectivos ClNa (7-10%), Telurito potásico, Cloruro de litio, Azida sódica, Glicina, sulfato • de amonio, ac. sórbico, polimixina, neomicina – Ag. diferenciales • Yema de huevo, telurito potásico, manitol – Medios: Baird-Parker, Kranep, Chapman-Stone, sal-manitol – Enriquecimiento • NMP (Giolitti-Cantoni)• Identificación – Indices de enterotoxigenicidad • Coagulasa, Termonucleasa, Catalasa• Detección de la enterotoxina – Métodos biológicos – M. inmunológicos • Difusión simple unidimensional de Oudin • Difusión doble en gel • Hemaglutinación • Ac. fluorescentes • RIA • ELISA Prevención y control• Manipular lo menos posible los alimentos cocinados. – Sobre todo alimentos cocinados calientes• Atención a personas con lesiones sépticas• tratamiento térmico adecuado – cuando los alimentos hayan de conservarse• Rápida refrigeración de productos preparados (Tª< 10 ºC)• minimizar la contaminación cruzada de los alimentos cocinados Tema. Bacillus cereus• Aspectos generales• Factores que afectan al crecimiento y multiplicación de B. cereus 59
  • 60. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Ecología y epidemiología• Secuencia del proceso• Síndrome diarreico• Síndrome emético• Aislamiento e identificación• Prevención y Control Aspectos generales• Características – Bacilo Gram-positivo esporulado – Anaerobio facultativo – Catalasa + – Género (Bacillus) muy heterogéneo (más de 30 spp. en Bergey) – Productor de enzimas (extracelulares) y antibióticos – Ubicuo – Otras especies (patógenas o relacionadas con intoxicaciones) • B. anthracis • B. licheniformis, B. subtilis, B. brevis-> intoxicaciones • B. licheniformis, B. subtilis, B. macerans, B. circulans-> oportunistas B. larvae, B. lentimorbis, B. papilliae, B. thuringiensis, B. sphaericus-> • patógenos de insectos – Clasificación de Bacillus • Grupo I • Grupo II • Grupo III• B. cereus: responsable de dos síndromes: – Emético: ingestión del alimento con la toxina – Diarreico: producción de la toxina en el intestino por las células Ecología y epidemiología• Esporas: ubicuas en la naturaleza • Suelo, vegetación, leche, cereales, almidón, especias, superficie de carne y pollo • Otros alimentos: pasta, crema pasteurizada• Brotes en restauración colectiva – Síndrome diarreico Consumo de platos con carne/especias las cuales están contaminadas con esporos. • Relacionado con amplia variedad de alimentos – Síndrome emético • Casi siempre debido al consumo de arroz o pasta contaminados• Alterante termorresistente en leche pasterizada: la intoxicación no se ha asociado a este producto Secuencia del proceso – El alimento se contamina – Las esporas no son destruidas por el tratamiento térmico, sí la flora acompañante 60
  • 61. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – El alimento se enfría en condiciones inapropiadas• Síndrome diarreico – Producción de la toxina en el intestino por las células (durante la esporulación probablemente)• Síndrome emético – Producción de la toxina en el alimento por las células (el calentamiento previo no destruye la toxina) Síndrome diarreico• Intoxicación similar a la causada por Clostridium perfringens – Período de incubación: 8-16 horas tras la ingestión del alimento – Duración: 12-24 h – Síntomas • Diarrea acuosa, profusa • Náuseas, dolor abdominal (colitis aguda), postración • No hay vómitos ni fiebre – Autolimitante. 10% de casos requieren hospitalización• 5 enterotoxinas responsables: – Hemolysin BL (Hbl)* – Nonhemolytic enterotoxin (Nhe)* – Enterotoxin T (BceT) – Enterotoxin FM (EntFM) – Cytotoxin K (CytK)* – Propiedades biológicas (empleo en detección)• Serotipificación: antígeno flagelar – Serotipos implicados: H.1, H.8 (comunes), H.2, H.6 Síndrome emético• Intoxicación similar a la causada por S. aureus – Período de incubación: 1-6 horas tras la ingestión del alimento – Duración: 6-24 h – Síntomas intestinales• Autolimitante. 10% de casos requieren hospitalización• Toxina responsable: – Polipétido sencillo – Propiedades biológicas (sistemas de detección)• Serotipos implicados: H.1, H.3, H.4, H.5, H.8 Factores que afectan al crecimiento y multiplicación de B. cereus – Temperatura Existen muchas cepas psicrotrofas: 4-55ºC. • – Aw min: 0,92 – pH: 4,3-9,3 – Requerimientos nutritivos: sí aa, no vitaminas – Productor de 61
  • 62. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • enzimas extracelulares • toxinas antibióticos • – Termorresistencia de los esporos • Serotipo I (productor de intoxicación): D95=24 min • Otros serotipos: D95=1,5-36 min – Germinación • Tª=8-30ºC Aislamiento e identificación• Diagnóstico – Aislamiento de grandes cantidades de B. cereus en • Heces, vómito • alimento (>10^5 cel/gr) – Caracterización de los microorganismos aislados e identidad fenotípica• Medios de cultivo – No selectivos: Agar sangre – Selectivos: Caldo Tripticasa soja con Polimixina B; Agar sangre con Polimixina B (siembra en superficie) ; MYEP, PEMBA, PEMPA: Polimixina B, yema de huevo, manitol, indicador• Confirmación – Examen microscópico – Pruebas bioquímicas (hemólisis, prod. cristales)• Identificación• Serotipificación – basada en el antígeno flagelar: H• Detección de toxina diarrogénica – Inmunodifusión en gel – Aglutinación en látex• Productos comerciales Prevención y control• A tener en cuenta: – Díficil evitar la contaminación – No peligroso a bajos niveles-> evitar el crecimiento• Procesado/cocinado: – destruir células vegetativas – evitar germinación y crecimiento – Tª<100: permite supervivencia de esporas• Almacenamiento – evitar almacenamiento no refrigerado de arroz, otros cereales• Preparación – pequeñas cantidades Tema. Micotoxinas y micotoxicosis• Aspectos generales 62
  • 63. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Micotoxicosis humanas• Micotoxinas en alimentos• Medidas de prevención y control• Detección de micotoxinas Aspectos generales• Micotoxinas: – Grupo de metabolitos fúngicos de composición química diversa no relacionados que inducen respuestas tóxicas en humanos y animales al ingerirse los alimentos contaminados – Se conocen más de 200 metabolitos• Mohos • hongos microscópicos pluricelulares y filamentosos • Productores de gran variedad de metabolitos secundarios • Crecen en condiciones de baja aw • aparecen con frecuencia en alimentos como contaminantes naturales (alterantes) o como cultivos adicionados Mohos productores: micotoxigénicos • – Principales géneros de mohos micotoxigénicos • Aspergillus • Penicillium • Fusarium• Vías de exposición – Ingestión, inhalación, contacto Micotoxicosis humanas – Ergotismo (Claviceps purpurea) • 2 formas clínicas: gangrenosa y convulsiva – Aleukia Tóxica Alimentaria (ATA) (Fusarium sporotrichioides) • Productor de tricotecenos • De menor difusión (Rusia, a comienzos de siglo, por cosechas de cereales) • proceso hemorrágico. Daños en médula ósea, mucosas y vasos sanguíneos. • Tasa de mortalidad hasta el 60% – Enfermedad del moho rojo (F. graminearum) • Micotoxina: DON o vomitoxina • Síntomas: cefalea, vómito, diarrea, anorexia – Cáncer hepático (Aspergillus) – Cáncer de esófago (F. moniliforme) – Estaquiobotriotoxicosis (Stachybotrys atra) – Enfermedad del arroz amarillo – Nefropatía endémica de los Balcanes (ocratoxina A y citrinina) – Beri-beri cardíaco (P. citreoviride) por consumo de arroz en Japón • – púrpura trombocitopénica (Porma sorghina) – enfermedad de Kashin-Beck u osteoartrosis por constricción de los vasos de la epífisis 63
  • 64. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León (Fusarium) – Ijesha shakes (Nigeria) Micotoxinas en alimentos – aflatoxinas • Aspergillus (A. flavus, A. parasiticus). • Procesos carcinogenéticos • varios tipos de constitución química similar (B1, B2, G1, G2, M1, M2) (cumarinas) Actividad biológica: toxicidad, carcinogénesis, mutagénesis, poder teratógeno • – zearalenona (Fusarium graminearum) • actividad estrogénica – ocratoxinas • producidas por A. ochraceus, P. viridicatum • Lesiones renales e infiltración grasa – citrinina • Aspergillus, Penicillium citrinum y otros Penicillium – patulina y ácido penicílico similares (deriv. lactonas), producido por A. ochraceus y P. expansum • – esterigmatocistina • elaborada por Aspergillus, Penicillium luteum y Bipolaris • composición química similar a la de las aflatoxinas y posible precursor hepatocarcinogenéticas • – tricotecenos: toxina T2, DON o vomitoxina, etc. (Fusarium) • necrosantes, citotóxicas, producen hemorragias en estómago e intestino – Otras: citreoviridina (P. citreoviride), rubratoxina (P. rubrum), ácidos micofenólico, ciclopiazónico, ß-nitropropiónico, tremorgenos, etc.• Epidemiología – Micotoxicosis primarias – Micotoxicosis secundarias• Utilización de mohos en fermentación de alimentos• Alimentos implicados – productos vegetales • legumbres (guisantes) • cereales (trigo, arroz) • semillas oleaginosas • frutos secos (cacahuetes, pistachos) – frutas y derivados • manzana, zumo • sidra • mermelada – productos animales • de animales alimentados con vegetales contaminados 64
  • 65. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León Medidas de prevención y control• Prevención de la contaminación – Medidas pre-recolección • Selección de variedades • Empleo de pesticidas • Métodos de cosecha adecuados – Medidas post-recolección • Control del almacenamiento y transporte • Control de la alimentación animal • Control de industrias de elaboración de productos fermentados• Prevención del crecimiento del moho y producción de toxina • Factores: tipo de alimento (carbohidratos) • Atmósfera de almacenamiento: reducción % 02 • Temperatura • HR y aw • sustancias químicas: antifúngicos • pH: amplia tolerancia • Irradiación• Eliminación de micotoxinas – Separación física y química (extracción) – Degradación física (luz uv), química (acidificación, empleo de bases) y biológica (Flavobacterium auranticum) Detección de micotoxinas• Métodos para la detección de micotoxinas – Representatividad en la toma de muestras – Técnica • Extracción: en solventes orgánicos (cloroformo, acetona) • Limpieza (separación líquido-líquido, separación en columna, diálisis) • Detección y cuantificación: mediante técnicas cromatográficas (HPLC, GLC) • Confirmación de su identidad: métodos inmunológicos (ELISA, RIA) y biológicos (efectos tóxicos en microorganismos, plantas, crustáceos y peces o tejidos celulares)• Normas sobre niveles máximos – FDA: 15 ppb (microgr./Kgr.) en aflatoxinas, 0,5 ppb para la M1 en leche (límites de detección) – FAO establece 3 categorías de utilización de productos • I: consumo humano directo (30 ppb) • II: productos de alimentación de ganado de leche • III:productos de alimentación de resto de ganado – Depende de: • disponibilidad de alimentos • capacidad tecnológica de industrias 65
  • 66. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • limitaciones de la metodología analítica Tema. Salmonella• Aspectos generales• Salmonelosis• Patogenia• Factores que afectan a la supervivencia y al crecimiento• Ecología y epidemiología• Prevención y Control• Aislamiento e identificación de Salmonella Aspectos generales• Características – Familia Enterobacteriaceae • Bacilo Gram-negativo, anaerobio facultativo, Oxidasa negativo, Catalasa positivo • – Móvil (flagelos peritricos, excepto S. gallinarum, S. pullorum) – Lactosa y sacarosa negativos (también existen cepas atípicas +) – Glucosa positivo con producción de gas – Clasificación • esquema Kauffman-White ( 5 subgéneros, más de 2300 serotipos) • Actualmente S. enterica (6 subespecies, 2300 serovars), S. bongori (19 serovars): multilocus enzime electrophoresis • Serovares en base a Ag O, y H• Enfermedades – Causante de fiebres tifoideas • S. typhi, S. paratyphi (A, B, C) • Septicemias con fiebres recurrentes • En países en desarrollo – Infección alimentaria • Serotipos no adaptados • Síndrome gastroentérico febril • nº 1 en España Salmonelosis• Características de la infección alimentaria – Dosis infectiva: 15-20 células, dependiendo de • edad, salud del hospedador y virulencia de la cepa – Período de incubación: 6-48 h – Duración de la enfermedad • síntomas agudos hasta 7 días • síntomas crónicos durante semanas – Síntomas • Náusea, fiebre, dolor abdominal, cefalea • Diarrea: presencia de mucus, glóbulos rojos y leucocitos en heces (en grano de 66
  • 67. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León arroz) • Vómito menos frecuente • Síntomas crónicos: artritis • El paciente puede permanecer como portador – Complicaciones posibles: • Septicemia, fallo renal, oseomielitis, meningitis• Características de las fiebres tifoideas – Período de incubación: 7-14 días – Síndrome: Septicemia, neumonía, meningitis – Malestar general, anorexia, fiebre, dolor abdominal, cefalea Patogenia• Fiebres tifoideas – Paso de la barrera intestinal – Distribución por sangre y linfa – No actúa a nivel intestinal• Infección alimentaria – Adhesión al borde en cepillo de células epiteliales – Penetración en células de la mucosa – Migración a la lámina propia – Multiplicación en folículos linfoides – Respuesta inflamatoria • Respuesta leucocítica, hiperplasia e hipertrofia reticuloendotelial Liberación de prostaglandinas • – Estimulación del cAMP y secreción de fluidos • diarrea (puede secretar una enterotoxina) Factores que afectan a la supervivencia y al crecimiento• similar a otras Enterobacteriáceas – Temperatura • Mesófilo • Tª= 5 - 45°C • es tolerante al frío (pueden crecen lentamente por encima de 4-5°C) • no son resistentes a la congelación: disminución cte con el tiempo • Destruidos por tratamiento térmico D60=0,27 min. – pH • 4,5-9 • Acido acético muy eficaz – aw • 0,93 – Eh • anaerobio facultativo – No muy resistentes al calor ni a las radiaciones ionizantes – poco resistentes a agentes del curado 67
