Trabajo de fin de Maestría de Biotecnología

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  • 1. AUTO-BIORREMEDIACION DE AGUASRESIDUALES DEL PROCESAMIENTO DELCORCHO POR BACTERIAS DEGRADADORAS DEFENOLES Y CLOROFENOLES INMOVILIZADASEN PARTICULAS DE CORCHOPAOLA HERNANDEZ GALVISSevilla, Diciembre de 2011Bacterias inmovilizadas enpartículas de corchoAgua residual dellavado del corchoAislamiento e identificaciónde bacteriasResistencia a fenol
  • 2. AUTO-BIORREMEDIACION DE AGUAS RESIDUALES DEL PROCESAMIENTODEL CORCHO POR BACTERIAS DEGRADADORAS DE FENOLES YCLOROFENOLES INMOVILIZADAS EN PARTICULAS DE CORCHOTrabajo Fin de MásterMáster en Genética y Biotecnología MicrobianaEste trabajo ha sido realizado en el Departamento de Microbiología y Parasitología de laFacultad de Farmacia (Universidad de Sevilla)TUTORA AUTORAEloísa Pajuelo Domínguez Paola Yamile Hernández GalvisSevilla, 12 de Diciembre de 2011
  • 3. A mis padres
  • 4. Quiero expresar mi agradecimiento a aquellas personas que me han ayudado en larealización de este trabajo.Especialmente quiero agradecer a mi tutora, Eloísa Pajuelo, la formación científica que deElla he recibido, siendo para mí un punto de referencia no solo por su alto nivel académicosino también por la comprensión y el respeto con el que trata a las personas que la rodean.Realmente me siento afortunada por haber tenido la oportunidad de trabajar con Elladurante estos meses.Quisiera mostrar mi más profundo agradecimiento al Dr. Miguel Ángel Caviedes porhaberme aceptado en su laboratorio.De manera especial, agradezco sinceramente a todos mis compañeros de laboratorio con losque he compartido mis buenos y malos momentos, la amistad, comprensión y a vecespaciencia que siempre, han demostrado hacia mí, a Nacho, a Julián Delgadillo, a Bouchra, aAlejandro, a Ana Marí y a Pati. Gracias por haberme creado un ambiente de amistad ycompañerismo a mí alrededor, facilitándome la integración en el grupo.También quisiera agradecer a mis amigos de Marchena y en particular a Marielita y a DonJosé por Haberme acogido en su hogar como una hija, por haberme brindado todo el amor yel calor de unos verdaderos padres, sin ellos no hubiera sido posible mi estancia en España.Quisiera agradecer a mis padres y hermanos, por el constante apoyo y comprensión quesiempre me han ofrecido y el estar lejos de Ellos me hizo comprender cuanto los amaba y loimportante que son en mi vida.; en los momentos de tristeza y soledad fueron el motor queme impulsaba a seguir adelante y hoy me siento muy feliz por el resultado obtenido en estetrabajo, porque es el fruto del esfuerzo propio y el de muchas personas que me quieren.Por ultimo quiero agradecer a Sergio, por su comprensión y apoyo, por demostrarme que suamor es más fuerte de lo que pensaba y estar lejos de El me hizo comprender lo mucho que loamo.Este trabajo es financiado por el MEC (proyecto BIO-2009-7766). Agradezco al Servicio deMicroscopía del CITIUS (Universidad de Sevilla) por la ayuda técnica.
