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FARMACOLOGIA EXPERIMEN …

FARMACOLOGIA EXPERIMEN
TAL TECNICAS

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  • 1. MODELOS EXPERIMENTALES PARA LA EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD FARMACOLÓGICA DE PRODUCTOS NATURALES Mg. Q.F. Nesquen José Tasayco Yataco
  • 2.
    • OBJETIVOS:
    • Determinar los efectos que los diferentes constituyentes de la planta pueden provocar en el organismo.
    • Establecer cual de los principios activos de la planta es responsable del efecto.
    • Explicar por diferentes métodos que se pueden implementar, el modo de acción, especificidad de sus efectos en el organismo intacto o en los diferentes órganos y tejidos.
    MODELOS EXPERIMENTALES PARA LA EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD FARMACOLÓGICA DE PRODUCTOS NATURALES
  • 3. MODELOS DE ESTUDIOS EN LOS ANIMALES ESTUDIOS PRECLÍNICOS
    • Las pruebas de actividad farmacológica de un producto que quiere usarse para consumo humano, debe estudiarse en por lo menos 5 especies de animales diferentes.
    • Los animales que se prefieren son los mamíferos como mono, perro, gato, conejo, cuy, rata, ratón.
  • 4. Extracto total del Producto Vegetal Principio Activo aislado Determinación de la Estructura Química ESTUDIO DE ACTIVIDAD FARMACOLÓGICA Estudios de Toxicidad
  • 5. ESTUDIOS DE FARMACODINAMIA MODELO FARMACOLÓGICO Animal Sano Animal Enfermo provocado artificialmente En el animal Intacto o en órganos aislados
  • 6. Modelos farmacológicos en animales enfermos provocados artificialmente
  • 7. ETIOPATOGENIA DE LA ULCERA PÉPTICA
    • Helicobacter pylori
    AINES ALTERACION DE MECANISMOS DEFENSIVOS DE LA BARRERA MUCOSA GASTRODUODENAL OTROS FACTORES ALCOHOL DIETA TABACO ESTRÉS FACTORES DE AGRESIÓN ACIDO Y PEPSINA ULCERA
  • 8.  
  • 9. LESIONES GÁSTRICAS INDUCIDAS POR ESTRÉS POR INMOVILIZACIÓN EN FRÍO (Apecechea y col; 2000) Si 5 10 Sustancia de prueba 3 Si 5 10 Sucralfato 200 mg/mL 2 Si 5 10 Agua 1 Inducción de lesión gástrica Días de tratamiento Nº Ratas (150 – 200 g) Tratamientos Grupos
  • 10. LESIONES GÁTRICAS INDUCIDAS POR ESTRÉS POR INMOVILIZACIÓN EN FRÍO (Apecechea y col; 2000)
    • 4º día de tratamiento: Inmovilizar a las ratas y colocarlo en un refrigerador a una temperatura entre 5 y 10 ºC durante 2 horas.
    • 5º día de tratamiento: Repetir la operación. Inmediatamente después las ratas son sacrificadas.
    • Abrir los estómagos a lo largo de la curvatura mayor, lavar con solución salina fisiológica y fijar en placas para su inspección microscópica.
    • Determinar el índice de área dañada (Sumatoria del área en milímetros cuadrados de las lesiones producidas en cada estómago).
    • Determinar el % de Inhibición en la formación de lesiones.
    • % Inhibición = 100 – tratados x 100
    • Controles
  • 11. LESIONES GÁTRICAS INDUCIDAS POR ETANOL (Robert et al; 1979) 54 Total SI 9 Sustancia de prueba 3 6 SI 9 Sustancia de prueba 2 5 Si 9 Sustancia de prueba 1 4 SI 9 Ranitidina 100 mg/kg 3 10 mL/kg V.O. SI 9 SSF 1 mL/100g 2 SSF NO 7 días 20 – 22 ºC 180 – 200g 9 SSF 1 mL/100g 1 Administración de Etanol 96 % Inducción de lesiones gástricas Adaptación Peso Nº Ratas Tratamientos Grupos
  • 12. LESIONES GÁTRICAS INDUCIDAS POR ETANOL (Robert et al; 1979)
    • Hora cero: Administrar los tratamientos.
    • Hora uno: Administrar 1 mL de etanol a los grupos del 2 al 6. Al grupo 1 administrar SSF 1 mL.
    • Hora dos: Anestesiar a las ratas con vapores de éter dietílico, luego sacrificar.