  • 68. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Mal competidor frente a alterantes • su crecimiento se ve enmascarado por psicrotrofos (Pseudomonas) BAL (lactobacilos) como cultivos iniciadores • – Limiting conditions for Salmonella growth. Ecología y epidemiología• Habitante primario del tracto gastrointestinal – hombre, animales homeotermos y poiquilotermos.• Adaptación a hospedadores – serotipos adaptados (auxótrofos) S. typhi (hombre), S. abortus ovis (oveja), S. gallinarum (aves) • – serotipos no adaptados (ubicuos)• Contaminación – Endógena – exógena (cruzada)• Reservorios – Animales de abasto • de carne roja • Aves – Aves silvestres, roedores, insectos – pescado, moluscos, tortugas y reptiles usados como mascotas• Alimentos involucrados – Huevos • contaminados exteriormente (cáscara) contaminados interiormente (proporción baja pero importante) • – Carne y productos cárnicos • Canales de ave (-50-100%) • Contaminante de carne en operaciones de sacrificio (pollos) y preparación • Carne de cerdo Carne de vacuno • – Todo alimento susceptible de ser contaminado por efluentes fecales: moluscos bivalvos, agua, vegetales crudos, leche cruda, ancas de rana – Leche y productos lácteos – Alimentos fermentados• Otras peculiaridades – Presente en heces, piensos – ha permitido la distribución mundial de serotipos confinados – Excretado por convalecientes durante un largo período • 1 hasta 4 meses – Operaciones de transporte, sacrificio de animales de abasto (estrés) • Aumentan la excreción Prevención y Control• Debe ser en múltiples etapas 68
  • 69. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Control de animales silvestres – Producción de animales • Regulación del empleo de piensos • Depuración de efluentes • Prácticas de manejo, higiene • Empleo de probióticos – Sacrificio de animales • Manejo antes del sacrificio: transporte de animales, estrés ante-mortem • Empleo de sistemas de control microbiológico: HACCP, GMP • Contaminación cruzada en mataderos: escaldado, herramientas – Fabricación de alimentos • Pasterización de leche • Empleo de sistemas de control microbiológico: HACCP – Preparación de comidas: catering, restauración colectiva (aplicable también a mataderos e industrias de alimentos) • Formación y educación sanitaria • Vigilancia y control médico de manipuladores • Atención a excretores asintomáticos Buenas prácticas de higiene (comunes a otros microorganismos): tratamiento • térmico, refrigeración... – Educación del consumidor • Cocina, turismo Aislamiento e identificación de Salmonella• Método clásico – Preenriquecimiento caldo lactosado, nutritivo, TSB, solución Ringer, Tampón fosfato, leche en polvo • – Enriquecimiento selectivo Caldo selenito-cistina, caldo tetrationato-verde brillante, caldo Rappaport- • Vassiliadis, caldo GN – Siembra en medio sólido selectivo y diferencial Agar sulfito bismuto, verde brillante, SS, McConkey, Hektoen, XLD, • desoxicolato citrato – Aislamiento e identificación de las colonias • Agar TSI, LIA • Pruebas bioquímicas de confirmación – Tipificación • Serología• Métodos rápidos (normalmente tras preenriquecimiento y enriquecimiento) – ISO-GRID – Detección con sondas DNA – ELISA, inmunofluorescencia – Impedancia – Commercial Test Products 69
  • 70. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León Shigella• Características – Familia Enterobacteriaceae • Bacilo Gram-negativo, anaerobio facultativo • Oxidasa negativo, catalasa positivo – Inmóvil – Lactosa negativo: lo diferencia de E. coli – Glucosa positivo sin producción de gas – Adaptado a humanos y primates• Patogenicidad por producción de toxina e invasividad• Transmisión – No por alimentos? – Contaminación • Directa • Indirecta• Especies (y grupos serológicos) – S. dysenteriae (serogrupo A): menos frecuente, más patógena – S. flexneri (serogrupo B) – S. boydii (serogrupo C) – S. sonnei (serogrupo D)• Factores que afectan al crecimiento y supervivencia (Limiting conditions for Shigella growth) Sigelosis (disentería bacilar)• Enfermedad – Gravedad variable dependiendo de paciente, cepa y nº de células ingeridas (+++S. dysenteriae ---S. sonnei) – Período de incubación variable (1-7 días) – Dosis infectiva muy baja: 100 bacterias o menos (10) – Diarrea (con sangre, mucus y pus), con dolor abdominal, fiebre – Más infrecuente: cefalea, náuseas – Autolimitante excepto pacientes debilitados con deshidratación• Mecanismos patogénicos – Producción de enterotoxina (toxina Shiga). Similar a Shiga de EHEC • Cantidad producida variable dependiendo de la cepa • Proteica, termolábil, citotóxica, necrosante y neurotóxica • Unión a glicoproteínas de célula hospedada • Inactiva la unidad 60S del ribosoma-> inhibición de la síntesis de proteínas-> muerte celular – Invasividad • Proliferación en luz intestinal, invasión de la mucosa del ileon terminal y colon, necrosis y hemorragia • Multiplicación en el interior de las células 70
  • 71. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Confinada a células epiteliales. No hay diseminación• Epidemiología y ecología – Hábitat: intestino humano: heces-> • productos contaminados directa o indirectamente • aguas de abastecimiento en zonas con malas prácticas higiénicas – Gran período de excreción: hasta 145 días – Brotes • Mayoría asociados al consumo de agua contaminada • Manipulación de última hora por portadores contaminados • Transmisión persona-persona – Otros alimentos implicados • Sobre todo, ensalada. Leche.• Prevención y control – Educación de manipuladores• Aislamiento e identificación – Enriquecimiento no selectivo • TSB – Enriquecimiento selectivo • caldo tetrationato, selenito – Siembra en medio sólido selectivo y diferencial Agar SS, McConkey, Hektoen, XLD, desoxicolato citrato • – Aislamiento e identificación de las colonias • Reacciones químicas Tema. Escherichia coli• Aspectos generales• Grupo enteropatogénico (EPEC)• Grupo enteroinvasivo (EIEC)• Grupo enterotoxigénico (ETEC)• Grupo enterohemorrágico (EHEC) -> E. coli O157:H7• Toxinas LT y Verotoxinas• Factores que afectan a la supervivencia y al crecimiento• Métodos de aislamiento de E. coli Aspectos generales• Tipos • Enteropatogénico (EPEC) • Enteroinvasivo (EIEC) • Enterotoxigénico (ETEC) • Enterohemorrágico (EHEC) • Enteroadherente-agregativo (EAEC)• Características comunes de las cepas diarrogénicas • Fam. Enterobacteriaceae: Gram negativas, anaerobio facultativas • Habitante tracto intestinal, comensal 71
  • 72. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • genes de virulencia en plásmidos transmisibles. • toxinas citótonicas y citotóxicas. • especificidad de hospedador. • cada grupo patogénico se asocia con serotipos distintos. • Tienen dosis infectivas elevadas• Tipificación – Antigénica • antígenos somáticos O (170) • flagelares H (56) • capsulares K (80) fimbriales F • – Fagotipia, biotipificación, proteinotipia, antibiotipia, hemaglutinacion – Métodos genéticos Grupo enteropatogénico (EPEC)• Características del proceso – diarrea en agua de arroz con mucus. No hemorrágica o ligeramente – Afecta sobre todo a niños, en zonas con malas prácticas higiénicas• Fuente o reservorio – Seres humanos portadores sintomáticos o asintomáticos (heces)• Alimentos involucrados – Brotes relacionados con mayonesa, crustáceos, sucedáneo de café, agua y sobre todo, carne (fiambres, empanadas). – En general, cualquier alimento con contaminación fecal• Mecanismos de patogenicidad – Destruye las microvellosidades intestinales sin posterior invasión – La adhesión interfiere en el transporte electrolítico Adhesión en dos formas (EAF): localizada y difusa • – No hay producción de toxinas (o muy limitada: SLT) Grupo enteroinvasivo (EIEC) – atípico: anaerogénicos y no fermentan la lactosa o lo hacen lentamente – 1 grupo serológico y 11 serotipos (p. ej. O:124). – Relacionado antigénicamente con Shigella dysenteriae• Características del proceso – parecido a la disentería bacilar. – afecta al hombre principalmente. – caracterizado por la producción de heces mucosas y sanguinolentas. – También fiebre, escalofríos• Fuente o reservorio – seres humanos infectados.• Alimentos implicados – Relacionado con agua, queso, salmón, ensalada de patata. – No están presentes de modo natural en los alimentos-> contaminación por personal 72
  • 73. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León infectado.• Mecanismo de patogenicidad – Invasión del epitelio intestinal y multiplicación intracelular con inflamación y ulceración resultante. – Plásmido de elevado peso molecular: codifica la producción de OMP Grupo enterotoxigénico (ETEC)• Características del proceso – "diarrea del turista" – síndrome semejante al cólera (diarrea acuosa) ->deshidratación, shock, sin fiebre – espectro geográfico propio – dosis infectiva oscila entre 10^6 y 10^8 células• Reservorio – heces humanas• Alimentos involucrados – agua, vegetales regados, carne y productos cárnicos, leche y productos lácteos.• Mecanismo de patogenicidad – Colonizan la superficie del intestino delgado (fimbrias) – Elaboran una o más toxinas (plásmidos), -> acúmulo de agua en intestino delgado • ST • LT-> LTI y LTII (similar a toxina colérica, también a Verotoxinas). Grupo enterohemorrágico (EHEC) -> E. coli O157:H7 • Dosis infectiva muy baja • sorbitol negativa • MUG (4-metilumbeliferil-D-glucuronidasa) negativo (actividad ß-glucuronidasa)• Tres síndromes: – Colitis hemorrágica: diarrea sanguinolenta y fuertes dolores abdominales (vómitos -50%-, fiebre -33%-) – Síndrome urémico hemolítico: fallo renal en niños. – Púrpura trombocitopénica (SUH+fiebre+síntomas neurológicos) - adultos• Mecanismo de patogenicidad: – toxinas (tóxicas frente a líneas Vero) • Verotoxina I (VT I) o Shiga-like toxin I (SLT 1) • VT 2 o SLT 2 VT 3 • – Factor de adherencia (fimbrias, en plásmido) – OMP, en cromosoma – Enterohemolisina (en plásmido)• Reservorios – intestino en vacuno y ovino, ciego de aves• Alimentos implicados – carne, carne picada, hamburguesa, embutidos. Jugo de manzana, yogur – Reservorios 73
  • 74. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Alimentos implicados• E. coli enteroadherente-agregativo Toxinas LT y Verotoxinas• LT: Compuestas de • Pm=86 Kd. Estructural y antigénicamente similar a toxina colérica • 5 subunidades B: Unión a receptores de superf. de cél. eucarióticas (Gangliósido GM1): en cél. endoteliales de colon y glomérulos renales. Permite entrada de subunidad A a través del poro • 1 subunidad A: Tras la entrada, se hidroliza (A1 y A2). A1 activa la adenilato ciclasa irreversiblemente-> aumento del AMPc-> inhibición de la absorción de iones-> diarrea acuosa• ST • estimula la guanilato-ciclasa: aumento de los niveles de GMPc • STa (2 Kd) y STb (5 Kd)• VT1 y VT2 – Capacidad para producirlas: transmisión por un bacteriófago (directa o indirectamente de Shigella) – Compuestas de • 1 subunidad A (32 Kd) • 5 subunidades B (7,7 Kd) – Diferencia VT1-Shiga toxin: un aminoácido – VT1-VT2: 58% de homología – Actividad • Subunidad B: Unión a receptores de la superficie de células eucarióticas (globotryaosylceramide (Gb3): en células endoteliales de colon y glomérulos renales. Penetración en la célula por endocitosis • Subunidad A: N-glycosidasa que inactiva el ribosoma 28S (bloquea la síntesis proteica) • Citotóxicas para células Vero y HeLa, con receptores. Otras, sin actividad Factores que afectan a la supervivencia y al crecimiento• similar a Salmonella y otras Enterobacteriáceas – Tª= 7 - 48°C, • ETEC es tolerante al frío (crecen a 4-5°C). – pH: EHEC es resistente a la acidez • – No muy resistentes al calor ni a las radiaciones ionizantes. – relativamente resistentes a la congelación, (sobreviven 9 meses a -20°C) – algo resistentes (+ que Salmonella) a agentes del curado. – Mejor competidor que Salmonella frente a alterantes – su crecimiento se ve enmascarado por psicrotrofos (Pseudomonas)• Limiting conditions for pathogenic E. coli growth. Métodos de aislamiento de E. coli• Sistema clásico 74
  • 75. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Recuperación (preenriquecimiento) • Caldo nutritivo, 4-6h 35ºC – Enriquecimiento selectivo Caldo EE, caldo lauril sulfato triptosa (37, 44ºC) • – Siembra en medio solido selectivo • con sales biliares (selectivo) y lactosa (diferencial), incubación 94 h,37°C • Agar McConkey, Agar McConkey-purpura • Agar Levine • Agar Violet Red Bile • Agar McConkey Sorbitol (EHEC no fermenta el sorbitol y es glucuronidasa positivo)• ISO-Grid – Medios empleados: LMA (24 h a 35ºC) y BMA (2h a 35ºC) – Recuento por estimación del NMP• Detección/identificación – de EHEC y otros grupos. • Hibridación: 3-4 días • Separación inmunomagnética • inmunoblotting. 48 horas. • PCR + fingerprinting: http://www.hhmi.org/grants/lectures/biointeractive/web_video/ecoli.htm • Combinación de inmunoblotting y uso de membranas con rejilla hidrofóbica Combinación de anticuerpos marcados con enzimas y uso de membranas con rejilla • hidrofóbica. 24 h y 95% detección – de las toxinas • PCR • tecnicas serológicas (ELISA)• Estudio de la patogenicidad – Administración oral a monos – Test Sereny: inoculación en ojo – Asa intestinal ligada – Efecto en cultivos celulares Tema. Campylobacter• Aspectos generales• Campilobacteriosis• Mecanismo patogénico• Supervivencia y multiplicación• Epidemiología• Aislamiento y Detección• Identificación y tipificación• Prevención y control 75
  • 76. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León Aspectos generales• Características del microorganismo – Gram-negativos – Bacilos delgados curvados espiralmente, no esporulados y oxidasa positivos – Flagelo polar único – microaerófilos – Tª óptima de crecimiento (C. jejuni) es 42°C. Otras especies, 37ºC – Fragilidad – Baja dosis infectiva• Taxonomía – Incluye 14 especies – Clásicamente se dividían en dos grupos: catalasa + y - – En la actualidad • Termofílico o termotolerante (Tª óptima 42-43ºC): C. jejuni, C. coli, C. lari, C. upsaliensis (También C. hyointestinalis) • No termofílicos Campilobacteriosis• Grupos afectados – Niños, ancianos, y jóvenes entre 20 y 30 años• Dosis mínima infectiva – 200 células• Signos clínicos – Duración: período de incubación 3-5 d, hasta 10 d. – Dolor abdominal intenso, fiebre (>40ºC) – diarrea variable, desde heces sueltas hasta sanguinolentas – ausencia de vómito (o escasez)• Pronóstico – Persiste 3- 5 días (máximo 7 días) – Rara vez, los síntomas persisten más de una semana – 25% de los pacientes recaen (diarrea) – Complicaciones • En un pequeño nº de pacientes: septicemia, meningitis, colecistitis e infecciones respiratorias. • Síndrome Guillain-Barré• Tratamiento – Eritromicina -> recuperación Mecanismo patogénico. Debido a:• movilidad que favorece su capacidad de penetración.• capacidad de adhesión y colonización• carácter invasivo• Toxinas – Enterotoxina parecida a la del cólera y a la LT de ETEC. Se caracteriza porque aumenta su 76
