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es la guía aplicada que se uttiliza en el presente ciclo

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  1. 1. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA MANUAL MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA APLICADA Dr. Q.F. HÉCTOR ALEXANDER VILCHEZ CÁCEDA Mg. EN GERENCIA DE SERVICIOS DE SALUD LIMA – PERÚ 2010
  2. 2. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PROLOGO La Universidad Inca Garcilaso de la Vega, está empeñada en realizar importantes innovaciones en la concepción y práctica educativa con el propósito de brindar a sus alumnos una formación profesional más competitiva, que haga posible su ingreso con éxito al mundo laboral, desempeñándose con eficacia y eficiencia en las funciones que les tocará asumir. El marco referencial está dado por los cambios significativos de la sociedad contemporánea, expresados en la globalización y los nuevos paradigmas del conocimiento, de la educación y la pedagogía así como los retos del mundo laboral. Uno de los medios para el logro de nuestros propósitos lo constituye el MANUAL DE PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA el cual ha sido concebido como un material educativo que va ha servir para afianzar conocimientos, desarrollar habilidades y destrezas, así como orientar la autoeducación permanente. por ello se ubica como un material de lectura independiente, sirve de información y recreación, desempeña un papel motivador, se orienta a facilitar la lectura comprensiva, a ampliar conocimientos en otras fuentes, crear hábitos y actitudes, así como a desarrollar destrezas para el procesamiento de información, adquisición y generación de conocimientos. El presente Manual, constituye material de apoyo al desarrollo de la asignatura y está organizado en dos unidades: Unidad I: Microbiología Generalidades, Unidad II: Microbiología Aplicada comprende: Microbiología Clínica, Microbiología Alimentaria, Microbiología en la Industria Farmacéutica y Cosmética y de un Trabajo de Campo. Los alumnos deben leer detenidamente cada práctica, antes de su realización, para una mejor comprensión en la observación del fenómeno biológico de cada microorganismo en estudio. Además debe realizar diagramas de flujo de lo observado el cual será revisado por el profesor responsable de cada grupo de práctica. El autor agradece anticipadamente la(s) crítica(s) o sugerencia(s) que puedan tener los lectores que sirvan para mejorar el presente trabajo. Dr. Q.F. HÉCTOR ALEXANDER VILCHEZ CÁCEDA DOCENTE DE MICROBIOLOGÍA 1 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  3. 3. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA INDICE PRÓLOGO 01 INDICE 02 INTRODUCCIÓN 04 RESULTADO DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO 06 UNIDAD II: MICROBIOLOGÍA APLICADA 07 2.1 MICROBIOLOGÍA CLÍNICA 08 PRACTICA N° 07 Aislamiento e Identificación de Staphylococcus y Streptococcus. 08 PRACTICA N° 08 Bacilos Gram Negativos de Importancia Medica 24 PRACTICA N° 09 Hemocultivo y Coprocultivo 36 PRACTICA N° 10 Urocultivo, Recuento de Colonias, Antibiograma. 44 2.2 MICROBIOLOGÍA ALIMENTÁRIA 53 PRACTICA N° 11 Análisis Microbiológico de Productos Lácteos 54 - Preparación y Dilución de las Muestras de Alimentos - Numeración de Microorganismos Aerobios Mesófilos Viables. - Identificación de Patógenos. PRACTICA N° 12 Análisis Microbiológico de una Muestra de Agua 61 - Preparación y Dilución de la Muestra - Numeración de Coliformes - Determinación del Numero Más Probable (NMP). - Identificación de Patógenos. 2 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  4. 4. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA 2.3 MICROBIOLOGÍA EN LA INDUSTRIA FARMACÉUTICA Y COSMÉTICA 65 PRACTICA N° 13 Monitoreo de Ambientes Superficies y Personal. 66 PRACTICA N° 14 Control Microbiológico de Crema de Baba de Caracol 70 PRACTICA N° 15 Control Microbiológico de Envases. 73 PRACTICA N° 16 Control Microbiológico de Lápices Labiales 74 REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA 77 ANEXO III: ESQUEMA DE RESULTADOS DE MICROBIOLOGÍA APLICADA 79 3 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  5. 5. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA 3 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  6. 6. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA INTRODUCCIÓN La Microbiología es la ciencia encargada del estudio de los organismos microscópicos, deriva de 3 palabras griegas: mikros (pequeño), bios (vida) y logos (ciencia) que conjuntamente significan el estudio de la vida microscópica. Son considerados Microbios todos los seres vivos microscópicos consistentes en una sola célula, es decir unicelulares, así como aquellos que forman agregados celulares en los cuales todas las células son equivalentes. Los microorganismos pueden ser Eucariotas (Las células poseen núcleo), tales como los hongos y los protistas, o Procariotas (células carentes de núcleo), como las Bacterias y los Virus (Aunque los virus no son considerados seres vivos estrictamente hablando). El Químico Farmacéutico y Bioquímico, es el profesional universitario de las Ciencias Médicas con formación científica, tecnológica y humanística, con capacidad gerencial, ejecutiva y de liderazgo. Así mismo altamente capacitado para poder ejercer profesionalmente en los campos de la Industria Farmacéutica e Industria Cosmética siendo Jefe de Control de Calidad, del Laboratorio de Análisis Clínicos y Bioquímicos ejerciendo la Microbiología Clínica y del Laboratorio de Bromatología realizando los Controles Microbiológicos a los Alimentos. Hoy en día el Profesional Químico Farmacéutico y Bioquímico es el profesional responsable de la producción de los medicamentos y de los cosméticos de calidad, seguros y eficaces y para lograr este objetivo el control microbiológico se considera de gran importancia, ya que en estos productos se pueden presentar las condiciones necesarias para la multiplicación de microorganismos capaces de deteriorar al producto o, lo que es peor, afectar la salud del consumidor. El cuidado de los alimentos y la industrialización de los mismos se ha convertido en una ciencia y cada vez más se estudia e investiga la forma de mejorar la calidad. Día a día surgen nuevas técnicas, nuevos tipos de envases, nuevos aditivos, nuevos conservadores, etc. Esto ha llevado al establecimiento de normas, al desarrollo de métodos y sistemas de control, que aseguren la inocuidad de los mismos. Para lograr este objetivo el Químico Farmacéutico y Bioquímico, realiza los Controles Microbiológicos donde cuantifica e identifica los microorganismos presentes en los alimentos. 4 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  7. 7. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA Las infecciones intrahospitalarias cada vez más constituyen un serio problema de salud pública, ya sea por su efecto sobre la salud de los pacientes, como por los costos que este problema implica. Esto hace, que en el país se estén aunando esfuerzos para implementar sistemas de vigilancia, prevención y control, orientados a enfrentar este problema. Por lo que el Medico debe basar su diagnóstico en evidencias disponibles, como son los aspectos epidemiológicos, y la importante contribución del Laboratorio de Microbiología, que además de permitir el diagnóstico etiológico, orienta el manejo clínico terapéutico del paciente. El estudiante de Microbiología de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímica de la Universidad Inca Garcilaso de la Vega, en el futuro será el profesional Químico Farmacéutico y Bioquímico, quien con los conocimientos presentes en este manual estará en la capacidad de poder afrontar y resolver con criterio los problemas presentados ya sea en la Jefatura de Control de Calidad de una Industria Farmacéutica ó Cosmética, como en un Laboratorio Clínico Microbiológico ó un Laboratorio Bromatológico. 5 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  8. 8. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA RESULTADO DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO Nombre: _______________________ Código: ___________________ Lote: __________________________ Fecha de Análisis: ___________ Fecha de Ingreso: ____________________ N° An álisis: ______________ de Resultados: Microorganismos Aeróbios 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 24 Horas 48 Horas 72 Horas Microorganismos Patógenos 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 24 Horas 48 Horas 72 Horas Resultado: Hongos y Levaduras 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 3er Día 5to Día Resultado: Observaciones: Fecha ___________________ ________________________ Analista Jefe de control de Calidad 6 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  9. 9. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA UNIDAD II: MICROBIOLOGÍA APLICADA 7 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  10. 10. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA 2.1 MICROBIOLOGÍA CLÍNICA PRACTICA N°07 AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS Y STREPTOCOCCUS STAPHYLOCOCCUS Los estafilococos constituyen un grupo de microorganismos esféricos, Gram positivos, agrupados en forma de racimos, tetradas o aisladas, inmóviles no esporulados. El género Staphylococcus pertenece a la familia Micrococcaceae. La especie patógena del género es Staphylococcus aureus. Este microorganismo puede formar parte de la flora nasal del hombre y también es causante de diversos procesos infecciosos tales como impétigo, forunculosis, abscesos, intoxicaciones alimentarias e infecciosas particularmente graves como bacteriemias. La especie patógena produce una enzima llamada coagulasa, que puede estar libre (free- coagulase) o ligada (clumping factor). Algunas especies de Staphylococcus coagulasa negativas, tales como Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus saprophyticus considerados hasta hace relativamente poco tiempo como no patógenos, vienen teniendo un papel relevante en cuadros infecciosos bacteriémicos y urinarios. MATERIALES - Placas petri con agar sangre de carnero. - Placas petri con agar Dnasa. - Placas petri con agar manitol salado. - Placas petri con agar tripticasa soya agar. - Tubos con caldo plasma. - Asas de platino. - Juego de colorantes para Gram. - Láminas portaobjetos simples. - Caldo nutritivo en tubo. - H2O2 al 3%. - Lápiz graso - Aceite de inmersión. PROCEDIMIENTO - Hacer un frotis en las láminas portaobjetos limpios y desengrasados a partir de la muestra problema, realizar la coloración de Gram. - Observar con el microscopio utilizando objetivos de inmersión, destacando la forma de agrupación y la coloración que toma la bacteria. - Realizar la siembra en estría de la muestra problema en los siguientes medios de cultivo: Agar sangre de carnero, agar manitol salado y agar TSA. Llevar a la Incubadora a 37ºC durante 24 – 48 horas. - Realizar una siembra en forma circular o elíptica en la placa que contiene agar Dnasa. Llevar a la Incubadora a 37ºC durante 24 – 48 horas. 8 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  11. 11. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PRUEBA DE LA CATALASA Determina la presencia de la enzima catalasa, esta enzima descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. PROCEDIMIENTO - Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18 a 24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio. - Agregar una gota de H2O2 al 3% usando un gotero o una pipeta pasteur. - No es necesario mezclar el cultivo con el H2O2. - Observar una inmediata efervescencia (formación de burbujas) lo que indica una prueba positiva, de lo contrario se considera la prueba negativa. - Desechar el portaobjetos colocándolo en un desinfectante. NOTA: Al coger la colonia con el asa de siembra tener cuidado de no llevar algo del medio de agar sangre debido a que la catalasa presente en los eritrocitos, puede dar resultados falsos positivos. No invertir el orden del método porque pueden producirse resultados de falsos positivos. PRUEBA DE LA COAGULASA Se realiza para comprobar la facultad de la bacteria de coagular el plasma por acción de la enzima coagulasa, la cual aumenta la velocidad de coagulación del plasma. El resultado final es la formación de un coágulo de fibrina. - Prueba en lámina (detecta factor de aglutinación o coagulasa ligada). - Prueba en tubo (detecta coagulasa libre y ligada). La prueba de coagulasa en tubo es definitiva, y la prueba de coagulasa en lámina puede ser usada como una técnica de tamizaje rápida para la identificación de S. aureus. Todas las pruebas negativas en lámina deben repetirse utilizando la técnica en tubo. NOTA: El plasma humano no debe ser usado a menos que haya sido cuidadosamente probado de no contener algún agente infeccioso, capacidad de coagulación e inhibidores. PRUEBA EN LÁMINA La prueba de la coagulasa en lámina es un método únicamente presuntivo. Por esa razón todos los resultados negativos o retardados (más de 20 segundos) deben ser confirmados por la prueba en tubo. PROCEDIMIENTO - Preparar una suspensión densa de la colonia en agua destilada o solución fisiológica mezclando bien para homogenizar. 9 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  12. 12. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA - Si hubiera autoaglutinación no continuar y realizar la prueba en tubo. - Agregar una gota de plasma y mezclar con movimientos circulares. - Observar la formación de aglutinación o precipitado dentro de 20 segundos. - Todas las pruebas negativas y positivas retardadas (20 a 60 segundos) debe confirmar-se con la prueba en tubo. NOTA Es una prueba bastante rápida y económica pero del 10 a 15 % de S. aureus pueden dar un resultado negativo, por eso, todos los resultados negativos deben repetirse utilizando la técnica en tubo. PRUEBA EN TUBO PROCEDIMIENTO - Transferir una colonia aislada del agar sangre de carnero a 0,5 mL de plasma reconstituido (en un tubo de vidrio estéril de 13 x 100). - Girar el tubo suavemente para lograr la suspensión del organismo. No agitar. - Incubar la mezcla a 35 – 37° (en baño maría de p referencia) por 4 C horas; observar si hay formación de coagulo inclinando lentamente el tubo. - Observar cuidadosamente si hay formación de coagulo inclinando lentamente el tubo (sin agitar) en intervalos hasta 4 horas. Cualquier grado de coagulación es una prueba positiva. - La mayoría de los S. aureus formarán coagulo dentro de una hora. - Si es negativa a las 4 horas seguir incubando hasta el día siguiente a temperatura ambiente. Esto es recomendado porque un pequeño número de cepas de S. aureus pueden requerir más de cuatro horas para la formación del coágulo. Considerar que Staphylococcus produce fibrinolisina, la cual puede lisar el coagulo. - Si son estafilococos coagulasa negativos, realizar las pruebas de resistencia a la polimixina B y novobiocina (disco de 5ug) para tener una identificación presuntiva. S. saprophyticus es resistente a la novobiocina y S. epidermidis es resistente a la polimixina B. 10 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  13. 13. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA STAPHYLOCOCCUS Aislamiento e identificación: Staphylococcus aureus COLONIAS: MEDIOS A. S. A. M. S. T. S. A. DNASA TAMAÑO FORMA PIGMENTO HEMÓLISIS MANITOL DNASA CATALASA COAGULASA GRAM Aislamiento e identificación: Staphylococcus epidermidis COLONIAS: MEDIOS A. S. A. M. S. T. S. A. DNASA TAMAÑO FORMA PIGMENTO HEMÓLISIS MANITOL DNASA CATALASA COAGULASA GRAM Aislamiento e identificación: Staphylococcus saprophyticus COLONIAS: MEDIOS A. S. A. M. S. T. S. A. DNASA TAMAÑO FORMA PIGMENTO HEMÓLISIS MANITOL DNASA CATALASA COAGULASA GRAM 11 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  14. 14. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA INTERPRETACIÓN COLORACIÓN GRAM Gram positivos en racimos Estructura pared celular Gram positivo AGAR SANGRE DE CARNERO Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus 12 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  15. 15. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA AGAR MANITOL SALADO Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus (+) AGAR DNASA Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus 13 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  16. 16. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PRUEBA DE LA COAGULASA Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus PRUEBA DE LA CATALASA Staphylococcus aureus: catalasa positivo Staphylococcus epidermidis: catalasa positivo Staphylococcus saprophyticus: catalasa positivo Streptococcus: catalasa negativo Micrococcus: aerobio estricto, presenta colonias amarillas anaranjadas, catalasa positivo, oxidan, no fermenta. Los micrococos son muy abundantes en la naturaleza, viéndose aislado más frecuentemente del polvo y agua. A menudo se encuentra en utensilios y equipos usados en alimentación que no han sido adecuadamente limpiados e higienizados. 14 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  17. 17. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS DE LAS ESPECIES DE STAPHYLOCOCCUS COMÚNMENTE AISLADOS EN INFECCIONES PIGMENTO DE HEMOLISINA ESTAFILO FACTOR DE COLONIA (*) COAGULASA AGLUTINACIÓN S. aureus Subespecies aureus + + + + S. epidermidis - (d) - - S. haemolyticus d (+) - - S. lugdunensis d (+) - (+) S. saprophyticus Subespecies d - - - saprophyticus S. schleiferi, Schleiferi - (+) - + S. warmeri d (d) - - RESISTENCIA A RESISTENCIA A ORNITINA ACIDEZ DE NOVOBIOCINA POLIMIXINA B DESCARBOXILASA MANITOL S. aureus Subespecies aureus - + - + S. epidermidis - + (d) - S. haemolyticus - - - d S. lugdunensis - d + - S. saprophyticus + - - d Subespecies saprophyticus S. schleiferi, Schleiferi - - - - S. warmeri - - - d + 90% o más especies o cepas positivas. - 90% o más especies o cepas negativas. d 11% - 89% de especies o cepas positivas (+) Reacción retardada (*) En agar sangre de carnero + Zona amplia de hemólisis dentro de 24 – 36 horas (+) Hemólisis retardada, de una zona moderada a amplia dentro de las 48 – 72 Horas (d) No hay hemólisis o es retardada - No hay hemólisis o hay una zona muy angosta (≤ 1mm) dentro de las 72 horas. Algunas de las cepas pueden producir in ligero color verdusco o marrón en agar sangre de carnero. CUESTIONARIO 1. ¿Qué factores son los qué condicionan la patogenicidad del Staphylococcus aureus, en comparación con otras especies de estafilococos? 2. ¿Qué enfermedades produce el Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus saprophyticus? 15 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  18. 18. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA STREPTOCOCCUS Y ENTEROCOCCUS INTRODUCCIÓN Constituye un grupo de microorganismos esféricos o lanceolados, gram positivos, inmóviles no esporulados, en cadena cortas o largas. En el género Streptococcus están comprendidas especies patógenas para el hombre tales como Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae, existen portadores asintomáticos de ambas especies. Streptococcus pyogenes es causante de faringitis, amigdalitis, otitis, escarlatina, erisipela e impétigo, la fiebre reumática y la glomérulo nefritis pueden ser secuelas de la infección. En placas de agar sangre produce hemólisis tipo beta y puede ser identificada mediante su sensibilidad a la bacitracina. La especie Streptococcus pneumoniae se presenta en forma de diplococo, posee una cápsula nítida asociada con la virulencia del germen, en medio enriquecido como el agar sangre, las cepas encapsuladas de neumococos forman colonias mucoides y son virulentas para los ratones se identifican por su solubilidad en sales biliares, por metabolizar la inulina y por su sensibilidad a la optoquina. Produce hemólisis tipo alfa, carácter que comparte con los Streptococcus alfa hemolíticos o Streptococcus viridans. Son los agentes causales más frecuentes de neumonía lobar, sinusitis y meningitis. Las especies del género Enterococcus son bacterias que se encuentran en el intestino y algunas veces pueden producir infecciones fuera del intestino. Se identifican por su crecimientros en medios de concentración alta de cloruro de sodio. MATERIALES - Placas petri con agar sangre de carnero. - Asas de platino. - Juego de colorantes para Gram. - Láminas portaobjetos simples. - Caldo nutritivo en tubo. - H2O2 al 3%. - Lápiz graso - Aceite de inmersión. - Bajalengua. - Hisopos de algodón estéril. PROCEDIMIENTO 1. Tome un hisopo estéril y un bajalengua. 