    • Extraer los estómagos, abrir por la curvatura mayor y fijar sobre una placa porosa con alfileres para su evaluación microscópica.
    • Conservar en formol al 10% para su estudio histopatológico con tinción hematoxilina-eosina.
  • 13.
    • Los resultados de la observación macroscópica es expresado en % de inhibición de las lesiones gástricas.
    • % Inhibición de lesiones gástricas = (ILGc – ILGt) x100
    • ILGc
    • ILGc = Inhibición de lesiones gástricas del grupo control
    • ILGt = Inhibición de lesiones gástricas de los grupos con tratamiento
  • 14. Grupo 1: Se observa la conservación De la citoarquitectura del tejido gástrico Grupo 2: Se observa descamación de las células epiteliales, células Inflamatorias en región mucosa y evidente zonas erosivas.
  • 15. Escala para calificar el grado y aspecto de la mucosa Marcadas erosiones, pequeñas o amplias y extensas, o úlceras. MUY SEVERO Puntos de erosión, con edema, congestión y sangrado SEVERO Regular edema, congestión y sangrado MODERADO Ligero edema y congestión LEVE Normal 0 ASPECTO DE LA MUCOSA GRADO
  • 16. Medida del índice de lesión gástrica La sumatoria se expresa como índice de lesión gástrica y se expresa en Porcentaje de inhibición. 4 puntos Úlceras perforadas 3 puntos Úlceras de más de 1 mm 2 puntos Úlceras de menos de 1 mm 3 puntos Más de 10 petequias 2 puntos Menos de 10 petequias 1 punto Pérdida de mucosa, decolaración de mucosa, edema y hemorragia
  • 17. Calificación del grado de úlcera gástrica Muy severo Índice ulceroso Mayor a 30 Severo Índice ulceroso 20 – 30 Moderado Índice ulceroso 10 – 20 Leve Índice ulceroso Menor a 10 Normal Índice ulceroso 0
  • 18. PRUEBA PARA MECANISMOS ANTI - ULCEROGÉNICOS
    • DETERMINACIÓN DE LA SÍNTESIS DE PROSTAGLANDINAS
    • (Curtis et al. 1995)
    • Las ratas son deprivadas de alimentos 24 h antes del experimento.
    • Grupo 1: Twen 80 al 12 % (control, administración oral)
    • Grupo 2: Indometacina 20mg/kg (administración sub cutánea)
    • Grupo 3: Sustancia de prueba (administración oral)
    • Los animales son sacrificados 30 min. Después del tratamiento y el abdomen es abierto.
  • 19.
    • DETERMINACIÓN DE LA SÍNTESIS DE PROSTAGLANDINAS
    • (Curtis et al. 1995)
    • Una muestra del cuerpo del estómago (grosor completo) es cortada, pesada y suspendida en buffer citrato sódico (10 mM, pH 7.4; 1 ml).
    • El tejido es finamente desmenuzado con tijeras e incubado a 37 ºC por 20 min.
    • Las prostaglandinas E2 (PGE2) en el buffer es medido por inmunoensayo enzimático. La densidad óptica se lee a 450 nm.
  • 20. ACTIVIDAD ANTIDIARREICA MODELO DE DIARREA INDUCIDA CON ACEITE DE RICINO (Edwin E, et al; 1997) 18 Total Material fecal 1 mL 6 Sustancia de prueba 3 Material fecal 1 mL 6 Loperamida 3mg/kg 2 Material fecal 1 mL 6 Carboximetilcelulosa 1% 1 Medición Durante 5 horas 1 hora después Aceite de ricino Nº Ratas Tratamiento Grupos
  • 21. MODELO ANIMAL DE RESISTENCIA FÍSICA Grupo control Grupo tratado Agua Extracto acuoso 30 días de tratamiento por vía oral Prueba de nado forzado Registrar tiempo de resistencia de cada animal Sacrificar luego de 5 minutos post ejercicio Medición de actividad enzimática Superóxido Dismutasa (SOD) Lactato Deshidrogenasa (LDH) Catalasa
  • 22. ACTIVIDAD ANTINOCICEPTIVA: TEST DEL ACIDO ACÉTICO ANIMALES: Ratones machos con peso entre 23-30g FUNDAMENTO: Inducir contorsiones abdominales en el ratón Mediante la inyección de AcH 1% V/V i.p. PROCEDIMIENTO: Cinco minutos después de la administración De AcH contar el número de contorsiones en todos los Animales durante 20 minutos.