  • 5. ABREVIATURASAPI 20: Sistema estandarizado para la identificación de bacteriasATSDR: Agency for Toxic Substances & Disease RegistryBA: Balsa de AlmacenamientoBAE: Balsa de Almacenamiento EnriquecidaBC: Balsa de CocciónBCE: Balsa de Cocción EnriquecidaBenzoil-CoA: Benzoil – Coenzima ABLAST: Basic Local Alignment Search ToolC 1,2O: Catecol 1,2-dioxigenasaC 2,3O: Catecol 2,3-dioxigenasaCWAO: Oxidación de aire húmedo catalíticodNTP: Deoxiribonucleótidos trifosfatoDTT: 1, 4 Ditio – 1 – treitolEHD: Descargas Electro – HidráulicasEPA: Environmental Protection AgencyFC: Folin` CiocalteauG1, 2O: Gentisato 1, 2-dioxigenasaIARC: Agencia Internacional para la investigación del CáncerKPa: KiloPascalmM: miliMolarMTBE: metil-terbutil-éterMMS: Medio Mínimo SuplementadoMTC: Concentration Maxima TolerableNCBI: National Center for BioinformaticsNADH: Nicotinamin – Adenín Dinucleótido ReducidoPCR: Polymerase Chain ReactionPMSF: Fluoruro de fenil-metano-sulfoniloP3, 4O: Protocatecuato 3,4-dioxigenasaP4, 5O: Protocatecuato 4,5-dioxigenasaRDP: Ribosomal Database Projectrpm: revoluciones por minuto
  • 6. SEM: Microscopia Electrónica de BarridoTSA: Agar Tripticasa SojaTSB: Caldo Tripticasa SojaUV: Ultravioleta
  • 7. 1. Título: Self-Bioremediation of cork-processing wastewaters by (chloro) phenol-degrading bacteria immobilized onto cork particles.Autores: I. Del Castillo; P. Hernández, I.D. Rodríguez-Llorente; M.A. Caviedes; E. Pajuelo.Artículo aceptado en la revista “WATER RESEARCH” con revisión moderada. Nº dereferencia: WR18785. Índice de impacto: 4.546.Ranking de esta revista según el índice de impacto:Category NameTotal Journalsin CategoryJournal Rankin CategoryQuartilein CategoryENGINEERING, ENVIRONMENTAL 45 4 Q1ENVIRONMENTAL SCIENCES 193 11 Q1WATER RESOURCES 76 1 Q12. Comunicación en congresoAutores: I. Del Castillo; P. Hernández, I.D. Rodríguez-Llorente; M.A. Caviedes; E. Pajuelo.Título: Diseño de un sistema para la Auto – Biorremediación de aguas residuales del hervidodel corcho.Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia de la Universidad deSevilla.Congreso Nacional de la Sociedad Española de Microbiología. Junio 2011.Tipo de comunicación: Póster.
  • 8. ÍNDICE1. ANTECEDENTES………………..………………………………………………............11.1 Generalidades de la industria productora del corcho…….……..………………........11.2 Aguas residuales de la industria del corcho ...…………………….……..………......21.3 Tratamientos para la depuración de aguas residuales……………….………….…....41.3.1 Métodos físico-químicos………………...…….……...…………..….…..........41.3.1.1 Separación de fenol en soluciones acuosas….....…..………....…........41.3.1.2 Destrucción de fenol en soluciones acuosas……..………...…..…….41.3.2 Métodos biológicos………....………………………..…………...……...…....61.3.2.1 Biodegradación en condiciones aerobias……….…………………….71.3.2.2 Biodegradación en condiciones anaerobias….…….……….…….......82. Objetivos………………………………………………………………………………...102.1 Objetivos específicos……………………….………………………………………103. MATERIALES Y METODOS………………………………………………………….103.1 Determinación de polifenoles totales en aguas residuales del corcho…………..….103.2 Material biológico……………..………………………………………………........113.3 Aislamiento e identificación de microorganismos…...………………….….……...123.3.1 Pruebas bioquímicas........................................................................................123.3.2 Extracción de ADN..........................................................................................123.3.3 PCR 16S...........................................................................................................123.4 Resistencia a fenol y clorofenoles…………….....…………..………….………......133.5 Degradación de fenol……………………………………………………………….133.6 Actividades enzimáticas de la ruta aerobia de degradación del fenol........................143.6.1 Fenol hidroxilasa……………..…………………………………….….……..143.6.2 Catecol 1,2–dioxigenasa………..………………………...……………….....143.6.3 Catecol 2,3-dioxigenasa…………...………………………...……………….153.7 Formación de “biofilms” en partículas de corcho……….……....…...………….…153.8 Optimización de condiciones para la biodegradación del fenol................................154. RESULTADOS OBTENIDOS………….………………………………......……..…....164.1 Cuantificación de polifenoles totales en aguas residuales del hervido del corcho....164.2 Aislamiento e identificación de microorganismos………………………………….174.2.1 Caracterización bioquímica………………………………..………...……….19