  • 77. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León producción mediante pases en animales – Factor citotóxico, aparece en cultivos sonicados libres de células• Sideróforos• Resistencia a macrófagos• LPS• OMP• Factores mediados por plásmidos Supervivencia y multiplicación Epidemiología• Incidencia – Causa principal de enfermedades gastrointestinales – Brotes/casos esporádicos – Depende de los estudios y de la vigilancia – Diferencia países desarrollados/no desarrollados • infección sintomática en los países desarrollados • de carácter hiperendémico (tasa de infecciones asintomáticas muy alta) en países en vías de desarrollo• Hábitats – Reservorio: TGI de animales de abasto (vacuno, ovino, caprino, cerdos, y todo tipo de aves) – TGI de mascotas• Factores de riesgo – Alimentos • carne de pollo (Contaminación superior al 50%) • agua contaminada con heces de animales o aves • leche no pasteurizada – Contacto con animales Aislamiento y detección• Muestreo, transporte y almacenamiento – Temperatura. A 25º mueren más rapidamente que a 4ºC. – Atmósfera. Mejor en ausencia de Oxígeno (N2 100%) – Compuestos. Bisulfito sódico, 0.001%, tioglicolato sódico• Enriquecimiento – Método de Park (pollo) – Lovett et al. (leche) – Wesley et al. (carne) – Rogol. Usa caldo de enriquecimiento con sales biliares – Doyle y Roman.• Medios selectivos – Skirrow – Butzler – Blaser- Wang o Campy-BAP – Preston 77
  • 78. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – CCDA Identificación y tipificación• Identificación – Examen de colonias – Microscopía – Pruebas bioquímicas• Tipificación – Biotipado • En función de la producción de SH2-> dos biotipos de C. jejuni (Skirrow). También los distingue la producción de Delta-glutamil-aminopeptidasa – Fagotipado – Serotipado • 60 serotipos basados en el antígeno O – Esquemas • Penner • Fricker • Lior – Otros sistemas – Productos comerciales Prevención y control• Los habituales en otro tipo de bacterias: medidas higiénicas• Además: – Control en granja • sistemas de colonización (exclusión competitiva) – Control en industrias Mataderos: desecación. • – A nivel de consumidor • educación en BPM Tema. Listeria monocytogenes• Introducción• Listeriosis• Mecanismos de Patogenicidad• Incidencia y Epidemiología• Factores que afectan a la supervivencia y al crecimiento de Listeria• Aislamiento e Identificación• Prevención y control Introducción• Historia• Taxonomía – Bacilos o coco-bacilos Gram-positivos, anaerobios facultativos y no esporulados. – Especies 78
  • 79. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • L. monocytogenes • L. ivanovii • L. seeligeri • L. innocua, L. welshimeri, L. grayi, L. murrayi, L. denitrificans – Diferenciación de Listeria monocytogenes de otras especies de Listeria Listeriosis – Zoonosis, infección de baja incidencia con elevada letalidad y gravedad de lesiones y secuelas – Dosis mínima infectiva • quizá es suficiente con 100 células – Factores de hospedador que determinan la susceptibilidad a la listeriosis (infección oportunista) • Gestación • Inmunocompetencia • Alimentación • Micronutrientes • Clima • estrés, especie, factores genéticos, edad, tratamientos antiulcerosos – Período de incubación: 3 d- 4 semanas – Sintomatología • Gripe • Síntomas materno-fetales • Recién nacido • Meningitis, encefalitis y meningoencefalitis • Septicemia • Granulomatosis oculo-glandular • Granulomas generalizados – Pronóstico – Tratamiento: antibioterapia Mecanismos de Patogenicidad• Parásito intracelular – células del sistema mononuclear fagocítico – células no fagocíticas (ej: células epiteliales).• Pasa de célula a célula al abrigo del sistema inmune• Invasividad• Toxinas – Hemolisina: Listeriolisina O – Otras enterotoxinas y endotoxinas• Estudio de la patogenicidad – Hemólisis • agar sangre • CAMP-test 79
  • 80. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • microplaca – Animales de experimentación • test de Anton • DL50 • cultivos celulares Incidencia y Epidemiología• Brotes• Ubicuidad• Distribución en agua, pasto, ensilados, animales• Hábitat – heces animales y humanas – suelo, fangos, aguas superficiales, vegetación y ensilado• Alimentos – Leche • cruda pasterizada • – Derivados lácteos – Carne cruda – Productos cárnicos – Hortalizas Factores que afectan a la supervivencia y al crecimiento de Listeria• Temperatura – Psicrotrofo (1,1ºC):Tª mínima de multiplicación es de 1.1°C – Tª máxima de multiplicación es de 45°C – Tiempo de generación a 4°C es de 30-40 horas – Cuando se multiplican a baja Tª, mayor virulencia• Termorresistencia – Pasterización (leche)• Irradiación – Sensible• Resistencia a – Elevadas concentraciones de sal (10% de ClNa) – Concentraciones de nitritos habituales – Se multiplican bien en atmósferas modificadas – Se multiplican a temperaturas de refrigeración – Cierta tolerancia a las condiciones ácidas Aislamiento e Identificación• Preenriquecimiento – Enriquecimiento en frío – Enriquecimiento selectivo• Agentes selectivos – ácido nalidíxico, tiocianato potásico, acriflavina, cloruro de litio, polimixina B 80
  • 81. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Agentes diferenciales – azul tripan y esculin• Medios de cultivo – PALCAM – LSAMm – OXFORD• Identificación: API-Listeria• Tipificación – Antisueros: 4 serogrupos (1/2, 3,4 y 7) y 13 serovares (p.ej. 1/2 a) – Fagos – Pruebas genéticas Prevención y control• Minimizar la contaminación de los alimentos• Educación de los consumidores, especialmente los grupos de riesgo Tema. Clostridium perfringens• Aspectos generales• Características de crecimiento• Secuencia de pasos en la presentación de la toxiinfección• Toxiinfección alimentaria por Cl. perfringens tipo A• Patogenia• Toxinas• Diagnóstico de la toxiinfección alimentaria• Epidemiología• Prevención y control Aspectos generales• Tipos de síndromes – Infección alimentaria por Cl. perfringens tipo A – Enteritis necrotizante (Pig bel)• Microorganismo – bacilo Gram-positivo, anaerobio obligado, formador de endosporas – Termorresistente – Rápido crecimiento a Tª elevada • tiempo de generación a 45°C de sólo 12 minutos – Esporulación en el intestino delgado y producción de toxina• Clasificación de Cl. perfringens en base a sus exotoxinas – tipo A: responsable de la toxinfección • termolábil o clásico • termorresistente – tipo C: Enteritis necrotizante • adhesión a células de la pared intestinal y • producción de toxinas necrosantes de la mucosa 81
  • 82. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León Características de crecimiento• aw – mínima para el crecimiento de 0,95-0,96• pH – óptimo entre 6-7 (también para producción de toxina) – por debajo de 5,5 inhiben el crecimiento, – por debajo de 5,0 los microorganismos mueren en pocos días• sales del curado – se multiplica por encima del 6% ClNa• termorresistencia – A termolábil D100>1 min • – A termorresistente • D100 6-17 min• Limiting conditions for C. perfringens growth. Secuencia de pasos en la presentación de la toxiinfección• Presencia en el alimento (típicamente carne) de esporas termorresistentes – Contaminación en matadero o manipulación• Preparación del alimento: proliferación microbiana gracias a circunstancias favorables – Calentamiento activa esporos y elimina oxígeno – Refrigeración inadecuada – Aprovecha tiempos de generación cortos a Tª elevada – Necesita altos números de células vegetativas (más de 10^6 céls/gr)• Consumo: – multiplicación al alcanzar el tracto digestivo – esporulación en el intestino delgado – liberación de la enterotoxina Toxiinfección alimentaria por Cl. perfringens tipo A• Aparición de los síntomas – 8-12 horas tras la ingestión de la comida contaminada• Signos clínicos – dolor abdominal – diarrea profusa – No está acompañado por fiebre ni vómito – Duración breve, los síntomas desaparecen en 12-24 horas – Autolimitante• Complicaciones – No hay lesiones en la mucosa intestinal. Regresión espontánea en 24-48 horas, sin secuelas – niños pequeños, ancianos, pueden resultar más serios, pues la deshidratación ocasionada por la diarrea puede ser grave 82
  • 83. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León Patogenia• Esporulación en el intestino• Ruptura del esporangio y liberación de la toxina• Secreción de líquido, sodio y cloruros en el intestino• Toxinogénesis – En principio, ligada a la esporulación. – Pero hay producción de enterotoxinas sin – esporulación por • cepas esporuladas • en medios corrientes • y por mutantes esporo-deficientes. Toxinas• Exotoxinas (hasta 13) – Toxina alfa: Fosfolipasa C que hidroliza la lecitina en fosforilcolina y un diglicérido. Hemolítica y necrotizante – Toxina beta: polipéptido de cadena simple (Pm=30.000). Aumenta la permeabilidad capilar – Toxinas epsilon e iota, protoxinas activadas por enzimas proteolíticos, (tripsina). Aumentan la permeabilidad vascular• Enterotoxina – Polipéptido (19 aa) de cadena simple, PI 4,3 PM 34.000 d. – Dos zonas: hidrofóbica e hidrofílica • la fracción hidrófila de la molécula serviría para la fijación específica y la zona hidrófoba penetra en el interior: responsable de los efectos biológicos • En enterocitos, la enterotoxina (zona hidrófoba) se fija específicamente a una proteína de pm 50 Kd • unión imprescindible para que la toxina ponga en marcha su actividad biológica. – Estructura inmunológica común – termolábil, destruyéndose a temperaturas de 60ºC durante 10 min – no inactivada por tripsina Diagnóstico de la toxiinfección alimentaria• Análisis bacteriológico – del alimento o de las heces – Procedimiento • Siembra directa en medio selectivo (antibióticos) y diferencial (sulfito y fuente de Fe)-> colonias negras por reducción a sulfuro + Fe (negro) • Agar TSC (triptosa sulfito cicloserina) y SPS (sulfito polimixina sulfadiazina) • Incubación a 37ºC 24 h• Detección de la enterotoxina – Extracción por diálisis – Detección basada en sus propiedades biológicas • Produce acumulación de líquidos en asa intestinal ligada • Produce dermoeritematosis, al provocar un aumento de la permeabilidad capilar 83
  • 84. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Citotoxicidad en cultivos celulares Vero Letal para el ratón • – Detección basada en sus propiedades serológicas • Inmunodifusión doble en agar • electroinmunodifusión • contra-inmunoelectroforesis • hemoaglutinación pasiva • ensayos inmunoenzimáticos • látex-aglutinación – Detección basada en sus características genéticas Epidemiología• Hábitat de las esporas – ampliamente distribuido en el ambiente – aislado frecuentemente de intestino de hombre (80-100%) y animales domésticos – Tracto gastrointestinal, suelo – Las esporas pueden permanecer en el suelo, sedimentos y áreas contaminadas con efluentes humanos o animales• Incidencia – causa frecuente de intoxicación alimentaria• Alimentos implicados. Normalmente – un producto cárnico (vacuno, cerdo, cordero, pollo y pavo. Carne cocinada, estofados, empanadas) – preparado en gran cantidad y – conservado largo tiempo a temperatura ambiente• Ámbito – Lugares de preparación de alimentos en grandes cantidades (empresas de catering, restauración colectiva) Prevención y control• Limitar la contaminación de los alimentos – Respetar las técnicas correctas de sacrificio, – evitar bacteriemias y contaminaciones exógenas• Evitar condiciones que permitan el crecimiento de Cl. perfringens – empleo (en almacenamiento de productos preparados) de temperaturas fuera de su rango – ojo con los productos grandes: interior difícil de refrigerar• Destruir las células vegetativas – Recalentamiento • rápido • a Tª adecuada Tema. Yersinia enterocolitica.• Introducción• Enfermedad: yersiniosis• Mecanismos de patogenicidad. Virulencia 84
  • 85. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Factores epidemiológicos• Factores que afectan a su supervivencia y multiplicación• Aislamiento e identificación• Control Introducción• Familia Enterobacteriaceae• Especies de interés – Y. pestis (responsable de la plaga o peste bubónica, transmitida por pulgas->zoonosis) – Y. pseudotuberculosis (patógeno de animales), también patógeno de hombre, pudiendo estar implicados los alimentos – Y. enterocolitica. Principales serotipos patógenos O:3, O:8 y O:9 – Otras especies avirulentas (Y. kristensenii, Y. fredriksenii, Y intermedia, Y. aldovae, "Y. enterocolitica-like"), oportunistas.• Características fenotípicas y de crecimiento – Bacilo-coco pleomórfico, Gram negativo, anaerobio facultativo, – Capacidad de crecer a bajas temperaturas (4ºC) y condiciones de alcalinidad-> aislamiento (en preenriquecimiento). – Inmóvil a 37ºC. Móvil (flagelos peritricos) a 30ºC. Enfermedad: yersiniosis• Período de incubación – Máximo de 1-2 días. Duración 1-3 d.• Dosis infectiva desconocida• Intensidad de los síntomas. Depende de – Cepa ingerida, dosis, características genéticas, de edad y salud del hospedador.• Síntomas – Gastroenteritis: diarrea, fiebre, cefalea, en ocasiones vómitos, – Característicamente dolor agudo abdominal en la zona ventral inferior derecha• Pronóstico – Enfermedad autolimitante – Sólo en ocasiones: complicaciones crónicas serias • artritis • enfermedades autoinmunes • septicemias Mecanismos de patogenicidad. Virulencia• Temperatura: regula la expresión de genes de virulencia. – Algunos genes son encendidos a 26 y apagados a 37ºC y con otros sucede al revés. – Se sugiere que los genes que codifican para la invasion se encienden a Tª bajas, mientras que los pasos subsiguientes en la patogénesis requieren el apagar dichos genes y encender los otros• Como otras Enterobacterias, control de la virulencia por genes cromosomales y plasmídicos – Genes cromosomales-> 85