  • 23. 36.69 32.08 500 Extracto 2 21.06 40.00 250 Extracto 1 74.93 12.60 10 Indometacina ____ 50.67 ____ Control % Inhibición Nº de contorsiones Dosis (mg/kg) Grupo
  • 24. ACTIVIDAD ANTINOCICEPTIVA: TEST DE LA FORMALINA ANIMALES: Ratones machos con peso entre 23-30g FUNDAMENTO: Fase 1: Indicativa de dolor neurogénico (primeros 5 minutos) Fase 2: Indicativa de dolor inflamatorio (15 a 30 min. Después De la administración de formalina) Evaluación de las fases: Se mide el tiempo Acumulado en segundos durante el cual el animal se lame la pata PROCEDIMIENTO: Se estímulo doloroso se induce por la Inyección de 20 ul de formalina al 2.5% en la pata trasera Izquierda del ratón.
  • 25. ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA TEST DEL EDEMA DE PATA EN RATA INDUCIDO POR CARRAGANINA ANIMALES: Ratas hembras con un peso entre 180 y 200g PROCEMIENTOS: El edema se induce inyectando 0.1 mL de Carragenina al 1% en SSF en la almohadilla plantar de la Pata trasera derecha. La inflamación se cuantifica midiendo el volumen de las patas Utilizando un Pletismómetro a las 0, 1, 3 y 4 después de la Inyección de carragenina. La diferencia entre el volumen de la pata izquierda y el de la Derecha es indicativa del grado de inflamación.
  • 26. MODELO DE INFLACIÓN INTESTINAL CRÓNICA INDUCIDA POR INDOMETACINA (Sartor et al; 1992) ANIMAL: Ratas machos de 250g, ambientados 5 días antes del experimento. PROCEDIMIENTO: Administrar dos veces indometacina vía s.c. 7.5 mg/kg cada 24 horas Los tratamientos se administran por 6 días vía oral. Después de 7 días de la administración de la primera Inyección de indometacina, las ratas son sacrificadas Se extrae el yeyuno, se lava con SSF y se fija en formol Al 10 % para estudio histopatológico.
  • 27. Corte histológico del Epitelio intestinal normal Corte histológico del Epitelio intestinal destruido. La ulceración alcanza la Capa muscular Intestino delgado luego De la administración de los tratamientos
  • 28.
    • Modelos farmacológicos en animales sanos
  • 29. MODELO DE ESTUDIO PARA EVALUAR LA FERTILIDAD EN RATAS NORMALES 7 2 meses 180 a 200 g 24 machos 24 hembras 48 Dosis sustancia de prueba 2 7 2 meses 180 a 200 g 24 machos 24 hembras 48 Control SSF 5 mL/kg 1 Días de ambientación Edad Ratas Peso Ratas Sexo Nº Ratas Tratamientos Grupos
  • 30. MODELO DE ESTUDIO PARA EVALUAR LA FERTILIDAD EN RATAS NORMALES 48 ratas Total Fecundación o gravidez 6 machos y 6 hembras LH, FSH, estrógeno y progesterona 6 hembras Testosterona 6 machos Sustancia de prueba 2 Fecundación o gravidez 6 machos y 6 hembras LH, FSH, estrógeno y progesterona 6 hembras Testosterona 6 machos SSF 5 mL/kg 1 Criterios de medición Sub grupos Tratamiento Grupos
  • 31. Gravidez en ratas controles Gravidez en ratas tratadas
  • 32. Método de evaluación del sistema reproductor Efecto sobre la función sexual
    • Evaluación del apareamiento por 1 día
    • Material Biológico: Ratones machos y hembra 23 - 25 g
    • Material Farmacológico: Sustancias de prueba
    • Estradiol benzoato
    • Progesterona
    • Procedimiento: Evaluación sobre el apareamiento por un día
  • 33. Procedimiento: Evaluación de apareamiento por un día N Tratamientos Vía administración G 1 G 2 Control (n = 10) Sustancia de prueba (n = 10) Oral Oral
  • 34. Procedimiento: Evaluación de apareamiento por un día
    • Cada ratón macho es colocado en jaula separada
    • Después de una hora se admiten 5 ratones hembras a cada macho
    • Cada ratón hembra es expuesto en estro con dosis única s.c. de benzoato estradiol y progesterona
    • Observación: La mañana siguiente se examina una muestra vaginal bajo un microscopio para la presencia de esperma
    • Registrar: El número de hembras positivo para esperma en cada jaula.