  • 9. 4.3 Resistencia a fenol y clorofenoles…………………………………………………..204.4 Consumo de fenol en medio líquido......…………………………………………....224.5 Degradación de fenol……………………………………..…………………….…..224.6 Actividades enzimáticas de la vía aerobia de la degradación del fenol…………….244.7 Capacidad de formación de “biofilms” sobre partículas de corcho…………...…..264.8 Optimización de condiciones para la degradación del fenol………………………..285. DISCUSIÓN………………………………………………………………………….....316. CONCLUSIONES………………….………………………………………………...…347. BIBLIOGRAFIA……….……………………………………………………..………...35
  • 10. Probablemente no va en contra de la cienciasugerir que en un lugar u otro existe algúnorganismo que, bajo las condicionesadecuadas, pueda oxidar cualquier sustancia.(Gale, 1952)
  • 11. 1Auto-biorremediación de aguas residuales del procesamiento del corcho por bacteriasdegradadoras de fenoles y clorofenoles inmovilizadas en partículas de corcho.1. AntecedentesLa inadecuada utilización del agua y la contaminación proveniente de la industria es uno delos principales problemas medioambientales de la actualidad. El agua es un componenteesencial en la vida del hombre que se encuentra en cantidades abundantes en la naturaleza yocupa grandes extensiones, pero el crecimiento poblacional y la industrialización hanaumentado la demanda y la contaminación de este recurso natural. La mayor fuente decontaminación de las aguas superficiales y subterráneas se debe principalmente al vertido deresiduos derivados de actividades industriales.1.1 Generalidades de la industria productora del corchoEl aprovechamiento principal del Quercus suber o alcornoque es el corcho; el alcornoquetiene una limitada distribución geográfica. En Portugal se encuentra la masa alcornocal másgrande y mejor conservada (803.000 Has); en segundo lugar se encuentra España (725.000Has) y detrás Argelia (463.000 Has), Marruecos (350.000 Has), Italia (150.000 Has), Francia(65.000 Has) y Túnez (45.500 Has) (Fuente: Feria de Montado Portel, 2005). En España encuanto a superficie alcornocal, Andalucía es la comunidad con mayor superficie, con un 50%del total; Extremadura ocupa el segundo lugar con un 30% de la superficie; Cataluña ocupa eltercer lugar con 8% y el resto de comunidades representan el 11,7% de los alcornoques deEspaña. (Consejería de Medio Ambiente, Junta de Andalucía, 2006). Dentro de la producciónmundial de corcho, Portugal y España son los países con mayor producción anual de corchocon un 50,5% y 22,7%, respectivamente.La naturaleza química del corcho está dada por la suberina (40%), lignina (22%) ypolisacáridos (celulosa y hemicelulosa, 20%); a su vez está compuesto por ceras, taninos yotros componentes extraíbles, (Gil, 1997). Actualmente se sabe que la suberina es unacombinación de ácidos grasos, aunque todavía se desconoce la composición de los mismos; sehan identificado algunos como el felogénico, esteárico, floiónico y subérico; siendo elprimero el más abundante. La suberina es inflamable e insoluble en agua, éter, cloroformo,ácido sulfúrico, ácido clorhídrico y amoniaco, y es el mayor determinante de las numerosascualidades del corcho. Las células del corcho son impermeables a líquidos y gases; por lo cualel corcho es un material idóneo para la elaboración de utensilios de pesca y flotadores engeneral. Otra propiedad del corcho es la elasticidad, en virtud de la flexibilidad de sus