  • 86. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • invasión o internalización • Enterotoxina: • implicación no clara • similar a ST de ETEC en propiedades y actividad • producida a bajas temperaturas – Genes plasmídicos (plásmido de 40-48 Mdaltons, pVY) • adherencia, por proteínas de membrana externa o yops -> común a las tres especies patógenas Otras características reguladas por el plásmido: autoaglutinación, resistencia a • sueros, citotoxicidad para macrófagos, producción de antígenos V y W, y la respuesta a bajos niveles de Ca o LCR – Endotoxina: no importante en infecciones alimentarias Factores epidemiológicos• Individuos susceptibles – Niños (síntomas más graves) – Ancianos – personas inmunodeprimidas. Los más susceptibles a la artritis poseen el antígeno de linfocitos HLA-B27 (o relacionados: B7)• Incidencia – Más alta en países fríos (Escandinavia), y aquellos con hábitos alimenticios (Bélgica, cerdo crudo).• Distribución – Global. Se aísla de muchos animales y ambientes (aguas, fangos). De alimentos, normalmente cepas avirulentas – O:3, serotipo global; O:9, europeo; O:8, americano.• Reservorio entre animales de abasto – Cepas virulentas en cerdo (cavidad oral y tracto gastrointestinal, único lugar conocido)• Alimentos implicados – Leche cruda, carne fresca (de cerdo), carne picada – Importante la contaminación post-procesado• Brotes Factores que afectan a su supervivencia y multiplicación – Temperatura • Sensible al calor. Destruido por los tratamientos de pasterización normales. • Temperatura óptima: 32ºC-34ºC. • Psicrotrofo (0ºC-44ºC). – Rango de pH 4.6-9.0 (óptimo 7-8) – Resiste hasta 5% de ClNa. – Sensible a las radiaciones – Sensible a desinfectantes como cloro – Atmósfera • Puede crecer en anaerobiosis • Inhibido por CO2 pero necesita de la acción combinada del pH, Tª y atmósferas 86
  • 87. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León para detener su crecimiento – En condiciones normales la flora autotóctona del alimento compite ventajosamente y es inhibido por ella Aislamiento e identificación• Preenriquecimiento • para rebajar niveles de flora acompañante y estimular Yersinias – Tª de incubación. No es necesario rebajar la Tª hasta 4°C (9º) – Medios líquidos no selectivos (PBS, phosphate Buffer Saline). – Medios selectivos (BOS broth, bile-oxalate-sorbose) – Se prefieren medios como el TSB o PBS+2% peptone, (alto contenido proteínico y baja glucosa) – Dos pasos del preenriquecimiento (no selectivo y selectivo, Tª 22ºC)-> para aislar el máximo número de yersinias y de todos los serovares.• Siembra en medios selectivos• Detección por hibridación de DNA• Identificación• Determinación de virulencia in vitro – dependencia al Ca a 37ºC – morfología de la colonia a la misma tª -> correlación con plásmido. – Autoaglutinación – Toma de los colorantes Methylene blue y rojo Congo (en placa)• Tipado – Biotipado (propiedades bioquímicas) Esquema Bercovier-Mollaret, modificado por Cornelis, (6 biovares). test de • pirazinamidasa (ez infrecuente en patógenos). – Serotipado (antígenos O) • Esquema de Wauters: 57 tipos antigénicos • Esquema simplif. de Aleksic y Bochemuhl-> 18 serovar., 20 O ag • No existen kits comerciales-> laboratorios especializados • Relación entre bioserovares, distribución geográfica y patogenicidad Control• Actuación a diversos niveles – Cría de animales libres de patógenos – Mejora de la higiene en la producción, sacrificio, procesado y distribución de alimentos – Establecer sistemas de APPCC – Educar y formar manipuladores (operarios de matadero, inspectores) y consumidores – Evitar el consumo de productos como carne de cerdo fresca• Otros aspectos – Atención a su capacidad de crecimiento a temperaturas y condiciones que impiden el desarrollo de flora inhibidora -> cuidado especial con recontaminaciones Tema. Especies patógenas de Vibrio• Introducción 87
  • 88. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Vibrio cholerae• Vibrio parahaemolyticus• V. vulnificus• Otros vibrios Introducción• Características – Vibrionaceae. Bacilos Gram-negativos, anaerobio-facultativos, móviles – Flagelo polar característico – Hábitat marino. Crecimiento: se estimula por iones Na – Fase viable pero no "cultivable": persistencia en el ambiente• Especies responsables de toxiinfecciones alimentarias – V. cholerae cólera asiático (pandemias del siglo XIX) • – V. parahaemolyticus • Asociado a consumo de pescado crudo. En Japón, elevada incidencia – V. vulnificus Gran invasividad, septicemia, mortalidad elevada • – V. fluvialis, V. mimicus, V. hollisae, V. metschnikovii, V. cholerae no-O1 • Asociados con diarreas suaves, sin complicaciones• Aislamiento e identificación de Vibrio spp. – Enriquecimiento (3% ClNa) – Siembra en medios sólidos selectivos. – Identificación y diferenciación de especies enteropatógenas• Factores que afectan a su supervivencia y multiplicación – Resisten elevadas cc de sal (min 5%) – Rango pH en torno a 5-10 – Temp 10-43 (V. parahaemolyticus es psicrotrofo) • V. cholerae • V. parahaemolyticus • V. vulnificus Vibrio cholerae – History and spread of epidemic cholera• Tipificación – Serotipificación • V. cholerae O grupo 1 (O1) (origina el cólera) (Ogawa, Inaba, e Hikojima) • V. cholerae O grupo 139 Bengal • V. cholerae no O1 (vibrios NAG, no aglutinables) – Biotipificación V. cholerae O1 clásico y “El Tor”. • – Otros esquemas• Sintomatología del cólera – incubación: 6 h - 5 d. 88
  • 89. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – heces: diarrea en agua de arroz. – Pérdida de líquido (hasta 1 litro/h). Pérdida de K y de bicarbonato – Alteración de la función renal• Tratamiento de las infecciones – rehidratación intravenosa – corrección de las alteraciones del equilibrio ácido-base y electrolitos – fármacos utilizados: tetraciclina y menos, furazolidona – Vacunas• Epidemiología – Últimas pandemias • Sudamérica (1991-94). 1040.000 casos y 9.600 muertes Bangladesh (1992-93) • . Serotipo 0139 Bengal – Alimentos asociados • agua: el vehículo más importante. Sirve de vehículo alimentos: Sobre todo pescado y marisco de aguas contaminadas y consumidos • crudos – El Tor, asociado a epidemias – Personas con riesgo particular de sufrir infecciones • malnutrición, pobreza, acidez gástrica baja, factores genéticos (grupo O), enf. hepáticas • Contacto con los vibrios• Mecanismos de patogenicidad – Control genético de factores de virulencia en cromosoma • Producción coordinada de factores de virulencia • Proteína TOXR necesaria para la expresión de virulencia (CT y adhesión por fimbrias) TOXR responde a señales del medio ambiente: osmolaridad baja y asparragina • – Colonización del intestino delgado • Movilidad y Quimiotaxis Adherencia • – Estructura y modo de acción de la toxina CT (similar a LT y VT) – Proteasas – Otras toxinas• Determinación de la virulencia in vitro – Cultivos celulares – Animales de laboratorio – Enterotoxina Vibrio parahaemolyticus• Tipificación – Serotipificación. • Antígenos O (11) y K (71) Antigenic scheme of V. parahaemolyticusa • – Biotipificación 89
  • 90. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Kanagawa: presencia de una hemolisina termostable (Vp-TDH)• Síntomas – Diarrea con dolor abdominal y naúseas – Personas con un riesgo particular de sufrir infecciones por Vibrio parahaemolyticus.• Mecanismos de patogenicidad – Control genético – Adherencia y Penetración. La capacidad invasiva parece ser una característica de todas las cepas • – Infección sistémica – Compuestos • Vp-TDH (Hemolisina Termostable Directa) • toxina termolábil, fosfolipasa A, lisofosfolipasa y glicerilfosforilcolina esterasa.• Determinación de la virulencia in vitro – Reacción de Kanagawa – Gene probes V. vulnificus• Enfermedad – Síntomas: acompañados a septicemia malestar, escalofríos, fiebre y postración • – Tratamiento de la infección• Mecanismos de patogenicidad – Adherencia y penetración – Resistencia a la fagocitosis. – Resistencia al suero humano. – Efecto del exceso de hierro. – Producción de toxinas • Hemolisinas (citotóxica y citolítica) Enterotoxina • – Otros productos (fosfolipasas, proteasas, otras enzimas)• Determinación de la virulencia in vitro – Animales de laboratorio• Personas con un riesgo particular de sufrir infecciones – Pacientes de más de 50 años con problemas: • enfermos del hígado, exceso de Fe, alcoholismo, cáncer, problemas renales, enfermedades gástricas, (aclorhidria y procesos inflamatorios intestinales), empleo de esteroides e inmunodeficiencia Otros vibrios• Especies – V. fluvialis – V. mimicus – V. hollisae – V. metschnikovii 90
  • 91. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – V. cholerae no O1• Personas con un riesgo particular de sufrir infecciones• Mecanismos de patogenicidad de estas especies enteropatógenas – Disponibilidad de Fe – Compuestos extracelulares Tema. Aeromonas• Aspectos generales• Signos clínicos de las infecciones por Aeromonas• Mecanismos de patogenicidad• Factores que afectan al crecimiento y supervivencia de Aeromonas en alimentos• Ecología, epidemiología• Métodos de aislamiento e Identificación• Control de Aeromonas en alimentos Aspectos generales• Aeromonas: perteneciente a la familia Aeromonadaceae – Características: Bacilos Gram-negativos, anaerobios facultativos, no esporulados y oxidasa- positivos• Especies – A. hydrophila – A. sobria • A. veronii biotipo sobria, A. jandaei y la propia A. sobria. – A. caviae – A. schubertii, A. veronii biotipo veronii, A. eucrenophila• Hábitat principal acuático• Responsables de – infecciones extraintestinales – infecciones de heridas – toxinfecciones alimentarias • Considerados, tradicionalmente, oportunistas en individuos susceptibles (YOPI) • Hay casos descritos de gastroenteritis por Aeromonas en individuos sanos Signos clínicos de las infecciones por Aeromonas• Tres tipos (patrones síntomáticos) – Parecido al cólera. Diarrea de agua de arroz – Diarrea con mucus hemorrágico. Disentérico – Gastroenteritis con diarrea prolongada• Diarrea – Duración 1-7 d – Benigna y autolimitante – Casos con síntomas durante semanas. – Excepcionalmente, los pacientes requerirán rehidratación y/o una terapia antibiótica adecuada (similar al cólera) 91
  • 92. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León Factores que afectan al crecimiento y supervivencia de Aeromonas en alimentos• Capaces de crecer a temperaturas de refrigeración (incluso por debajo de 4-5°C)• Ligera halotolerancia (4% NaCI).• Sensible a tratamientos térmicos suaves y se inactiva fácilmente por el cocinado.• Resistente al CO2. Capaz de crecer en alimentos envasados en atmósferas modificadas.• Sensible a las radiaciones ionizantes. Ecología, epidemiología• Ecología – Hábitat acuático (agua dulce de zonas templadas, principalmente) – Ampliamente distribuidas en el ambiente – Presentes en intestino de peces sanos – Capacidad de adaptación y rápida velocidad de crecimiento• Alimentos – Aisladas de gran número de alimentos• Casos esporádicos de intoxicación alimentaria Métodos de aislamiento e identificación• Enriquecimiento – agua de peptona alcalina (pH 8.5), – muestras clínicas: caldo nutritivo suplementado con ampicilina• Medios de cultivo – incubación 24-48 horas a 28°C (muestras ambientales y alimentos) o 37°C (muestras clínicas) – GSP (Glutamato, Almidón, Penicilina) – SAA (Agar Almidón Ampicilina) – Aeromonas Agar• Identificación – API 20NE – Esquema clásico de Abbot Mecanismos de patogenicidad• Patogenicidad controvertida – Falta de correlación producción de toxinas-gastroenteritis• Factores – Asociados a productos extracelulares Hemolisina-a, Hemolisina-b, Enterotoxina citotónica, Proteasa termolábil, • Proteasa termoestable, a-amilasa, Quitinasa, Sideróforos – Asociados a la célula Invasinas, Resistencia a sueros, Plásmidos, Adhesinas • – Factores extracelulares • Pilis, Capas-S, LPS, OMPs 92
  • 93. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Determinación de la virulencia in vitro – A. hydrophila y A. veronii sobria (A. sobria). • actividad proteolitica: Utilizando azocaseína como sustrato. • actividad hemolítica • toxicidad a nivel celular (citotoxicidad). • Ensayos electroforéticos • actividad enterotoxigénica – A. caviae • Estudios relativos a su capacidad invasiva sobre monocapas de células HEp Control de Aeromonas en alimentos• Varios problemas – Frecuente presencia en los alimentos, – Muchas cepas psicrotrofas. – Capaces de alcanzar altos recuentos incluso en alimentos refrigerados. – El procesado térmico y/o el cocinado suelen ser suficientes para destruirlos. – Alimentos crudos o con un cocinado insuficiente son potencialmente peligrosos (concentración activa en moluscos) Tema. Otros agentes de procesos gastrointestinales transmitidos por los alimentos.• Plesiomonas shigelloides• Otros microorganismos• Tres grupos – Patógenos oportunistas • Plesiomonas shigelloides • especies de Enterobacteriaceae • Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecium • – Agentes probables pero controvertidos (otras vías de contagio) • Clostridium difficile • Coxiella burnetti – Agentes de procesos graves (históricos) • Brucella • Mycobacterium • Streptococcus pyogenes Plesiomonas shigelloides• Características generales – Como Aeromonas, patógeno oportunista – Aislada en el 5% de muestras de heces en pacientes sanos – Diarrea suave pero complicaciones en ciertos pacientes – Características 93
  • 94. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Bacilos Gram-negativos, anaerobios facultativos, no esporulados y oxidasa- positivos • Confusión con Enterobacteriaceae – Debida al consumo de marisco crudo y agua – Característica de zonas tropicales• Enfermedad: gastroenteritis por Plesiomonas – Síntomas • Período de incubación de 1 a 2 días. • Duración de la enfermedad: 1-7 días • Diarrea ligera con heces acuosas no hemorrágicas, naúseas y dolor abdominal • Vómitos, fiebre y dolor de cabeza ocasionales • Enfermedad autolimitante – Dosis infectiva: se cree elevada (por encima de 10^6 microorganismos)• Mecanismo de patogenicidad – No esclarecido. Se cree debido a, fundamentalmente: • Capacidad invasiva • Actividad enterotóxica: toxina termolábil y toxina termoestable• Ecología y epidemiología – Factores que afectan al crecimiento y supervivencia – Alimentos implicados en brotes • ostras y otro marisco crudo • agua – Característica de zonas tropicales y en meses de verano• Aislamiento e identificación – Enriquecimiento • no selectivo (agua de peptona alcalina) selectivo: muestras muy contaminadas (caldo tetrationato con yodo) • – Siembra en medio sólido • Agar Inositol Bilis Verde Brillante, Plesiomonas Agar – Confirmación de cepas sospechosas • Pruebas bioquímicas: oxidasa, prueba del TSI y prueba del Inositol Gelatina • Serotipificación • antibiogramas• Control en alimentos • atención al consumo de productos de origen acuático, de áreas subtropicales y templadas en meses cálidos del año, que no hayan sido cocinadas adecuadamente • empleo de atmósferas modificadas Otros microorganismos• Pseudomonas aeruginosa – Patógeno oportunista (grupos de riesgo: ancianos y niños) – Presente en agua embotellada y de grifo• Enterobacteriaceae – Características comunes 94
