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Todas las practicas de Laboratorio

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  • 1. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA MANUAL DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA Dr. Q.F. HÉCTOR ALEXANDER VILCHEZ CÁCEDA Mg EN GERENCIA DE SERVICIOS DE SALUD LIMA – PERÚ 2010
  • 2. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PROLOGO La Universidad Inca Garcilaso de la Vega, está empeñada en realizar importantes innovaciones en la concepción y práctica educativa con el propósito de brindar a sus alumnos una formación profesional más competitiva, que haga posible su ingreso con éxito al mundo laboral, desempeñándose con eficacia y eficiencia en las funciones que les tocará asumir. El marco referencial está dado por los cambios significativos de la sociedad contemporánea, expresados en la globalización y los nuevos paradigmas del conocimiento, de la educación y la pedagogía así como los retos del mundo laboral. Uno de los medios para el logro de nuestros propósitos lo constituye el MANUAL DE PRACTICAS DE MICROBIOLOGÍA el cual ha sido concebido como un material educativo que va ha servir para afianzar conocimientos, desarrollar habilidades y destrezas, así como orientar la autoeducación permanente. por ello se ubica como un material de lectura independiente, sirve de información y recreación, desempeña un papel motivador, se orienta a facilitar la lectura comprensiva, a ampliar conocimientos en otras fuentes, crear hábitos y actitudes, así como a desarrollar destrezas para el procesamiento de información, adquisición y generación de conocimientos. El presente Manual, constituye material de apoyo al desarrollo de la asignatura y está organizado en dos unidades: Unidad I: Microbiología Generalidades, Unidad II: Microbiología Aplicada comprende: Microbiología Clínica, Microbiología Alimentaria, Microbiología en la Industria Farmacéutica y Cosmética y de un Trabajo de Campo. Los alumnos deben leer detenidamente cada práctica, antes de su realización, para una mejor comprensión en la observación del fenómeno biológico de cada microorganismo en estudio. Además debe realizar diagramas de flujo de lo observado el cual será revisado por el profesor responsable de cada grupo de práctica. El autor agradece anticipadamente la(s) crítica(s) o sugerencia(s) que puedan tener los lectores que sirvan para mejorar el presente trabajo. Dr. Q.F. HÉCTOR ALEXANDER VILCHEZ CÁCEDA DOCENTE DE MICROBIOLOGÍA 1 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 3. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA INDICE PRÓLOGO 01 INDICE 02 INTRODUCCIÓN 04 INSTRUCCIONES GENERALES 06 MATERIALES QUE DEBEN TRAER LOS ALUMNOS A LAS PRÁCTICAS 08 SISTEMA DE EVALUACIÓN 09 PROTOCOLO DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO 10 UNIDAD I: MICROBIOLOGÍA GENERALIDADES 12 PRACTICA N°01 Bioseguridad, Toma de Muestra y Acondicionamiento de Materiales. 13 PRACTICA N°02 Métodos de Esterilización y Desinfección (Antisépticos y Desinfectantes). 20 PRACTICA N°03 Medios de cultivo: Preparación de Medios de Cultivo. 32 PRACTICA N°04 Coloración Gram y Coloración de Bacterias Ácido Alcohol Resistentes. 39 PRACTICA N°05 Análisis Cualitativo y Cuantitativo Bacteriano. 59 PRACTICA N°06 Metabolismo Bacteriano. 70 2 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 4. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA 79 ANEXO I: Flora Microbiana del Cuerpo Humano Normal 80 ANEXO II: Fundamentos e Interpretación de Agares y Caldos 83 3 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 5. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA 3 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 6. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA INTRODUCCIÓN La Microbiología es la ciencia encargada del estudio de los organismos microscópicos, deriva de 3 palabras griegas: mikros (pequeño), bios (vida) y logos (ciencia) que conjuntamente significan el estudio de la vida microscópica. Son considerados Microbios todos los seres vivos microscópicos consistentes en una sola célula, es decir unicelulares, así como aquellos que forman agregados celulares en los cuales todas las células son equivalentes. Los microorganismos pueden ser Eucariotas (Las células poseen núcleo), tales como los hongos y los protistas, o Procariotas (células carentes de núcleo), como las Bacterias y los Virus (Aunque los virus no son considerados seres vivos estrictamente hablando). El Químico Farmacéutico y Bioquímico, es el profesional universitario de las Ciencias Médicas con formación científica, tecnológica y humanística, con capacidad gerencial, ejecutiva y de liderazgo. Así mismo altamente capacitado para poder ejercer profesionalmente en los campos de la Industria Farmacéutica e Industria Cosmética siendo Jefe de Control de Calidad, del Laboratorio de Análisis Clínicos y Bioquímicos ejerciendo la Microbiología Clínica y del Laboratorio de Bromatología realizando los Controles Microbiológicos a los Alimentos. Hoy en día el Profesional Químico Farmacéutico y Bioquímico es el profesional responsable de la producción de los medicamentos y de los cosméticos de calidad, seguros y eficaces y para lograr este objetivo el control microbiológico se considera de gran importancia, ya que en estos productos se pueden presentar las condiciones necesarias para la multiplicación de microorganismos capaces de deteriorar al producto o, lo que es peor, afectar la salud del consumidor. El cuidado de los alimentos y la industrialización de los mismos se ha convertido en una ciencia y cada vez más se estudia e investiga la forma de mejorar la calidad. Día a día surgen nuevas técnicas, nuevos tipos de envases, nuevos aditivos, nuevos conservadores, etc. Esto ha llevado al establecimiento de normas, al desarrollo de métodos y sistemas de control, que aseguren la inocuidad de los mismos. Para lograr este objetivo el Químico Farmacéutico y Bioquímico, realiza los Controles Microbiológicos donde cuantifica e identifica los microorganismos presentes en los alimentos. 4 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 7. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA Las infecciones intrahospitalarias cada vez más constituyen un serio problema de salud pública, ya sea por su efecto sobre la salud de los pacientes, como por los costos que este problema implica. Esto hace, que en el país se estén aunando esfuerzos para implementar sistemas de vigilancia, prevención y control, orientados a enfrentar este problema. Por lo que el Medico debe basar su diagnóstico en evidencias disponibles, como son los aspectos epidemiológicos, y la importante contribución del Laboratorio de Microbiología, que además de permitir el diagnóstico etiológico, orienta el manejo clínico terapéutico del paciente. El estudiante de Microbiología de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímica de la Universidad Inca Garcilaso de la Vega, en el futuro será el profesional Químico Farmacéutico y Bioquímico, quien con los conocimientos presentes en este manual estará en la capacidad de poder afrontar y resolver con criterio los problemas presentados ya sea en la Jefatura de Control de Calidad de una Industria Farmacéutica ó Cosmética, como en un Laboratorio Clínico Microbiológico ó un Laboratorio Bromatológico. 5 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 8. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA INSTRUCCIONES GENERALES NORMAS DE BIOSEGURIDAD PRINCIPIOS GENERALES 1. La señal internacional de riesgo biológico debe colocarse en las puertas de los locales en que se manipulan microorganismos del Grupo de Riesgo 2,3,4. 2. En la zona de trabajo del laboratorio o aula de prácticas no se permitirá al personal: comer, beber, fumar, guardar alimentos, ni aplicar cosméticos. 3. No pipetear con la boca. 4. Mantener el laboratorio limpio y aseado, retirando del mismo cualquier material que no tenga ninguna relación con el trabajo. 5. Las superficies de trabajo se descontaminarán al terminar la práctica y en caso derramamiento de sustancias potencialmente peligrosas. 6. El personal de laboratorio y/o alumnos se lavarán las manos después de haber manipulado material infeccioso, así como al abandonar el laboratorio. 7. Todos los procedimientos de siembra se practicarán de manera que no se produzca la formación de aerosoles. 8. En el laboratorio se utilizarán obligatoriamente: mandiles, batas, uniformes u otras prendas apropiadas, esta no se llevará fuera del laboratorio. 9. Utilizar guantes en todos los trabajos con riesgo de contaminación como sangre, material infeccioso o productos infectados. 10. Todos los derramamientos, accidentes y exposiciones reales o potenciales a material infeccioso se notificarán inmediatamente al profesor. 6 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 9. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA RECOMENDACIONES PARA EL MANEJO DEL MICROSCÓPIO En microbiología el manejo del microscopio es de gran ayuda para el reconocimiento de los microorganismos, por lo que es necesario conocer su correcto manejo. Las preparaciones coloreadas necesitan el uso de objetivos de inmersión, en las cuales se utiliza aceite de cedro en la interfase objetivo – portaobjetos, el condensador próximo a la platina y el diafragma abierto para permitir una buena iluminación. Antes y después de su uso limpie los objetivos con papel para lentes. DE CÓMO MANIPULAR LOS CULTIVOS Y EL MATERIAL CONTAMINADO - Siempre trabajar cerca de la llama de un mechero de gas o alcohol. - Nunca dejar tubos ni placas destapadas. - Colocar las placas Petri en posición invertida para evitar que caiga el agua de condensación la cual puede estar contaminada. - Mantener los tubos con caldo en posición vertical para evitar que se mojen los tapones. - Abrir los tubos en forma adecuada, flamear la boca del tubo antes y después de efectuarse el trabajo. No dejar el tapón del tubo sobre la mesa. Las placas deben ser cubiertas cuidadosamente para evitar que se contaminen. - Esterilizar las asas de alambre antes e inmediatamente después de usarlas. Si se ha empleado para trabajar un material que crepita como el caso del esputo, previamente al flameado introducir el asa en un frasquito de vidrio que contenga arena y alcohol. Nunca dejar asas sobre la mesa de trabajo sino en frascos especiales y en posición vertical con el alambre hacia arriba. - Aprender a usar las pipetas adecuadamente: para el trabajo bacteriológico éstas vienen estériles y envueltas en papel. Manipularlas exclusivamente por su extremo posterior, desenvolviéndolas en el momento de usarlas. No quitar el algodón que llevan, por ser un elemento de protección para el que la usa. Emplear micropipetas para realizar la succión. No pipetear con la boca - Eliminar pipetas, láminas y todo el material contaminado en un recipiente con solución desinfectante. - En caso de accidentes como, ruptura de una placa o un tubo con materiales infectante, contaminación del mandil o de la mesa, etc. Durante el trabajo, avisar inmediatamente al profesor. 7 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 10. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA DE CÓMO TERMINAR EL TRABAJO DE PRACTICA 1. Todos los cultivos que se incuben deben tener las siguientes anotaciones: nombres ó iniciales de los estudiantes, nombre del microorganismo, grupo de práctica y fecha de siembra. 2. En caso de las placas, todas deben incubarse invertidas a menos que sean dadas instrucciones contrarias por el profesor. 3. Los tubos deben estar bien tapados y colocados en gradillas de metal. 4. Los alumnos se responsabilizarán de colocar estos cultivos en estufas a 37° por 24 horas C TERMINADA LA PRACTICA, AL FINALIZAR EL TRABAJO 1. Limpiar la mesa de trabajo con algodón embebido en desinfectante. 2. Comprobar que las llaves de gas estén cerradas. 3. Lavarse prolijamente las manos con jabón germicida. 4. Se llevará un cuaderno de laboratorio donde se apuntará todos los diagramas de flujo. MATERIALES QUE DEBEN TRAER LOS ALUMNOS PARA LAS PRACTICAS - Dos pliegos de papel kraft (Por alumno). - Un asa de siembra (Por alumno). - Aguja de siembra (03 Unidades) (Por alumno). - Papel Toalla y Encendedor a Gas (Por grupo de práctica). - Jabón Germicida (Por Grupo de Practica). - Desinfectante para limpiar las mesas trabajo (Por Grupo de Práctica). - Plumón Marcador (Por alumno). - Guantes para cada laboratorio (Por alumno). - Mascarilla para cada laboratorio (Por alumno). - Gorro para cada laboratorio (Por alumno). - Mandil blanco (Por alumno). - Baja - lengua (04 Unidades) (Por alumno). - Torundas (04 Unidades) (Por alumno). - Algodón industrial (No hidrófilo 500 gramos (Por grupo de práctica). - Un rollo de pavilo (Por grupo de práctica). 8 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 11. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA SISTEMA DE EVALUACIÓN Habrá tres evaluaciones como se describe a continuación: 1. La Primera Evaluación es Escrita después de la sexta práctica de Laboratorio. 2. La Segunda Evaluación es Práctica, al finalizar las prácticas programadas. Comprenderá de un trabajo de campo y la elaboración de un Protocolo de Análisis Microbiológico; y 3. La Tercera Evaluación es la exposición de sus respectivos resultados. Los temas del trabajo de campo y el orden de las exposiciones son las siguientes: a. Microbiología Clínica: Coprocultivo y Antibiograma. b. Microbiología Clínica: Urocultivo y Antibiograma. c. Microbiología Alimentaria: Análisis Microbiológico de productos lácteos Ejemplo: Leche, queso, etc. d. Microbiología Alimentaria: Análisis Microbiológico de Salsas Ejemplo: Mayonesa, tomate, Mostaza, etc. e. Microbiología en la Industria Farmacéutica y/o Cosmética: Monitoreo de Ambiente, Superficies y Personal. Ejemplo: Laboratorio N°06 de la Facultad, etc. f. Microbiología en la Industria Farmacéutica y/o Cosmética: Análisis Microbiológico de Envases. Ejemplo: Cápsulas, Tapas, Potes, Frascos, etc. PONDERACIÓN DE LAS EVALUACIONES 1. Primera Evaluación 1A 2. Segunda Evaluación: Protocolo de Análisis Microbiológico 1B 3. Tercera Evaluación: Exposición de los Resultados 1C PROMEDIO FINAL = 1A + 1B + 1C 3 TIPO DE CALIFICACIÓN: La calificación es vigesimal, de cero a veinte. 9 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 12. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PROTOCOLO DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO PROTOCOLO DE ANÁLISIS DE ENVASES O EMPAQUE PROTOCOLO N° CÓDIGO DE ENVASE: ---------------------------------------------------- FORMA: ---------------------------------------------------- LOTE: ---------------------------------------------------- FECHA DE ANÁLISIS: ---------------------------------------------------- ENSAYO ESPECIFICACIONES RESULTADOS TÉCNICA ANALÍTICA ENSAYO TÉCNICA ESPECIFICACIONES RESULTADOS MICROBIOLÓGICO ANALÍTICA OBSERVACIONES: ------------------------------------------------------------------------------------- FECHA: ----------------------------------------------------------------------------------------------------- ANALISTA JEFE DE CONTROL DE CALIDAD 10 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 13. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA CONTROL MICROBIOLOGICO DE AMBIENTES AREA: ________________ N°ANALISIS: ____________ MAPA DE PLAQUEO A1 A2 Puerta de Ingreso Leyenda: A1: Placa en el Piso A2: Placa sobre la mesa o equipo FECHA: _____________________ RESULTADOS: ___________________________________________________ OBSERVACIONES:___________________________________________________ ___________________________________________________________________ REALIZADO POR: ______________ VERIFICADO POR: _____________ Especificaciones: Máximo 500 microorganismos viables permitidos 11 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 14. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA UNIDAD I: MICROBIOLOGÍA GENERALIDADES 12 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 15. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PRACTICA N°01 BIOSEGURIDAD, TOMA DE MUESTRA Y ACONDICIONAMIENTO DE MATERIALES. Para trabajar en un laboratorio de Microbiología se requieren técnicas específicas y diferentes a las que se utilizan en otras disciplinas. Es imprescindible trabajar en condiciones asépticas: el material e instrumental que se va a utilizar, así como los medios de cultivo, deben ser sometidos con algunas excepciones (Caldo Selenito, Agar XLD) a procedimientos de esterilización, eliminándose de ellos posibles microorganismos contaminantes. Para mantener las condiciones de esterilidad, debemos trabajar en campana de flujo laminar o en la proximidad de la llama de un mechero Bunsen. En el laboratorio, el trabajo con microorganismos suele realizarse utilizando cultivos axénicos o puros, es decir, que contienen organismos de una sola especie microbiana. La posibilidad de contaminación está siempre presente porque los microorganismos se encuentran en todos los ambientes: en el aire, en el agua, en nuestra piel y, en general, en todo lo que tocamos. Para evitar las contaminaciones hemos de observar las siguientes normas: • El medio de cultivo y el recipiente que lo contiene deben estar estériles. • Los tubos o matraces deben ser tapados con algodón hidrófobo estéril o cubiertos con un capuchón metálico, para impedir la entrada de microorganismos. Si se usan placas Petri deben mantenerse tapadas mientras no se estén manipulando. • Los instrumentos que van a entrar en contacto con el medio de cultivo, con los distintos recipientes o con los microorganismos en estudio (asa de siembra, pipetas, etc.) deben ser previamente esterilizados. MATERIALES EMPLEADOS Y FORMA DE USO ASA E HILO DE SIEMBRA: Antes de su utilización, se esterilizan sometiéndolos a la acción de la llama de un mechero hasta que el filamento quede incandescente, luego se flameará la parte inferior del filamento. Una vez utilizados, deben flamearse de nuevo para eliminar los microorganismos que quedan en ellos. PIPETAS GRADUADAS DE VIDRIO O PLÁSTICO Se suministran ya estériles a los alumnos, dentro de estuches metálicos o bien empaquetadas de forma individual (envueltas en papel Kraft o aluminio para mantener su esterilidad), en cualquier caso deben abrirse cerca de la llama del mechero. La pipeta, si es de cristal, y por lo tanto reciclada, debe flamearse ligeramente antes de ser usada. Las pipetas llevan un algodón en la boquilla, que actúa como filtro, para evitar la contaminación y para impedir la llegada de líquido al sistema de succión. Dicho algodón debe permanecer en la boquilla durante el uso. Bajo ningún concepto se debe pipetear con la boca una muestra microbiológica. Para pipetear suspensiones de microorganismos se utilizan propipetas o bombillas que permitan controlar la succión y el dispensado de los líquidos o los dispositivos semejantes a jeringas en los que se coloca la pipeta y que operan por medio de un émbolo. También se pueden utilizar micropipetas o pipetas automáticas. 13 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 16. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA TUBOS DE ENSAYO CON CULTIVOS PROBLEMA Y PLACAS PETRI Se destapan cerca de la llama del mechero utilizando para ello sólo los dedos que quedan libres en la mano que sostiene el asa de siembra. Se flamea la boca del tubo, se toma una pequeña muestra del cultivo con asa de siembra estéril, previamente atemperada, y tras flamear de nuevo la boca del tubo colocamos el tapón. Todo el proceso se realiza cerca de la llama. Si el medio es líquido, se debe agitar el tubo antes de tomar la muestra, porque los microorganismos tienden a sedimentar. En el caso de que el medio sea sólido (tubos de agar inclinado y placas Petri), la muestra se obtendrá rozando ligeramente con el asa la zona en la que se aprecia masa microbiana. Los tubos y las placas deben permanecer abiertos el menor tiempo posible con el fin de evitar contaminaciones. INSTRUMENTOS PARA SIEMBRA DE MICROORGANISMOS A.- Asa de Siembra C.- Pipeta de Pasteur. B.- Hilo de Siembra D.- Cayado. PIPETAS A.- Pipeta automática de 0,2 - 1mL. C-- Pipeta de vidrio de 10mL. B.- Pipeta automática de 0,02 - 0,2mL. D.- Pipeta de vidrio de 1mL. MANEJO DEL ASA DE SIEMBRA DURANTE UNA INOCULACIÓN 14 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 17. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PROCEDIMIENTOS DE BIOSEGURIDAD La BIOSEGURIDAD es una combinación de procedimientos técnicos uso de equipos, materiales e infraestructura que se debe practicar diariamente y que no debe olvidar el personal de laboratorio. Los procedimientos de BIOSEGURIDAD tienen por finalidad: - PROTEGER: Al personal de laboratorio contra la exposición innecesaria e injustificada a microorganismos infecciosos. - EVITAR: La contaminación de las muestras que puede echar a perder el trabajo del laboratorista con resultados falsos. - MANTENER (Contención): Los microorganismos infecciosos dentro del ambiente del laboratorio. MICROORGANISMOS INFECTANTES POR GRUPOS DE RIESGOS Es IMPORTANTE conocer los tipos de microorganismos infectantes con los que trabajamos, para tomar las medidas de BIOSEGURIDAD respectivas. - La capacidad infectante del microorganismo. - Los modos de transmisión (por Ej: aerosoles). - Si son prevenibles por medio de inmunización (vacuna contra la Hepatitis B, Fiebre amarilla, etc.). - Si se dispone de medidas eficaces para el tratamiento contra el microorganismo infectante (por ejemplo: uso de Antibióticos). Alerta de Riesgo Biológico Alerta de Ondas Alerta de Peligro Radiales Tóxico 15 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 18. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA MICROORGANISMOS INFECTANTES POR GRUPOS DE RIESGO GRUPO DE RIESGO MICROORGANISMO INFECTANTE RIESGO 1 Agrupa microorganismos que tienen escaso o nulo riesgo de provocar enfermedades Ej: Plasmodium, helmintos intestinales, etc. humanas. RIESGO 2 Agrupa microorganismos que pueden provocar enfermedades humanas de riesgo Ej: Entamoeba histolytica, Leishmania, moderado. Si provoca una infección al Salmonella typhi, Staphylococcus, etc. personal de laboratorio, ésta tiene tratamiento y cura. RIESGO 3 Agrupa microorganismos que pueden Ej: Mycobacterium tuberculosis, Taenia provocar enfermedades humanas graves. solium, Yersinia pestis, etc. Tiene tratamiento, cura y se limita. RIESGO 4 Agrupa microorganismos que provocan Ej: Virus de la Inmunodeficiencia humana enfermedades graves en el ser humano. No (VIH), etc. hay tratamiento para su cura. NIVELES DE BIOSEGURIDAD Grupo de Nivel de Ejemplos de Equipos de Microorganismo Bioseguridad Laboratorio Seguridad Infectante Laboratorio de Ninguna. Laboratorio Básico Enseñanza. RIESGO 1 Sólo mesas de Nivel de Bioseguridad 1. Laboratorio Laboratorio al Universitario descubierto. Mesa de Servicio de Atención Laboratorio al Laboratorio Básico. Primaria de Salud. descubierto o RIESGO 2 Cámara de Nivel de Bioseguridad 2. Hospital de nivel Seguridad primario, diagnóstico. Biológica. Cámara de Seguridad Laboratorio de Biológica o Contención. Diagnóstico RIESGO 3 Contención Especial. Primaria para Nivel de Bioseguridad 3. todas las actividades. Cámara de Laboratorio de Seguridad Contención Máxima. Unidades Patógenas Biológica Clase III RIESGO 4 Peligrosas. o Ropa de Presión Nivel de Bioseguridad 4. Especial, Aire Filtrado. 16 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 19. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA LABORATORIOS BÁSICOS NIVELES DE BIOSEGURIDAD 1 y 2 - Las Reglas Más Importantes: - Del Ambiente: - Del Personal: 17 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 20. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA TOMA DE MUESTRA SANGUÍNEA 18 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 21. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA Recepción de los pacientes - Nombres y apellidos - Tipo de muestra - Tipo de análisis Recepción de la orden de análisis - Toma de muestra - Orina, sangre, otros Preparación del paciente para la toma de muestra Colocar la ligadura, limpiar la zona de aplicación, indicar al paciente que haga puño. Introducir la aguja Aspirar, retirando suavemente el émbolo. El ingreso de sangre a la jeringa nos indicará que estamos en vena. 19 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 22. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PRACTICA N°02 MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN En Microbiología se define Esterilización como el proceso por el que se destruye o elimina de un objeto o de una sustancia todos los microorganismos vivos: virus, bacterias, esporas. La esterilidad es un estado absoluto, no hay grados de esterilidad. OBJETIVO Conocer la importancia de la Esterilización y Desinfección familiarizarse con el manejo de los procedimientos más frecuentemente utilizados para llevarla a cabo. MATERIAL Mechero Bunsen, horno, autoclaves, equipos de filtración y materiales a tratar. TÉCNICAS El método más comúnmente empleado para destruir los microorganismos es el calor, entre otras razones porque es el más económico y el más fácil de controlar. El calor utilizado con este fin puede aplicarse en forma de calor seco o de calor húmedo. El calor seco destruye los microorganismos por efectos de oxidación y se requieren temperaturas muy elevadas. El calor húmedo elimina los microorganismos a temperaturas menores, ya que la presencia de agua acelera la rotura de los puentes de hidrógeno responsables de la estructura tridimensional de las proteínas, haciendo que éstas se desnaturalicen y pierdan por tanto su funcionalidad. En el laboratorio clínico, la esterilización y la desinfección se logra con los siguientes métodos: - Calor húmedo: Vapor saturado a presión, olla de presión, ebullición, vapor fluente - Calor seco: Horno de aire caliente, flameado. - Desinfección intensiva por inmersión en productos químicos: Lejía. - Desinfección por frotación con un producto químico. - Filtración. MECHERO DE BUNSEN 20 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 23. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA CALOR SECO FLAMEADO Se emplea para esterilizar asas e hilos de siembra, pinzas, espátulas, etc. Consiste en someter directamente a la acción de la llama de un mechero Bunsen los utensilios que se vayan a esterilizar. Este método es rápido y su eficacia es altísima, sin embargo no se puede aplicar a objetos termolábiles. ESTERILIZACIÓN POR AIRE CALIENTE Se lleva a cabo en estufas de aire caliente y consiste en colocar los objetos que se van a esterilizar, debidamente protegidos para que no se contaminen una vez esterilizados, en el interior de un horno. Este procedimiento se utiliza para esterilizar material de vidrio: pipetas, matraces, tubos, etc. U otros materiales termorresistentes. Las temperaturas a las que se someten estos materiales son muy elevadas (180ºC durante 2 horas). Estas temperaturas no pueden utilizarse para esterilizar líquidos (como medios de cultivo), ya que al llegar a los 100ºC comenzarían a hervir y continuarían hirviendo sin elevar su temperatura por encima del punto de ebullición del agua a presión atmosférica, y a esta temperatura las endosporas bacterianas pueden sobrevivir durante horas. Pero incluso en muestras en las que supiésemos que no existen endosporas, esta metodología puede implicar cambios en la concentración de los componentes del medio, a causa de la fuerte evaporación sufrida. CALOR HUMEDO: EBULLICIÓN: El agua hirviendo (100ºC) tiene acción limitada, ya que aplicada durante 10 – 20 minutos va a destruir las formas vegetativas de los microorganismos, pero las endosporas bacterianas pueden sobrevivir incluso a tratamientos prolongados. 21 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 24. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA Se podría utilizar el baño María o baño de agua hirviente (sólo con fines de desinfección en el laboratorio), cuando no se necesita alcanzar la esterilidad o cuando no se dispone de otros métodos mejores, tanto para material (pinzas, tijeras, escalpelos, etc.) como para medios de cultivo que no puedan esterilizarse en autoclave. VAPOR FLUENTE Esta técnica se emplea con frecuencia para esterilizar medios de cultivo que no se puedan someter a una temperatura superior a 100ºC sin que pierdan alguna de sus propiedades, como leche, azúcares, suero, etc. Se utiliza un autoclave a presión atmosférica, con la espita abierta, donde nunca se superan los 100ºC, y se realiza el proceso durante tres días consecutivos, dejándose a temperatura ambiente en los intervalos entre dos tratamientos. La muestra se somete a calentamiento (100ºC) durante 30-45 minutos destruyéndose en este proceso las formas vegetativas pero no las endosporas termorresistentes. Si éstas se encuentran presentes en la muestra germinan después del calentamiento y estas formas vegetativas serán destruidas en los siguientes ciclos. Este método de esterilización se denomina también Esterilización Fraccionada o Tindalización. VAPOR SATURADO A PRESIÓN La esterilización por esta técnica utiliza vapor de agua saturado que se somete a una atmósfera extra de presión sobre la presión atmosférica normal, elevándose con ello el punto de ebullición del agua de 100ºC a 121ºC y consiguiéndose la destrucción de todos los microorganismos en un tiempo de 15 minutos. Esta temperatura es también necesaria para la destrucción de las endosporas bacterianas, que presentan una alta resistencia térmica y que pueden sobrevivir, como ya se ha indicado, a 100ºC durante horas. El vapor de agua difunde por ósmosis a través de las membranas de las esporas, coagulando su protoplasma, fenómeno que se acentúa si el vapor es saturado y a sobrepresión. 22 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 25. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA Esta técnica de esterilización requiere el uso del Autoclave. FILTRACIÓN Es el paso de un líquido o gas a través de un material filtrante, con poros lo suficientemente pequeños como para retener células microbianas. Los filtros que se utilizan en la actualidad son, generalmente, los denominados filtros de membrana y están integrados por pequeñas piezas de material sintético, generalmente Acetato de celulosa o policarbonato, que pueden tener poros con tamaños de 0,22 y 0,45 µm, diseñados para retener bacterias. La acción combinada de los poros, la trama del filtro y la naturaleza química del material utilizado retiene los microorganismos, pero no el fluido. ELIMINACIÓN Y LIMPIEZA DEL MATERIAL CONTAMINADO En Microbiología es importante recordar la necesidad de una pulcra y esmerada limpieza del material. Asimismo, es muy importante la recuperación del material reciclable y la eliminación del material desechable. Todos los objetos sucios o contaminados deben recogerse en recipientes adecuados, provistos de tapa. El material de vidrio, tubos, matraces y pipetas, se separa del resto del material recogiéndose en un contenedor vertical u horizontal lleno de una solución desinfectante, como por ejemplo una solución diluida de lejía, en la que permanecerá antes de su lavado durante 24 horas. Como los objetos contaminados contienen, con frecuencia, cantidades importantes de materia orgánica (procedente de los medios de cultivo) que protegen a los microorganismos de los agentes físicos o químicos utilizados en la descontaminación de los mismos, no puede asegurarse la total destrucción de las formas vegetativas y mucho menos de las esporas. Por ello, se recomienda utilizar mayores concentraciones de desinfectante y tiempos más largos de tratamiento que para la desinfección o la esterilización de material limpio. 23 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 26. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA Generalmente se utiliza el autoclave para la descontaminación de instrumentos, equipos y material que sean estables al calor, así como de material desechable. A tal objeto se coloca este material en recipientes adecuados y se introducen en el autoclave sometiéndolos a la acción del vapor de agua a una atmósfera de sobrepresión (121º C) en ciclos más prolongados de lo habitual (1 hora en lugar de 30 minutos). Una vez efectuado este tratamiento, se procede a su lavado para eliminar toda materia extraña, sumergiendo el material en agua caliente jabonosa o utilizando detergentes, mezcla sulfocrómica o cualquier otro procedimiento enérgico, tanto mecánico como químico. Se aclara bien con abundante agua y se deja escurrir y secar a temperatura ambiente. En el caso de las pipetas, y antes de ser lavadas, debe extraerse con ayuda de un alambre o pinzas especiales, el trozo de algodón que tienen en la boquilla. Algunos de los objetos sucios y contaminados (portaobjetos, pipetas, etc), después de lavados, se sumergen en una mezcla sulfocrómica donde se dejan 24 horas al cabo de las cuales se lavan con agua y se dejan escurrir. Los portas se secan con un paño de hilo limpio, procurando que no queden hilazas sobre la superficie. El material que contiene colorantes se trata, según las condiciones del material, durante un tiempo variable con una solución que puede ser de ácido clorhídrico, nítrico o mezcla sulfocrómica. El resto del material (tubos de plástico, jeringas, etc) se trata con distintas soluciones desinfectantes como hipoclorito sódico, formol, etc, pero debe recordarse que se utilizan a concentraciones superiores a las utilizadas con otros fines. 24 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 27. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA MANEJO DEL AUTOCLAVE PROCEDIMIENTO: − Cerciorarse que el agua desionizada o destilada cubra la rejilla (aproximadamente 6 litros de agua). Colocar cuidadosamente en la bandeja el material a autoclavar (para el caso de placas colocarlas como si fuera a plaquear y para el caso de tubos se pueden colocar con sus gradillas); si es necesario utilizar las dos bandejas. − Luego colocar encima de la bandeja la cubierta protectora. − Bajar la tapa y colocar todas las manoplas, después realizar en forma simultanea el ajuste de las mismas, en forma diagonal o en (cruz). − Encender el equipo (llave principal – pared) “ON” y posteriormente girar la perilla AUTOMATICO en “HI” y la perilla RELOJ hasta 50 minutos. − Cuando el equipo se encuentre aproximadamente entre 90° C – 100° C cerciorarse si por la espita ya no sale aire y que en su lugar salga “VAPOR” se puede corroborar colocando un pedazo de papel a la salida de la espita si se humedece entonces cerrar la espita. − Simultáneamente el equipo empezará a elevar la presión y cuando se encuentre entre 15 a 17 libras de presión, entonces girar la perilla AUTOMÁTICO a “3” para mantener la presión constante a partir de ese momento controlar 15 minutos (121°C por 15 libras por 15 minutos). − Terminado el equipo apagarlo y girar la perilla AUTOMÁTICO en “OFF” y la perilla RELOJ “O” y finalmente la llave principal – pared “OFF”. − Esperar que la presión comience a disminuir por si sola y cuando llegue a “CERO” entonces proceder a abrir por completo la llave de la espita, posteriormente aflojar las manoplas y retirarlas: como precaución mantenerse atrás del autoclave para la apertura de la tapa (cuidándose del vapor). − Retirar el material autoclavado. 25 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 28. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA DESINFECCIÓN INTENSIVA POR INMERSIÓN EN PRODUCTOS QUÍMICOS DESINFECTANTES QUÍMICOS: Las fórmulas de los productos desinfectantes presentan grandes diferencias. Es esencial, por lo tanto, que las diluciones se hagan de acuerdo con lo recomendado por los fabricantes. HIPOCLORITO DE SODIO: Es un agente químico barato y fácil de adquirir, mata bacterias y virus. Tiene dos inconvenientes importantes: se deteriora y es corrosivo. CLORAMINA: Es más estable que el hipoclorito de sodio. Sin embargo, debe protegerse de la humedad, la luz y el calor excesivo. Puede obtenerse en forma de polvo o de tabletas. DESINFECCIÓN POR FROTACIÓN CON UN PRODUCTO QUÍMICO La frotación con un desinfectante adecuado es un procedimiento aceptable en el caso de superficies (mesas, etc.) y de salpicaduras de sangre. Cuando éstas son visibles, se empezará por derramar desinfectante sobre la superficie; luego se retirará la mezcla de sangre y desinfectante. El hipoclorito de sodio (lejía) es el desinfectante más indicado. AGENTES QUÍMICOS La efectividad de estos agentes depende de las condiciones bajo las que actúan: - Concentración: Varía con el tipo de agente y de microorganismo, pues una misma concentración del agente puede producir un efecto diferente en distintos microorganismos. - Tiempo: Los microorganismos no son susceptibles a un agente en la misma forma, por lo que no todos los microorganismos mueren al mismo tiempo. - PH: Afecta tanto a los microorganismos como a los agentes químicos. Alcoholes Yodo Antisépticos Agentes catiónicos, aniónicos y anfóteros Órgano mercuriales 26 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 29. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA Cloro y compuestos clorados Desinfectantes y/o Aldehídos Esterilizantes Oxido de etileno Compuestos fenólicos Ácidos y álcalis CLASIFICACION DE DESINFECTANTES Basados en las diferencias existentes entre los desinfectantes en uso, se estableció tres niveles de acción microbicida, cuyo reconocimiento servirá de fundamento para establecer los procedimientos de desinfección efectiva en cada laboratorio. Los términos que se define son: alto nivel, nivel intermedio y bajo nivel de desinfección. A. DESINFECCIÓN DE ALTO NIVEL Algunos instrumentos o materiales no resisten la exposición al calor y es necesario someterlos a desinfección utilizando agentes químicos. Los desinfectantes de alto nivel se diferencian de los demás por su capacidad esporocida, siendo su principal desventaja el largo tiempo de exposición que debe tener el material (hasta 24 horas). Este método requiere de técnicas de limpieza rigurosa para reducir al máximo la contaminación microbiana de los instrumentos y eliminar residuos orgánicos que inactivan los desinfectantes. B. DESINFECCIÓN DE NIVEL INTERMEDIO Los desinfectantes de nivel intermedio no son capaces de destruir las esporas bacterianas, pero tienen la capacidad de inactivar el bacilo tuberculoso, que es más resistente a los germicidas en solución acuosa que las bacterias vegetativas comunes. También son efectivos contra los hongos (esporas asexuadas, pero no siempre clamidosporas secas o esporas sexudas) y contra los virus con cubierta lípidica de tamaño mediano y algunos virus sin cubierta lípidica de tamaño pequeño. C. DESINFECCIÓN DE BAJO NIVEL Los desinfectantes de bajo nivel son aquellos que no tienen capacidad para actuar sobre las esporas bacterianas, el Mycobacterium tuberculosis, o los virus no lipídicos de tamaño pequeño. Pueden ser útiles en la práctica por tener una acción rápida sobre las formas vegetativas comunes de las bacterias y varios tipos de hongos, así como sobre los virus de tamaño mediano y con cubierta lipídica. Algunos de estos desinfectantes, a mayor concentración, pueden elevar su acción microbicida al nivel intermedio, como los yodóforos y fenoles. En cambió, otros no tienen esta propiedad. 27 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 30. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA CARACTERÍSTICAS DE ALGUNOS DESINFECTANTES CLASE CARACTERÍSTICAS Glutaraldehído Solución Esporocida, bactericida, tuberculicida, tóxico, solución Acuosa activada activada inestable. Fecha de expiración 14 días desde su activación. Peróxido de Hidrógeno Esporocida, sol. En uso estable hasta 6 semanas, estabilizado tóxico para ojos y vía oral, menos tóxico para piel. Escasa inactivación por materia orgánica. Formaldehído + Alcohol Esporocida, tóxico, volátil. Emanaciones nocivas. Yodo + Alcohol Acción rápida, corrosivo, inflamable. Irrita la piel, mancha Alcohol Acción microbicida rápida, excepto esporas bacterianas y algunos virus resistentes. Volátil, inflamable. Seca e irrita la piel. Compuestos de Cloro Acción rápida, inactivado por materia orgánica. Corrosivo, irrita la piel. Compuestos de Fenol Estable, corrosivo, irritante para la piel. Escasa inactivación por materia orgánica. Yodóforos Algo inestables, escasa irritación de la piel. Corrosivo. Poco irritante, inactivado por jabón y compuestos Compuestos Amonio aniónicos, absorbido por telas. Soluciones diluidas o Cuaternario antiguas permiten el crecimiento de Bacterias Gram Negativas. Poco irritante, muy inactivadas por materia orgánica, Compuestos Mercuriales débilmente bactericidas. 28 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 31. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA NIVEL DE AGENTES QUÍMICOS Clase Concentración Nivel de Actividad Glutaraldehído Sol. acuosa 2% Alto Peróxido de hidrógeno 6 – 10% Alto Formaldehído + Alcohol 8% + 70% Alto Formaldehído Sol. Acuosa 3 – 8% Alto a Inter. Yodo + Alcohol 0.5 – 1% + 70% Intermedio Alcohol 70% Intermedio Compuestos de Cloro 0.1% Intermedio Compuestos de Fenol 0.5 – 3% Inter. a Bajo Yodo, Sol. Acuosa 1% Intermedio Yodóforos 0.007 – 0.015%** Intermedio Compuestos Amonio Cuaternario 0.1 – 0.2% Bajo Hexaclorofeno 1% Bajo Compuestos Mercuriales 0.1% - 0.2% Bajo LAVADO DE MANOS PROCEDIMIENTO CORRECTO 1. Acercarse al lavatorio, sin permitir que el uniforme toque el lavadero durante el método de lavado. 2. Quítese los anillos, reloj, pulsera o acostumbrarse a usar bien arriba de la muñeca. 3. Abrir la llave del agua, regular el flujo (para que no se disperse) y temperatura (tibia). 4. Mójese las manos, tomar la pastilla de jabón, enjabonarse bajo el chorro de agua frotándose vigorosamente con el jabón las manos, muñecas, hasta la parte media del antebrazo; manteniendo las manos bajas en relación al antebrazo y codo, con las manos enjabonadas lavar la llave del agua. 5. Enjuagar el jabón y guardar sin tocar la jabonera. 6. Por medio del frotamiento enérgico produzca espuma, realizar frotamiento firme y movimientos circulares de: antebrazo, muñeca, palmas, dorso, cada dedo, cada área interdigital. Limpiar las uñas, mínimo una vez al día antes de comenzar a trabajar. 7. Enjuagarse en sentido distal: antebrazo, muñeca y manos; manteniendo las manos por debajo del antebrazo. Enjuagar la llave del caño al tocarla. 29 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 32. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA 8. Repetir los pasos 4, 5 y 6 (volver a repetir según el grado de contaminación). 9. Enjuáguese en sentido proximal individualmente dejando correr el agua de los dedos a la muñeca y antebrazo, quedando con la mano y antebrazo por encima del codo. Con una toallita se secará con golpecitos suaves las manos muñecas y antebrazos. 10. Cerrar la llave del caño. 30 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 33. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA CONCEPTOS BÁSICOS Asepsia: Ausencia de microorganismos patógenos. Microorganismos Patógenos: Es causante de enfermedad. Contaminación: Presencia de agentes infecciosos vivos en la superficie del cuerpo, prendas de vestir o artículos sucios (no constituye infección). Infección: penetración y desarrollo o multiplicación de un agente infecciosos en el organismo de una persona o animal. Enfermedad infecciosa: Enfermedad clínicamente manifiesta del hombre resultados de una infección. Asepsia médica: Normas ideadas para reducir el número de transmisión de microorganismos patógenos, ej: lavado de manos. Desinfección: proceso por el que se da muerte a microorganismos patógenos pero no necesariamente a sus esporas, aplicado sobre un objeto inanimado (inerte). Desinfectante: Sustancia empleada para la desinfección, ej: alcohol yodado, sablón. Antisepsia: Proceso de lisis o inhibición del crecimiento bacteriano sobre la superficie de tejidos vivos. Antiséptico: Sustancia empleada para la antisepsia. Por lo general su uso es inocuo en las personas ej: alcohol 70° agua oxigen ada. , Espora: Microorganismos que en determinadas circunstancias producen una especie de cápsula que le permite pasar por una fase de inactividad, que más tarde en situaciones adecuadas recuperan su actividad, ej: Clostridium tetan, causante del tétanos. Limpieza: Es la remoción mecánica de toda materia extraña en el ambiente, en superficies y objetos utilizando para ello el lavado manual o mecánico. Normalmente se usa agua y detergente para este proceso. El propósito de la limpieza es disminuir el número de microorganismos a través de arrastre mecánico y no asegura la destrucción de éstos. Bactericida: Sustancia química que elimina todas las bacterias, patógenas y no patógenas, pero no necesariamente las esporas bacterianas. Bacteriostático: Sustancia química que previene el crecimiento de bacterias, pero no necesariamente las destruye. En muchas ocasiones la diferencia entre bactericida y bacteriostático únicamente depende de las condiciones de aplicación: tiempo, temperatura, pH. 31 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 34. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA 31 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 35. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PRACTICA N°03 MEDIOS DE CULTIVO: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO INTRODUCCIÓN Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes, preparados en el laboratorio, que suministran los compuestos necesarios para el desarrollo de los microorganismos. Algunas bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de cultivo, otras bacterias necesitan medios especiales y existen algunas que no pueden crecer en ninguno de los medios desarrollados hasta ahora. Los distintos tipos de medios de cultivo varían según las necesidades de los microorganismos objeto de estudio, pero todos han de cumplir los siguientes requisitos: - Han de contener las sustancias necesarias para el crecimiento del microorganismo que se siembra. - Han de mantenerse estériles hasta el momento de la siembra. - Los requerimientos para el crecimiento microbiano se pueden agrupar en dos categorías: Físicos y químicos. Entre los primeros se incluyen la temperatura, el pH y la presión osmótica; entre los requerimientos químicos se encuentran el agua, las fuentes de carbono y nitrógeno, las sustancias minerales, el oxígeno y determinados factores orgánicos de crecimiento. - Finalmente, una vez sembrados, deben ser incubados a la temperatura y condiciones adecuadas. Requerimientos para el desarrollo bacteriano: Las bacterias pueden ser divididas en autótrofas y heterótrofos. Las primeras comprenden las bacterias del suelo y el agua que obtienen carbono y nitrógeno de la atmósfera y de la materia inorgánica simple. Las bacterias heterótrofas requieren compuestos orgánicos más complejos como fuente de carbono y nitrógeno, así como proteínas o sus derivados, también requieren carbohidratos y grasas. Este último grupo de organismos es el más importante en bacteriología médica. - Proteínas: Se suministran generalmente como peptonas que se encuentran disponibles en el comercio, preparadas por digestión parcial de carne con enzimas pépticas, consisten en polipéptidos, dipéptido y aminoácidos. - Carbohidratos: Suministran carbono para las síntesis, y además su fermentación libera energía utilizable en el metabolismo. 32 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 36. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA - Factores accesorios de crecimiento: Son también requeridos por algunas bacterias. Entre ellos están las vitaminas del complejo B (tiamina, ácido nicotínico, piridoxina, botina). Estas sustancias son necesarias y las bacterias no las pueden sintetizar. Otros factores necesarios para algunas bacterias son obtenidos de nutrimentos más complejos, como el suero, la sangre la yema del huevo, etc. - Sales minerales: Elementos como potasio, sodio, calcio, etc. También son requeridos por algunas bacterias en su desarrollo. - Atmósfera: Microorganismos aerobios obligados, anaerobios obligados, anaerobios facultativos, etc. - Presión osmótica: Las células pueden encogerse y ser destruidas (plasmólisis) en soluciones hipertónicas, inversamente, se rompen (plasmoptisis) por entrada de agua, en las soluciones hipotónicas. - Temperatura: Para la mayoría de bacterias patógenas del hombre la temperatura óptima de crecimiento es de 37°C. - Luz: La mayoría de las bacterias desarrollan en ausencia de luz porque esta puede ser letal. - Reacción: La mayoría de las bacterias crece mejor en un medio ligeramente alcalino (pH 7,2- 7,6). OBJETIVOS Aprender a preparar, esterilizar y almacenar distintos tipos de medios de cultivo. TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO Existe una gran variedad de medios para el cultivo de los microorganismos en el laboratorio, la mayoría de ellos pueden adquirirse ya elaborados, necesitando algunos sólo la adición de agua o la esterilización. Los medios de cultivo pueden clasificarse: a) POR SU CONSISTENCIA: 1. Medios Líquidos o Caldos: Son aquellos que contienen, disueltos en agua, los nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos. 33 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 37. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA 2. Medios Sólidos: Contienen nutrientes disueltos en agua pero se les añade un agente solidificante. El Agar es un polisacárido complejo que se obtiene de algas rodofíceas de origen marino cuyas propiedades son de gran utilidad en la preparación de medios de cultivo sólidos: No es degradado enzimáticamente por los microorganismos (a excepción de algunos microorganismos de ambientes marinos), funde aproximadamente a 100ºC y permanece en estado líquido mientras la temperatura no descienda por debajo de 45-50ºC. Además, una vez solidificado se puede incubar a temperaturas elevadas sin que se licúe. Generalmente el Agar se añade, para solidificar un medio líquido, en una concentración del 1,5%. Los medios con Agar se envasan en tubo o en placa de Petri. 