  • 12. 2membranas celulares, el tejido suberoso posee una gran capacidad para soportar presionesfuertes. El corcho como aislante puede ser usado en diferentes situaciones por ejemplo, poseeun coeficiente de conductividad térmica de 0,035 Kcal.m/m2para una densidad de 110Kg/m3,lo que sitúa a la corteza suberosa entre las sustancias más adecuadas para el aislamientotérmico (Góngora y Benítez de Lugo, 1980). Así mismo por el efecto de elasticidadmencionada, el corcho es un excelente aislante acústico y amortiguador de vibraciones, otrascualidades que le permiten ser usado en la técnica de aislamiento, son la capacidad deabsorber humedad, ser inodoro, higiénico, compacto y resistente. Gracias a las propiedadesdel corcho se usa en diversas áreas como: construcción, aislamiento térmico, correcciónacústica, aislamiento de vibraciones, tabiques prefabricados, revestimientos, decoración; enla industria del frío, la industria naval, la automoción; transportes, maquinaria en general, laindustria textil, la industria química-farmacéutica y la industria pesquera, etc. El polvo oserrín producido en el procesamiento del corcho puede ser usado como combustible o comoagente de llenado (mezclado con cola) para tapones de corcho con menor calidad y para laproducción de linóleo, producto que puede usarse en la fabricación de explosivos y en laagricultura.1.2 Aguas residuales de la industria del corchoEsta industria se destaca como el grupo industrial más importante de todo el sector forestalgracias a la fabricación de tapones para el vino y de accesorios como calzado, bolsos y demásartículos elaborados con corcho; a pesar de que la industria corchera es considerada unaindustria ecológica, ya que el corcho es un producto natural no contaminante y en la mayoríade sus procesos de transformación el impacto ambiental puede considerarse casi nulo. Hayque tener en cuenta que el corcho natural contiene una estructura lignificada, una serie decompuestos tánicos o clorados que durante el proceso de cocción se hidrolizan,transformándose en sustancias como el pentaclorofenol, el 2, 4,6–tricloroanisol y los ácidospolifenólicos. Estos compuestos además de conferir mal sabor al vino y otros licores; por sucarácter toxico están siendo objeto de control de sus niveles en tapones de corcho y en lasaguas residuales usadas para el procesamiento de dicho material. El procesamiento delcorcho requiere un lavado a 95° C para limpiar y ablandar el material. Generalmente con lamisma agua se suelen lavar 15-20 partidas de corcho, hasta que el agua residual se vuelve deun color negruzco y es preciso desecharla. Estas aguas en ocasiones son vertidas directamente
  • 13. 3a los afluentes de aguas naturales, ocasionando graves problemas medioambientales por laelevada contaminación.Entre los contaminantes más abundantes en el agua que afectan los diversos sistemasbiológicos encontramos los compuestos fenólicos, los cuales se caracterizan por tener unnúcleo aromático unido a un grupo hidroxil. Bajo esta definición quedan incluidos el fenol,los fenoles di y trihídricos, los ácidos hidrobenzoicos, nitrofenoles, clorofenoles,aminofenoles, metoxifenoles, fenoxifenoles, alquilfenoles y derivados de núcleos aromáticoscondensados (naftofenoles). Del total de los compuestos fenólicos conocidosaproximadamente el 4% son producidos naturalmente y el 96% son de origen sintético. De losfenoles sintéticos, los clorofenoles son los más comunes, son altamente tóxicos y persistentesen el medio ambiente. La contaminación del medio marino por fenoles es causadaprincipalmente por las descarga de aguas residuales, destacando las aguas procedentes delprocesamiento de fármacos, papel, carbón, refinerías, explosivos, producción de celulosa ymadera, tintorerías, manufactura de plaguicidas y herbicidas, plásticos y resinas, entre otros(Moussavi et al., 2009; Patel & Rajkumar, 2009; Varma & Gaikwad, 2009). Adicionalmente,las aguas de desechos industriales son tratadas con cloro, proceso mediante el cual se formanotros fenoles como el clorofenol, di y triclorofenol. Una vez que los