  • 95. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Posible transferencia de factores de virulencia vía plásmidos • Hábitat intestinal. Aislados de heces y alimentos • Aislamiento a partir de McConkey • Generalmente patógenos oportunistas – Citrobacter (C. freundii y C. diversus) – Edwarsiella (E. tarda) – Enterobacter (E. cloacae, E. sakazakii) – Klebsiella (K. pneumoniae, K. planticola) – Proteus (P. vulgaris), Providencia (P. mirabilis), Morganella (M. morganii) – Serratia (S. marcescens, S. liquefaciens)• Clostridium difficile – Presente en tracto gastrointestinal – Menor importancia – Asociado a tratamiento antibiótico o antineoplásico – Gastroenteritis debida a colonización y crecimiento en el intestino – Lesiones variables en la mucosa: colitis pseudomembranosa – Productor de dos toxinas • A, citotóxica B, favorece la movilidad y acumulación de fluidos • – La relación de esta toxiinfección con el consumo de alimentos no está clara• Coxiella burnetti (fiebre Q) – Familia Rickettsiae – Parásito intracelular obligado (en vacuolas) – Síntomas fiebre, neumonía, cefalea y endocarditis (rara) • – Vías de contagio • respiratoria (aerosoles) oral (leche) • – Resiste el TT de 61ºC durante 30 min• Enterococcus (E. faecalis y E. faecium) – Controvertido – Resultados variables en voluntarios humanos• Brucella (B. abortus, B. melitensis y B. suis) – Cocobacilos Gram-negativos – Enfermedad profesional – Leche cruda y productos lácteos pueden ser vehículo (carne, más raramente)• Mycobacterium – Relacionados taxonómicamente con Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus – Control: pasteurización de la leche, saneamiento ganadero, inspección• Streptococcus (S. pyogenes) – Ocasiona escarlatina y faringitis en hombre. Mamitis en animales – Alimentos implicados: leche y otros alimentos crudos (ensaladas) 95
  • 96. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Parásitos – Protozoos • Entamoeba histolytica • Toxoplasma gondii • Cryptosporidium parvum • Giardia lamblia • Balantidium coli – Toxinas de moluscos • PSP • NSP • DSP • ASP Tema. Virus transmitidos por los alimentos• Introducción• Procesos transmitidos por alimentos• Aspectos epidemiológicos• Influencia de distintos parámetros en la infectividad de partículas víricas• Detección, prevención y control Introducción• En alimentos – normalmente esféricos y pequeños (25-70 nm) – Composición sencilla (ADN/ARN, proteínas, y a veces, lípidos) – Inertes – Replicación • Adhesión • Endocitosis • Desprendimiento de la cubierta • Formación de proteínas • Acoplamiento • Liberación• Características – no multiplicación en alimentos->vectores – difícil estudio: epidemiología confusa – subestimación• Daños producidos – Muerte de la célula – Pérdida de funcionalidad de un tejido – Proliferación celular Procesos transmitidos por alimentos – Gastroenteritis • Rotavirus 96
  • 97. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Adenovirus • Norwalk y Norwalk-like • Astrovirus • Coronavirus – procesos respiratorios • Rotavirus • Adenovirus • Rinovirus – hepatitis – poliomielitis – otros• Gastroenteritis – Rotavirus • Afecta a bebés y niños • Incidencia: zonas templadas, ambientes urbanos, meses frescos • Vía: agua, inhalación • Síntomas: gastrointestinales y respiratorios • Tres grupos: A, B, C • Aislamiento – Adenovirus • Procesos gastroentéricos, respiratorios y genitourinarios – SRSV (Small, round, structured virus). Norwalk y Norwalk-like • Vías: agua de consumo público, piscinas • Vómitos (violentos) y/o diarrea (explosiva). Fiebre, náusea y dolor abdominal – Astrovirus • niños de menos de un año • asociados a parvovirus – Coronavirus – Calicivirus • casos esporádicos en bebés • Invierno• Procesos respiratorios • Vías respiratoria y oral (agua y alimentos) • síntomas: anginas, tonsilitis, faringitis, otitis• Hepatitis – Hepatitis A • incubación de 3-6 semanas • Síntomas: malestar, fiebre, fatiga, náuseas. Síntomas hepáticos (ictericia, orina coloreada) • Alimentos Prevención: inmunización pasiva en frupos de riesgo • – Hepatitis E • Alimentos y agua contaminados. También hay contacto persona-persona 97
  • 98. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Período de incubación muy largo síntomas similares y autolimitantes • – Poliomielitis • transmitida por leche cruda en EE.UU. (1940)• Otros – Echovirus – Virus agentes de enfermedades animales raramente transmisibles – Virus oncogénicos Aspectos epidemiológicos• Contaminación endógena – animales enfermos • vía leche (cruda o pasteurizada recontaminada) • vía carne – moluscos bivalvos • acumulación por filtración activa • dudas sobre depuración • fuente de contaminación cruzada• Contaminación exógena – vegetales (lechugas, tomates) • regados con aguas residuales o abonados con excrementos humanos – agua no higienizada (23%) – hielo – insectos y roedores – manipuladores • importante en platos que no se calientan tras manipulación – contaminación cruzada Influencia de distintos parámetros en la infectividad de partículas víricas• Tratamientos físicos – refrigeración y congelación supervivencia • – tratamiento térmico • SRSV y hepatitis A: inactivados a 90ºC durante 50 min. – deshidratación y liofilización – radiaciones • ionizantes: muy resistentes • uv: eficacia limitada – desinfectantes químicos • Gran importancia. recomendados con cloro – pH – depuración – parámetros biológicos 98
  • 99. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León Prevención, control y detección• Detección mediante microscopio electrónico – Metodología complicada, tediosa – Detección en alimentos muy difícil, en heces: microscopio electrónico – Procedimiento • Separación: centrifugación diferencial • Concentración: gradiente de ClCs • examen microscópico: tinción negativa• Indicadores: coliformes, colifagos• Serología: EIA (enzyme immuno assay)• Medidas de prevención y control – Medidas de higiene – Tratamiento de aguas residuales – Higienización de aguas – Higiene de manipuladores – Cocinado – Vacunas grupos de riesgo? 99
  • 100. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León Tema. Microbiología y análisis microbiológico de la leche cruda, de la leche pasteurizada y de la leche esterilizada• Leche como sustrato para la multiplicación microbiana: Factores intrínsecos• Origen de los microorganismos presentes en la leche cruda• Métodos para evitar la contaminación de la leche cruda en la granja• Alteraciones de origen microbiano de la leche cruda y microorganismos responsables• Microorganismos patógenos• Métodos para prolongar la vida útil de la leche• Evaluación de la calidad higiénica de la leche cruda• Leche pasterizada• Leche esterilizada• Control microbiológico Leche como sustrato para la multiplicación microbiana: Factores intrínsecos• Definición de leche cruda • La leche producida por la secreción de la glándula mamaria de una o varias vacas, ovejas, cabras o búfala y que no haya sido calentada a una temperatura superior a 40ºC ni sometida a un tratamiento de efecto equivalente• Nutrientes• Factores fisicoquímicos – pH, aw, Eh• Compuestos antimicrobianos – específicos • Ig: aglutininas • polimorfonucleares Nisina, bacteriocinas • – inespecíficos • sistema lactoperoxidasa/tiocianato • Lactoferrina • Lisozima • Quelantes de vitaminas Origen de los microorganismos presentes en la leche cruda• del interior de la ubre – Animales con ubres sanas (10^3 ufc/ml) – Animales con ubres infectadas (mamitis)• del exterior de la ubre y pezones – Microflora normal del exterior de la mama: Micrococáceas, corinebacterias, lactobacilos, cocos, levaduras• del medio ambiente – piensos: aerobios esporógenos (restos de tierra) – piensos ácidos: BAL y clostridios – polvo de heno y tubérculos: mohos y bacterias esporuladas aerobias 100
  • 101. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – estiércol, camas (hasta 8-9 ul/g): enterobacteriáceas, enterococos (Str. faecalis), lactobacilos, esporulados – agua, aire, insectos, roedores, brazos y manos del personal• del equipo de ordeño y tanque de almacenamiento en la granja y durante el almacenamiento de la leche cruda – estreptococos lácticos, coliformes, psicrotrofos (Gram-negativos -PAM-, termodúricos - micrococos, bacilos, brevibacterias-) Métodos para evitar la contaminación de la leche cruda en la granja• Controlar el estado higiénico-sanitario del animal – prevención y control de mamitis• Mantener medidas higiénicas adecuadas – Higiene en el ordeño – Diseño higiénico de instalaciones y materiales – Programas de limpieza y desinfección • exterior del animal: ubre y pezones sobre todo utensilios • – Pruebas para evaluar la limpieza y desinfección – Programas de control de pestes – Evitar contaminaciones del aire, agua – Control y formación del personal Alteraciones de origen microbiano de la leche cruda y microorganismos responsables – Acidificación • Streptococcus lactis (Lactococcus lactis) a Tª ambiente • Streptococcus thermophilus (Str. salivarius var. thermophilus), Str. (Enterococcus) faecalis y Lactobacillus bulgaricus (L. delbrueckii subsp. bulgaricus) a Tª 37-55ºC • Lactobacillus thermophilus a Tª más elevada Bacterias no ácido-lácticas: coliformes, Micrococcus, Microbacterium, Bacillus. • – Producción de gas • Coliformes, Clostridium, levaduras (Candida, Torula), Bacillus, acidolácticas heterofermentativas, propiónicas. – Proteolisis • Acida: Micrococcus; Streptococcus faecalis var. liquaefaciens; Bacillus; esporulados fermentadores de la lactosa • Dulce: Micrococcus; Alcaligenes; Pseudomonas; Flavobacterium; Serratia; Proteus; esporulados – Viscosidad • en la superficie: Alcaligenes viscosus (A. viscolactis), Micrococcus freudenreichii en el seno de la leche: Coliformes, algunas acidolácticas, otras bacterias • productoras de álcali – Cambios en la grasa • Pseudomonas, Proteus, Alcaligenes, Bacillus, levaduras, mohos 101
  • 102. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Producción de álcalis • Pseudomonas fluorescens, Alcaligenes viscosus – Cambios en el sabor • sabor a ácido: Streptococcus lactis, otras BAL, Str. lactis + Leuconostoc, coliformes, Clostridium • sabor amargo: proteolíticos, cocos, coliformes, levaduras no esporuladas • sabor a caramelo: Streptococcus lactis var. maltigenes • otros sabores – Cambios en el color • Leche azul: Pseudomonas syncyanea (+ Streptococcus lactis), Actinomycetes, Geotrichum • Leche amarilla: Pseudomonas synxantha, Flavobacterium • Leche roja: Serratia marcencens, Brev. erythrogenes, Micrococcus roseus, Torula glutinis • Leche marrón: Pseudomonas putrefaciens, Pseudomonas fluorescens Microorganismos patógenos• Campylobacter• S. aureus• Listeria• Salmonella• E. coli• Coxiella burnetti, Brucella, M. tuberculosis..• Microorganismos responsables de mamitis• Virus• B. cereus Métodos para prolongar la vida útil de la leche• Empleo del frío – Refrigeración – Congelación • helados, nata, mantequilla• Bactofugación – Eliminación del 99% de esporos y 50% células vegetativas• Pasterización• Esterilización• Disminución del contenido en agua – leche evaporada, concentrada, condensada (azúcar)• Fermentación – fabricación de queso, yogur• Utilización de conservadores – sólo en ciertos productos lácteos Evaluación de la calidad higiénica de la leche cruda• En la granja 102
  • 103. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Evaluación del estado higiénico de la producción • Impurezas, FAM, coliformes, termodúricos, psicrotrofos, esporulados – Evaluación de su capacidad de conservación Temperatura, reducción de colorantes, prueba de la capacidad de conservación, • acidez titulable – Pruebas de mamitis• En la industria láctea Además de las anteriores – Para determinar la calidad microbiológica de la materia prima • análisis microbiológico clásico, temperatura, acidez titulable, reducción de colorantes, recuento microscópico directo, pruebas rápidas (Impedancia, ATPmetria, Limulus, DEFT -epifluorescencia directa) – Otras pruebas: composición química (grasa, ESM, proteína, caseína, agua añadida)• Leche cruda de vaca destinada al consumo directo (R.D.1679/94, B.O.E 24/9/94; R.D.402/96, B.O.E 8/4/96) – Aerobios mesófilos (u.f.c./ml, 30ºC) 5x10^4 – S. aureus (por ml) n=5, c=2, m=10^2, M=5x10^2 – Salmonella (en 25 ml): ausencia Leche pasterizada• DefinicióníasObjetivos – higiénico, comercial, tecnológico• Tipos de tratamiento – LHT, HTST, VHT• Microbiología – Supervivientes: termodúricos, esporulados, patógenos?, toxinas• Alteración – Contaminantes post-tratamiento térmico • Tª almacenamiento<8ºC: proteolisis, lipolisis (olores, sabores, colores), viscosidad • Tª almacenamiento>8ºC: acidificación, producción de gas, proteolisis – Supervivientes del tratamiento • termodúricos, esporulados• Análisis • FAMV, coliformes, psicrotrofos• Legislación (RD 1679/1994) – Gérmenes patógenos: ausentes en 25 g, n = 5, c = 0, m = 0, M = 0. – Coliformes (por ml): n = 5, c = 1, m = 0, M = 5. – Después de incubación a 6 °C durante cinco días: Contenido de gérmenes a 21 °C (por ml): n = 5, c = 1, m = 5 x 10 ^4, M = 5 x 10^5 Leche esterilizada• Definición 103