    • Calcular el promedio de hembras Espermas – positivo para el grupo control y esperimental
  • 35. MODELO DE ESTUDIO DE TOXICIDAD SUB AGUDO Grupo Control Grupo Tratado 30 días de tratamiento Muestras de sangre Inicio, 15 y 30 días de tratamiento Día 30, las ratas son sacrificadas Estudios de perfil bioquímico Glucosa, Triglicéridos LDL-Colesterol, HDL-Colesterol Colesterol total Proteínas totales Albúmina, TGO, TGP Estudios Hematológicos Hemoglobina Hematocrito Estudios Anatomopatológicos Hígado, corazón Páncreas, estómago Riñones
  • 36. Actividad hipoglucemiante del extracto hidroalcohólico de las hojas del Smallanthus sonchifolius (Yacón) en ratas con diabetes mellitus tipo 1 y 2
  • 37. [email_address] 1.- Material Biológico: Ratas albinas cepa Holtzmann Características DMT1 DMT2 Número de ratas Edad Peso Sexo Procedencia Temperatura Alimentación Agua 45 8 semanas 180 ± 20 g Machos INS 20 – 23 ºC Obtenidas del INS Ad libitum 24 8 a 9 semanas 225 ± 25 g Machos INS 20 – 23 ºC Obtenidas del INS Ad libitum
  • 38. [email_address] 2.- Materila Farmacológico: Extracto hidroalcohólico al 10% p/v de Smallanthus sochifolius (yacón) Glibenclamida tableta 5 mg. Aloxano (5,6 - dioxyuracil). 3.- Equipos: Balanza analítica al 0.001g (Metter Zurich) Estufa (Memmert) Refrigerador Glucómetro Accu-Chek Active (Laboratorios Roche) Kit Sistemas Elecsys 1010/2010 (Laboratorios Roche) Equipo de disección
  • 39. [email_address] 4.- Descripción del estudio Estudio prospectivo, longitudinal experimental del tipo “casos y controles”.
  • 40. [email_address] 100g HOJAS DESHIDRATADAS Y MICROPULVERIZADAS DE Smallantus sonchifolius (yacón) MACERACIÓN EN 1000 mL de ALCOHOL AL 80% POR 7 DÍAS FILTRACIÓN SECADO A 40 GRADOS PESADO ALMACENAMIENTO REFRIGERACIÓN
  • 41.
    • 2.- Inducción de diabetes mellitus tipo 1 y 2 a ratas
    [email_address] DMT1 DMT2 Método Aloxano buffer citrato pH 4.75 Glucemia Mendez JD et al 1994 Tres dosis 150 mg/kg p.c. / 48 h Mayores a 300 mg/dL Zanoello Am et al 2002 Cuatro dosis de 75 mg/kg p.c. / 48 h Entre 125 – 359 mg/dL
  • 42.
    • 3.- Criterios de medición
    [email_address] DMT1 Determinación de glucosa Determinación de insulina DMT2 Determinación de glucosa Determinación de efectos adversos a nivel bioquímico Determinación de efectos adversos a nivel hematológico
  • 43.
    • 4.- Diseño experimental de diabetes mellitus tipo 1.
    Grupos Tratamientos Nº Ratas Aloxano 1 2 3 4 5 Control + SSF Glibenclamida 10 mg/Kg Yacón 250 mg/Kg Yacón 500 mg/Kg Yacón 1000 mg/Kg TOTAL 9 9 9 9 9 45 Recibió Recibió Recibió Recibió Recibió SSF. = Solución Salina Fisiológica
  • 44.
    • 5.- Diseño experimental de diabetes mellitus tipo 2.
    Grupos Tratamientos Nº Ratas Aloxano Días de Tratamiento 1 2 3 4 Normal + SSF Control (+) + SSF Glibenclamida 10 mg/Kg Yacón 500 mg/Kg TOTAL 6 6 6 6 24 S.S.F. Recibió Recibió Recibió 30 30 30 30 SSF = Solución Salina Fisiológica
  • 45.
    • Se compararon los resultados obtenidos para cada grupo (caso y control), se realizaron procedimientos estadísticos como media de tendencia central; promedio y error estándar, y para probar la hipótesis el análisis de varianza ANOVA mediante el paquete estadístico SPSS versión 13.0 y fueron considerados estadísticamente significativos a p<0.05. Los resultados se muestran en tablas y gráficos.
    6.- Análisis estadístico
  • 46. MUCHAS GRACIAS