compuestos fenólicos selocalizan en el agua, se pueden diluir con la misma o dispersarse en función de la fuerza ydirección de las corrientes marinas, de igual forma son susceptibles de experimentar unproceso de foto-oxidación cerca de la superficie acuática. Dicho proceso incluye lahidroxilación del anillo, su condensación y dimerización, y por último, una eliminaciónfotoinducida (Bianchi, T. S., M. Argyrou & H. F. Chippett, 1999).Los fenoles pueden adsorberse en las partículas suspendidas y precipitarse posteriormente.El comportamiento de los compuestos fenólicos en el ecosistema marino abarca también suabsorción por diversos organismos; o bien al acumularse, en los sedimentos están sujetos a ladegradación por microorganismos.Los compuestos fenólicos en los seres humanos pueden entrar por inhalación, contacto por lapiel o ingestión, ya sea por medio de alimentos o agua contaminada; vía por la cual el fenolingresa rápidamente al cuerpo a través del tubo digestivo. Dicha ingestión de productoslíquidos que contienen fenol pueden producir daño intestinal grave y aun causar la muerte.Según análisis toxicológicos realizados en animales de laboratorio beber agua con niveles defenol extremadamente altos puede ocasionar temblores musculares, dificultad para caminar,alteraciones en hígado y sistema inmunológico y llevar a la muerte (ATSDR, 2008abc). Nohay ninguna evidencia que indique que la exposición al fenol produce cáncer en seres
  • 14. 4humanos, la IARC y la EPA han determinado que el fenol no es clasificable en cuanto acarcinogenicidad en seres humanos (ATSDR, 2008abc). Sin embargo, existen normativas anivel mundial que fijan el valor máximo permisible de compuestos fenólicos en el agua. LaEPA en Estados Unidos ha fijado una concentración de una parte por millón (1 mg.L-1) defenol en aguas superficiales. Por otro lado, la Unión Europea acuerda que el límite de fenolesen agua potable y mineral es de 0,5 g.L-1. El límite de emisiones de fenol en agua residualson de 0,5 mg.L-1para aguas de superficie y 1 mg.L-1para sistemas de alcantarillado.1.3 Tratamientos para la depuración de aguas residuales1.3.1 Métodos físico–químicos1.3.1.1 Separación de fenol de soluciones acuosas- La destilación se basa en la volatilidad del fenol, este proceso demanda alta cantidad deenergía, puesto que el fenol destila a 180ºC. Se puede emplear otros procesos como laextracción de fenol del agua con la ayuda de algunos solventes orgánicos comohidrocarburos, compuestos oxigenados, n-hexano, ciclohexanol, benceno, tolueno, entreotros; los cuales pueden ser más tóxicos que el fenol como es el caso del tolueno.- La adsorción es ampliamente usada en la purificación de pequeños ríos contaminados yaguas residuales. Algunos adsorbentes usados son el carbón activado o resinaspoliméricas. También se pueden emplear membranas de polipropileno y solventesorgánicos tales como MTBE, cumeno y una mezcla de hidrocarburos, con una sobrepresión de 31–38 kPa, para la extracción de fenol.1.3.1.2 Destrucción de fenol en soluciones acuosas- Oxidación con aire húmedo no catalítico se basa en las propiedades oxidativas deloxígeno del aire, es aplicado en tratamiento de aguas residuales, en especial cuando sonmuy diluidas para incinerar y demasiado tóxicas para tratamientos biológicos. Unamineralización completa de aguas residuales es imposible con este método, debido a quealgunos compuestos de bajo peso molecular son resistentes a la oxidación.- Oxidación con aire húmedo catalítico (CWAO): las catálisis homogéneas de CWAOson usualmente la transición catiónica de un metal (iones Cu y Fe). El carbón activadotambién puede actuar como catalizador aunque pueda ser consumido por la oxidación.- Polimerización oxidativa con oxígeno en presencia de enzimas: la tirosina polifenoloxidasa y lacasa convierten los fenoles usando oxígeno en o-quinonas. (Amjad & Qay2007). Estos compuestos también pueden ser fácilmente filtrados y/o adsorbidos ensólidos.