  • 104. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Leche esterilizada – Leche UHT• Clasificación de las bacterias según su resistencia al calor – Clase 1 – Clase 2 – Clase 3• Alteración – Contaminantes post-tratamiento térmico (fallos durante el envasado) producida por multitud de bacterias • – Supervivientes del tratamiento • esporulados: B. coagulans, B. subtilis, B. licheniformis• Control debe ejercerse sobre – condiciones microbiológicas de leche cruda – producción compuestos microbianos (ez) – envasado• Legislación (RD 1679/1994) – Tras incubación a 30°C, 15 días: • Contenido de gérmenes a 30 °C (por 0,1 ml):<= 10 • Control organoléptico: normal • Sust. farmacológicamente activas: no superar límites del Reglamento (CEE) 2377/90 Tema. Microbiología y análisis microbiológico de los productos lácteos• Leche evaporada• Leche condensada• Leche concentrada• Leche en polvo• Yogur• Leches fermentadas• Cremas• Mantequilla• Helados• Queso• Leche evaporada • CAE: "leche esterilizada privada de parte de su agua de constitución" Concentrada por evaporación, no edulcorada y esterilizada: • – Alterantes (supervivientes por tt insuficiente o recontaminantes) • Abombamiento por esporulados (Clostridium) • Coagulación (Bacillus spp.) • Sabor amargo por proteolisis y lipolisis (esporulados) • alteraciones varias por recontaminantes• Leche condensada 104
  • 105. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • CAE: leche higienizada "concentrada con azúcar", privada de parte de su agua de constitución y conservada mediante la adición de sacarosa – Alterantes • producción de gas: levaduras osmotolerantes (o coliformes) fermentadoras de sacarosa • espesamiento por micrococos (cc no suficiente) • crecimiento de mohos (Aspergillus y Penicillium) en superficie (botones)• Leche concentrada • leche natural entera, desnatada o semidesnatada, pasterizada y privada de parte de su agua de constitución • producto bastante perecedero refrigeración durante distribución a T<6 °C; vida útil max. 8 días tras • fabricación – Microbiología y alteración: similar a leche pasterizada• Leche en polvo • CAE: "el producto seco y pulverulento que se obtiene mediante la deshidratación de la leche natural, o de la total o parcialmente desnatada, higienizada al estado líquido antes o durante el proceso de fabricación" contenido en agua inferior al 5%. aw<0,60 • – Microflora presente: depende de la calidad de la leche cruda (coliformes, termodúricos) – Atención patógenos: Salmonella, B. cereus, C. perfringens, S. aureus – Legislación • Ausencia Salmonella, Listeria monocytogenesS. aureus: m = 10, M = 100, n = 5, c = 2 • Coliformes: m=0, M=10, n=5, c=2• Yogur leche coagulada obtenida por fermentación láctica (L. (delbrueckii) bulgaricus y • Strept. (salivarius) thermophilus) de la leche pasterizada o concentrada, con o sin adición de nata pasterizada, leche en polvo entera, semidesnatada o desnatada, suero en polvo, proteínas de la leche y/u otros productos procedentes del fraccionamiento de la leche. – Alterantes: mohos, levaduras, otros – Otros problemas: bacteriófagos, residuos de antibióticos, y desinfectantes• Leches fermentadas – kefir • bebida espumosa, cremosa y de sabor ácido y ligeramente alcohólico • bacterias de granos de kefir: Saccharomyces kefir, Lactobacillus caucasicus, Streptococcus cremoris y Streptococcus lactis – koumis • líquido espumoso de sabor ácido-alcohólico, de Asia Central, de leche de yegua, de burra o de camella Lactobacillus bulgaricus, L. acidophilus y levaduras (Torula y Saccharomyces • lactis) – leche acidófila • Lactobacillus acidophilus 105
  • 106. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Considerada alimento funcional (como los anteriores) – mazada de cultivo leche ácida de la mazada (batido de la mantequilla) a la que se añaden bacterias • lácticas acidificantes y aromatizantes (estreptococos lácticos y Leuconostoc) – Otras: Mazun armenio (yogur), Gioddu sardo (kéfir), Leben mediterráneo• Crema• Mantequilla • emulsión plástica de agua en grasa obtenida por procedimientos mecánicos tipos: 1) aromática (acidificada o agria), fabricada con leche madurada, 2) dulce • (no acidificada), consiguiéndose la acidificación mediante fermentos lácticos o ácidos orgánicos – Producto microbiológicamente seguro por: • estructura física: distribución de la fase acuosa con % variable (prod. tradicionales >20%. Light, <20%) • presencia de inhibidores: sal, sorbatos, benzoatos (mohos y levaduras), otros ácidos orgánicos • pH bajo (en mantequilla elaborada con crema madurada) – Alteración • Descomposición pútrida: P. putrefaciens • olor a sebo (mohos, micrococos, levaduras) • olor a fruta (pseudomonas) • olor a malta • Cambio de color (Pseudomonas nigrifaciens) – Patógenos – Análisis• helados – Leche/nata + azúcar + opcional (huevos, almendras, avellanas, pulpa frutas…, espesante, aromatizantes) – Proceso: Mezcla, pasterización, reposo, congelación (5ºC), batido, congelación (-20ºC) – Microorganismos: supervivientes de pasteurización, contaminantes, de ingredientes – Patógenos: salmonella, Staphylococcus – Norma: RD 618/98 Queso• Etapas de su fabricación – Selección de la leche. En función de • composición química • calidad microbiológica • ausencia de alterantes (esporulados, coliformes), y patógenos • aptitud para la coagulación – Preparación Clarificación, bactofugación, normalización • – Pasterización • destruye la flora patógena, la flora útil y ciertos enzimas 106
  • 107. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Maduración-acidificación de la leche – Coagulación • enzimática • ácida • mixta – corte de la cuajada/desuerado – moldeado y prensado – salazonado. Importancia en • evolución de la flora microbiana • sabor, aroma regula la disponibilidad del agua • – maduración o afinado del queso • degradación de proteínas, carbohidratos y grasa – (ahumado, parafinado)• Clasificación de los quesos – Según la leche usada en su fabricación vaca, oveja, cabra o mezclas • – Según el método de coagulación cuajo, cuajos microbianos, por acidificación, por un sistema mixto, con extractos • vegetales, etc. – Según la tecnología de elaboración • quesos frescos • quesos madurados: quesos fundidos • – Por el contenido en humedad • frescos: 60-80% de humedad • blandos: 55-57% de humedad • semiduros: 42-55 de humedad duros: 20-40 de humedad • – Por el contenido en grasa • extragraso: más del 60% • graso: del 45 al 60% • semigraso: del 25 al 45 % • semidesnatado: del 10 al 25 % • desnatado: menos del 10%. – Por su textura • quesos con ojos redondeados: emmental y gruyère, gouda y edam. • de textura granular: tilsit, manchego. • de textura cerrada: cheddar, parmesano, cantal, algún manchego, etc. – Por el tipo de microorganismos • quesos veteados de pasta azul (penicillium): roquefort, danablu, gorgonzola, cabrales • quesos de moho blanco: camembert y brie 107
  • 108. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • quesos de corteza enmohecida, como el saint paulin, port salut, etc. • quesos madurados por adición de cultivos lácticos.• Condiciones disgenésicas del queso madurado – pH – ácido láctico – Eh – sal – aw – BAL – Compuestos varios Microbiología del queso• Cultivos iniciadores – Cultivos mesófilos para ácido láctico Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris • – Cultivos mesófilos para aroma Lactococcus lactis biovar diacetylactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. • cremoris – BAL termófilas • Strept. salivarius subsp. termophilus, Lact. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. helveticus, Lb. casei subsp. casei, Lb. plantarum, Lactobacillus lactis, Lactobacillus acidophilus – Mohos: Penicilllium roqueforti, P. camemberti, Geotrichum candidum • – Otras bacterias • Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium shermanii, Brevibacterium linens,• Papel de los cultivos iniciadores – producción de ácido láctico – producción de compuestos aromáticos, gas – producción de enzimas• Alteración – fabricación • hinchazón temprana • aspecto gelatinoso – maduración • hinchazón tardía • amargor • color anómalo • putrefacción de corteza • pintas de tirosina cristales de lactato cálcico • – Almacenamiento • Mohos 108
  • 109. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Patógenos – Brucella, M. tuberculosis – Salmonella – E. coli – S. aureus – C. botulinum – Listeria – Aminas biológicamente activas Tema. Microbiología de la carne fresca y de los productos cárnicos.• Introducción• Factores que afectan al crecimiento de los microorganismos en la carne• Microbiología de la carne fresca almacenada aeróbicamente a refrigeración• Alteración microbiana de la carne• Control de la alteración• Sistemas de determinación de la alteración de la carne• Microbiología de otras carnes• Microbiología de los productos cárnicos Introducción• Extensión de la contaminación en la carne – Contaminación superficial – Contaminación profunda o interna• Contribución a la higiene y microbiología de la carne fresca – Animal • Condiciones higiénicas (instalaciones, manejo) • Condiciones fisiológicas – Tecnología • Diseño higiénico del equipo • Nuevos procedimientos • Automatización y mecanización-> No intervención humana, Limpieza in situ • Sistemas de control de calidad (APPCC) • Control del aire, agua (filtros, cloración) – Personal • Salud, control médico • Educación, formación • Motivación • Ergonomía• Origen primario de la contaminación – Tracto gastrointestinal (microorganismos entéricos) – Medio ambiente (mayormente microorganismos saprófitos) • Superficies externas del animal (piel, pezuñas...) • Suelo • Manipuladores 109
  • 110. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Aire, agua de duchado • Utensilios, equipo: vehículos• Distribución de células microbianas en la canal – Nº de microorganismos habitual: 10^3, 10^4 ufc/cm^2 – Muestreo • Destructivo No destructivo • – Adhesión bacteriana a las superficies de la carne • Fase reversible • Fase irreversible Factores que afectan al crecimiento de los microorganismos en la carne• Factores intrínsecos: – pH 7->5.6 – aw 0.99 – Eh: Profundidad: 250->-200 mV – nutrientes: SNNP y carbohidratos• Factores extrínsecos: – Temperatura, – HR, – [O2 y CO2]• Procesado – Procesos que favorecen – Procesos que perjudican/limitan• Atributos fisiológicos del microorganismo en cuestión Microbiología de la carne fresca almacenada aeróbicamente a refrigeración• Tipos de microorganismos – Gram-negativos: • Pseudomonas (P. fragi, P. lundensis, P. fluorescens, P. putida) • Acinetobacter, Moraxella, Psychrobacter, Flavobacterium, Alcaligenes, Alteromonas • Shewanella (S. putrefaciens) • Enterobacterias (Enterobacter, Serratia, Klebsiella, Hafnia) – Gram positivos: • Brochothrix thermosphacta • Micrococcus, Staphylococcus • Leuconostoc, Lactobacilos, Bacillus, Clostridium – Levaduras • Trichosporon – Mohos • Cladosporium, Sporotrichum, Geotrichum, Thamnidium, Mucor, Penicillium, Alternaria 110
  • 111. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Patógenos: • Salmonella, Staphylococcus, Yersinia, Campylobacter, Streptococcus, Brucella, Mycobacterium tuberculosis, Clostridium perfringens, Cl. botulinum Alteración microbiana de la carne• Definición • cualquier signo o grupo de signos de actividad bacteriana abierta, manifestada por cambios en el color, olor o apariencia de la carne• Alteración enzimática • produce compuestos de bajo peso molecular fácilmente asimilables por los microorganismos• Alteración microbiana • compuestos originados durante la degradación microbiana de los aminoácidos• Evolución microbiana durante el almacenamiento (gráfico)• Fenómenos bioquímicos que ocurren durante la alteración – Metabolismo de los azúcares – Metabolismo de las sustancias nitrogenadas – Metabolismo de las proteínas y otros compuestos• Otros tipos de alteración • Limosidad superficial • Cambios en el color de los pigmentos • Cambios en las grasas • Fosforescencia • Otras coloraciones • Agriado o acidez. Taint Control de la alteración• Sistemas para retrasar la alteración de la carne fresca – Depilado químico – Higiene – Lavado de superficies • Calor • Pasteurización usando vapor ultracalentado • Cloro • ácidos orgánicos • Tri-sodium phosphate (TSP) – Envasado en atmósferas controladas o vacío – Frío – Radiaciones – Adición de glucosa – Utilización de bacterias acidolácticas: probióticos – Desecación de las superficies carnicas – Bacteriófagos – Calor – Curado 111
  • 112. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León Sistemas de determinación de la alteración de la carne• Métodos sensoriales – apreciación subjetiva• Métodos microbiológicos – recuento de Gram-negativos, pseudomonas, etc.• Métodos fisico-químicos – determinación del volumen de extracto libre que es una medida de la capacidad de retención de agua y que, a su vez, depende del pH• Métodos químicos – amoniaco (resultado del metabolismo bacteriano), – otras aminas (putrescina, cadaverina) – gluconato – pH (ya que el pH alto está relacionado con la producción de amoniaco) Microbiología de otras carnes y productos cárnicos• Carne almacenada en atmósferas distintas del aire – Tipo de atmósfera • MAP (20-30% CO2, O2) CO• – Microbiología • Bacterias acidolácticas: Lactobacillus, Leuconostoc, Carnobacterium • Brochothrix thermosphacta • Enterobacteriaceae – Vida útil• Carne envasada a vacío – Tipo de atmósfera 1% de 02, 20- 40% de C02, resto N2. • – Microbiología – Bioquímica • Glucosa: acetoína, diacetilo, ácido acético, ácido láctico • Aminoácidos: Triptófano, aminoácidos azufrados • Aminas, NH3 • Indol • SH2, CH3-SH, (CH3)2S2 – Vida útil• Carne congelada – Aplicación – Microbiología – Vida útil Tema. Microbiología y análisis microbiológico de los productos cárnicos: productos cárnicos frescos, embutidos fermentados, salazones cárnicas, productos tratados por el calor, otros productos cárnicos.• Factores que influyen en los cambios sufridos por la carne 112
  • 113. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Flora inicial de carne: Gram-negativos fundamentalmente – Flora inicial de ingredientes • Microorganismos esporulados de especias (Bacillus, Clostridium) • Bacterias acidolácticas • Cocos Gram-positivos (St. carnosus, Micr. carnis) • Levaduras (Debaromices hansenii) Mohos (Penicillium nalgiovensis, P. camemberti, Streptomyces griseus) • – Ingredientes • Tipo de azúcar: fermentación rápida y lenta • Sales del curado • Otros aditivos: fosfatos, GDL, ascorbatos, especias – Procesado • Despiece, corte, picado, mezclado • Operaciones: estufaje, escaldado, ahumado, cocido, embutido• Resultado: cambio en parámetros fisicoquímicos – Variaciones en Tª – Descenso en contenido en agua y aw – Variaciones del pH – Variaciones de atmósfera (Eh, [CO2]), cc compuestos inhibidores (sal, metabol.)• Tipos de productos cárnicos – Productos cárnicos frescos – Productos cárnicos crudos adobados – Embutidos crudos curados – Productos cárnicos tratados por el calor – Salazones cárnicas – Platos preparados cárnicos – Otros derivados cárnicos Carnes picadas, carnes en trozos de menos de 100 gramos y preparados de carnes – Definiciones• Características del producto – Contaminación del producto inicial elevada – Materia prima – Condimentos – Manipulación elevada • Manipulador • Maquinaria, equipo • Medio ambiente – Abundancia de nutrientes – Barreras al crecimiento: • Refrigeración (+ 2ºC), congelación (-18ºC) • Atmósferas 113