2. Pida al compañero que se eligió para la práctica que mire hacia arriba, abra la boca y saque la lengua. 3. Con el bajalengua deprima la lengua para tener una mejor visión de la faringe 4. Con el hisopo, toque a manera de raspado la parte posterior de la faringe, las amígdalas y el pilar posterior del velo del paladar. 5. Retire el bajalengua y el hisopo con el exudado de la faringe. 16 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  19. 19. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA 6. Con el mechero de Bunsen encendido y respetando el margen de esterilidad inocule con el hisopo el material del exudado faríngeo en una placa con agar sangre y siembre con una asa con la técnica de estría múltiple. 7. Queme por la parte de en medio su hisopo para que no sea nuevamente utilizado 8. Incube a 37ºC durante 24 horas. 9. Transcurrido las 24 horas, saque las cajas de la incubadora y encienda el mechero 10. Haga un frotis de las colonias que crecieron en el agar sangre 11. Tiña con la técnica de Gram 12. Observe con aceite de inmersión el frotis 13. De acuerdo a lo observado en cada uno de los frotis realice las pruebas correspondientes. Para cocos Grampositivos en cadena de acuerdo a la hemólisis - Tomar la cepa sospechosa de estreptococos e inocular la en una placa de agar sangre en un cuadro de aproximadamente 1.5 cm por 1.5 cm por estriación masiva. - En medio del cuadro estriado con la cepa colocar el disco con la Bacitracina Incubarlos a 37ºC durante 24 horas. - En las placas de agar sangre observar las colonias pequeñas y rodeadas de hemólisis, sin destapar la placa observar al microscopio con objetivo de 5X la zona de hemólisis tipo beta (destrucción total de los hematíes) y la hemólisis tipo alfa. STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE (NEUMOCOCO) Y ENTEROCOCCUS MATERIALES - Cultivo de neumococos en caldo nutritivo - Cultivo de neumococo en agar sangre y discos de Optochin - Cultivo de enterococcus sp. En agar sangre - Cultivo de enterococcus sp. En caldo con NaCL 6.5% - Láminas portaobjetos simples. - Solución de sales biliares al 10% - Caldo esculina. PROCEDIMIENTO - Hacer frotices a partir de las colonias en agar sangre, colorearlos con gram. - Observar con lentes de inmersión la morfología del diplococo lanceolado gram positivo, típico del neumococo. - Observar la discreta y uniforme turbidez en el medio líquido. - En la placa de agar sangre observar la colonia pequeña aplanada y rodeada de un color verdoso por la hemólisis alfa. 17 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  20. 20. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA - En las placas de agar sangre con discos de optoquina, observar halo de ausencia de desarrollo con el neumococo. - En el medio con inulina constatar la formación de acidez por metabolismo de este carbohidrato. - Observar el aclaramiento ión del cultivo líquido al añadirse sales biliares al 10%. STREPTOCOCCUS Aislamiento del estreptococo beta hemolítico del grupo A. MEDIOS DE CULTIVO AGAR SANGRE Tamaño Forma Hemólisis gram Tipificación: MEDIOS DE CULTIVO AGAR SANGRE Bacitracina Hemólisis STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE Aislamiento MEDIOS DE CULTIVO AGAR SANGRE Tamaño Forma Hemólisis gram Tipificación: MEDIOS DE CULTIVO AGAR SANGRE Optoquina Sales biliares Inulina Gram (tinta china) * Para Enterococcus, interpretar el desarrollo en el caldo con NaCL 6.5% 18 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  21. 21. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PRUEBA DE LA ESCULINA EN MEDIO CON BILIS Para determinar la facultad de un organismo de hidrolizar el glucósido esculina en esculetina y glucosa, en presencia de bilis. PROCEDIMIENTO - Inocular el cultivo en estudio haciendo estrías sobre la superficie del pico de flauta o de la placa de agar bilis esculina. - Incubar a 35 – 37° hasta 72 horas. C - Se puede controlar periódicamente, y esperar hasta las 72 horas antes de informar como negativo. LECTURA Positivo: En tubo: Ennegrecimiento difuso en el agar inclinado. En placa: Se observa un halo negro o marrón alrededor de las colonias en la placa. Negativo: No se produce ennegrecimiento del medio o ennegrecimiento de menos de la mitad del tubo después de 72 horas de incubación. TOLERANCIA AL CLORURO DE SODIO Para determinar la facultad de un organismo de desarrollar en presencia de una concentración de 6.5 % de cloruro de sodio. PROCEDIMIENTO - Inocular en el caldo TSB con cloruro de sodio un cultivo de 18 - 24 horas de incubación. - Incubar a 35 – 37° por 24 horas. C - Se puede controlar periódicamente, y esperar hasta las 72 horas antes de informar como negativo. LECTURA Positivo: Hay desarrollo bacteriano Negativo: No se observa crecimiento en el caldo Observar el oscurecimiento del agar indicando si hubo hidrólisis de la esculina y el crecimiento en el caldo con cloruro de sodio. Con estas pruebas tenemos dos identificaciones presuntivas posibles: así todos los enterococos (95%) son esculina positivos y crecen en medios con 6.5% de cloruro de sodio produciendo acidez. 5% – 10% de Streptococcus del grupo viridans son bilis esculina positivos. 19 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  22. 22. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA INTERPRETACIÓN COLORACIÓN GRAM Cocos gram positivos en cadena AGAR SANGRE Beta hemólisis Alfa hemólisis Estreptococo pneumoniae hemólisis parcial Gama hemólisis no hay cambios 20 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  23. 23. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA Hisopado de las amígdalas En la placa se observa beta hemólisis posible streptococcus pyogenes mezclada con la alfa normal y gama hemólisis colonias de los estreptococcus viridans que viven normalmente en la garganta. Estreptococo pneumoniae Estreptococo pyogenes Sensibilidad a la bacitracina Estreptococo pneumoniae Sensibilidad a la optoquina 21 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  24. 24. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA Enterococo faecalis Caldo S F Los enterococos en presencia de azida de sodio crecen, fermentan la dextrosa formando acido el cual vira el indicador de pH de un violeta a un color amarillo marrón. Agar Bilis Esculina Los enterococos crecen en presencia de sales de bilis. Mientras crecen, hidrolizan la esculina del medio de cultivo apreciándose un color negro en el agar. Hidrólisis de la esculina En medio bilis esculina Caldo con NaCL 6.5% 22 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  25. 25. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PRINCIPALES CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS DE COCOS GRAM POSITIVOS, EN CADENA CATALASA NEGATIVOS BILIS CRECIMIENTO NACL 6.5% HEMÓLISIS ESCULINA 10° C 45° C Enterococcus + + + + α, β, η Streptococcus -a -b - V α, β, η Lactococcus + V + V α, η Vagococcus + + + V α, η a De los Streptococcus viridans 5% - 10% son bilis esculina positivas b Algunos Streptococcus beta hemolíticos crecen en 6,5% de NaCL n No hemolítico + ≥ 95% reacciones positivas - ≤ 5% reacciones positivas V Reacciones variables Hisopado Faríngeo CUESTIONARIO 1. ¿Recomendaría usted, a un paciente que presenta un cuadro de faringoamigdalitis se haga un examen de secreción faríngea, con el fin de descartar la presencia de Streptococcus pyogenes? 23 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  26. 26. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PRACTICA N° 08 BACILOS GRAM NEGATIVOS DE IMPORTANCIA MEDICA Los bacilos Gram negativos conforman un grupo compuesto por múltiples familias bacterianas entre las que destacan la familia Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Pseudomonadaceae y otras. La familia Enterobacteraceae constituye el conjunto mayor y más heterogéneo de bacilos Gram negativos. Se han descrito al menos 27 géneros y 7 grupos entéricos con más de 110 especies. Estos géneros se han clasificado en función de la homología del ADN, propiedades bioquímicas, reacciones serológicas, susceptibilidad a bacteriófagos específicos y patrones de sensibilidad a los antibióticos. Son bacilos Gram negativos, facultativos que fermentan glucosa, son oxidasa negativos, reducen nitratos a nitritos y no requieren ni su desarrollo se acrecienta con NaCl. Pueden ser móviles o inmóviles, estas características sirven para diferenciar miembros de esta familia de otros bacilos Gram negativos facultativos fermentadores de glucosa pertenecientes a la familia Vibrionaceae. Son organismos ubicuos de distribución mundial, se encuentran en el suelo, agua, vegetación y formando parte de la microbiota normal del intestino de casi todos los animales incluyendo al humano. Las Enterobacterias pueden dar cuenta del 80% de los aislamientos clínicamente significativos de bacilos Gram negativos en laboratorios de microbiología clínica y del 50% de todos los aislamientos clínicamente significativos, así mismo pueden causar aproximadamente de un 60 a 70% de enteritis bacteriana aguda. Si bien muchas Enterobacterias han sido implicadas en caso de diarrea solo se han establecido claramente como patógenos entéricos miembros de los géneros Escherichia, Salmonella, Shigella y Yersinia. Excepto las especies de Shigella, que rara vez causan infecciones fuera del tracto gastrointestinal, la mayoría de las Enterobacterias son capaces de producir una variedad de infecciones extraintestinales. Sin embargo, un pequeño número de especies incluyendo Enterobacter aerógenes, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoneae, Proteus mirabilis y Serratia marcescens dan cuenta de la gran mayoría de las infecciones. Las infecciones del tracto urinario (mas del 70%) principalmente cistitis son las más comunes, heridas por infecciones respiratorias, de heridas, del torrente sanguíneo y del SNC. MATERIALES Placas con Agar Mac Conkey Tubos con TSI Placas con Agar EMB Tubos con LIA Placas con Agar XLD Tubos con Caldo Triptófano Placas con SSAgar Tubos con MIO, MR-VP Placas con TCBS Reactivo de Kovacs Tubos con caldo Selenito Reactivos para tinción de Gram Tubos con citrato de Simmons Asas y aro de siembra 24 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  27. 27. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS GÉNEROS ESCHERICHIA, KLEBSIELLA ENTEROBACTER, CITROBACTER, SALMONELLA, SHIGUELLA, YERSINIA, PROTEUS INTRODUCCIÓN Las enterobacterias son bacilos gram negativos no esporulados, aeróbicos y anaeróbicos facultativos que habitan en el tracto intestinal. Algunos géneros de esta familia son patógenos para el hombre, en cambio otros condicionan su patogenicidad al hábitat que colonizan. La identificación de las diferentes especies de enterobacterias se realizan estudiando la actividad metabólica del microorganismo sobre los diversos sustratos (carbohidratos, proteínas, etc) en la practica se estudiarán las especies de mayor importancia medica. Comprenden muchos géneros entre ellos: Escherichia que se encuentra en la flora normal intestinal; en ocasiones puede ser agente de diarreas (E. Coli enteropatógenos, toxigénicos, enteroinvasivo, enterohemorrágico, etc.) y en otras, agente de infecciones en el tracto urinario y genital. Así mismo los géneros Klebsiella y Citrobacter se encuentran como flora normal y son patógenos condicionales. IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA El reconocimiento de las diversas especies de enterobacterias se realiza observando las reacciones metabólicas, por los cambios de color del medio sobre los substratos contenidos en dichos medios diferenciales. SALMONELLA, SHIGELLA, YERSINIA El género Salmonella constituye un amplio grupo de bacterias patógenas como por ejemplo: Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A y B, que producen la fiebre tifoidea y fiebres paratíficas: Salmonella enteritidis que se encuentra en los animales, al infectar al hombre produce gastroenterocolitis. El género Shigella produce disentería bacilar que se caracteriza por diarrea con moco y sangre. Esta bacteria sólo afecta al hombre. En el género Yersinia, una especie importante es Yersinia enterocolítica que es causante de adenitis aguda e ileítis terminal (simulando apendicitis), y diarrea en niños. Por una enterotoxina termoestable se cree que es la causa de la diarrea; el reservorio de este género son los roedores y el ganado porcino. Estos tres géneros tienen la misma característica morfológica (bacilos Gram negativos) la Shigella carece de flagelos por lo cual es inmóvil en cambio la Salmonella presenta flagelos lo mismo que la Yersinia. Los tres géneros son anaerobios facultativos, desarrollan en medios como en el agar Mac Conkey, y SSagar a una temperatura de 37° exc epto la Yersinia que C, desarrolla mejor a 28° C. 25 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  28. 28. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA Yersinia pestis es la causa de la peste bubónica que es primariamente una enfermedad de los roedores. El hombre se infecta al ser picado por la pulga de los roedores infectados, desarrollándose una infección primaria ganglionar y hay una forma neumónica más grave porque el contagio es directo de persona a persona. Esta bacteria es de forma coco bacilar, desarrolla a 30° en la fase lisa produce C, una cápsula y forma colonias viscosas. PROCEDIMIENTO - Hacer un frotis en las láminas portaobjetos limpios y desengrasados a partir de la muestra problema, realizar la coloración de Gram. - Observar con el microscopio utilizando objetivos de inmersión, destacando la forma de agrupación y la coloración que toma la bacteria. - Realizar la siembra en estría de la muestra problema en los siguientes medios de cultivo: Agar Mac Conkey, SSAgar, EMB, XLD. Llevar a la Incubadora a 37ºC durante 24 – 48 horas. - Realizar la siembra en tubos de diferenciación bioquímica: Agar citrato, TSI, LIA, Indol, Movilidad, Medio MR – VP. Llevar a la Incubadora a 37ºC durante 24 – 48 horas. DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA 26 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  29. 29. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA INTERPRETACIÓN COLORACIÓN GRAM Gram negativos bacilos Estructura pared celular Gram negativo Flagelos en peritrico propio del Proteus Flagelos en peritrico propio de la Salmonella. Proteus mirabilis swarming TSI 1 2 3 4 5 6 1 Sin inocular 2 Pseudomona aeruginosa 3 Shiguella sonnei 4 Salmonella typhi 5 Escherichia coli 6 Proteus mirabilis 27 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  30. 30. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA MANERA DE REALIZAR LA LECTURA EN LAS PLACAS Y TUBOS 28 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  31. 31. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA AGAR XLD Escherichia coli Enterobacter cloacae Klebsiella pneumoniae Salmonella enteritidis Shiguella sp. Proteus vulgaris. AGAR MAC CONKEY Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Enterobacter cloacae Salmonella typhi Shiguella sonnei Proteus vulgaris 29 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  32. 32. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA AGAR EMB Escherichia coli Enterobacter cloacae Klebsiella pneumoniae Salmonella typhi Shiguella sonnei Proteus vulgaris SALMONELLA SHIGUELLA AGAR Yersinia enterocolítica Salmonella Escherichia coli Proteus vulgaris TSA 30 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  33. 33. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA TSI CITRATO SIM VP UREA Proteus mirabilis Proteus vulgaris Salmonella paratyphi - A Salmonella typhimurium 31 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  34. 34. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA Shiguella sonnei Klebsiella pneumoniae AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE VIBRIONES INTRODUCCIÓN Los vibriones tienen las siguientes características: bacilos curvos o rectos. Gram negativos, son móviles por la presencia de flagelos polares y pueden crecer en los medios para las enterobacterias, son oxidasa positivos y anaeróbios facultativos. En este género la especie Vibrio cholerae es causante del cólera epidémico en el hombre. La enfermedad más devastadora de todos los tiempos por el cuadro de diarreas potencialmente muy severa que produce. En la séptima pandemia se considera al Vibrio cholerae, biotipo El tor, principalmente el serotipo Ogawa. En la octava pandemia se considera al Vibrio cholerae 0139, como el agente causal. Otras especies de Vibrio pueden causar también diarrea y son: Vibrio parahaemolyticus, Vibrio fluviales. Las especies asociadas a infecciones extraintestinales como Vibrio alginolyticus. En la práctica estudiaremos al Vibrio cholerae, agente del cólera, que se adquiere por la ingesta de alimentos y aguas contaminadas. La mortalidad es elevada si no se restablece de inmediato el equilibrio hidroelectrolítico. Para su aislamiento se utiliza muestras de heces o hisopados rectales. Las muestras que llegan al laboratorio deben sembrarse de inmediato. Los hisopados rectales pueden incluirse en el medio de transporte de Cary Blair. El cultivo directo en el Agar TCBS (tiosulfato, citrato sales biliares y sacarosa) y como enriquecimiento en el medio agua peptonada alcalina. Después de la incubación por 24 horas las colonias de Vibrio cholerae son circulares de borde entero, de color amarillo (sacarosa positivas) en el agar TCBS. La identificación bioquímica de Vibrio cholerae se realiza por las siguientes características: en el medio TSI pico de flauta ácido en el fondo sin gas, sin H2S, lisina positivo, indol positivo, rojo de metilo positivo, voges proskauer negativo. Citrato positivo y ureasa negativa. Desarrolla en caldo peptonado con 0% de NaCL. 32 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  35. 35. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA INTERPRETACIÓN Vibrio cholerae Gram Negativo Detección de especies de Vibrios potencialmente patógenas al camarón Vibrio cholerae Vibrio Vibrio Agar TCBS alginolyticus parahaemolyticus Vibrios en TCBS Agar 33 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  36. 36. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS NO FERMENTADORES PSEUDOMONAS Este género comprende bacilos rectos Gram negativos con flagelo polar, no formadores de esporas, carente de cápsula y aerobios. De las numerosas especies de este género, las más importantes han sido relacionadas a infecciones en el hombre, como patógenos oportunistas en huéspedes comprometidos; son Pseudomona aeruginosa, Pseudomona mallei, Pseudomona pseudomallei, Pseudomona cetácea y Pseudomona maltophilia. De éstas, la primera es la especie más frecuente, se asocia con enfermedades neoplásicas o en quemaduras severas. También pueden ser causa de infecciones oculares, osteomielitis, sepsis post quemaduras, infecciones en vías urinarias y respiratorias. La mayoría de cepas de Pseudomonas aeruginosa son identificadas en base a su olor característico, morfología colonial, producción de piocianina y fluoresceína, desarrolla fácilmente en medios como Agar Nutritivo, Agar Mac Conkey y muchas cepas desarrollan fácilmente en medios selectivos conteniendo cloruro de hexadeciltrimetilamonio (Agar Cetrimida). Examen macroscópico: Observar las características de la colonia de Pseudomona aeruginosa en Agar Mac Conkey y Agar Nutritivo, percibir el olor y el color. Examen microscópico: Coloración Gram, visualizar su tamaño, forma y reacción al gram. Características Bioquímicas: Observar el desarrollo del microorganismo en el medio TSI, Citrato de Simmons, LIA, Indol, Movilidad. Reacción de la oxidasa: Positivo: Viraje de color hacia el azul -violeta (con el reactivo N, N, N, N, tetrametil-p- fenilenediamina) o púrpura (con el reactivo N, N, dimetil-p fenilenediamina) después de 10 - 15 segundos. Negativo: No hay viraje de color (Foto Nº 23) Alternativamente una solución de reactivo al 0.5% puede ser goteado directamente sobre la colonia. Demostración del pigmento: Con una pipeta depositar cloroformo en el tubo con caldo nutritivo con desarrollo bacteriano, luego agitar y dejar reposar. Observar en el fondo del tubo el pigmento azul que es soluble en el cloroformo. 