  • 15. 5Otro tipo de oxidación puede ser la oxidación húmeda con químicos oxidantes los cualesincluyen:- Oxidación con ozono: consiste en que el ozono molecular actúa directamente en lossitios nucleofílicos y radicales insaturados de los compuestos orgánicos. Sus principalesintermediarios son hidroquinona, benzoquinona y catecol, pero el principal producto es elácido oxálico.- Oxidación con peróxido de hidrógeno: el H2O2 tiene una cantidad de oxígenoefectiva, su costo es bajo, de fácil almacenamiento, manejo y sobre todo, amigable con elambiente. Sin embargo, la reactividad del H2O2 es generalmente baja y en gran parteincompleta debido a su cinética.Otra forma de empleo del H2O2 es en conjunto con una sal de hierro II (reactivo deFenton) para producir radicales hidroxilos, los cuales pueden oxidar compuestosorgánicos en solución. Sin embargo, el monitoreo de la reacción de Fenton hace de éste unproceso costoso e inhibe su uso común; además pueden producirse intermediarios muchomás tóxicos que el propio fenol.También existe la posibilidad de usar una polimerización oxidativa con H2O2 catalizadapor peroxidasas; sin embargo, el costo elevado de las enzimas limita su uso.- Oxidación con otros químicos oxidantes: incluyen la oxidación con clorina, dióxidode cloro y permanganato de potasio. Estos métodos no son amigables con el ambientedebido a la formación de compuestos orgánicos clorados y a la dispersión de compuestoscomo el Mn. Además de ser costoso, también requieren un control preciso de pH.También se puede usar el ión ferrato (VI), el cual es un oxidante fuerte amigable con elambiente, pero su potencial redox decrece fuertemente por incremento de pH.- La oxidación electroquímica: Es un proceso indirecto de electro-oxidación incluyendo“electro-Fenton” (Mohan et al. 2007). Esta técnica puede oxidar efectivamente muchoscontaminantes orgánicos e inorgánicos en concentraciones altas de cloro. Es posible laformación de compuestos intermediarios orgánicos clorados. El ozono también puede serusado como electro-oxidación, con la ayuda de mediadores (iones metálicos). Tanto laelectroxidación como la oxidación mediada por electro-Fenton, necesitan operar en medioácido para evitar la precipitación de los hidróxidos metálicos. Este método se ve limitadopor la adición de metales pesados que pueden formar contaminantes secundarios.- La oxidación directa anódica por “oxígeno activo": Se basa en la electro-oxidaciónde contaminantes aplicada directamente en ánodos por “oxígeno activo”. La adsorciónfísica del “oxígeno activo” puede causar una completa combustión de compuestos
  • 16. 6orgánicos. La oxidación directa no necesita añadir una alta cantidad de químicos paraaguas residuales o colocar O2 para los cátodos. No tienden a producir contaminantessecundarios y requiere muy pocos accesorios. Lo importante de una oxidación directa(oxidación anódica) es el material del ánodo. Sin embargo, ninguno tiene suficienteactividad y al mismo tiempo estabilidad.- Oxidación fotocatalítica. También se puede destruir el fenol mediante la oxidacióncatalítica, se han reportado conversiones de fenol significativas por luz UV sola. Sinembargo, la actividad en la oxidación de fenol sobre la irradiación UV puede serfuertemente mejorada en presencia de fotocatálisis. El TiO2 tiene actividad fotocatalíticay ha sido usado en la destrucción de contaminantes tóxicos del ambiente. Este eseconómico, no tóxico, resistente a la foto-corrosión y tiene un alto poder oxidativo. Porotro lado, permite la adsorción de contaminantes pero también la desorción deintermediarios y productos. Existen otros métodos de destrucción de fenol que no sonoxidativos, como por ejemplo la gasificación de fenol en agua superficial, que consisteen la conversión de material orgánico en productos gaseosos como el H2, CO, CO2 yCH4. La aplicación de descargas electro-hidráulicas (EHD) y electrólisis también sonempleadas para la degradación de compuestos fenólicos.La sonicación y cavitación hidrodinámica son sistemas que proveen energía paradestruir fenol en soluciones acuosas; sin embargo, son pobremente eficientes si sonempleadas