3. Medios Semisólidos: Son similares a los medios sólidos, pero la concentración del agente solidificante es menor, generalmente del 0,4% con lo que, una vez solidificados mantienen una consistencia gelatinosa. Se utilizan, por ejemplo, para determinar la movilidad de los microorganismos. b) POR SU COMPOSICIÓN 1. Medios complejos: Contienen todos los nutrientes necesarios para el crecimiento de muchos tipos de microorganismos, pero no se conocen todos los componentes que forman parte de ellos, ni las concentraciones exactas de cada uno de ellos. Muchos de sus componentes proceden de la degradación parcial de tejidos o productos animales, de plantas o de microorganismos que son fuente de aminoácidos, azúcares, lípidos, vitaminas y minerales. Ejemplos de dichos componentes son las peptonas o triptonas (proteínas animales digeridas enzimáticamente), el extracto de carne y el extracto de levadura. Como ya se ha mencionado, en estos medios suelen encontrarse azúcares pero en muchos casos los medios complejos son suplementados con glucosa. Un ejemplo de medio nutritivo complejo es el caldo nutritivo, que contiene peptona y extracto de carne. 34 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 38. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA 2. Medios definidos: Son aquellos que contienen los distintos nutrientes en forma de productos químicos puros (pero no extrapuros) y en concentraciones conocidas. Así, un medio definido que permita el desarrollo de un microorganismo heterótrofo y "poco exigente", como E. coli, debería contener sales inorgánicas y fuentes de carbono y nitrógeno: MgSO4, KPO4H2, Na2PO4H, glucosa y NH4Cl. Otros elementos esenciales, como hierro, manganeso y cobre, se encuentran generalmente presentes como contaminantes de los productos químicos antes citados, en cantidades suficientes para el crecimiento. c) POR SU UTILIZACIÓN: Muchos medios de cultivo utilizados en el laboratorio son medios generales en los que se pueden desarrollar una gran variedad de microorganismos con distintos requerimientos nutricionales. Sin embargo, en algunas ocasiones, es necesario aislar a partir de una muestra un microorganismo que se encuentre en un bajo número y que pueda ser enmascarado por otros microorganismos presentes en un número más elevado. En esos casos es recomendable utilizar medios de cultivo que ayuden a separar y diferenciar dichos microorganismos o que, de forma selectiva, favorezcan el crecimiento de alguno de ellos. Estos medios pueden ser: 1. Medios Selectivos: Son aquellos que permiten el crecimiento de un tipo determinado de microorganismos, inhibiendo el desarrollo de los demás. Algunos de estos medios contienen un agente selectivo como antibióticos, productos químicos, colorantes, etc. Entre los agentes selectivos podemos citar el SS AGAR cloruro sódico, que en concentración elevada inhibe la mayoría de los microorganismos excepto los microorganismos halotolerantes, como son los estafilococos, o la azida de sodio, que inhibe el crecimiento de bacterias Gram negativas al fijarse al hierro de la porfirina del sistema citocromo, permitiendo seleccionar los estreptococos, que carecen de este sistema, así como otros Gram positivos. AMS De la misma manera, la bilis y sales biliares convierten los medios de cultivo a los que se añaden en selectivos para Salmonella ya que, además de inhibir a los microorganismos Gram positivos, en concentraciones elevadas inhiben también a bacterias Gram negativas fermentadoras de lactosa. Los colorantes, como el verde brillante, inhiben selectivamente las bacterias Gram positivas, siendo también inhibidor para la mayoría de las bacterias intestinales excepto para Salmonella. 35 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 39. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA Este colorante es la base del medio Agar Verde Brillante, utilizado para el aislamiento de Salmonella a partir de muestras fecales. Los medios selectivos pueden serlo también por su pH, así el Agar glucosado de Sabouraud ajustado a pH 5,6, se usa para el aislamiento de hongos, que a ese pH crecen mejor que las bacterias. 2. Medios Diferenciales: Son aquellos diseñados para distinguir unos microorganismos de otros, a partir de una población mixta, por la apariencia distinta que toman sus colonias. Estos medios de cultivo ponen de manifiesto propiedades que un determinado tipo de microorganismo posee. Por ejemplo, los medios diferenciales llevan incluido un indicador de pH, que pone de manifiesto la degradación de un nutriente específico (generalmente un azúcar) por el cambio de color que se origina cuando éste es metabolizado, como en el caso del medio CLED. Agar Mac Conkey Los medios diferenciales pueden ser además selectivos, si se añaden agentes que inhiben el crecimiento de determinados microorganismos. En este caso va a ser posible distinguir diferentes tipos microbianos dentro del limitado grupo de microorganismos que pueden crecer. Así, el medio EMB de Levine es selectivo para las bacterias Gram negativas por contener dos colorantes, eosina y azul de metileno, que inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas. EMB Es también un medio diferencial, porque distingue las bacterias que fermentan la lactosa (con producción de ácido) de las no fermentadoras. La formación de ácidos a partir de lactosa hace que ambos colorantes precipiten en la superficie de las colonias, que aparecen de color morado. En ciertas ocasiones, como ocurre en el caso de E. coli, las colonias presentan además un brillo metálico. El Agar Mac Conkey es otro ejemplo de medio selectivo y diferencial. La presencia de sales biliares y cristal violeta inhiben el crecimiento de bacterias no entéricas; la fermentación de lactosa con liberación de productos ácidos hace virar un indicador de pH incorporado en el medio. 36 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 40. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO La preparación de medios de cultivo se ha simplificado en gran medida por la comercialización de medios deshidratados, en los que los diferentes nutrientes se encuentran ya mezclados en las debidas proporciones, siendo sólo necesario la adición de la cantidad correcta de agua destilada para disolver sus componentes. Cuando se prepara un medio líquido se debe disolver totalmente todos sus componentes en agua destilada. A continuación el caldo se envasa en los recipientes adecuados (matraces o tubos), tapando los mismos y esterilizándolos. La preparación de un medio sólido puede hacerse de dos maneras: Preparar el caldo y añadir Agar al 1,5% o bien utilizar un medio sólido comercial. Independientemente de la forma elegida para hacerlo, la preparación de los medios de cultivo sólidos requiere procedimientos especiales, ya que el Agar es insoluble en agua. Por ello, una vez añadida el agua, se debe calentar la mezcla hasta 100ºC, para permitir que el Agar se funda y quede incorporado al resto de los nutrientes disueltos. El medio fundido se dispensa en tubos o matraces, que se tapan y se esterilizan. Los medios sólidos contenidos en tubos pueden dejarse enfriar en posición vertical, si van a ser inoculados en profundidad, o bien pueden inclinarse para que al solidificarse en esa posición adopte la forma inclinada que proporciona una mayor superficie de siembra. Si se desean preparar placas de Petri, se utilizará el medio de cultivo que ha sido esterilizado en un matraz y, una vez atemperado, se verterá en placas vacías en un ambiente aséptico, como el que proporciona la proximidad de la llama de un mechero o una campana de flujo laminar. En algunas ocasiones, el medio de cultivo destinado a placas puede conservarse estéril en tubos, que se fundirán al baño María cuando se vayan a preparar las placas. Si se han de incorporar al medio compuestos termolábiles, como vitaminas o antibióticos, se esterilizarán éstos por filtración y se añadirán al medio de cultivo previamente esterilizado en autoclave y una vez que este se haya atemperado. En todos los casos se han de seguir las instrucciones del fabricante. La conservación de los medios ya preparados puede hacerse a temperatura ambiente, pero es preferible conservarlos a 4ºC para retrasar su deshidratación. 37 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 41. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 38 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 42. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PRACTICA N°04 COLORACIÓN GRAM Y COLORACIÓN BACTERIAS ÁCIDO ALCOHOL RESISTENTES La morfología de los microorganismos puede examinarse de dos formas: observando microorganismos vivos sin colorear (en fresco) y observando células muertas teñidas con colorantes. Klebsiella pneumoniae El examen en fresco de los microorganismos permite conocer algunas de sus características (morfología, tamaño, movimiento, etc). Sin embargo, las microorganismos vivos son casi incoloros y no se pueden visualizar fácilmente al microscopio óptico normal cuando se encuentran suspendidos en agua, de ahí que se utilicen colorantes para incrementar su contraste con el entorno que los rodea y de esta forma hacerlos visibles. Los colorantes pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. El Colorante es aquella sustancia que tiene la propiedad de comunicar color a otros cuerpos de cualquier naturaleza. De acuerdo a su Origen los colorantes pueden ser Naturales como por ejemplo el carmín o Artificiales como el cristal violeta. De acuerdo a su Composición Química los colorantes pueden ser Básicos como la fucsina básica y Ácidos como el anaranjado de metilo y Neutros como el Wright o Giemsa. Algunos colorantes teñirán mejor sólo después que la célula haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina Mordiente; un mordiente habitual es el Lugol. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante. Cristal Violeta Carmín 39 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 43. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA EL MICROSCOPIO El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño Actualmente existen dos tipos de microscopios: el óptico y el electrónico. MICROSCOPIO OPTICO Los microscopios de este tipo generalmente producen un aumento de 1000 veces el tamaño original. El límite lo tienen en unas 2000 veces. Las lentes de un microscopio óptico son el condensador, el objetivo y el ocular. La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparación y para esto se utiliza el condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de luz y elegirse una posición que consiga el foco preciso. El objetivo es la lente situada cerca del objeto que se observa. El aumento primario del objeto es producido por la lente objetivo y la imagen se transmite al ocular, donde se realiza el aumento final. Los microscopios que se usan normalmente en microbiología están equipados con tres objetivos: bajo poder, alto poder y objetivo de inmersión. 40 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 44. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA MICROSCOPIO ELECTRÓNICO Los microscopios electrónicos utilizan rayos de electrones en lugar de la luz, lo que les permite tener un poder de resolución muy elevado. La longitud de onda de los rayos de electrones es de 0,005 - 0,0003 nm, muy corta comparada con la de la luz visible (426 - 750 nm; violeta - rojo). Es posible con el microscopio electrónico resolver objetos separados por una distancia de 0,003 µm, comparado con los 0,25 µm de uno óptico. Los aumentos pueden llegar a ser de un millón de veces. A causa de la naturaleza de este instrumento sólo pueden examinarse objetos muy delgados; incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada directamente. OBJETIVOS - Ejecutar las técnicas básicas de coloración. - Interpretar los procesos de coloración de las técnicas estudiadas. - Observas diferentes formas, tamaños y agrupaciones que permitan los microorganismos. EXAMEN MICROSCÓPICO OBJETIVO - Observar microorganismos vivos en el microscopio de campo claro. - Estudiar su morfología y agrupación, apreciar las diferencias de tamaño entre organismos procarióticos y eucarióticos y aprender a diferenciar el movimiento browniano de la movilidad de los microorganismos. TÉCNICA - Para la observación de microorganismos sin teñir se realiza el montaje húmedo. - Depositar una gota de la muestra tomada con asa de siembra previamente flameada, en un portaobjetos y colocar sobre la misma un cubreobjetos presionando suavemente. - Utilizar el microscopio con el objetivo de 40 aumentos, disminuyendo la cantidad de luz incidente sobre la muestra con ayuda del diafragma o bajando el condensador. Un exceso de luz dificultará la observación de los microorganismos, ya que poseen el mismo índice de refracción que el medio circundante (el vidrio del portaobjetos y el líquido en el que se encuentran suspendidos). - Para reducir la evaporación de la muestra con el calor desprendido por el foco luminoso y que los microorganismos pierdan su movilidad, debe realizarse la operación rápidamente o bien sellar los bordes del cubreobjetos con parafina. - Observar la forma y el tamaño de los microorganismos. 41 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 45. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA - Describir su movilidad, diferenciando el movimiento browniano, debido a la colisión de los microorganismos con las moléculas del líquido que los rodea, de la verdadera movilidad. La movilidad se manifiesta por el desplazamiento de los microorganismos a grandes distancias y en una dirección determinada, aunque a veces pueden apreciarse rotaciones o giros. Los desplazamientos cortos y sin sentido se deben al movimiento browniano. GRAFIQUE LO OBSERVADO 10 Aumento 40 Aumento MÉTODOS DE COLORACIÓN 1. TINCIÓN SIMPLE: Aquella en la que sólo se utiliza un colorante, que generalmente tiñe a los microorganismos. Este tipo de tinción se denomina directa. Si el colorante proporciona una coloración al fondo, sin alterar el aspecto de las células, que permanecen sin teñir, la tinción se denomina negativa. La tinción simple permite observar morfología celular, tamaño y agrupación de los microorganismos. 2. TINCIÓN DIFERENCIAL: Es aquella que emplea secuencialmente dos colorantes que permiten distinguir tipos de microorganismos en función de diferencias en su estructura y composición química. La tinción de Gram y la Ácido-Alcohol-Resistente, basadas en las propiedades de la pared celular bacteriana, son las más utilizadas. 42 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 46. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA TINCIÓN GRAM 3. TINCIÓN ESTRUCTURAL: Se utiliza para identificar y estudiar determinadas estructuras que pueden estar presentes en los microorganismos. En las tinciones estructurales se colorea únicamente una parte de la célula. Se utilizan este tipo de tinciones para poner en evidencia la presencia de cápsulas, endosporas, flagelos o inclusiones (almidón, polifosfato, etc.). Tinción de Capsula PROCEDIMIENTO GENERAL PARA TODA COLORACIÓN En la mayoría de los casos, los pasos a seguir son los que se indican a continuación: - EXTENSIÓN: Realizar una extensión con el asa de siembra esterilizada, para ello se toma una pequeña gota de cada uno de los cultivos y se extiende en un portaobjeto limpio. Si el cultivo procede de un medio sólido, se coloca una gota de agua o NaCl 0,9% en el portaobjeto y se mezcla con una pequeña porción de la muestra hasta formar una suspensión homogénea, extendiéndola con el fin de obtener una fina película. Posteriormente, se deja secar al aire o en la parte alta de la llama del mechero, pero no se debe eliminar el líquido calentando el portaobjetos a la llama porque pueden distorsionarse las células. TÉCNICA DE EXTENSIÓN DE UNA MUESTRA SOBRE PORTAOBJETOS 43 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 47. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA - FIJACIÓN: La fijación tiene como finalidad coagular el citosol de las células y hacer que se adhieran al portaobjeto, siendo el calor el método más utilizado para la fijación, aunque pueden utilizarse otros agentes, como el alcohol (metanol) u otros compuestos químicos. La fijación con calor se recomienda cuando se trabaja con muestras de un cultivo sólido; en muestras obtenidas de un cultivo líquido es mejor hacer la fijación con metanol ya que se retienen en el portaobjetos un mayor número de células. Es necesario que la extensión se haya secado antes de proceder a la fijación, por ello se debe esperar hasta que el líquido de la misma se evapore. La fijación por calor se lleva a cabo pasando varias veces la preparación seca a través de la llama de un mechero, con la extensión hacia arriba. El calor desnaturaliza las proteínas y suele matar al microorganismo. Es importante no excederse en este proceso, para evitar que las bacterias se deformen o se rompan, siendo suficiente que el portaobjeto se note caliente sobre el dorso de la mano, pero no demasiado. - COLORACIÓN O TINCIÓN: Para ello es necesario cubrir la preparación con abundante colorante y dejarlo actuar durante algún tiempo. Pasado ese tiempo, lavar con agua las preparaciones teñidas para eliminar el exceso de colorante, dejando caer con suavidad el agua sobre un extremo del portaobjeto, que se mantendrá inclinado durante este proceso. No se debe dirigir el agua con demasiada fuerza sobre la preparación para no arrastrar la muestra. Eliminar el exceso de agua del portaobjeto golpeándolo ligeramente por el extremo; este proceso debe realizarse con cuidado. Permitir que se seque la preparación, bien utilizando un papel secante, sin frotar o bien dejándola secar al aire, aunque lleva más tiempo. Examinar la preparación al microscopio, con el objetivo de inmersión (100x), colocando, previamente, una gota de aceite de inmersión sobre la preparación. TINCIÓN SIMPLE OBJETIVO: Estudiar las características de los microorganismos en cultivo, es decir: tamaño, forma y agrupación de las células. TÉCNICA - Preparar extensiones de los distintos microorganismos, dejar secar al aire y proceder a su fijación. - Realizar la coloración cubriendo la preparación con abundante colorante y dejarlo actuar durante algún tiempo. Para el azul de metileno un minuto. - Lavar con agua las preparaciones teñidas y continuar con la técnica tal y como se indica previamente. - Examinar la preparación al microscopio con el objetivo de inmersión. Observar la forma y disposición de los microorganismos teñidos con el colorante. MUESTRA 44 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 48. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA EXTENSIÓN Y FIJACIÓN DE LA MUESTRA TINCIÓN DE LA MUESTRA (Medio Ambiente) Tinción con Azúl de Metileno 45 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 49. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA TINCIÓN DE GRAM Es uno de los procedimientos de tinción más útiles en la identificación de microorganismos, ya que divide a éstos en dos grandes grupos: Gram positivos y Gram negativos. En 1884, Hans Christian Gram, un Médico danés que laboraba en Berlín, accidentalmente descubrió un método para teñir y diferenciar bacterias. Empleaba cristal violeta como colorante y una solución yodada potásica como mordente. Mientras examinaba preparaciones de tejido pulmonar de pacientes que habían muerto por neumonía, descubrió que el colorante era retenido por algunas bacterias y otras permanecían incoloras después de lavar el frotis con etanol y agua. Clasificó a las primeras como Gram-positivas y Gram-negativas a las segundas. Posteriormente Carl Weigert introdujo la modificación por la cual se incorporaba safranina como colorante de contraste al método facilitando la diferenciación entre positivas (violeta) y negativas (rosa/naranja). 1. Un primer colorante básico, generalmente cristal violeta, que se aplica sobre la muestra y que reacciona con las células (cargadas negativamente), coloreándolas. 2. Un mordiente, que incrementa la afinidad entre el primer colorante y las células. Parece ser que el mordiente (solución diluida de yodo) se combina con el colorante, para formar un compuesto insoluble coloreado en el interior de la célula. 3. Un agente decolorante, como el etanol de 95% o la mezcla alcohol – acetona (1:1), que son disolventes orgánicos capaces de eliminar el primer colorante de algunas bacterias, decolorándolas. 4. Un colorante de contraste, igualmente de carácter básico pero de distinto color que el primer colorante. Generalmente se suele utilizar la safranina, de color rosa, que contrasta con el color violeta del primer colorante, y que teñirá sólo a las bacterias decoloradas en el paso anterior. Los organismos que resisten la decoloración y retienen el complejo cristal violeta-yodo aparecerán de color violeta oscuro al microscopio y se denominan Gram positivos. Aquellos que pierden el color inicial del cristal violeta tras la decoloración, se clasifican como Gram negativos y toman el color rosa debido al segundo colorante, la safranina. Las diferencias químicas en sus paredes celulares, son las que permiten o no la salida del complejo cristal violeta-yodo. Las bacterias Gram positivas tienen una pared celular gruesa, compuesta principalmente por peptidoglicano, mientras que en Gram negativas, aunque la pared está también constituida por péptidoglicano, es más delgada y presenta además una membrana externa con lipopolisacáridos. 46 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 50. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA Las paredes de las bacterias Gram positivas tratadas con alcohol sufren una deshidratación y sus poros se contraen, dificultando la salida del complejo cristal violeta-yodo. En las Gram negativas, el alcohol desorganiza la capa lipídica más externa y lava el colorante de la delgada capa de peptidoglicano. La tinción de Gram es más reproducible cuando se aplica a cultivos jóvenes de bacterias, ya que las bacterias Gram positivas, en la fase estacionaria de crecimiento, pueden aparecer como Gram negativas. OBJETIVO Aprender una técnica de coloración diferencial e interpretar los resultados obtenidos en la misma, distinguiendo bacterias Gram positivas y Gram negativas. TÉCNICA Preparar extensiones de los distintos microorganismos, que deberán encontrase en fase exponencial de crecimiento. Dejar secar al aire y proceder posteriormente a la fijación, siguiendo la técnica ya descrita. Para la coloración se seguirá el siguiente protocolo: Equipo para realizar la tinción de gram Colorantes: Cristal Violeta, Lugol y Safranina. Solvente: Alcohol-Cetona. Puente de tinción. Asa bacteriológica o hisopo. Piceta o Frasco lavador. Muestra bacteriana sólida (agar), líquida (caldo) o especímen clínico. Extensión y fijación de la muestra Después de llevar la lámina al puente de tinción Cubrir la preparación con Cristal Violeta por 60 segundos y enjuagar suavemente con agua destilada. 47 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 51. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA Cubrir la preparación con Lugol por 60 segundos y enjuagar suavemente con agua. Cubrir la preparación con Alcohol-Cetona durante algunos segundos (5-10) y enjuagar suavemente con agua. Cubrir la preparación con Safranina por 30 segundos y enjuagar suavemente con agua. Secar y Observar en 100x (inmersión). Es conveniente secar el exceso de agua en el frotis cuidadosamente con un paño suave o papel desechable para proceder a la observación al microscopio empleando el objetivo de inmersión Bacterias Gram Bacterias Gram Negativas Positivas 48 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 52. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA TINCIÓN DE GRAM MORFOLOGÍA BACTERIANA Estafilococos Grampositivos Diplococos Gramnegativos Estreptococos Grampositivos Cocobacilos Gramnegativos Bacilos Grampositivos Espirilos Levaduras Espiroquetas 49 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 53. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA Diplococos Grampositivos Vibrios Cápsula Esporas Otras Tinciones Bacteriológicas Simple, que emplea un solo colorante Compuesta o múltiple como el Gram, Ziehl Neelsen Especial para visualizar algunas estructuras bacterianas: Gray para flagelos Argéntica para flagelos Tinta China para cápsulas Anthony para cápsulas Albert para gránulos metacromáticos Schaeffer-Fulton para esporas Bacilos Ácidos Alcohol Resistentes Fontana-Tribondeau para espiroquetas. 50 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 54. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA 51 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 55. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA COLORACIÓN DE BACTERIAS ÁCIDO ALCOHOL RESISTENTES (BAAR) Los microorganismos pertenecientes al género Mycobacterium se caracterizan por tener una pared celular completamente diferente a las restantes Eubacterias. La pared de las Mycobacterias posee un alto contenido de lípidos que la hace impermeable a los agentes hidrofílicos, por lo tanto estos microorganismos no se tiñen adecuadamente con los reactivos utilizados en la coloración de Gram y no pueden ser clasificados como Gram positivos o negativos. Las Mycobacterias son teñidas adecuadamente por el método de Ziehl-Neelsen (Tinción Ácido-Rápida o Acid-Fast Stain) que utiliza como solución decolorante una mezcla de etanol y ácido clorhídrico. Estos microorganismos una vez coloreados son resistentes a la decoloración ácido-alcohólica y por eso se denominan Bacilos Ácido Alcohol Resistentes (BAAR). Los microorganismos del género Mycobacterium contienen una membrana citoplasmática formada por una bicapa lipídica similar a las restantes Eubacterias. Por encima de esta membrana se encuentra el rígido Peptidoglicano que contiene N-glucolilmurámico en lugar de N-acetilglucosamina. Por medio de una unión fosfodiéster, el peptidoglicano se halla unido covalentemente al Arabinogalactano, un polímero de arabinosa y galactosa. En la porción más distal y externa de los arabinogalactanos se hallan fijados los ácidos micólicos que tienen cadenas carbonadas largas (C60 a C90). Los glucolípidos son un grupo de compuestos (micolatos de trealosa, sulfolípidos, micósidos, etc) que se encuentran asociados no covalentemente a los ácidos micólicos y se ubican periféricamente en la pared. Los micolatos de Trehalosa (llamados factores de cordón porque su presencia produce cultivos que tienen forma de cordones serpenteantes) y sulfolípidos se encuentran principalmente en las cepas de Mycobacterias más virulentas. El Lipoarabinomanano (LAM) es un compuesto que se halla anclado en la membrana citoplasmática. El LAM es considerado como el equivalente Mycobacteriano del lipopolisacárido de las Gram negativas debido a que provoca una importante respuesta antimicrobiana en macrófagos. 52 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 56. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA En las cepas de Mycobacterias más virulentas la arabinosa terminal del LAM está recubierta con residuos de manosa (manLAM) a diferencia de las cepas no virulentas no están recubiertas (AraLAM). Además, el LAM también podría servir como poro para el paso de los nutrientes a través de la pared celular. En la pared celular también se encuentran proteínas inmunoreactivas que son utilizadas con fines diagnósticos (PPD). El Mycobacterium tuberculosis es el agente etiológico de la tuberculosis, una enfermedad que primariamente produce lesiones en los pulmones y que puede causar la muerte si nos es tratada en forma adecuada. Existen otras Mycobacterias capaces de producir infecciones en el hombre. El M. bovis también causa tuberculosis, mientras que las infecciones producidas por M. avium, M. kansakii, M. fortuitum y M. chelonei son consideradas oportunistas y no tuberculosas. La lepra es una infección causada por el Mycobacterium leprae que es un parásito intracelular obligado que se multiplica lentamente en células fagocitarias mononucleares como los histiocitos de la piel y en las células de Shwan de los nervios. La tuberculosis es una enfermedad de distribución mundial pero con consecuencias devastadoras en los países en desarrollo. En el año 1993 la Organización Mundial de la Salud (OMS - WHO World Health Organization) declaró a la tuberculosis una "Emergencia Global". Se estima que un tercio de la población mundial está infectada con el M. tuberculosis, y que en la próxima década serán infectadas más de 300 millones de personas de las cuales 90 millones desarrollarán la enfermedad y 30 millones morirán por ella. Micrografía Electrónica del Mycobacterium tuberculosis 53 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 57. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN FUNDAMENTO ► La capacidad de formar complejos coloreados con los derivados de trifenilmetano que resiste la acción del etanol-ácido (ácido-alcohol resistente), es propiedad característica de las Micobacterias. MUESTRAS ► Expectoración (esputo). Se requiere de 2 muestras. El envase debe ser de boca ancha y de material descartable. Tendrá cierre hermético (tapa rosca) para evitar aerosoles. Su capacidad será de 30 – 50 ml y de paredes rotulables. ► Lavado Gástrico. Se requiere 3 muestras. Utilizar envases de 50 – 100 ml. Se extraerá por sondeo gástrico bucal o nasal. ► Lavado Bronquial. Por Broncoscopía. ► Orina Se requiere 3 muestras. Recolección de toda la orina de la mañana previa higiene. Envase 300 – 500 ml. Boca ancha. ► Líquido Cefalorraquídeo. Recoger la muestra sin anticoagulante en un envase estéril. Se recomienda cultivar inmediatamente. ► Otros Líquidos de punción y pus. Son líquidos recogidos en forma estéril Se recomienda cultivar inmediatamente. OBSERVACIÓN DE LA MUESTRA ► Toda muestra se debe procesar inmediatamente. ► Se puede conservar en refrigeración (2-8ºC) durante 7 días. MATERIALES REACTIVOS ► Microscopio. ► Fucsina básica ► Laminas portaobjetos nuevos. ► Azul de metileno ► Aplicadores o palitos de madera. ► Fenol al 5% ► Mechero. ► Ácido clorhídrico ► Lápiz para marcar vidrio. ► Alcohol de 95. 54 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 58. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA METODO 1 2 Nunca tome muestras de esputo dentro de la clínica o laboratorio. Es más seguro tomar las muestras fuera de éstos. 3 4 AREA 1 ¡Las mascarillas quirúrgicas no Un espacio bien iluminado con un evitan el lavabo o tarja con agua corriente contagio de para preparación y tinción de los TBC! extendidos, 5 AREA 2 Una mesa para microscopio; de no haber electricidad, esta mesa debe colocarse directamente enfrente de una ventana, y 6 AREA 3 Una mesa para registrar resultados y almacenar portaobjetos. 7 Recolección de muestras 8 Rotular los envases de las muestras sobre la mesa de trabajo. 9 Para una mejor detección de los bacilos de la tuberculosis, se recomienda tomar tres muestras. Por lo menos una debe ser “la primera muestra de la mañana”. 55 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 59. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA 10 11 Enumerar las láminas portaobjetos con un lápiz para marcar vidrio en el tercio proximal de la lámina. En los 2/3 distales se realizará el extendido. Siempre lávese las manos con agua y jabón Después de manejar muestras y recipientes. 12 Abra despacio el recipiente, esto evita La producción de aerosoles. Dividir un aplicador de madera en dos Y tomar parte de la muestra eligiendo Un aplicador de Madera Aquella de características Mucopurulentas. Con el aplicador, extender la muestra Tomada sobre el portaobjetos con un Un Asa Movimiento de vaivén hasta lograr un Equilibrio homogéneo. 13 NO LOS FLAMEE para inducir el secado. Esto también produce aerosoles. Ya secos, fije los portaobjetos usando La llama azul de un mechero Bunsen. Con pinzas, y con el extendido hacia arriba, Pase brevemente el portaobjetos a través De la llama 3 veces. 14 Colocar sobre el soporte de coloraciones La lámina fijada. Cubrir la totalidad de la Superficie del extendido con el colorante Fucsina básica fenicada previamente filtrada. Flamear el frotis con la llama de un hisopo De algodón embebido en alcohol por tres Veces consecutivas, hasta que se observe La emisión de vapores. Se debe cuidar que El calentamiento sea suave y que no se Produzca la ebullición del colorante. Si el Volumen del colorante disminuye se debe Agregar más para cubrir el extendido. El Tiempo mínimo de coloración con fucsina Es de 5 minutos. 56 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 60. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA 15 Lave suavemente el colorante de Cada portaobjetos con agua corriente Fría hasta que toda la tinción libre Quede lavada. Siempre lave Suavemente de manera que el Extendido no se barra del portaobjetos. 16 Incline individualmente cada Portaobjetos para drenar todo el Exceso de agua. Esto evita que quede Agua remanente sobre el portaobjetos Que pueda diluir el próximo reactivo. Cubra cada portaobjetos con la Solución decolorante, tal como Alcohol ácido y manténgalo sobre el Portaobjetos durante 3 minutos. 17 18 Lavar con agua corriente y a baja presión. Vuelva a enjuagar con un leve chorro Cubrir el portaobjetos con la solución de de agua e incline cada portaobjetos Azul metileno la que se dejará por un minuto hasta drenar el exceso de agua. 19 Dejar secar a temperatura ambiente. Realizar la lectura en un microscopio con Lente de inmersión, leyendo de izquierda a Derecha un mínimo de 100 campos útiles Durante 5 minutos. Un campo útil es Aquel que contiene elementos celulares De origen bronquial leucocitos, fibras Mucosas y células ciliadas. 20 Después de examinar el portaobjetos detenidamente, Desmóntelo cuidadosamente de la platina del Portaobjetos. Verifique otra vez el número de Identificación del portaobjetos e inmediatamente Anote el resultado en el registro del laboratorio. 57 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 61. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA 21 Antes de examinar el próximo portaobjetos, limpie El lente de inmersión con el papel para limpiar Lentes; esto evita la transferencia de organismos Que pueden crear una lectura falsa positiva. INTERPRETACIÓN ► Los bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) aparecen teñidos de rojo Sobre un fondo de azul claro. INFORMES DE LOS RESULTADOS (-) No se encuentran bacilos ácido alcohol resistente (BAAR) en 100 campos microscópicos. (+) < 1 BAAR por campo en promedio, en 100 campos observados. (++) De 1-10 BAAR por campo, en 50 campos observados. (+++) > 10 BAAR por campo, en 20 campos observados. Si en un extendido se encuentra de 1 a 9 bacilos en 100 campos observados, observar 100 campos más. Si persistiera igual, realizar otro extendido eligiendo otra zona de la misma muestra. Proceder según los resultados encontrados. 22 Los bacilos de la tuberculosis Semejan delgados bastoncillos Rojos que resaltan contra el fondo Azul. Pueden ser un poco Encorvados granulados y Presentarse individualmente, en Pares o en grupos. 58 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 62. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PRACTICA N°05 ANÁLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO BACTERIANO SIEMBRAS OBJETIVOS - Aprender a inocular distintos medios de cultivo contenidos en tubo: caldo, agar inclinado y medio semisólido sembrado en profundidad. - Observar el crecimiento bacteriano en los distintos medios de cultivo. - Observar el crecimiento de microorganismos en ausencia de oxígeno. - Comprobar la movilidad de determinados microorganismos. MATERIAL Asa de siembra, hilo de siembra, pipetas Pasteur o pipetas graduadas, suspensión de microorganismos y tubos con medio de cultivo líquido, sólido inclinado y semisólido. TÉCNICA a) En medio líquido con asa: Transferir asépticamente, con el asa de siembra, una pequeña muestra de los microorganismos, desde el tubo que contiene el material problema al tubo con medio de cultivo estéril. Sumergir el asa en el líquido y agitar para desprender y diluir la muestra. Incubar el tubo recién sembrado en estufa, durante 24-48 horas a la temperatura óptima de crecimiento. 59 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 63. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA b) En medio líquido con pipeta: Introducir asépticamente la pipeta Pasteur o la pipeta graduada en el medio líquido que contiene los microorganismos y, aspirando de forma adecuada, sacar una cantidad establecida de material que se transfiere al tubo con medio de cultivo estéril. Incubar en estufa durante 24-48 horas a la temperatura más adecuada. c) En medio sólido (agar inclinado): Con el asa de siembra estéril tomar los microorganismos de la muestra e inocular el tubo realizando un movimiento de zig-zag en la superficie. El proceso se inicia en el fondo y se va avanzando hacia arriba por el área inclinada. Incubar en estufa durante 28-48 horas a la temperatura más adecuada. TRIPLE AZUCAR HIERRO LISINA HIERRO AGAR 60 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 64. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA d) En medio semisólido: La siembra en este tipo de medio, que contiene una proporción menor de agar que los medios sólidos y que se envasa en tubos, se lleva a cabo con un hilo de siembra esterilizado, con el cual se toma la muestra. El medio queda inoculado al introducir el hilo en profundidad hasta el fondo del tubo, retirándolo posteriormente por la misma trayectoria utilizada al realizar la picadura. Una siembra con asa o con un cierto movimiento de vaivén podría originar un patrón de crecimiento que se interpretaría erróneamente como movilidad bacteriana. Incubar durante 24-48 horas a la temperatura óptima de crecimiento. Prueba de Movilidad en Agar Semisólido 1. Microorganismo Móvil 2. Microorganismo Inmóvil 3. Tubo Control sin Inocular 61 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 65. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA RESULTADOS a y b) En los cultivos líquidos no tiene lugar la formación de colonias, por lo tanto se examinará la existencia de enturbiamiento más o menos intenso, la formación de una película o velo sobre la superficie, la aparición de sedimento en el fondo del tubo, etc. La utilización de medios de cultivo líquidos permite la obtención de una población microbiana grande, con un elevado número de microorganismos, para ser utilizados posteriormente. GRAFIQUE LO OBSERVADO c) En medio sólido (agar inclinado) se observará el aspecto general del medio y la aparición de crecimiento sobre su superficie. Este tipo de siembra permite el cultivo de microorganismos aerobios o anaerobios facultativos. Además, se utiliza para almacenar cultivos durante cortos períodos de tiempo, a temperaturas de 4ºC. d) En medio semisólido se podrá comprobar si el microorganismo es o no móvil, ya que en el primer caso se observará que el crecimiento difunde alrededor de la zona donde se hizo la picadura, detectándose turbidez. Por eso es tan importante que, al inocular el medio de cultivo, no se distorsione el agar y se vuelva a sacar el hilo por el mismo sitio de inoculación. Los microorganismos inmóviles crecerán únicamente a lo largo de la picadura. Este tipo de siembra en picadura sirve, también, como otro de método de conservación de microorganismos anaerobios facultativos. 62 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 66. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA INOCULACIÓN DE DISTINTOS MEDIOS DE CULTIVO DESARROLLO BACTERIANO EN CALDO DE CULTIVO DESARROLLO BACTERIANO EN TUBOS CON AGAR INCLINADO 63 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 67. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS INTRODUCCIÓN En la naturaleza, la mayoría de los microorganismos no se encuentran aislados, sino integrados en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos axénicos o puros. Un cultivo axénico o puro es aquel que contiene un sólo tipo de microorganismo y que procede generalmente de una sola célula; el crecimiento de ésta origina, en medio sólido, una masa de células fácilmente visible que recibe el nombre de colonia. Para obtener cultivos axénicos o puros a partir de una población microbiana mixta, se utilizan las denominadas técnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio, Lister utilizó diluciones seriadas en medio líquido con esta finalidad, pero la presencia de contaminación, es decir, de microorganismos no deseados, dificultó el aislamiento. La escuela de Robert Koch introdujo los medios sólidos, complementados con agar, y las placas de Petri en Bacteriología, permitiendo así la separación física de las colonias sobre la superficie del medio de cultivo o en el interior del mismo. El aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas especies microbianas. OBJETIVOS - Familiarizarse con el manejo de microorganismos y con las técnicas de aislamiento en placa de Petri. - Obtener colonias separadas, utilizando uno o más métodos. - Estudiar la morfología de cada colonia. MATERIAL Asa de siembra, cayado, placas de Petri con medio de cultivo sólido y cultivo de microorganismos. TÉCNICAS Existen distintas técnicas que pueden ser usadas: a) Extensión en superficie con cayado: Depositar sobre la superficie de una placa con agar nutritivo una gota ó 0,1 ml de una determinada dilución del cultivo de microorganismos problema y extenderlo con ayuda del cayado, previamente esterilizado, en todas las direcciones hasta que esté completamente seco. Incubar la placa, en posición invertida, a la temperatura deseada (durante 24, 48 ó 72 horas) según el tipo de microorganismo. La posición invertida evitará que el agua de condensación se deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtención de colonias aisladas. Es una técnica usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente el volumen de muestra sembrado. 64 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 68. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA EXTENSIÓN EN SUPERFICIE CON CAYADO 65 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 69. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA b) Estría múltiple en superficie: Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un área pequeña de la superficie de la placa con agar nutritivo, en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no dañar el agar. Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estría. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en posición invertida. Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado número de bacterias. c) Dilución en masa: En una placa de Petri vacía se deposita un pequeño volumen conocido de muestra y a continuación se añade el medio de cultivo (agar nutritivo) fundido y atemperado aproximadamente a 45ºC. Se mezclan ambos por rotación suave de la placa. De esta forma los microorganismos se distribuirán de forma homogénea en el medio de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar. Otra variación de esta técnica consiste en inocular el medio de cultivo, fundido y atemperado, contenido en un tubo, con un determinado volumen de la muestra. La homogeneización de la muestra y el medio de cultivo se realiza por rotación del tubo entre las manos, antes de verterlo sobre la placa. En ambos casos, tras homogeneización, se dejan enfriar las placas hasta que se solidifique el medio y posteriormente se incuban a la temperatura adecuada (siempre en posición invertida). Aunque con esta técnica se obtienen colonias aisladas, generalmente sólo se utiliza para determinar el número de microorganismos viables en una muestra, cuando éstos son anaerobios facultativos o microaerófilos. 66 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 70. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA INTERPRETACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE SIEMBRA a) Extensión en superficie: Tras el período de incubación se examinarán las placas. Las colonias aparecen sobre la superficie, distribuidas uniformemente si la siembra se ha realizado de forma correcta. Podrán diferenciarse las colonias de acuerdo a su tamaño, forma, color, textura, etc. Esta técnica de siembra, además de permitir que se distingan las colonias por su morfología, permite el recuento de microorganismos viables. La expresión de este recuento se hace en “unidades formadoras de colonias” (UFC) ya que cada una procede de un sólo microorganismo (o de un grupo de microorganismos, pues en algunos casos éstos tienden a formar agregados). A partir de las colonias aisladas, los microorganismos pueden transferirse a otros medios de cultivo para su estudio. b) Por estría múltiple en superficie: Tras la incubación, se observarán las colonias aisladas en alguna región de la placa inoculada. Con esta técnica se logra la separación de los microorganismos que se encuentran en un cultivo mixto, o bien que proceden de muestras homogéneas, pero en las que existe un elevado número. En las zonas donde existen colonias aisladas se puede estudiar la morfología colonial. c) Dilución en masa: Aparecen las colonias distribuidas por toda la masa del agar. Aquellas que están en la superficie tendrán distintas características, dependiendo del tipo microbiano, mientras que las colonias que se desarrollan en el interior, bajo la superficie del agar, tienen forma lenticular, aunque los microorganismos que formen las distintas colonias sean de distinto tipo. Por tanto, las colonias que aparecen en la profundidad del agar son siempre biconvexas y no se diferencian unas de otras por su morfología. 67 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 71. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA ESTRÍA MÚLTIPLE EN SUPERFICIE 2 Esterilizar el aro o aguja de siembra sometiéndolos directamente a la acción de la llama 1 de un mechero Bunsen Seleccionar aro o aguja de siembra 3 4 6 5 7 68 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 72. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA DILUCIÓN EN MASA 1 2 3 5 4 6 7 ASPECTOS MÁS COMUNES DE LAS DIVERSAS COLONIAS MICROBIANAS AISLADAS SOBRE MEDIO SÓLIDO. 69 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 73. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PRACTICA N°06 METABOLISMO BACTERIANO INTRODUCCIÓN Los microorganismos durante la actividad metabólica realizan una serie de acciones bioquímicas. De las diferentes reacciones obtienen la energía que se consume en síntesis, crecimiento y otras actividades. El objeto de esta práctica es hacer conocer al alumno algunas de las reacciones principales que se utilizan para reconocer, diferenciar e identificar los productos formados por microorganismos durante su metabolismo: ácidos, productos de putrefacción, toxinas, enzimas, etc. I. ACCIÓN SOBRE LOS HIDRATOS DE CARBONO Las bacterias pueden utilizar diferentes tipos de hidratos de carbono, desde polisacáridos (almidón, celulosa) hasta monosacáridos (pentosa – xilosa, hexosa – glucosa) produciendo diversos tipos y cantidades de ácidos. La fermentación de carbohidratos, se basa en que muchas especies de microorganismos actúan sobre el substrato hidrocarbonato, produciendo la acidificación del medio, el cual se detecta por cambio de pH (con el indicador) y la presencia de gas (CO2 e H2) por la presencia de burbujas o rotura del medio de cultivo. MATERIALES - Cultivo de microorganismos en medio semisólido con lactosa e indicador de pH, incubado a 37° . por 18 – 24 horas. C - Cultivo de microorganismos en medio semisólido con glucosa e indicador de pH, incubado a 37° . por 18 – 24 horas. C PROCEDIMIENTO Observar los cultivos presentados y notar los cambios producidos en el medio de cultivo. Producción de ácidos y acetil metil carbinol a) Prueba del rojo de metilo Esta prueba es cuantitativa para la producción de ácidos formados por microorganismos que utilizan principalmente la vía de fermentación mixta, con producción de ácido láctico, formico, acético y mantiene el pH por debajo de 4,4, luego de una incubación prolongada (48 – 72 horas) contrarrestando el sistema estabilizador del medio MR – VP. Algunos microorganismos que degradan la glucosa, tienen la capacidad de formar ACETIL METIL CARBINOL (acetoína). 70 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 74. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA La acetoína es un subproducto neutro de la vía del butilenglicol. En la practica se detecta la acetoína utilizando hidróxido de potasio al 40%, el cual es presencia de oxigeno atmosférico se convierte en DIACETILO y el alfa naftol actúa como catalizador para revelar un complejo rojo. MATERIALES - Cultivo de bacterias sembradas en tubo con medio MR – VP. - Reactivo de rojo de metilo. - Reactivos de hidróxido de potasio y alfa naftol. PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS a) Para la prueba de rojo de metilo, añadir en el cultivo de 48 – 72 horas, unas gotas del indicador pH que es el rojo de metilo, cuyo rango de viraje está entre pH 4,4 (ROJO) y pH 6,0 (AMARILLO). Prueba positiva: color rojo estable en la superficie del medio. Prueba negativa: Incoloro, amarillo o naranja. b) Para la prueba de Voges – Proskauer, añadir al cultivo de 18 – 24 horas, 0.6 mL (12 gotas) de alfa naftol al 5% y 0,2 mL (4 gotas) de KOH al 40%. Agitar el tubo por un minuto y dejarlo en reposo por 15 minutos. Es esencial añadir los reactivos en el orden señalado. Prueba positiva: color rojo dentro de los 15 minutos (colocados en la mitad superior o en todo el tubo). Prueba negativa: ausencia del color rojo. Es importante que la lectura no se realice después de una hora, porque los cultivos de VP pueden presentar un color cobrizo dando una interpretación falsa positiva. II. ACCIÓN SOBRE LAS PROTEÍNAS a) Producción de sulfuro de hidrógeno (H2S) Su liberación ocurre por la acción enzimática de ciertos microorganismos sobre la peptona, polipéptidos y aminoácidos como la cisteina, metionina, cistina que contienen azufre. Para su comprobación se puede hacer en medios sólidos o semisólidos a base de peptonas e indicador (acetato de plomo, por ejemplo) y en contacto con éste, se produce sulfuro de plomo, dando un precipitado de color negro, en la superficie y puntura de siembra. PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS Observar los cultivos sembrados en agar peptona – subacetato de plomo compararlos con el tubo de control. Prueba positiva: se manifiesta por la aparición de un precipitado de color negro insoluble en la superficie y puntura de siembra. 71 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 75. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA b) Producción de indol Ciertas bacterias tienen la capacidad de desdoblar la molécula de aminoácido triptófano (presente en la peptona) mediante un complejo sistema de enzimas aminolíticas dando lugar a ácido pirúvico, amoníaco y metabolitos: Indol, escatol e indolacético, productos de putrefacción. El indol se detecta en el medio observándose el desarrollo del color rojo (en forma de anillo) luego de añadir un reactivo que contiene p- dimetilamino benzaldehido (reactivo de Ehrlich o Kovac). El alcohol amílico empleado como diluyente en el reactivo de kovac extrae suficientemente el indol del medio acuoso para producir una reacción positiva. MATERIALES - Cultivo de la bacteria en caldo peptona. - Reactivo de Kovac. PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS Añadir 5 gotas del reactivo de Kovac por las paredes del tubo al cultivo de 18 – 24 horas. Prueba positiva: desarrollo de un color rojo vivo en forma de anillo en la superficie del tubo. Prueba negativa: se forma un anillo del color del reactivo. III. HIDRÓLISIS DE LA UREA Muchas especies de microorganismos poseen la enzima ureasa, la cual actúa hidrolizando la urea con la formación de amoniaco y dióxido de carbono. Estos reaccionan en solución para formar carbonato de amonio que alcaliniza el medio. Este efecto se manifiesta debido a la presencia de un indicador de pH que es el rojo de fenol cuyo rango de viraje está entre pH 6,8 (amarillo) y 8,4 (rojo) incluido en el medio de urea de Christensen. MATERIAL - Cultivo de la bacteria sembrado en agar de urea de Christensen. PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS - Observar los cultivos sembrados en el medio de urea de Christensen, incubados a 37° . por 18 – 24 horas. C - El carbonato de amonio producido en una reacción positiva, confiere reacción alcalina al medio, lo cual se demuestra por el viraje del indicador del pH (rojo de fenol) a rosado. 72 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 76. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA IV. UTILIZACIÓN DEL CITRATO Algunas bacterias pueden obtener energía por vía distinta de la fermentación de hidratos de carbono, utilizando el citrato como única fuente de carbono. La prueba de utilización del citrato (en el medio de Citrato de Simmons) es positiva si hay viraje del medio hacia el color azúl o si se nota desarrollo aunque no haya viraje de color. MATERIAL - Cultivos de bacterias en medio de agar citrato de Simmons. PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS Observar los cultivos sembrados en agar citrato de simmons, incubado a 37° por C 18 -24 horas. Prueba positiva: color azul en 24 a 48 horas y crecimiento en la superficie del medio. Prueba negativa: no hay cambio de color ni crecimiento. V. PRODUCCIÓN DE TOXINAS - Acción de la Hemolisina Algunos microorganismos elaboran una serie de enzimas y sustancias tóxicas que ayudan al poder invasivo por cuanto lesionan el mecanismo de defensa del huésped. La actividad hemolítica de enzimas que actúan en cultivos sobre placas de agar sangre y causan la lisis completa de los eritrocitos, se denomina: beta hemólisis y la que produce la destrucción parcial de los glóbulos rojos: alfa hemólisis MATERIAL - Placa con bacteria beta hemolítica sembrada en agar sangre. PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS Observar la presencia de beta hemólisis en el cultivo bacteriano sembrado en la mitad de la placa con agar sangre de carnero, con aclaración total del medio alrededor de la colonia. 73 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 77. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA UTILIZACIÓN DEL CITRATO: Agar citrato de simmons En la figura aparecen de izquierda a derecha: Tubo sin inoculación de bacterias, resultado Negativo y resultado positivo a la derecha. ACCIÓN DE LA HEMOLISNAS 74 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 78. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA ACCIÓN SOBRE LOS HIDRATOS DE CARBONO TRIPLE AZUCAR HIERRO NUMERO DE TUBO 1 2 3 4 5 Desaminación de los aminoácidos (Reacción alcalino + + + + + aerobio.) Fermentación de la glucosa (Reacción ácida de menor – + + + + importancia.) Fermentación de la lactosa y/o de la sacarosa (Reacción ácida – – – + + importante.) Producción del H2S (color negro) – – + – + Gas – – – + + C: tubo control 75 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 79. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA LISINA HIERRO AGAR NUMERO DEL TUBO 1 2 3 4* Desaminación de aminoácidos + + + + (Reacción alcalino aerobio.) Desaminación de la Lisina – + – – (pico de flauta rojo oscuro) Descarboxilación de la Lisina – – + + (Reacción alcalino anaerobio.) Fermentación de la glucosa + + + + (Reacción ácida) H2S – – – + C: tubo control 76 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 80. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PRODUCCIÓN DE INDOL En la figura aparecen de izquierda a derecha: Tubo sin inoculación de bacterias, resultado Negativo y resultado positivo a la derecha. Producto de la degradación Del Aminoácido triptófano PRUEBA DE LA UREASA Detecta presencia de la Enzima ureasa Hidrólisis de la urea libera Amoniaco PRUEBA DE LA MOVILIDAD Movilidad positiva Sin inocular Movilidad negativa 77 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 81. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PRUEBA DEL ROJO DE METILO En la figura aparecen de izquierda a derecha: Tubo sin inoculación de bacterias, resultado Negativo y resultado positivo a la derecha. Producción de ácidos a partir de la glucosa. PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER En la figura aparecen de izquierda a derecha: tubo sin inoculación de bacterias, resultado negativo y resultado positivo a la derecha. Producción del acetil-metilcarbinol ó acetoína Complejo rojo com alfa naftol y creatina. 78 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 82. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA - Microbiology. Davis B, Dulbecco R, Eisen H, Gisnberg H 4th Edition 1984. Harper & Row Pub. - Microbial Life Perry J, Staley JT, Lory S. Sinauer Ass Publishers Inc. MA. 2002. - Ecología microbiana y Microbiología ambiental Atlas R M, Bartha R Pearson Educación. Madrid, 4a ed. 1998. - Microbial ecology and infectious disease Rosenberg E ed. ASM Press. Washington . 1999. - Biología de los microorganismos. Brock T D, Madigan M T, Martinko J M, Parker J. 8° Ed, Prentice Hall Madrid, 1999. - Zinsser. Microbiología. Joklik W K, Willett H P, Amos D B, Wilfert C M. 20° edición. Panamericana. 1996. - Microbes in action: A laboratory Manual of Microbiology. Seeley H W, Vanderrmark P J, Lee J, Freeman W H. 4th edition 1991. - General Microbiology. Schlegel H G 7th edition Cambridge University Press UK 1997. - Bacteria in Biology, Biotechnology and Medicine. Singleton J. 3rd Edition Ed. Wiley & Sons, USA. 1995. - Encyclopedia of Microbiology. Lederberg J. Academic Press, Inc. USA. 1992. - Microbiología en Práctica Vullo D L, Wachsman M B, Alché L E Editorial Atlante S.R.L. Buenos Aires, 2000. - Introducción a la Microbiología Tortora G J, Funke B R, Case C L. Editorial Acribia SA, Zaragoza España, 1993. - Diagnostic Microbiology Koneman E W, Allen S D, Janda W M, Schreckenberger P C, Winn W C Jr. 5 th Edition, Lippincott, Philadelphia, 1997. - Antibiotics in Laboratory Medicine Lorian, Victor Editor, Williams & Wilkins, Baltimore USA, 1980. - Inmunología e Inmunoquímica Margni R A, 5°edición Editorial Médica Panamerican a 1996. - Inmunología. Fundamentos Roitt, I M, Delves, P J, 10a Edición, Editorial Médica Panamericana, 2003. - Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de Importancia Clínica MacFaddin 3ra Edición, Editorial Médica Panamericana, 2003. 79 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 83. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA ANEXO I: FLORA MICROBIANA DEL CUERPO HUMANO NORMAL 80 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 84. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA FLORA MICROBIANA DEL CUERPO HUMANO NORMAL Los seres humanos son bombardeados de forma constante por las miríadas de microorganismos que ocupan el medio ambiente. Sin embargo, por fortuna los seres humanos no constituyen un hábitat favorable para la mayoría de estos saprófitos porque deben competir con la flora comensal ya adaptada al medio humano. Los microorganismos que constituyen la flora normal deben superar las barreras para la colonización producidas por el flujo de jugos corporales, la depuración mucociliar y mecanismos inmunitarios locales. Además, la persistencia de varios microorganismos en sus nichos específicos puede depender de su unión a las células del huésped en esas áreas. La piel. Conjuntivas Nariz y nasofaringe. Boca y orofaringe. Tracto intestinal - Estómago e intestino delgado. - Intestino grueso. Tracto genitourinario - Genitales externos y uretra anterior. - Vagina. Sangre y tejidos. FLORA NORMAL PREDOMINANTE EN DIFERENTES SITIOS DEL CUERPO SITIOS DEL CUERPO FLORA MICROBIANA Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium, Piel. Propionibacterium, Micrococcus, Levaduras. Conjuntivas. Staphylococcus epidermidis. Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Nariz y nasofaringe. Streptococcus spp. S. epidermidis, Estreptococo no grupo A, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mitis, Boca y orofaringe. salivarius, Neisseria, Haemophilus, Veillonella, Bacteroides, Fusobacterium, Treponema, Lactobacillus, levaduras Lactobacillus, Streptococcus spp, Enterococcus, Tracto intestinal: intestino delgado. Veillonella, Actinomicetos, levaduras. Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium, Tracto intestinal: intestino grueso. Eubacterium, Bifidobacterium, Lactobacillus, Peptostreptococcus, Enterococcus, Enterobacterias. Corynebacterium, Estreptococos alfa y no hemolíticos, Staphylococcus epidermidis, Tracto genitourinario. Enterococcus, Lactobacillus, Mycobacterium smegmatis, Enterobacteriaceae, Bacteroides, Sangre y líquido cefaloraquídeo. Estéril. Tejidos, vejiga, útero y trompas de falopio, Estéril. oído medio, senos paranasales. 81 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 85. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA INFECCIONES NOSOCOMIALES SITIO DE INFECCIÓN PORCENTAJE AGENTES MÁS COMUNES Escherichia coli, Enterococcus, Proteus, Tracto urinario. 40% Klebsiella, Pseudomona aeruginosa. Staphylococcus aureus, Staphylococcus Herida Quirúrgica. 20% epidermidis, Escherichia coli. Klebsiella, Pseudomonas, Escherichia coli, Pulmonares. 10% Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus, Staphylococcus Bacteriemia primaria. 5 – 10% epidermidis, Bacilos G (-) Otras. 20 – 25% Staphylococcus aureus, Escherichia coli CONDICIONES DIVERSAS QUE COMPROMETEN LAS DEFENSAS DEL HUÉSPED Fármacos: inmunosupresores, antibióticos, anestésicos Alcoholismo Desnutrición Infecciones virales: influenza, sarampión, etc. Alteraciones de las barreras mucosas cutáneas normales Procedimientos iatrogénicos Prótesis: Catéteres intravenosos, sondas vesicales Aparatos de asistencia respiratoria: nebulizadores, respiradores, etc. 82 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 86. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA ANEXO II: FUNDAMENTOS E INTERPRETACIÓN DE AGARES Y CALDOS 83 Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 87. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA AGARES Y CALDOS ► La preparación debe cumplir con las exigencias indicadas por el fabricante. En el caso de medios comerciales se deben tener las características optimas (pH, control de esterilidad, vigencia). MEDIO DE TRANSPORTE MEDIO DE CARY-BLAIR: FUNDAMENTO ► Para la conservación y transporte de muestras de microorganismos patógenos, como Salmonella, Shiguella, Haemophilus, Estreptococos, Corynebacterium, con considerable conservación de la composición de la flora de gérmenes. ► La carencia de una fuente de nitrógeno impide considerablemente la multiplicación de gérmenes. La composición del medio garantiza una supervivencia suficientemente larga de los microorganismos. El medio goza de anaerobiosis. PREPARACION ► Disolver 12 grs. por litro y distribuir hasta aproximadamente 7 cms de altura en tubos con tapón de goma o cierre de rosca. Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121ºC, luego enfriarlos en posición vertical. pH final = 7.4 ± 2. USO ► Utilizar para el recojo del material a estudiar un hisopo de algodón estéril, eventualmente impregnado con una suspensión de carbón vegetal. ► Introducir el hisopo en el medio de transporte hasta la mitad de su longitud. Cerrar herméticamente el tubo y conservarlo en frió hasta su transporte. MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO CALDO SELENITO PROPOSITO Y COMPONENTES DIFERENCIALES ► El caldo Selenito se recomienda para el aislamiento de bacterias del género Salmonella en muestras como: heces, orina o aguas cloacales con abundante concentración de mixtura bacteriana. Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 88. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA ► El selenito de sodio es inhibidor de E. Coli y de muchos otros coliformes, incluyendo cepas de Shiguella. REACCIONES E INTERPRETACION ► Dado que los coliformes y otros organismos de la flora intestinal pueden en pocas horas superar el desarrollo de las especies patógenas, se recomienda subcultivar luego de 8 a 12 horas en Agar Salmonella-Shiguella o Sulfito de Bismuto. ► A las pocas horas de inocular la muestra, el caldo se enturbiará. ► Al sobrecalentar el Caldo durante la preparación, se producirá un precipitado visible que lo hace insatisfactorio para el uso. CALDO CEREBRO CORAZÓN (MEDIO BRAIN HEART INFUSION): FUNDAMENTO ► Este medio de cultivo se basa en el principio del caldo de Rosenow preparado con trozos de cerebro y es adecuado para el cultivo de muchas bacterias exigentes, como estreptococos, neumococos, meningococos y otros. ► El caldo cerebro–corazón es especialmente adecuado para el cultivo de estafilococos destinados al ensayo de la plasmocoagulasa y para la realización de hemocultivos. ► El rendimiento del caldo para gérmenes anaerobios o microaerófilos resulta decisivamente mejorado por la adición de pequeñas cantidades de Agar. (Aprox. 0.05 – 0.2 % ) PREPARACION ► Disolver 37 gramos por litro y esterilizar en autoclave (15 minutos a 121ºC) pH: 7.4 ± 0.2. ► El medio es ligeramente parduzco y con aspecto claro. AGUA DE PEPTONA: FUNDAMENTO ► Para el enriquecimiento previo y no selectivo. Se usa especialmente en enterobacterias patógenas a partir de alimentos y otros materiales. El enriquecimiento previo en este caldo conduce a mayores concentraciones enterobacterias patógenas, en especial si existen bacterias ligeramente dañadas. ► El Caldo es rico en sustancias nutritivas lo que provoca una alta cuota de sobrevivencia de bacterias ligeramente dañadas y un crecimiento intenso. Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 89. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA REACTIVOS Composición (1 litro) ► Peptona de carne 10.0 gr. ► Cloruro sódico 5.0 gr. ► Cloruro sódico 5.0 gr. ► Tampón de fosfato 10.0 gr. PROCEDIMIENTOS ► Sembrar el medio de cultivo con el material de muestra. ► Incubación: Aproximadamente 18 hrs. a 37ºC. ► A continuación se siembra en medios nutritivos de enriquecimiento selectivo. CALDO DE TIOGLICOLATO: FUNDAMENTO ► Para el cultivo y aislamiento de anaerobios estrictos y facultativos, de gérmenes microaerófilos y para ensayo de esterilidad. ► Las sustancias reductoras, tioglicolato y cisteína, proporcionan una anaerobiosis suficiente, incluso para anaerobios exigentes. ► Debido a sus grupos sulfhidrílicos, son inactivados los compuestos de arsénico, mercurio y de otros metales pesados por lo que los medios con tioglicolato son adecuados para la investigación de materiales que contengan materiales pesados. ► La elevada viscosidad del medio de cultivo impide la penetración rápida de oxigeno. El eventual aumento del nivel en oxígeno se manifiesta por un viraje a rojo del indicador. REACTIVOS ► Preparar del medio comercial 29 gr por litro, distribuir en tubos, esterilizar en autoclave 15 minutos a 121ºC y a un pH = 7.1. ± 0.2 ► Los medios de cultivo varían de un color amarillento hasta parduzco. ► De ser posible, estos medios de cultivo deben usarse recién preparados. ► El medio no puede utilizarse cuando presenten una coloración rosa en más del tercio superior de la altura del tubo debido a la penetración de oxigeno. Tampoco cuando dicha coloración no quede eliminada por la ebullición. PROCEDIMIENTOS DE SIEMBRA ► El material objeto de ensayo se siembra en profundidad en el medio de cultivo. A continuación puede superponerse una capa de aproximadamente 1 cm de altura de parafina estéril. Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 90. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA INCUBACION ► Varios días a temperatura según requiera el germen a investigar. INTERPRETACION ► Los gérmenes anaeróbicos crece en la parte inferior del tubo de cultivo. MEDIOS MEJORADOS DE AISLAMIENTO NO SELECTIVO AGAR CHOCOLATE: FUNDAMENTO ► La liberación de hemoglobina por el hematíe es producto de la acción del calor sobre el medio. El hematíe lisado por el calor aporta al agar chocolate, el factor X (hemina o hematina) que es termoestable y el factor V (NAD – Nicotinamida Adenina Dinucleótido) termolábil, factores que potencian el crecimiento de algunos gérmenes. PREPARACION ► Para su preparación se utiliza los agares base y sangre. ► Cuando los medios base se encuentren entre 60 a 80ºC, añadir la sangre y agitar frecuentemente manteniendo el medio de cultivo a aproximadamente 80ºC en baño María o estufa bacteriológica durante unos 10 minutos hasta que adquiera un color pardo o “achocolatado”. UTILIZACION ► Para el desarrollo de bacterias del género Neisseria, Haemophilus, cocos gram positivos, etc. INTERPRETACION COLONIA MICROORGANISMOS Pequeñas, grises, traslúcidas, de bordes enteros o festoneados. A las 40 h visibles y opacos. Neisseria gonorrhoeae Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 91. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA INTERPRETACION COLONIA MICROORGANISMOS Pequeñas, transparentes, puntiformes (como rocío). Desarrollan alrededor de estría estafilocócica. Haemophilus influenzae Opacas, blanquecinas, a veces amarillentas y con bordes irregulares. Pueden encontrarse colonias mucosas. Neisseria. meninigitidis Medio sin inocular MEDIO BIFÁSICO (RUIZ CASTAÑEDA): FUNDAMENTO ► Medio de cultivo que consta de 2 fases; una sólida, la cual se deja solidificar en plano inclinado, después del cual se agrega 30 ml de fase líquida. PREPARACION ► Se reparte en frascos estériles de 100 mL de capacidad. Inicialmente se añaden 25 mL de fase sólida, la cual se deja solidificar en plano inclinado, después del cual se agrega 30 mL de fase líquida. Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 92. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PROCEDIMIENTO DE USO ► Se usa generalmente para hemocultivos y mielocultivos. Se siembra 10 mL de sangre en forma aséptica y se deja en incubación de 15 a 21 días a 37º C según sea el caso. Al cabo de 6 - 24 - 48 - 72 hrs., 4 – 7 - 15 y 21 días de incubación se realizan subcultivos en Agar Sangre y Agar Mac Conkey. INTERPRETACION Indican desarrollo bacteriano: ► Presencia de turbidez, Hemólisis. ► Indicios de presencia de gas. ► Presencia colonias sobre la superficie sólida. AGAR MUELLER HINTON: FUNDAMENTO ► Para el ensayo de la sensibilidad o para ensayos de resistencia de agentes patógenos médicamente importantes frente a antibióticos. ► Se utiliza para la realización del ensayo de disco difusión en placas. ► La composición de este medio de cultivo garantiza condiciones favorables de crecimiento y además esta libre de antagonistas de sulfamidas. ► Para mejorar de forma considerable el crecimiento de microorganismos exigentes, puede añadirse sangre. Esto puede sin embargo conducir a resultados erróneos en el ensayo de enterococos frente a aminoglicósidos. AGAR NUTRITIVO – CALDO NUTRITIVO ► Medios universalmente utilizados para el cultivo de microorganismos poco exigentes. ► Se puede utilizar el caldo nutritivo como medio de enriquecimiento excelente para Listeria monocytogenes, añadiendo 0.05% de telurito potásico. EMPLEO E INTERPRETACION ► Se orientan según los fines de utilización previstos. Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 93. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA AGAR SANGRE: FUNDAMENTO ► Producto preparado con un medio base completo de gran calidad nutritiva. ► El cultivo de microorganismos incluye los exigentes. ► ► El medio base puede ser agar columbia, agar mueller, agar tripticase soya y agar sangre base. ► ► Para la determinación de los tipos de hemólisis es adecuado añadir sangre de carnero, recién obtenida y desfibrinada. PREPARACION ► Preparar cualesquiera de los medios base, esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121ºC. Dejar enfriar y cuando se encuentre entre 45–50ºC incorporar de 5-8% de sangre desfibrinada. Mezclar y luego verter en las placas. Obtener un pH= 6.8. ± 0.2. RESULTADO ► Los medios óptimos son color sangre, no debe haber hemolizados. Se guardarán entre 2-8ºC. ► Las placas de agar sangre preparadas y listas para el uso son utilizables durante 3 meses como máximo. UTILIZACION ► La siembra de las muestras biológicas a investigar se realizan por diferentes métodos ► Es este medio desarrollan casi todas las bacterias heterótrofas y se aprecia muy bien la hemólisis Alfa o Beta. INTERPRETACION COLONIA MICRORGANISMOS Blanquecina con halo verdoso Streptococcus viridans estrecho S. faecalis Crateriforme con halo verdoso Streptococcus pneumoniae Blanquecino con halo Streptococcus pyogenes transparente, 2 ó 3 veces el Algunos S. faecalis y todo diámetro de la colonia. estreptococo hemolítico. S. Faecalis Falta de hemólisis. Estreptococos no patógenos. Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 94. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA AGAR TRIPTICASA SOYA: FUNDAMENTO ► Este medio es generalmente utilizado con sangre ú otros medios enriquecidos para el aislamiento y cultivo de diversos microorganismos exigentes. ► Cuando se añade sangre, el medio es adecuado para determinar reacciones hemolíticas. ► Cuando el medio es preparado para chocolate, soporta el crecimiento de bacterias del género Neisseria, Haemophilus y otros microorganismos. ► En una baja concentración de oxigeno, bacterias del género Clostridium y de gérmenes anaerobios no esporulados crecen. MEDIOS DE AISLAMIENTO SELECTIVO AGAR MC CONKEY PROPOSITO Y MEDIOS DIFERENCIALES ► El agar Mac Conkey es un medio diferencial para la selección y recuperación de enterobacterias y bacilos Gram negativos entéricos relacionados. ► Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de bacterias gram positivas y de algunos Gram negativos exigentes. ► La lactosa es el único hidrato de carbono. ► Las bacterias fermentadoras de lactosa forman colonias de diferentes tonos de rojo debido al viraje del indicador rojo neutro (rojo a pH < de 6.8) por la producción de ácidos mixtos. Las colonias no fermentadoras de lactosa aparecen incoloras o transparentes. REACCIONES E INTERPRETACION ► Los fermentadores fuertes de lactosa forman colonias rojas rodeadas de una zona de bilis precipitada, tales como: E. Coli, Klebsiella y Enterobacter. ► Los fermentadores débiles o lentos de lactosa, tales como Citrobacter, Providencia, Serratia o Hafnia pueden formar colonias incoloras a las 24 horas o ligeramente rosadas a las 48 horas. Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 95. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA ► Las colonias de Proteus, Edwardsiella, Salmonella y Shiguella, con raras excepciones son incoloras o transparentes. LACTOSA POSITIVO LACTOSA NEGATIVO AGAR MANITOL SALADO: FUNDAMENTO ► Es un gran medio selectivo para la demostración de estafilococos patógenos en alimentos y otros materiales. ► Debido a la concentración extremadamente alta de sal, permite solo el crecimiento de microorganismos tolerantes a ella, entre otros, los del género Staphylococcus. La degradación del manitol, con formación de ácido, está notablemente correlacionada con la patogenicidad del germen en cuestión y sirve, por lo tanto, como indicativo de la presencia de Staphylococcus aureus. PROCEDIMIENTO ► La siembra se realiza en superficie, por estría. Debido al potente efecto inhibidor de este medio debe sembrarse masivamente. INCUBACIÓN ► Hasta 3 días a 37° C. INTERPRETACION COLONIA MICROORGANISMOS Con halo amarillo luminoso y Manitol – positivo: crecimiento intenso Stafilococcus aureus. Sin cambio de color: Crecimiento Manitol – negativo: Staphylococcus leve, casi siempre epidermis y otros. Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 96. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA AGAR SALMONELLA – SHIGUELLA (SS) PROPOSITO Y COMPONENTES DIFERENCIALES ► El Agar es un medio altamente selectivo, que inhibe el desarrollo de la mayoría de los coliformes y permite el crecimiento de especies de Salmonellla y Shigella en muestras ambientales y clínicas. ► La alta concentración de sales biliares y citrato de sodio inhibe a todas las bacterias Gram positivas y a muchas Gram negativas, incluyendo las coliformes. ► La lactosa es el único hidrato de carbono y el rojo neutro detecta la producción del ácido. ► El Tiosulfato de sodio es una fuente de azufre. ► Las bacterias que producen (H2S) se detectan, por el precipitado negro formado con el citrato férrico (relativamente insensible). REACCIONES E INTERPRETACION ► Las colonias fermentadoras de lactosa se tornan rojas. ► Raras cepas de Salmonella (cepas de Arizona) fermentadoras de lactosa, pueden simular Escherichia coli. ► El desarrollo de especies de Salmonella traduce colonias incoloras con centro negro debido, a la producción de H2S ► Las especies de Shiguella muestran Inhibición variable y sus colonias incoloras no presentan ennegrecimiento. SALMONELLA AGAR XILOSA LISINA DESOXICOLATO (XLD) PROPOSITO Y COMPONENTES DIFERENCIALES ► Las sales biliares en concentraciones relativamente bajas, hacen a este medio menos selectivo que otros. ► Puede haber producción de ácido a partir de tres hidratos de carbono y el rojo de fenol es el indicador del pH ► Las cepas de Salmonella enteritidis, forman colonias iniciales amarillas por utilización de xilosa y colonias tardías rojas por descarboxilación de lisina. Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 97. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA REACCIONES E INTERPRETACION ► La Escherichia coli, especies de Klebsiella y Enterobacter pueden utilizar más de un hidrato de carbono y formar colonias color amarillo brillante. ► Las colonias de muchas especies de Proteus son también amarillas. ► La mayor parte de Salmonellas forman colonias rojas, la mayoría con centro negro por el gas H2S. ► Los géneros Shiguella y Providencia y muchas especies de Proteus no utilizan ningún hidrato de carbono y forman colonias traslúcidas. SALMONELLA ► Las colonias de Citrobacter son amarillas con centro negro, las de muchas especies de Proteus son amarillas o traslúcidas con centro negro; las de Salmonella son rojas con centro negro. AGAR TCBS (AGAR SELECTIVO PARA VIBRIO): FUNDAMENTO ► Las elevadas concentraciones de tiosulfato y citrato, así como el medio fuertemente alcalino, inhiben notablemente a las enterobacterias. La bilis del buey y el colato inhiben sobre todo, a los enterococos. Solamente algunas cepas de Proteus sacarosa positiva pueden formar colonias amarillas semejantes a la de los vibriones. ► El indicador mixto de azul de timol – azul de bromotimol presenta un claro viraje a amarillo por la formación de ácido incluso en medio fuertemente alcalino. EMPLEO DEL AGAR ► Sembrar las placas en superficie, por estría, con el material objeto de investigación o con el procedente de un cultivo de enriquecimiento. INTERPRETACION COLONIAS MICROORGANISMOS Planas de 2 –3 mm de Vibrio cholerae diámetro, amarillas Vibrios tipo El Tor. Pequeñas, con el centro Vibrio parahaemolyticus verde azulado Grandes amarillas Vibrio alginotycus Azules Pseudomonas, aeromonas y otros Diminutas, transparentes. Enterobacterias y otros. Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 98. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA TCBS Agar - Vibrio chol. eltor ogava MEDIO DE CULTIVO LOWENSTEIN – JENSEN: FUNDAMENTO ► Para la demostración y ensayo de resistencia de bacterias de la tuberculosis, según Lowenstein modificado por Jensen. PROCEDIMIENTOS DE SIEMBRA ► Sembrar masivamente el medio de cultivo, por estría, en superficie. Cerrar Mycobacterium tuberculosis herméticamente los tubos. INCUBACION ► Hasta las 12 semanas a 37°C INTERPRETACION ► Al cabo de 10 a 14 días y después semanalmente se inspecciona el medio de cultivo en cuanto al crecimiento de cultivos. MEDIOS DE IDENTIFICACIÓN AGAR CITRATO DE SIMMONS: PRINCIPIO ► La utilización del citrato por una bacteria se detecta en este medio mediante la formación de subproductos alcalinos. El medio incluye citrato de sodio, un anión, como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. ► Las bacterias que pueden utilizar citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio con producción de amoniaco (NH3+), llevando a la alcalinización del medio por conversión del NH3+ en hidróxido de amonio (NH4OH). El azul de bromotimol es amarillo a un pH menor de 6 y azul a un pH mayor de 7.6. Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 99. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA TECNICA ► Tomar una colonia bien aislada de la superficie de un medio de aislamiento primario e inocularla en una sola estría en el pico del agar citrato. Incubar a 35°C durante 24 a 48 horas. INTERPRETACION CITRATO NEGATIVO ► El desarrollo de un color intenso en 24 a 48 hs. indica una prueba positiva y revela que el organismo en estudio ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con la formación de productos alcalinos. ► La prueba es también positiva en ausencia de color azul sí existiera un desarrollo visible de colonias a lo largo de la estría de inoculación. ► La interpretación positiva a partir del desarrollo en la línea de siembra se puede confirmar incubando el tubo durante 24 horas más, en que usualmente aparece un color azul. CITRATO POSITIVO AGAR LISINA HIERRO (LIA): FUNDAMENTO ► Agar de ensayo para la demostración simultánea de lisina decarboxilasa (LD) y de la formación de hidrogeno sulfurado (H2S) para la identificación de enterobacterias, sobre todo de Salmonellas y Arizona. ► La lisina puede ser descarboxilada por microorganismos LD positivas que la transforman en la amina cadaverina. ► Esto produce un viraje al violeta del indicador de pH púrpura de bromocresol, puesto que la descarboxilación sólo tiene lugar en medio ácido (pH inferior a 6.0). Es necesario que se produzca previamente la acidificación del medio de cultivo, por fermentación de la glucosa. Este medio de cultivo solo puede utilizarse para la diferenciación de bacterias que fermentan glucosa. ► Los microorganismos LD negativos, pero fermentadores de la glucosa, producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo. La incubación prolongada puede ocasionar alcalinización en la zona de la superficie del medio de cultivo y en consecuencia, se produce un viraje al violeta. La formación de H2S produce una coloración negra debido al sulfuro de hierro producido. Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 100. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA PROCEDIMIENTOS ► Este medio nutritivo se siembra con el cultivo puro sometido a ensayo, tanto por estría sobre la superficie inclinada como por punción central en la columna vertical subyacente. INTERPRETACION COLOR DEL MEDIO DE CULTIVO MICROORGANISMOS FORMACIÓN DE H2S Columna Superficie - inclinada Arizona Violeta Violeta + Salmonella Violeta Violeta + Proteus mirabilis Amarillo Pardo rojizo + Proteus vulgaris Amarillo Pardo rojizo + Proteus morgani Amarillo Pardo rojizo - Proteus rettgeri Amarillo Pardo rojizo - Providencia Amarillo Pardo rojizo - Citrobacter Amarillo Violeta + Escherichia Coli Amarillo Violeta - Shiguella Amarillo Violeta - Klebsiella Violeta Violeta - AGAR TRES AZUCARES HIERRO (TRIPLE SUGAR IRON AGAR – TSI): FUNDAMENTO ► La degradación del azúcar con formación de ácido se manifiesta por un cambio de color del indicador Rojo de fenol que vira de anaranjado rojizo a amarillo o por un viraje a rojo intenso en caso de alcalinización. ► El tiosulfato es reducido por algunos gérmenes a ácido sulfhídrico, el cual reacciona con la sal férrica produciendo sulfuro de hierro de color negro. INCUBACION ► Hasta 48 horas a 37 °C Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA
  • 101. UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUÍMICA INTERPRETACION SUPERFICIE FORMACIÓN De H2S BACTERIAS VERTICAL INCLINADA + Solo en la parte superior de la columna vertical, frecuente S. typhi S OA formación de anillo eventualmente sólo al cabo de 48 horas. S. paratyphi A SG OA - S. cholerae suis SG OA - S. pullorum SG OA + S. paratyphi B SG OA +- Columna S. typhimurium SG OA + No - S. enteritidis SG OA + vertical S. gallinarium S OA + Negra Escherichia coli SG SG - Citrobacter SG SG + Klebsiellla SG SG - Proteus vulgaris SG** SG** + - Verde Pr. Mirabilis SG** SG** + Negrusco Pr. Morganii SG** SG** - Sucio Pr. Rettgeri S (A) S (A) - Kleb. pneumoniae S/SG S/SG - Pse. aeruginosa OA OA* Alcalige. faecalis OA OA* - EXPLICACION DE LETRAS Y SIGNOS UTILIZADOS EN EL CUADRO A = Viraje a rojo, por formación de álcali OA = Sin alteración del color original del medio de cultivo, o rojo por formación de ácido. S = Viraje a amarillo, por formación de ácido SG = Viraje a amarillo y formación de gas. + = Ennegrecimiento, por formación de H2O - = Ausencia de ennegrecimiento * = Eventualmente, también formación de pigmento ** = Muchas cepas eventualmente sin formación de gas. *** = Cultivado en Agar Kliger: OA Mg. Q.F. HÉCTOR VILCHEZ CÁCEDA

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