  • 114. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Aditivos, condimentos (en caso de preparados de carne) – Otros factores • pH • aw • Eh• Microbiología – Patógenos • Salmonella • E. coli O157:H7 • S. aureus • Listeria monocytogenes • Yersinia enterocolitica • Campylobacter spp. • Esporulados: C. perfringens – Alterantes • Gram-negativos psicrotrofos• Legislación – Real Decreto 1916/1997, de 19 de diciembre, por el que se establecen las condiciones sanitarias aplicables a la producción y comercialización de carne picada y preparados de carne. En aplicación nacional de: Directiva 94/65/CE – RD 1376/2003, por el que se establecen las condiciones sanitarias de producción, almacenamiento y comercialización de las carnes frescas y sus derivados en los establecimientos de comercio al por menor – B.O.E. 13/1/98• Criterios microbiológicos (RD 1916/1997) – Anexo II: Criterios microbiológicos para carne picada – Anexo IV: Criterios microbiológicos para preparados de carne Microbiología de los productos cárnicos: embutidos – Tipos • Embutidos frescos • Embutidos escaldados y cocidos • Embutidos secos y semisecos (curados)• Características del producto – Contaminación del producto inicial elevada – Manipulación elevada – Abundancia de nutrientes – Barreras al crecimiento: • Refrigeración • Atmósferas • Aditivos: nitritos, acidificantes, otros conservadores – Otros factores • pH • aw 114
  • 115. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Eh• Grupos microbianos • bacilos Gram-negativos • bacterias acidolácticas • micrococos – Patógenos • L. monocytogenes • S. aureus, otros patógenos tolerantes al frío • Salmonella • E. coli 0157:H7 • Esporulados • Mohos • Virus, parásitos, nitrosaminas• Alterantes – Debidos a BAL Actuación de los microorganismos sobre lípidos y prótidos • – Gram-negativos psicrotrofos, Enterobacteriáceas – Esporulados – Mohos Microbiología de los productos cárnicos: cocidos• Carnes pasterizadas (semiconservas) – 65-75ºC. Necesitan refrigeración y otros agentes (nitritos, conservadores) – lterantes: esporulados, termodúricos, otros microorganismos de recontaminaciones – Patógenos: S. aureus, otros patógenos (operaciones)• Conservas – 95-112ºC. – Productos cárnicos almacenados a Tª ambiente: valor F0 >= 3,00 – Alteración ->Bacillus (agriado, ablandamiento) y Clostridium (hinchazón, putrefacción) , otros patógenos (recontaminaciones) • Patógenos: Cl. botulinum Microbiología de los productos cárnicos: salazones cárnicas• Carnes crudas curadas (salazones cárnicas) – Tipos • Bacon estilo Wiltshire Jamones crudos curados (serrano, westfalia, parma...) • – Microbiología • Bacon: Halotolerantes y psicrófilos de la salmuera (Proteus y Vibrio) Jamón: Halófilos (micrococos, mohos y levaduras capaces de crecer a elevadas • cc de sal) – Alteraciones • Bone taint • Coloraciones 115
  • 116. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Patógenos • Clostridium botulinum• Carnes crudas curadas envasadas a vacío – Alteraciones • Agriado • Olor a sulfhidrico Otros productos cárnicos• Carnes fundidas• Carnes deshidratadas• Plasma deshidratado• Gelatina• Tripas Tema. Microbiología y análisis microbiológico de la carne de aves y de la carne de caza de pluma• Importancia de los procesos de producción – Flora intestinal – Diseminación microbiana• En el matadero – Puntos críticos • Escaldado • Desplumado • Evisceración• Alterantes – Pseudomonas, Psychrobacter, Acinetobacter, Sh. putrefaciens – A tener en cuenta: • pH de pechuga<6.0 • pH de muslo>6.4• Patógenos – Campylobacter – Salmonella – Otras enterobacteriáceas Tema. Microbiología y análisis microbiológico del pescado, moluscos, crustáceos y productos derivados• Diferencias entre el pescado y la carne en relación a su capacidad de conservación• Microbiología• Alteración microbiológica del pescado fresco• Conservación del pescado• Moluscos y crustáceos• Diferencias entre el pescado y la carne en relación a su capacidad de conservación – Diferente composición • Elevado % en SNNP (aa, TMA, creatina, taurina, betaínas, a. úrico, anserina, 116
  • 117. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León carnosina) • % elevado de AG insaturados • % carbohidratos inferior a la carne (exc. Moluscos) • % bajo en colágeno – pH superior a la carne – Tª del agua (selecciona psicrotrofos) – Influencia del sistema de captura Microbiología• Flora inicial – Contaminación inicial en piel, branquias, intestino. Músculo estéril – Niveles variables • piel: 2-7 ul/cm^2 • branquias: 3-5 ul/cm^2 intestinos: hasta 9 ul • – Géneros alterantes • Gram-negativos: Pseudomonas, Shewanella, Acinetobacter, Moraxella, Flavobacterium, Vibrio, Alteromonas, Cythophaga • Gram-positivos: Micrococos y corineformes. Bacillus y Streptococcus• Microorganismos patógenos – Cl. botulinum tipo E – Vibrio y Aeromonas – Patógenos asociados a efluentes fecales: virus, Salmonella, E. coli, Shigella, etc. – En escómbridos (atún, bonito, caballa) y clupeidos (sardina, arenque): intoxicación por producción de aminas (decarboxilación de histidina-> histamina) • Microorganismos: Morganella morganii, Klebsiella pseumoniae, Hafnia alvei, Enterobacter, Lactobacillus spp.• Otros agentes patógenos – Parásitos • Trematodos • Cestodos • Nematodos – Intoxicaciones por biotoxinas marinas – Contaminantes abióticos Alteración microbiológica del pescado fresco• Otras alteraciones – autolisis enzimática – oxidación de las grasas• Factores que influyen sobre la velocidad y tipo de alteración – tipo de pescado – estado del pescado – nº y tipo de microorganismos – Tª 117
  • 118. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – empleo de conservadores• Microorganismos implicados – Pseudomonas, Shewanella (Alteromonas) putrefaciens• Cambios bioquímicos durante la alteración – OTMA->TMA (Catalizado por la ez TMAO reductasa. OTMA: aceptor de e-) – Compuestos azufrados: SH2, dimetil sulfuro – decarboxilación – proteolisis Conservación del pescado• Frío – Refrigeración – Congelación, ultracongelación• Secado• Salazón seca o en salmuera• Ahumado• Cocción• Irradiación• Liofilización• Conservadores – ClNa, sorbatos, polifosfatos, acético, formaldehido, H2O2, SO2, antibióticos – hielos eutécticos – antioxidantes• Almacenamiento en atmósferas combinadas y a vacío• Tratamiento térmico• Combinaciones Moluscos• Recolección: a mano. Venta vivos o envasados sin concha• Población microbiana residente: – variable según la época del año (3-5 ul/g) – comensales + contaminantes (agua filtrada) – comensal: espiroquetas (Cristispira pectineus y Saprospira), Alcaligenes y Flavobacterium – Contaminantes: Gram- (pseudomonadáceas, vibrionáceas, enterobacterias). Gram + (micrococos, Bacillus)• Alteración• Patógenos – Entéricos: enterobacterias, virus, otros patógenos – PSP, DSP, NSP, ASP• Microbiología de los productos comercializados – Depuración – Tratamiento térmico (pasterización) – enlatado, congelación, irradiación• Indicadores de alteración 118
  • 119. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Microbiológicos – químicos Crustáceos – Captura y comercialización – Microbiología – Alteración – Patógenos – Control• Crustáceos cocidos (congelados o refrigerados), carne de crustáceos "grandes" – Flora presente – Patógenos – Control• Legislación: Real Decreto 571/1999 –moluscos- y Decisión de la Comisión (93/51) – crustáceos- – Moluscos • Zona A: los moluscos cumplen condiciones de análisis: destino final directo consumidor • B: max. 6000 coli fecales/100 gr (4600 E. coli) en el 90% de muestras: destinados a reinstalación/depuración • C: max 60.000 coli fecales/100 gr: destinados a reinstalación/depuración duradera (más de 2 meses) – Crustáceos Otros productos de la pesca• Surimi – Proceso de fabricación • Recepción y almacenamiento de la Materia Prima • Proceso de Corte • Lavado de los Troncos • Separador de Carne • Lavados y Drenados • Proceso de Refinado • Proceso de Prensado • Estabilizado • Congelación • Empaque y Almacenamiento – Calidad • Humedad • pH • Detección de impurezas • Capacidad formadora de Kamaboko Tema. Microbiología y análisis microbiológico de los huevos y ovoproductos• Composición 119
  • 120. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Microbiología del huevo• Sistemas de conservación del huevo• Ovoproductos Composición• Nutrientes – 12% prot, 10% grasas – 1 % carbohidratos – sales minerales 11% – Rico en vitaminas (A-D, B1 y B2)• Parámetros – Protecciones mecánicas • cutícula cáscara y sus membranas • – Protecciones biológicas • pH>9 • lisozima • ovomucoide y ovoinhibidor • conalbúmina (ovotransferrina) • Avidina y apoproteína Microbiología del huevo• Distribución – Interior estéril • % contaminado: Salmonella – Exterior • Variable: 2-7 ul• Interior estéril – % contaminado • Salmonella• Exterior – Variable: 2-7 ul• Factores que afectan la penetración microbiana y su proliferación – Resistencia a la penetración – Factores antimicrobianos en la albúmina de huevo (clara)• Efecto de los procesos industriales sobre los microorganismos – Huevos enteros – Recogida, transporte y almacenamiento – Limpieza de los huevos – Recubrimientos de la cáscara – Pasteurización (Termoestabilización) de los huevos enteros Sistemas de conservación del huevo• Huevos licuados, congelados y desecados 120
  • 121. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Alteración de los huevos – Putrefacción • Pseudomonas… (pioverdina) • Mohos: Cladosporium, Penicillium, Sporotrichum• Microorganismos patógenos• Control Ovoproductos• Tipos de ovoproductos – Huevo líquido y huevo congelado – Otros productos elaborados que contienen huevo – Huevos deshidratados • Efectos de la manipulación industrial sobre los microorganismos • Alteraciones • Patógenos • Control • Elección de "categoría"• Efectos sobre los microorganismos de las operaciones de industrialización – Rotura, separación y homogeneización – Pasteurización – Envasado y refrigeración – Sal y azúcar – Congelación y descongelación• Alteraciones• Patógenos• Control – Control del proceso – Pruebas de laboratorio – Programas reguladores• Elección de "categoría" Tema. Microbiología y análisis microbiológico de los alimentos enlatados• Definición y clasificación de conservas y semiconservas• Tratamiento térmico• Causas de alteración microbiana en conservas• Microorganismos responsables de la alteración• Semiconservas• Análisis microbiológico Definición y clasificación de conservas y semiconservas• Definición de conservas y semiconservas – Conservas: productos que, tras ser generalmente esterilizados por calor, y envasados en recipientes inalterables, permanecen sin contaminar a temperatura ambiente durante largos períodos de tiempo (6 meses- varios años) – Semiconservas: productos estabilizados por el uso de aditivos químicos, envasados en 121
  • 122. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León recipientes inalterables, y que necesitan de la refrigeración para aumentar su vida útil (menor que la de las conservas)• Clasificación de las conservas según su pH – Poco ácidas, pH > 5,3: carne, pescado, y vegetales (guisantes, maíz, etc.) – acidez media, pH= 5,3- 4,5: verduras (espinacas, esparrágos), remolacha, calabaza – Ácidas, pH = 4,5-3,7: tomates, peras, piña americana – Muy ácidas, pH< 3,7: chucrut, bayas (fresas, moras), mejillones Tratamiento térmico• Tratamiento térmico para conservas de pH inferior a 4,5 – Clostridium botulinum no es importante – Destrucción de las formas vegetativas de patógenos en alimentos ácidos, y flora acidófila: levaduras, mohos, especies de Clostridium del grupo butírico y Bacillus (tanto termófilas como mesófilas)• Tratamiento térmico para conservas de pH superior a 4,5 – El pH no frena a Clostridium botulinum – Se pretende la destrucción de: • formas vegetativas y esporos de Cl. botulinum, así como de otros Clostridium toxinógenos • bacterias patógenas (Salmonella, St. aureus enterotoxigénico, Vibrio parahaemolyticus, etc.) • flora saprófita • toxinas, botulínica y estafilocócica • enzimas de los alimentos o microbianas Causas de alteración microbiana en conservas• Causas – Antes del tratamiento térmico • Materias primas contaminadas/alteradas • Insuficiente limpieza de la maquinaria • Fallos en cerrado – Durante • Tratamiento térmico insuficiente • Baremo de esterilización insuficiente • Presencia de esporos termorresistentes/alta contaminación • Diseño imperfecto del autoclave – Después • Manejo inadecuado de las latas • Enfriamiento y/o almacenamiento incorrecto Microorganismos responsables de la alteración• Esporulados termófilos – Acidificación plana • No hay producción de gas, pero el contenido es ácido por producción de ácido láctico 122
  • 123. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Debido a Bacillus stearothermophilus, (legumbres) B. thermoacidurans/coagulans y B. thermoaceticum (conservas ácidas) • Contaminación: equipamiento e instalaciones • Autoesterilización – Abombamiento o alteración TA • Abombamiento debido a la producción de gas (CO2 y H2) • Debido a Clostridium thermosaccharolyticum • Más frecuente en conservas poco ácidas • Fuente de contaminación Tipos de abombamiento • – Ennegrecimiento • Ennegrecimiento debido a la producción de sulfuro de hidrógeno (SH2) y reacción con Fe • Debido a Clostridium (Desulfotomaculum) nigrificans, esporulado anaerobio termófilo productor de SH2 • Más frecuente en conservas muy poco ácidas (maíz y guisantes) • Esporas muy poco termorresistentes • Termófilo• Esporulados mesófilos – Acidificación • Similar a la acidificación producida por termófilos • Responsables Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis y Bacillus pumilus • Acidificación,y reblandecimiento (pectinolisis) en conservas poco ácidas – Abombamiento con fermentación butírica • Productos de pH< 4,5 y conservas caseras con tratamiento térmico bajo • Responsables Cl. butyricum, Cl. pasteurianum y Cl. perfringens Fermentación del alimento, con acidificación y liberación de gran cantidad de gas • (H2 y CO2) – Abombamiento con putrefacción • Conservas de carne y pescado con tratamiento térmico insuficiente. • Responsables bacterias esporuladas anaerobias mesófilas pútridas (Cl. sporogenes, Cl. putrefaciens) Fermentación del alimento, con acidificación y liberación de gran cantidad de gas • (H2 y CO2) – Abombamiento con desprendimiento de nitrógeno • Ocasionado por Bacillus circulans Reducción de nitratos a nitritos, y nitritos a nitrógeno, responsable del • abombamiento – Abombamiento debido a la multiplicación de otras bacterias gasógenas • Bacillus polimyxa y Bacillus macerans • En conservas poco ácidas o de acidez media• No esporulados – Bacterias • Lactobacilus plantarum, L. brevis 123