solas, sin la co-presencia de oxidantes químicos.Según la literatura existente, se han desarrollado pocas tecnologías basadas en lautilización de organismos vivos para el tratamiento de aguas residuales procedentes de lafabricación del corcho, a pesar que es una industria importante en Andalucía yExtremadura. Adicionalmente, existen otras industrias importantes como, la extracción delaceite a partir de la aceituna, que también son generadoras de gran cantidad decompuestos fenólicos (Cabrera y col., 1996). La existencia de bacterias capaces dedegradar el fenol en soluciones puras e incluso en las aguas procedentes del hervido delcorcho sugiere una importante aplicación de estos microorganismos en la remediación deestos residuos.1.3.2. Métodos biológicosLos procesos biológicos, como la biorremediación han recibido mayor atención debido a queson amigables con el medio ambiente (Agarry & Solomon, 2008). Además, al trabajar con
  • 17. 7tratamientos biológicos se evitan problemas secundarios en los efluentes, como es el caso delos tratamientos físico-químicos, en los que se generan compuestos secundariospotencialmente más tóxicos que el propio contaminante (Hidalgo et al., 2002; Suárez et al.,2007; Saravanan et al., 2008). Actualmente, existen varios estudios relacionados con labiodegradabilidad de fenol, aplicando tanto procesos aerobios como anaerobios (Bajaj et al.,2008a; Lin et al., 2009). La biorremediación permite que los microorganismos transformen odegraden compuestos peligrosos en agua y suelos (Muñoz et al., 2001). Muchas bacterias soncapaces de usar los compuestos aromáticos como única fuente de carbono y energía (Jiang etal., 2004). Sin embargo, uno de los problemas que representa trabajar con fenol como únicafuente de carbono, es que el crecimiento microbiano puede sufrir una inhibición con elsustrato, debido a que es usado en altas concentraciones; para combatir este problema sepuede colocar una fuente convencional de carbono, como la glucosa, extracto de levadura oglutamato de sodio. Este tipo de compuestos incrementan la tolerancia celular al sustrato,mejorando además la biodegradación de fenol. Muchos de los cultivos analizados son capacesde degradar fenol en bajas concentraciones. Sin embargo, el fenol es tóxico para muchos tiposde microorganismos en altas concentraciones y puede ser un inhibidor para su crecimiento.Por lo tanto, para obtener mejores resultados, la concentración de fenol necesita ser mantenidabajo los límites de toxicidad y se requiere de una aclimatación de los microorganismos en elambiente del agua residual. En el ecosistema las bacterias pueden eliminar rápidamente elfenol, generalmente es eliminado en aire (1–2 días), en agua (9 días) y en suelo (2–5 días)(Busca et al., 2008). Existen varias géneros bacterianos capaces de degradar fenol, entre ellospodemos nombrar, Pseudomonas, Acinetobacter, Bacillus, Serratia, Alcaligenes,Burkholderia, Geobacillus entre otros (Adrian y col., 2000. Hidalgo et al., 2002;Arutchelvan, 2006; Agarry & Solomon, 2008; Van der Meer, 2008; Cordova, 2009). Sinembargo, los compuestos haloaromáticos como los clorofenoles y pentaclorofenoles sonmucho más difíciles de degradar, aunque se conocen algunos microorganismos capaces derealizar este proceso, tanto en condiciones aerobias como anaerobias, tales comoSphingobium chlorophenolicum, Dechloromonas y Dehalococcoides (Smidt y de Vos, 2004;Janssen y col., 2005; Van der Meer, 2008).1.3.2.1 Biodegradación bajo condiciones aerobiasEl primer paso de esta ruta consiste en la incorporación de grupos hidroxilos en el anillobencénico para lo cual los microorganismos han desarrollado una serie de rutas de oxidación,