34 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  37. 37. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA INTERPRETACIÓN Gram Negativo Colonias en TSA MEDIO HUGH LEIFSON MEDIO PARA OXIDO FERMENTACIÓN E. coli es fermentador Pseudomonas es oxidador E. coli Pseudomonas Agar Cetrimida Pseudomonas aeruginosa en Agar Cetrimida Colonias verde-amarillentas, fluorescentes bajo luz UVA de 366 nm (linterna MICROKIT VMT050). Prueba De la Oxidasa 35 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  38. 38. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PRACTICA N° 09 HEMOCULTIVO Y COPROCULTIVO HEMOCULTIVO INTRODUCCIÓN La sangre de los individuos sanos es estéril. Una afluencia repentina de bacterias es habitualmente eliminada del torrente circulatorio en un periodo de tiempo corto, de minutos a horas, excepto cuando existe una infección masiva o está presente un foco intravascular infectado. Básicamente cuando las bacterias se multiplican a tasas que exceden la capacidad del sistema reticuloendotelial para eliminarlas se habla de BACTERIEMIA. El término FUNGEMIA se utiliza para designar la presencia de hongos en sangre. La invasión del torrente sanguíneo se produce desde: - Un foco primario, vía sistema linfático al sistema vascular. - Entrada directa: por infecciones intravasculares (por ejemplo endocarditis), o a través de dispositivos médicos contaminados como catéteres y agujas. Siempre que exista una razón para sospechar una bacteriemia se debe practicar el cultivo de la sangre, ya que en muchas ocasiones solo se puede establecer el diagnóstico por este procedimiento. El aislamiento de un microorganismo en los hemocultivos es trascendente porque establece el diagnóstico etiológico de la bacteriemia y permite elegir el tratamiento más eficaz. DIAGNÓSTICO Es el aislamiento del microorganismo en la sangre mediante el cultivo de esta y aporta una valiosa información a la hora de elegir el tratamiento antimicrobiano adecuado. INDICACIONES - Fiebre alta, aunque en neonatos y ancianos la bacteriemia puede cursar con hipotermia y deterioro general. - Shock no explicado. - Infecciones localizadas. - Leucopenia, leucocitosis o trombopenias no relacionadas con procesos hematológicos. MÉTODOS - Cuantitativos, nos daría el número de bacterias por mililitro de sangre. - Cualitativo, indica simplemente la presencia de bacterias en sangre, es el que se realiza de forma rutinaria. 36 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  39. 39. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA OBTENCION DE MUESTRA DE SANGRE PARA CULTIVO - El momento óptimo de obtención de la muestra para hemocultivo es justo antes del pico mas alto de fiebre, sin embargo esta situación ideal no es frecuente. Alternativamente las muestras pueden obtenerse de acuerdo con el caso. Por Ej. - BACTEREMIAS CONTINUAS: En cualquier momento, Ej. Endocarditis. - BACTEREMIAS INTERMITENTES: Una hora antes del pico febril, Ej. Brucelosis. - Guía para la cronología y el número de cultivos de sangre en adultos: - En sepsis: Se debe tomar dos a tres muestras de lugares diferentes en un lapso de diez minutos. - En endocarditis aguda: Obtener tres muestras de tres lugares diferentes en un lapso de 1 a 2 horas. - En endocarditis subaguda: Obtener tres muestras de tres lugares diferentes a intervalos de al menos quince minutos. Si el cultivo es negativo a las 24 horas, obtener tres muestras más. - En fiebre de origen desconocido: Obtener dos o tres muestras de lugares diferentes con diferencia de una hora o más entre una y otra muestra. Si el cultivo es negativo a las 24 horas, obtener dos a tres muestras más. - Obtención de muestra de sangre mediante uso de jeringa: ver Practica N° del 01 Manual de Microbiología. La proporción entre el volumen de sangre obtenida y el volumen del caldo de cultivo debe estar en una relación de 1:5 - 1:10. El volumen de sangre dependerá de la edad del paciente; por cada venopunción se recomienda: - Adultos: 10 - 30 ml - Niños: 1 - 5 ml - Lactantes: 1 - 2 ml - Neonatos: 0.5 - 1 ml INOCULACIÓN DE LA MUESTRA DE SANGRE AL MEDIO DE CULTIVO - Utilizar un medio bifásico o monofásico para este procedimiento. - Desinfectar el diafragma del frasco de hemocultivo con alcohol de 70% ó alcohol yodado. - Inocular la muestra de sangre al frasco con medio de cultivo a través de diafragma. Debe realizarse inmediatamente de obtenida la muestra para evitar que se coagule. - Mezclar el contenido del frasco inclinándolo suavemente dos o tres veces. En caso que se use el medio bifásico, bañar la fase sólida con la sangre. - Descartar la aguja y la jeringa en un contenedor resistente a las punturas. No volver a introducir la aguja en su funda. - Limpiar la tapa del frasco. Etiquetar el frasco apropiadamente indicando además el número de hemocultivo. 37 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  40. 40. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA SIEMBRA PRIMARIA DE MUESTRA DE HEMOCULTIVO OBJETIVO Describir la técnica de siembra primaria de hemocultivo para el aislamiento de bacterias causantes de infecciones del torrente sanguíneo. CAMPO DE APLICACIÓN Se aplica para el aislamiento bacteriano a partir de hemocultivos en el diagnóstico bacteriológico de infecciones del torrente sanguíneo. MATERIALES Y EQUIPOS a) Estufa de 35 – 37° C b) Mechero Bunsen o Cabina de Flujo laminar c) Jeringa estéril d) Guantes de látex e) Alcohol al 70% f) Contenedor de material contaminado g) Medios de cultivo − Medio bifásico Ruiz Castañeda o monofásico − Agar sangre de carnero (AS). − Agar Mc Conkey (Mc C) − Se puede incluir otros medios (Ej. manitol salado) PROCEDIMIENTO - Incubar el frasco de hemocultivo a 35 – 37° hast a por 7 días. C - Bañar la superficie de agar con el caldo inclinando el frasco suavemente. - Examinar visualmente y con luz transmitida los frascos de hemocultivo después de 12 y 24 horas de incubación. - La observación de turbidez o lisis de los glóbulos rojos es indicativa de crecimiento bacteriano; entonces se realizará una coloración Gram y un subcultivo. En los medios bifásicos el desarrollo también se puede evidenciar en la fase sólida mediante la formación de colonias. - Si no se observa lisis de los glóbulos rojos o turbidez en el caldo, o colonias en la fase sólida, continuar observando todos los días para ver si aparecen signos de crecimiento, hasta siete días después de haber iniciado el procedimiento. SUBCULTIVO - Los subcultivos deben realizarse en cabina o cerca de un mechero Bunsen. - Realizar subcultivos ciegos dentro de las 12 y 24 horas de incubación. - Para realizar los subcultivos desinfectar la superficie de la tapa del frasco con alcohol de 70%. 38 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  41. 41. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA - Con una jeringa estéril, extraer a través del tapón de jebe la muestra de sangre. - Inocular una gota de la muestra del hemocultivo en un extremo de la superficie de las placas de agar sangre, agar Mac conkey y colocar cuidadosamente una gota sobre una lámina portaobjetos para hacer un frotis y coloración Gram. - Utilizando el asa de siembra y tomando como referencia central el inoculo de la muestra, realizar la siembra por dispersión agotamiento en los cuatro cuadrantes de la placa, con el propósito de obtener colonias aisladas. - Incubar las placas de AS y agar McC a 35 - 37° p or 24 horas. C - Observar la lámina coloreada y buscar la presencia de bacterias. - Si no hay crecimiento a las 24 horas seguir incubando hasta por 48 horas. - Si no hubiera desarrollo bacteriano, repetir el procedimiento al 5° 7° y día. LECTURA DE SUBCULTIVOS - A las 24 horas observar el crecimiento de colonias. Si no se observa desarrollo, incubar 24 horas más. - Cuando se ha confirmado crecimiento bacteriano por subcultivo, se puede descartar el frasco de hemocultivo siguiendo los procedimientos de bioseguridad. - En algunos casos el frasco de hemocultivo debe ser retenido para mayor estudio. - En la interpretación de los resultados deben considerarse los datos clínicos individuales. Staphylococcus coagulasa negativo, corinebacterias y especies de Bacillus son contaminantes frecuentes y a menudo se aíslan en sólo una de tres muestras. Si no hay leucocitos y el paciente no tiene factores de riesgo para bacteriemia por estos gérmenes como inmunosupresión, prótesis, líneas de acceso vascular e historia de adicción a drogas intravenosas se puede concluir que la presencia de estos gérmenes se debe a contaminación. - Se informará el resultado de cada frasco de hemocultivo individualmente. Medio Bifásico Ruiz - Castañeda Incubar a 37° C 5 -7 / 21 días Toma de Muestra Sanguínea Coloración Gram Selección del Medio de cultivo dependiendo de la tinción de Gram 39 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  42. 42. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA MICROORGANISMOS ASOCIADOS AL ASPECTO MACROSCÓPICO DE HEMOCULTIVOS ASPECTO MACROSCÓPICO MICROORGANISMO ASOCIADO Streptococcus, Staphylococcus, Listeria spp. Hemólisis Clostridium, Bacillus spp. Bacilo gramnegativo aerobio, Turbidez Staphylococcus, Bacteroides spp. Formación de gas Bacilo gramnegativo aerobio, anaerobios Formación de velo Pseudomonas spp., Bacillus spp., levaduras Coágulo Staphylococcus aureus Colonias visibles (puntiformes) Staphylococcus, Streptococcus MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS, SEGÚN TINCIÓN DE GRAM Agar Agar Mac CNA Agar Agar Gram Brucella Sangre Chocolate Conkey (*) Anaerobio Cocos Gram x x x x Positivos Bacilos Gram x x x x Positivos Cocos Gram x x x x x Negativos Bacilos Gram x x x x Negativos (*) CNA: Agar Columbia-Colistin-Ácido Nalidixico. Frascos de Hemocultivos (Aerobios y Anaerobios) 40 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  43. 43. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA COPROCULTIVO DIAGNOSTICO ETIOLÓGICO DE DIARREAS BACTERIANAS. La diarrea puede definirse como el proceso que va acompañado del aumento en el número de evacuaciones o una disminución en la consistencia de las heces, siendo una de las enfermedades de mayor frecuencia en nuestro país, afectando principalmente a niños. Los géneros bacterianos que causan diarrea comúnmente son: Shigella, Salmonella, Escherichia, Campylobacter, Vibrio y otros. MUESTRAS La muestra de elección para cultivo de agentes bacterianos productores de gastroenteritis es una porción de heces diarreicas, nunca heces formes. En el caso de heces formadas, el tamaño será la que asemeje a la de una aceituna, en heces líquidas de 10 a 20 mL. La muestra se debe colocar en un frasco limpio, estéril, de boca ancha y con tapa rosca. Las muestras de heces se procesarán para el cultivo dentro de las 4 – 6 horas siguientes a su emisión. Si esto no es posible, es conveniente su conservación en un medio de transporte adecuado como el de Cary - Blair para evitar la alteración de bacterias patógenas. Para la siembra deben escogerse las porciones con aspecto purulento, sanguinolento o con moco. PROCEDIMIENTO EXAMEN DIRECTO El examen microscópico directo de las heces persigue la observación de polimorfonucleares, que sugiere infección por un patógeno invasivo. - Examen en fresco y/o tinción con azul de metileno - Tinción de gram permite observar a los polimorfonucleares y flora predominante INOCULACIÓN Examen rutinario: el coprocultivo se realiza mediante la preparación de una emulsión de 1 – 2 gramos de heces en solución salina fisiológica, a partir de la cual se inoculan los medios de cultivo. - Placas de Agar Sangre - Medios entéricos: Mac Conkey; EMB; Endo. - Moderadamente selectivos: usar al menos uno de estos medios para inhibir el crecimiento de la mayoría de las enterobacterias mientras se permite el crecimiento de Salmonella y Shigella: Hektoen, XLD, SS. - Medio líquido: utilizar el medio Selenito para inhibir el crecimiento de la flora normal durante las horas iniciales de incubación. Se resiembran en medio sólido a partir de las 6 horas. Este medio es fundamental para portadores asintomáticos. 41 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  44. 44. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA - Vibrio: medio de enriquecimiento: Agua de Peptona Alcalina a partir de 6 horas, subcultivar en TCBS. - Medio selectivo: TCBS. - Salmonella: Verde Brillante, Bismuto Sulfito. - Escherichia coli: los procedimientos de aislamiento en heces de E. coli, habitualmente quedan fuera de la practica rutinaria de la mayoría de los laboratorios. Constituye una excepción la E. coli O157 H7 por las posibles complicaciones (síndrome hemolítico urémico), por lo que para esta cepa, por su gravedad, podría estar indicada la utilización de medios especiales para su detección o la investigación de toxinas fundamentalmente en heces hemorrágicas. RESULTADOS Cultivos negativos de enteropatógenos: se informará ausencia de crecimiento de salmonella shigella, mencionando todos los microorganismos incluidos en el estudio realizado. Cultivos positivos: se informará del aislamiento del agente patógeno y de su sensibilidad si procede. 42 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  45. 45. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA COPROCULTIVO Muestra de Heces Microscopía Siembra en Caldo Selenito Agar Mac SSAgar Conkey XLD Medios de Identificación Bioquímica 43 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  46. 46. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PRACTICA N°10 UROCULTIVO Y ANTIBIOGRAMA INTRODUCCIÓN El urocultivo es el cultivo de orina para diagnosticar infección sintomática del tracto urinario o infección asintomática (bacteriuria asintomática) en pacientes con riesgo de infección. Está basada en la presencia de un número significativo de bacterias (generalmente ≥ 100.000 bacterias por mililitro) La piuria junto con la bacteriuria, es un dato muy importante para el diagnóstico de infección del tracto urinario, ya que prácticamente está presente en todas las infecciones urinarias. Una excepción es la bacteriuria asintomática en la que la piuria puede estar ausente. Agentes etiológicos a investigar rutinariamente - Escherichia coli - Klebsiella spp. - Enterobacter spp. - Serratia spp. - Enterococcus spp. - Proteus spp. - Pseudomonas spp. - Acinetobacter spp. - Cándida spp. - Staphylococcus spp. - Streptococcus grupo B (imprescindible en embarazadas) OBTENCION DE MUESTRA DE ORINA PARA CULTIVO OBJETIVO - Describir el procedimiento de obtención de muestras de orina para cultivo, obtenida del chorro medio. CAMPO DE APLICACIÓN - El presente procedimiento se aplica en la obtención de muestras de orina de pacientes para el diagnóstico de infecciones del tracto urinario. CONDICIONES GENERALES - La orina es un excelente medio de cultivo para la proliferación bacteriana, por esta razón, la muestra debe ser procesada dentro de las 2 horas después de haber sido obtenida o debe refrigerarse a 4° (máximo 24 C horas) hasta su procesamiento. 44 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  47. 47. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA - Generalmente el desarrollo de dos o más tipos de colonias (en pacientes sin sonda vesical) indican que la muestra se ha contaminado por recolección incorrecta o demora en la siembra. OBTENCIÓN DE MUESTRA DE ORINA DEL CHORRO MEDIO PACIENTES MUJERES MATERIALES Y EQUIPOS a) Guantes de látex estériles. b) Cinco o más piezas de gasa estéril de tamaño adecuado pudiendo ser de 4” x 4” c) Jabón. d) Agua tibia estéril. e) Frasco estéril de boca ancha para la muestra de orina. PROCEDIMIENTO a) Mantener la privacidad de la paciente. b) Rotular el frasco con el nombre de la paciente, fecha de obtención de la muestra, hora y el procedimiento a utilizar para la obtención de la muestra. c) Lavarse las manos con jabón y abundante agua. d) Preparar una pieza de gasa para la limpieza de los genitales externos humedeciéndola con agua y una pequeña cantidad de jabón. Preparar dos piezas más de gasa para el enjuague con agua tibia. e) Separar los labios mayores con dos dedos de una mano y limpiar el área expuesta pasando la gasa de adelante hacia atrás. f) Descartar la gasa. g) Con otra gasa humedecida enjuagar el área de adelante hacia atrás. Repetir el procedimiento con otra gasa. h) Finalmente secar el área de adelante hacia atrás con un trozo de gasa seca. i) Mantener separados los labios mayores mientras la paciente empieza a orinar. Luego del chorro inicial colocar el frasco estéril para colectar el chorro medio. j) Al terminar de orinar, inmediatamente tapar el frasco y limpiar la superficie del mismo. k) Transportar el frasco con la muestra de orina inmediatamente al laboratorio. PACIENTES VARONES MATERIALES a) Guantes de látex. b) Cinco o más piezas de Gasa estéril. c) Jabón. d) Agua tibia estéril. e) Frasco estéril de boca ancha para la obtención de la muestra. 45 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  48. 48. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PROCEDIMIENTO a) Mantener la privacidad de la paciente. b) Rotular el frasco con el nombre de la paciente, fecha de obtención de la muestra, hora y el procedimiento a utilizar para la obtención de la muestra. c) Lavarse las manos con jabón y abundante agua. d) Preparar una pieza de gasa con agua y una pequeña cantidad de jabón. Preparar dos piezas más de gasa para el enjuague con agua tibia. e) Realizar la higiene de los genitales. Retraer el prepucio antes de lavar el glande con la gasa humedecida con jabón. Descartar la gasa. f) Enjuagar el glande, usando una gasa húmeda. Repetir el procedimiento con otra gasa. g) Secar la zona, usando uno o más piezas de gasa seca. h) Indicar al paciente que mantenga el prepucio retirado e inicie la micción directamente en un recipiente (orina para descartar). i) Después del chorro inicial colocar el frasco estéril para colectar la muestra del chorro medio. j) Obtenida la muestra, inmediatamente tapar el frasco y limpiar la superficie del mismo. k) Transportar el frasco con la muestra de orina inmediatamente al laboratorio. SIEMBRA PRIMARIA DE MUESTRA DE ORINA OBJETIVO Describir el procedimiento para la siembra primaria de muestra de orina CAMPO DE APLICACIÓN Se aplica para el cultivo de muestra de orina en el diagnóstico bacteriológico de infecciones del tracto urinario. MATERIALES Y EQUIPOS a) Asa calibrada de platino o descartable de 0.001mL, 0.01 mL. b) Estufa de 35 – 37° C. c) Mechero Bunsen o Cabina de Flujo laminar. d) Guantes de látex. e) Contenedor de material contaminado. f) Pinza estéril. g) Propipeta o pipeteador automático. 46 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  49. 49. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA h) Medios de cultivo - Placas con agar sangre de carnero (AS). - Placas con agar Mc Conkey (McC) PROCEDIMIENTO a) Mantener las muestras en refrigeración (4° ha sta su procesamiento por C) cultivo. b) Los cultivos deben realizarse en una cabina de bioseguridad o cerca del mechero Bunsen. c) Las placas con AS y McC que se utilizarán en el urocultivo deben estar a temperatura ambiente. Rotular las placas. d) Si el asa calibrada no es descartable, esterilizar el asa de siembra flameándola en el mechero Bunsen hasta que se ponga rojo vivo. Dejar enfriar el asa contando hasta 20. e) Tomar el frasco con la muestra de orina, abrir la tapa y flamear la boca del frasco en el mechero Bunsen. f) Tomar la muestra de orina con el asa de siembra estéril introduciéndola y sacándola del frasco en forma vertical. Tapar el frasco con la muestra. g) Inocular en el centro de la placa con AS a partir del cual se extiende la muestra, hacia delante y hacia atrás. h) Luego, sin quemar el asa, el inoculo se disemina uniformemente con trazos perpendiculares a la siembra inicial en toda la placa. i) Proceder de la misma forma para el agar Mc Conkey. j) Esterilizar el asa de siembra en el mechero. k) Concluida la siembra, cerrar la placa y colocarla con la parte que tiene el medio de cultivo hacia arriba. Incubar la placa de AS y Mc Conkey a 35 - 37° C en condiciones aeróbicas por 24 horas. LECTURA a) Realizar la evaluación a las 24 horas, si no hay crecimiento bacteriano dejar incubar hasta las 48 horas. b) La evaluación consiste en el recuento de colonias y se multiplica por el factor de dilución para obtener las UFC por mL. INTERPRETACIÓN a) En pacientes sin sonda vesical, la cuenta significativa de bacterias en orina 5 es la presencia de mas de 10 UFC / mL de un solo germen. 3 4 b) Los recuentos intermedios (10 - 10 UFC / mL) indican infección si el procedimiento de recolección de orina fue realizado correctamente. c) Generalmente, el aislamiento de tres o más especies bacterianas indican que la muestra se ha contaminado por recolección inadecuada o demora en la siembra. 47 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  50. 50. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA 5 d) En pacientes con sonda vesical, cuentas bacterianas menores de 10 UFC / mL pueden tener significado, así también se pueden encontrar bacteriurias polimicrobianas hasta en casi 15% de enfermos. e) En pacientes sin catéter se puede comprobar si el procedimiento de obtención de muestra fue realizado correctamente observando la frecuencia 3 4 con la cual se informan recuentos de colonias intermedias entre 10 - 10 UFC / mL. En pacientes sin infecciones del tracto urinario, el recuento es nulo o se reduce a pocas colonias. f) En muestras obtenidas por punción suprapúbica, el desarrollo de una sola colonia en el medio de cultivo indica infección del tracto urinario. NOTA 1: Se usará asas de siembra 0.001 mL para todas las muestras de orina a excepción de aquellas procedentes de aspirados suprapúbicos, de infantes, de niños y de pacientes con tratamiento antimicrobiano, las cuales se inocularán con asas de 0.01 mL debido a que en dichos pacientes pueden haber infecciones del 5 tracto urinario asociados a recuentos menores de 10 UFC/ mL. NOTA 2: De no contar con asa calibrada, utilizar tips estériles y micropipeta de 1µL o 10µL. Sedimento Urinario Coloración Gram Agar Manitol Sal TSA Agar Mac Agar CLED Agar CLED Conkey Lactosa (+) Lactosa (-) 48 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  51. 51. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA Los parámetros utilizados para obtener el recuento de UFC después del período fueron los siguientes: Si existía crecimiento en todas las líneas de siembra, se consideraba un recuento 100,000 UFC/ml. Si crecía en la línea central y hasta la mitad de las líneas que interceptan a ésta, el recuento era de 75,000 UFC/ml. Si crecía sólo en la línea central era compatible con un recuento de 50,000 UFC/ml. Cuando se obtenía crecimiento de sólo la mitad de la línea central de siembra, se consideraba que correspondía a un recuento de 25,000 UFC/ml. 49 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  52. 52. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA ANTIBIOGRAMA, MÉTODOS DE DILUCIÓN Y DE DIFUSIÓN INTRODUCCIÓN En la práctica médica los quimoterápicos y antibióticos se emplean para el tratamiento de enfermedades infecciosas. Las bacterias se defienden desarrollando varios mecanismos que los llevan a resistir a los antimicrobianos. En la mayoría de los casos esta resistencia no es predecible. El laboratorio de microbiología ayuda al clínico haciéndole reconocer la sensibilidad y resistencia de una determinada bacteria por medio del Antibiograma. El antibiograma puede realizarse por métodos de dilución o de disco – difusión. MÉTODO DE DILUCIÓN MATERIALES - Solución de antibiótico que contenga 1000 unidades internacionales o microgramos. - Tubos de 13 X 100 estériles. - Pipetas de 5 mL. - Cepa bacteriana, que contenga aproximadamente 100, 000 a 1 000, 000 microorganismos por ML. - Caldo de cultivo. PROCEDIMIENTO - Colocar 10 tubos de 13 X 100 estériles y tapados com algodón, enumerados del 1 al 10. - Descongelar el antibiótico que contenga mil unidades por mililitro y diluir en proporción 1:5 en caldo estéril, obteniendo una concentración de 200 unidades por mililitro. - Por medio de una técnica aséptica, colocar con una pipeta de 5 mL, 0.5 mL de caldo de cultivo estéril en los tubos marcados de 2 al 10. - Agregar 0.5 mL del antibiótico con 200 unidades a los tubos 1 y 2. mezclar el contenido del 2do tubo y trasvasar 0.5 mL al tubo 3, continuando hasta el 9. retirar 0.5 mL del tubo 9; el 10 no recibe antibiótico y sirve como control. - Agregar a todos los tubos 0.5 mL de la cepa bacteriana. - Incubar a 37° el tiempo necesario para que el tub o control presente turbidez C por crecimiento bacteriano, por lo general 12 a 18 horas. LECTURA E INTERPRETACIÓN - La concentración de antibiótico va de 100 unidades a 0.3 unidades / mL en orden decreciente a la mitad. - El último tubo que no presente turbidez, es la mínima concentración inhibitoria del antibiótico y se expresa en microgramos o unidades por mL (M.I.C.) 50 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  53. 53. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA B DILUCIÓN DEL ANTIBIÓTICO A 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C T E R 100 50 25 12.5 6.5 3.12 1.56 0.78 0.39 C I A MÉTODO DE DIFUSIÓN INTRODUCCIÓN El método de disco difusión en agar es una manera práctica, fácil y rápida de realizar el antibiograma. El recomendado, es el método de Kirby – Bauer, con el que se ha logrado uniformizar criterios que toman en cuenta los conceptos de concentración mínima inhibitoria (M.I.C.) y de la concentración promedio en sangre de las drogas frecuentemente usadas. MATERIALES - Placas petri con agar Mueller – Hinton. - Torundas estériles. - Discos impregnados con diferentes antibióticos y quimioterápicos. - Pinzas estériles. - Tubos de prueba con 3 mL decaído tripticase soya sembrados con una cepa bacteriana, con una turbidez (desarrollo comparable con el tubo N° de la 0.5 escala de Mac Farland (150 000, 000 gérmenes/mL) PROCEDIMIENTO - Sumergir la torunda en caldo tripticase soya con la cepa bacteriana, escurrir en las paredes del tubo y extender uniformemente en la superficie de la placa de agar Mueller – Hinton. - Colocar con ayuda de pinzas los discos impregnados con diferentes antibióticos y quimioterápicos sobre la superficie del agar. - Los discos deben quedar a una distancia de 20 mm entre ellos. - Incubar a 37C durante 24 horas. ° LECTURA E INTERPRETACIÓN - El diámetro de la zona de inhibición se mide con un vernier o una regla milimetrada, colocada debajo de la placa petri. - El límite del área de inhibición esta dada por la inhibición completa del desarrollo tal como se puede apreciar a simple vista. - Los milímetros de la lectura serán llevados a la tabla para traducir su interpretación a los términos de susceptible, intermedio y resistente. 51 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  54. 54. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA Antibióticos y Resultados Quimioterápicos Susceptible Intermedio Resistente EPSILON-TEST Es una técnica que combina los métodos de difusión en agar y dilución para determinar la CIM. La sistemática es similar al método de difusión en agar pero en lugar de discos utiliza tiras de E-test. Estas tiras contienen un gradiente del antimicrobiano en la superficie inferior que difunde en el agar estableciendo un gradiente continuo del mismo a lo largo de la tira. Después de la incubación se forma una zona elíptica de inhibición del crecimiento y la CMI corresponde con el punto donde el área de inhibición del crecimiento intersecciona con la tira. CIM (concentración inhibitoria mínima): menor concentración de antimicrobiano capaz de inhibir el desarrollo de una cepa bacteriana dada. CBM (concentración bactericida mínima): menor concentración de antimicrobiano capaz de destruir una cepa bacteriana dada. Método de Kirby – Bauer 52 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  55. 55. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA UNIDAD II: MICROBIOLOGÍA APLICADA 2.2 MICROBIOLOGÍA ALIMENTARIA 53 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  56. 56. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PRACTICA N° 11 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE PRODUCTOS LÁCTEOS INTRODUCCIÓN El número total de microorganismos presentes en la leche o sus derivados por unidad de volumen o de peso es indicativo de las condiciones sanitarias de producción y conservación, así como de la vida comercial del producto. Recuentos bacterianos muy altos en leche cruda son indicativos de fuerte contaminación durante las operaciones de ordeño, manipulación o almacenamiento, o bien de conservación a temperatura de refrigeración insuficientes para retardar al crecimiento microbiano. En productos lácteos pasteurizados, altas cuentas bacterianas indican deficiente procesamientos y/o mala conservación. Los valores obtenidos en los recuentos bacterianos de estos productos se toman como base para su clasificación en diferentes grados de calidad. De allí la gran importancia que esta determinación reviste, tanto desde el punto de vista del control de calidad a nivel de las industrias del ramo, como del control sanitario de las agencias gubernamentales. Los métodos comúnmente utilizados para el recuento total de microorganismo en la leche y sus productos son el macroscópico en placas de agar y el microscópico directo. Ambos métodos al igual que otras técnicas microbiológicas aplicadas a estos productos, generalmente se rigen por las normas establecidas por la Asociación Americana de Salud Publica (“Standard Methods for the Examination of Dairy Products”) que a su vez han sido recomendadas y traducidas por la Organización Panamericana de la Salud (“Normas para el Examen de Productos Lácteos”). TOMA DE MUESTRA PARA EL ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO Cuando las muestras de leche o derivados lácteos se destinan a análisis de tipo microbiológicos, es necesario tomar una serie de precauciones que además de garantizar la obtención de muestras verdaderamente representativas, eviten la contaminación por fuentes externas y la proliferación de la carga bacteriana ya presente en los productos. Entre esas precauciones destacan las siguientes: a) Todos los equipos empleados en la toma de muestras deben encontrarse estériles y desinfectados antes de cada recolección. Por ejemplo, para tomar varias muestras de leche cruda puede emplearse un probador adecuado que se va esterilizando en un baño de agua hirviente (1 minuto) o una solución que contenga 250 a 500 ppm de cloro residual (“esterilización química”) cuyo exceso se elimina por enjuague en agua estéril a fin de evitar que el desinfectante contamine el producto, donde actuaría como inhibidor microbiano. b) Tomar precauciones para evitar la contaminación externa, incluso de las manos de la persona que hace la operación. 54 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  57. 57. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA c) Recolectar porciones representativas (no menos de 150 g) directamente de tanques, recipientes de transporte o pesada, pero no de envases al por menor, los cuales deben tomarse completos en numero proporcional al lote. - Cuando el producto se encuentra en lata de tamaño comercial, se deben recolectar los envases completos cerrados. Una vez en el laboratorio, se eliminan las etiquetas de papel, se lava el exterior de la lata con agua tibia y jabón o detergente, y se desinfecta uno de sus extremos con solución de fenol al 5% o por inmersión durante 2 minutos en una solución de cloro conteniendo 100-200 ppm. Seguidamente la lata se agita, seca y se abre con un punzón previamente esterilizado en igual forma que la lata, dejando un orificio lo suficientemente grande como para introducir una pipeta estéril, con la cual se extrae la cantidad requerida para el análisis, o bien se transfiere el contenido a un frasco estéril. En esta práctica se aprenderá a: - Realizar la preparación y dilución de las muestras. - Realizar el recuento de microorganismos de aeróbios mesófilos viables. - Identificar patógenos. MUESTRAS: Leche cruda y pasteurizada, queso de diferentes marcas 1. PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS DE ALIMENTOS: Método recomendado por el Internacional Standard organizatión (ISO). a) EQUIPOS Y MATERIALES 1. Licuadora que alcance velocidades entre 8,000 a 45, 000 rpm. 2. Vasos de licuadora con tapa, resistentes a T° de esterilización. Vaso estéril por cada muestra de alimento a ser analizado. 3. Balanza de capacidad no inferior a 2,500 g. y una sensibilidad de 0.1 g. 4. Tenedores, cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas previamente esterilizadas en autoclave o por aire caliente. 5. Pipetas bacteriológicas de 1 mL graduadas al 0.1 6. Matraces o frascos que contienen 90 mL de diluyente. 7. Tubos (150 X 15 mm) que contienen 9 mL de diluyente. b) PROCEDIMIENTO 1. Tarar el vaso vacío y pesar en el 10 +/- 0.1 g. representativos de la muestra del alimento. 2. Añadir un volumen diligente igual a 9 veces la muestra (90 mL). Así se obtiene la dilución 10-1 (el diluyente puede ser agua tamponada con fosfato). 3. Hacer funcionar la licuadora un tiempo suficiente según su velocidad para conseguir 15, 000 – 20, 000 revoluciones, teniendo cuidado que la duración de la operación no exceda de 2.5 minutos aún a bajas velocidades. 55 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  58. 58. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA 4. Agitar el homogenizado (dilución 10-1) y pipetear una porción de 1 mL en un tubo con 9 mL de diluyente, obteniéndose la dilución 10-2 5. Mezclar el líquido cuidadosamente, aspirando 10 veces con pipeta estéril. 6. Transferir con la misma pipeta 1mL a otro tubo conteniendo 9 mL de diluyente y mezclar con nueva pipeta estéril y se obtendrá la dilución 10-3 7. Repetir los pasos anteriores hasta conseguir el N°de diluciones deseadas. REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA DE LA TÉCNICA Muestra 90 mL Diluyente B = Contiene 9 mL del Diluyente 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 10 g. Dilución 10-1 -2 -3 -4 -5 10 10 10 10 Agregar 1mL de cada dilución a una placa estéril Agregar 18 mL de Agar TSA licuado a cada placa Llevar cada placa a la incubadora a 37° por 24-48 C Hrs. 56 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  59. 59. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA 2. NUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS VIABLES: MÉTODO: recuento estándar en placa o Pour Plate o recuento en placa por siembra en profundidad. - Este método se recomienda para productos lácteos (Standard Methods for the Examination of Dairy Products 1972) y para alimentos congelados, enfriados, precocidos o preparados (ADAC, 1975) excepto que el úitimo especifica la temperatura de incubación de 35° C. a) EQUIPOS Y MATERIALES - Requisitos necesarios para la preparación y dilución de las muestras de alimentos. - Placas petri (100 X 15 mm) - Pipetas bacteriológicas de 1.5 y 10 mL. - Baño maría regulada a 44 – 46C para mantener el agar licuado. ° - Incubadora regulada a 29 – 31°C. - Contador de colonias. - Agar plate count. b) PROCEDIMIENTO 1) Preparar y diluir la muestra de alimento por la técnica adecuada. 2) Pipetear por duplicado a las placas petri estériles alícuota de 1 mL a partir de la dilución 10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 y una alícuota de 0.1 mL de la dilución 10 -5 para obtener de 10 -1 a 10 -6 g. o mL. De muestra por placa petri. Se sugiere esta serie de diluciones sino se conoce el rango aproximado de N° bacterias. de 3) Agregar rápidamente a las placas petri 15 mL de agar licuado y temperado. Entre la preparación y la adición del agar no debe transcurrir más de 10 minutos. 4) Mezclar inmediatamente las alícuotas con el agar mediante movimientos de vaivén y rotación de las placas petri, se pueden seguir los siguientes pasos: • mover la placa de arriba abajo 5 veces en una dirección. • Rotar 5 veces la placa en el sentido de las agujas del reloj. 5) Como control de esterilidad, adicionar a placas petri, agar sin inocular y agar inoculado con el diluyente. 6) Una vez solidificado el agar, invertir las placas e incubarlas a 29°– 31° c C durante 48 +/- 3 horas. 7) Cómputo del recuento Estándar, en placa: - Seleccionar 2 placas correspondientes a una dilución que contenga entre 30 y 300 colonias utilizando un contador de colonias. 57 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  60. 60. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA - Tomar la media aritmética de los recuentos y multiplicar por el factor de dilución (reciproco de la dilución utilizada). Reportar el resultado como N° microorganismos aeróbios mesófilos por gramo o mililitro según de sea el caso - Sí las placas de 2 diluciones consecutivas están dentro del rango de 30 – 300, computar el recuento para cada una de las diluciones y establecer la relación de los 2 recuentos. Si el cociente es menor que 2, reportar el promedio de los 2 valores. Si el recuento mayor contiene 2 veces o más al menor, en este caso se reportará el recuento menor. 8) Computo del estimado del Recuento Standard en placa. - Si las placas de todas las diluciones muestran más de 300 colonias, dividir cada duplicado de placas de la dilución, más alta en secciones radiales convenientes (2, 4, 8) y contar las colonias en una o más secciones. Multiplicar el total en cada caso por el factor apropiado para obtener el N° colonias por toda la placa. Promed iar los estimados de de las 2 placas duplicadas y multiplicar por la dilución correspondiente. Reportar el resultado como un estimado del número. - Si hubiese mas de 200 colonias por 1/8 de sección de la placa, multiplicar 1,600 (200 X 8) por la dilución y expresar el estimado como mayor que (>) el N°resultante. Ejem. 1600 X 10 -3 = 1600, 000/g ó mL - Si no hubiese colonias en placas de la mayor concentración, reportar el estimado como menor que (<) una vez la dilución. Ejemplo: 10-1 = 0 colonias. Se reporta como < 10/g ó mL. Si se hubiese sembrado 0.1 mL, en este mismo caso se reporta < 100/g ó mL. 9) Expresión de resultados - Se deberá reportar únicamente 2 dígitos significativos, ellos son el primero y el segundo (comenzando por la izquierda) del promedio de los recuentos. Los demás dígitos se reemplazarán por ceros. Ejemplo: 523, 000 se reportará como 520, 000 = 52 X 104 g ó mL de alimento según sea el caso. - Si el tercer dígito de la izquierda es 5 ó mayor que 5, adicionar una unidad al segundo dígito (redondear). Ejemplo: 83, 600 se reportará como 84, 000 = 84 X 103/ g ó mL de alimento. - Si el recuento en placa se utiliza para determinar la aceptación o rechazo de un lote de alimento, únicamente se considerará el recuento estándar en placa, nunca el estimado del recuento, éste es útil solamente como una aproximación primaria en la determinación de la calidad microbiológica. 58 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA

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