  • 124. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Leuconostoc mesenteroides, L. dextranicum • Micrococcus, Streptococcus thermophilus – Mohos • Byssochlamis fulva, Aspergillus, Penicillium, Citromyces – Levaduras Semiconservas• Productos cárnicos – Deben su estabilidad a: Refrigeración, sales del curado y pasterización • – Alterantes: • Clostridium spp. y Bacillus spp. • Enterococos fecales: Streptococcus faecalis var liquefaciens, S. faecium y S. thermophilus • Gram-negativos alterantes: Pseudomonas fluorescens, Acinetobacter, Moraxella• Productos de la pesca – La estabilidad depende de • la sal (anchoas) o del pH bajo (mejillones) juntamente con la refrigeración – microflora • Serratia, Micrococcus, Alcaligenes, Pseudomonas • Bacterias acidolácticas (Lactobacillus buchnerii)• Productos vegetales – Encurtidos (pepinillos) • Mohos (Penicillium, Fusarium, Cladosporium y Alternaria) • Bacterias lácticas heterofermentativas – Aceitunas • Enterobacter, Bacillus y Clostridium (ojo de pescado) • Fermentación butírica por especies de Clostridium • Enturbiamento de la salmuera: bacterias acidolácticas, bacterias halotolerantes, levaduras • Mohos (Penicillium y Fusarium) Análisis microbiológico• Dos niveles: – Control de estabilidad: comprobar ausencia de modificaciones tras incubación previa: es un control de rutina • Muestreo • Preparación de las latas • Examen macroscópico preliminar de los envases • Seguimiento de las latas durante la incubación • Examen externo del envase después de la incubación • Apertura del envase y examen del contenido • Preparación • Apertura del envase y análisis de gases 124
  • 125. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Estudio de características organolepticas • Medida del pH • Examen interno del envase • Examen microscópico directo • Interpretación del control de estabilidad – Control de esterilidad: cuando existan problemas de alteración o si se desea poner a punto un baremo de esterilización: es un control completo • Examen bacteriológico • Siembra del contenido de la conserva: Análisis microbiológico Tema. Microbiología y análisis microbiológico de las verduras, frutas y frutos secos• Verduras y hortalizas: características• Microbiología de verduras y hortalizas• Conservación de verduras y hortalizas• Frutas: características y microbiología• Frutos secos: características y microbiología• Microbiología y análisis microbiológico de las especias Verduras y hortalizas: características – Partes comestibles de una planta (hojas, tallos, raíces, tubérculos, bulbos, flores y semillas) – Tejidos vegetales • pobres en proteínas (con excepción de ciertas semillas) • componentes principales: fibra, almidón, algunas vitaminas, minerales, y ciertos lípidos • pH: 5-7. • crecimiento microbiano posible si las condiciones de humedad son adecuadas.• Composición – Fuentes de contaminación suelo, el agua, el aire, los insectos y otros animales • – Otras circunstancias • Empleo de pesticidas • Empleo de estiércol (abono) • Empleo de efluentes fecales (riego) Microbiología de verduras y hortalizas• Saprófitos – corineformes, coliformes, micrococos y pseudomonas, procedentes del suelo, el aire o el agua. – Hongos: Aureobasidium, Fusarium y Alternaria• Patógenos – Virus: hepatitis, gastroenteritis diversas – Bacterias: S. typhi, Shigella, Salmonella,cólera, – Protozoos: amebiasis – parásitos: 125
  • 126. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Alteración Conservación de verduras y hortalizas• Higiene en la recolección• Control del ambiente – temperatura: 0-3ºC – humedad relativa: >90% – composición atmosférica: CO2• Cloración del agua – 1-2 ppm y 400-500 ppm• Otros procesos – Enlatado: alimentos de baja acidez – Desecación – Fermentación/acidificación Frutas: características y microbiología• Características – mecanismos de defensa naturales, tales como una gruesa piel o sustancias antimicrobianas, como son los aceites esenciales – Ricos en hidratos de carbono – ácidos orgánicos en cantidades generalmente suficientes para producir un pH de 4,6 ó inferior: productos ácidos (excepto melón, plátano, higo) – No implicados en enfermedades (excep: micotoxinas) – Alteración: importante• Microbiología: mohos, levaduras y algunas bacterias acidolácticas• Control – Empleo de compuestos químicos – Control condiciones almacenamiento – higiene en la recolección – control del ambiente • temperatura: 0-3ºC • humedad relativa: >90% • composición atmosférica: CO2 (cc>10%) tratamientos químicos: fungicidas, SO2 • – cloración del agua • 1-2 ppm y 400-500 ppm – Otros procesos • enlatado: alimentos de baja acidez • Desecación • Fermentación/acidificación Frutos secos: características y microbiología• Definiciones y propiedades más importantes• Nutricionalmente – alto contenido en grasa, 126
  • 127. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – algunos contienen cantidades apreciables de proteínas y carbohidratos. – aw baja para permitir el crecimiento de bacterias (excepciones: coco, cacahuete (antes y durante la recolección): micotoxinas).• Microoorganismos – Aspergillus, Penicillium y Fusarium – hongos micotoxigénicos: Aspergillus flavus y A. parasiticus• Control – Recogida – Condiciones de almacenamiento: humedad – Separación de producto defectuoso Microbiología y análisis microbiológico de las especias.• Introducción – Definición – Propiedades importantes • Actividades antimicrobianas en especias • Efectos antimicrobianos de las especias en los alimentos • Estimulación por las especias del metabolismo microbiano. – Formas de procesado • Preparación • Extracción: aceites esenciales y oleorresinas• Microflora inicial – Géneros aislados• Efectos del procesado sobre los microorgansmos – Cosechado y primera parte del procesado • Rizomas • Corteza • Frutos en baya • Semillas – Secado – Desinfestación – Tratamiento con gases para destruir microorganismos – Otros tratamientos – Irradiación• Alteraciones – Alteraciones de las especias – Alteraciones de alimentos por microorganismos procedentes de especias• Patogenos – Bacterias – Mohos• Control 127
  • 128. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León Tema. Microbiología y análisis microbiológico de los cereales, harinas y derivados.• Introducción – Definiciones – Propiedades importantes – Métodos de manipulación y procesado de los productos derivados de los cereales• Microflora inicial (microflora de los granos en el campo)• Recolección, transporte y almacenamiento de los granos – Efectos del procesado sobre los microorganismos – Alteración de los granos • Actividad del agua (aw) • Temperatura y oxígeno • Calentamiento • Insectos • Invasión interna de las semillas por mohos • Cambios químicos • Examen microscópico y cultivo – Patógenos y toxinas • Micotoxinas Bacterias patógenas • – Interrelaciones – Control • Pruebas• Harinas y mezclas en seco – Procesado – Alteración – Patógenos y toxinas – Control Microbiología y análisis microbiológico del pan, pastas, cereales para el desayuno y productos de confitería.• Masas de pan – Procesados • Masa de pan normal • Pan Salt-Rising • Galletas crujientes (Soda Crackers) • Pan francés de San Francisco • Pan de centeno agrio • Panettone italiano • Idli • Masas de pan congeladas y refrigeradas – Alteración – Patógenos y toxinas 128
  • 129. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León – Interrelaciones – Control• Pan – Efectos del procesado sobre los microorganismos – Alteración – Patógenos y toxinas – Control• Pastas – Procesado – Alteración – Patógenos y toxinas – Control• Cereales para desayunos y aperitivos• Pasteles – Introducción • Alimentos incluidos Propiedades importantes • – Efectos del procesado sobre los microorganismos – Alteración – Patógenos • Introducción Calentamiento e higiene • – Interrelaciones – Control• Elección de la categoria – Materias primas a base de cereales – Masas de pan y pan – Pasta – Prodnctos de maíz – Pasteles de crema y rellenos Tema. Microbiología y análisis microbiológico del agua de bebida y de las aguas mineromedicinales y de mesa. Microbiología del agua en las industrias de alimentos.• La Calidad bacteriológica del agua potable – Bacterias patógenas transmitidas por el agua – Fundamentos para el uso de organismos indicadores • Organismos indicadores de contaminación fecal • Otros indicadores de contaminación fecal • Indicadores de la calidad del agua Organismos molestos • – Desinfección • Eficiencia de la desinfección 129
  • 130. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Desinfectantes residuales Efectos de la turbiedad • – Toma, almacenamiento y transporte de las muestras de agua para examen bacteriológico • Frascos para muestras • Neutralización de los desinfectantes • Procedimientos de muestreo Transporte y almacenamiento de las muestras • – Estudio de organismos indicadores de contaminación. Métodos recomendados para la detección y enumeración de organismos indicativos de contaminación • Instalaciones del laboratorio y condiciones de seguridad • Detección de organismos coliformes • Detección de estreptococos fecales • Detección de clostridios reductores de sulfito • Pseudomonas aeruginosa • Recuento de organismos aerobios• La calidad virológica del agua potable – Descripción general – Vías de exposición – Efectos sobre la salud – Fundamentos para formular recomendaciones – Métodos para el examen de virus – Interpretación y evaluación de los hallazgos positivos• Legislación Microbiología y análisis microbiológico de las bebidas refrescantes y de los zumos.• Introducción – Alimentos includos – Propiedades importantes • Acidez • Actividad del agua • Nutrientes • Oxígeno y potencial redox – Métodos de conservación • Sustancias antimicrobianas naturales • Conservadores• Microflora inicial• Tratamiento – Efectos de los distintos procesos sobre los microorganismos • Bebidas refrescantes • Jugo de tomate • Bebidas concentradas • Conservas de frutas 130
  • 131. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León• Alteración – Levaduras – Mohos – Bacterias – Patógenos• Control• Elección de la categoria• REAL DECRETO 1050/2003, de 1 de agosto, por el que se aprueba la Reglamentación técnico-sanitaria de zumos de frutas y de otros productos similares, destinados a la alimentación humana. Microbiología y análisis microbiológico de las bebidas alcohólicas• Vino – La fermentación alcohólica – La fermentación maloláctica – Tipos de vino • El vino tinto: un vino de Maceración• Cerveza – La historia de la cerveza • La cerveza en España – Elaboración • Preparación de la malta • Fabricación del mosto • Fermentación • Maduración, clarificación y envasado• Acético – Bacterias del ácido acético – Proceso industrial de fabricación del vinagre • Método Orleans • Método de goteo • Método de burbujeo Tema. Microbiología y análisis microbiológico de productos diversos• Microbiología y análisis microbiológico del azúcar, chocolate y derivados. Introducción – Alimentos incluidos – Propiedades más importantes• Azúcar – Azúcar de caña • Microflora Inicial • Efectos del procesado sobre los microorganismos – Azúcar de remolacha • Microflora Inicial • Efecto del almacenamiento y procesado sobre los m¡croorganismos 131
  • 132. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Alteración y otras repercusiones microbianas desfavorables. Control de la alteración durante la extracción • – Refinado del azúcar bruto • Efecto del procesado del azúcar bruto sobre los microorganismos • Alteración del azúcar líquido • Microorganismos del azúcar refinado capaces de provocar la alteración de otros alimentos • Control de los microorganismos del azúcar refinado – Elección de la Categoría• Granos de cacao, cacao y chocolate – Granos de cacao • Propiedades más importantes • Fermentación • Desecado • Procesado de los granos – Cacao • Propiedades más importantes • Microbiología • Control – Chocolate • Propiedades más importantes • Procedencia y destino de los gérmenes patógenos • Control de los microorganismos • Elección de la Categoría• Confituras – Propiedades más importantes – Efectos del procesado sobre los microorganismos – Alteración – Patógenos – Control – Elección de la Categoría• Piensos de origen animal y alimentos para animales de compañia – Introducción – Harinas procedentes de animales homeotermos • Propiedades importantes • Microflora inicial • Efectos del procesado en los microorganismos • Alteración • Patógenos Control • – Harinas de pescado • Propiedades importantes • Microflora inicial 132
  • 133. Microbiología y Análisis Microbiológico de los Alimentos Prof responsable: Miguel Prieto MaradonaFacultad de Veterinaria, Universidad de León • Efectos del procesado en los microorganismos • Alteración • Patógenos • Control – Alimentos para animales de compañía • Propiedades importantes • Microflora inicial • Efectos del procesado en los microorganismos • Alteración • Patógenos • Control• Elección de la categoría – Harinas de animales de sangre caliente – Harinas de pescado – Alimentos de animales de compañia Microbiología y análisis microbiológico de alimentos fermentados asiáticos y africanos. Microbiología y análisis microbiológico de sopas y salsas deshidratadas ensaladas, alimentos precocinados congelados y ancas de rana 133