  • 18. 8deshalogenación, desnitración o desulfuración, que dan lugar a un intermediario dihidroxiladosusceptible a la acción de dioxigenasas específicas que provocan la apertura del anillo. Estosderivados dihidroxilados serán canalizados por la ruta del catecol, en la que los intermediarios(muchos derivados aromáticos se transforman en catecol) son metabolizados mediante la rutaorto o meta, dependiendo de la posición en la que se efectué la apertura del anillo, o por laruta del gentisato. Los metabolitos finales entran directamente en el metabolismointermediario de la célula (Figura 1). El gentisato es un metabolito dihidroxiladointermediario de compuestos aromáticos como el antranilato (Ladd, 1962) B-naftol (Walker yLippert, 1965), 3- y 4-hidroxibenzoato, salicilato (Crawford y cols., 1975),nafialenodisulfonato (Whittich y cols., 1988), m-cresol, 2,5- y 3,5-xilenol (Hopper yChapman, 1970). En el primer paso de esta ruta catabólica interviene la gentisato 1,2-dioxigenasa que provoca la apertura del anillo aromático dando lugar a maleilpiruvato quepuede degradarse directamente por el metabolismo microbiano o transformarse previamenteen flimarilpiruvato mediante isomerización.Figura 1. Rutas aerobias de biodegradación de compuestos fenólicos (de Lorenzo y Rojo,1994).1.3.2.2 Biodegradación bajo condiciones anaerobias: Este tipo de biorremediación es lapreferida, debido al ahorro de energía usada en la aireación con producción de menorescantidades de lodos (Fang et al., 2006).Existen varias vías metabólicas de degradación de fenol bajo condiciones anaerobias, en estecaso el anillo aromático no es oxidado, pero sí reducido (Rigo & Alegre, 2004). Encondiciones mesófilas se han sugerido las siguientes vías, el fenol es convertido primero a
  • 19. 9través de carboxilación para producir benzoato; después, es desaromatizado para formarcicloheanocarboxilato, el cual es fraccionado para formar heptanoato y este es posteriormentedegradado a través de β-oxidación para formar valerato, propionato y acetato, o directamenteformar propionato y butirato, los cuales más tarde pueden ser degradados en acetato. Estasvías metabólicas se basan en la presencia de enzimas que realizan reacciones decarboxilación, descarboxilación y dehidroxilación durante la degradación anaerobia (Fang etal., 2006).En otra vía metabólica de degradación, el fenol es reducido en presencia de nitrato aciclohexanona y después a n-caproato, el cual subsecuentemente sufre una β-oxidación paraformar ácidos grasos volátiles (Figura 2. Fang et al., 2006). También, el fenol puede sertransformado a benzoato por vía de carboxilación reductiva y después a través de la vía delbenzoil-CoA producir acetato e hidrógeno (Bell, J., Young, e., Stephens, S., 2011; Lob &Tar, 2000).Figura 2. Biodegradación anaerobia del fenol, vía del benzoato (Bell, J., Young, e.,Stephens, S., 2011).
  • 20. 10Figura 3. Biodegradación anaerobia del fenol a través de la vía de la ciclohexanona2. ObjetivosEl objetivo general de este trabajo es la realización de un estudio de la población bacterianaaislada en las dos balsas presentes en el proceso de tratamiento del corcho: la balsa decocción, donde se sumergen las planchas de corcho para sucesivos hervidos, donde seacumulan progresivamente compuestos fenólicos, y las balsas de almacenamiento, donde seconservan las aguas residuales procedentes del proceso hasta alcanzar un volumen suficientepara enviar a la planta de depuración. Así mismo hemos realizado aislamientos demicroorganismos aerobios, presentes en ambas balsas, entre los cuales hemos seleccionadoaquellos con mayor capacidad de crecimiento en presencia de fenol y clorofenoles, con losque pretendemos diseñar un inoculante que permita la eliminación de los compuestosfenólicos hasta niveles permitidos por la normatividad vigente, para que estas aguasresiduales tratadas puedan ser vertidas en las cuencas hidrológicas.2.1 Objetivos Específicos- Cuantificar fenoles totales en aguas residuales del hervido del corcho a través de métodosespectrofotométricos.- Aislar e identificar bacterias procedentes de aguas del hervido del corcho.- Selección de un inoculo con capacidad de degradación de fenol.- Optimización de las condiciones para la biodegradación del fenol, con el fin de diseñar unsistema piloto de biorremediación, como alternativa al tratamiento físico–químico de lasaguas residuales del procesamiento del corcho.3. MATERIALES Y METODOS3.1 Determinación de polifenoles totales en aguas residuales del corchoSe obtuvieron muestras de aguas residuales procedentes del procesamiento del corcho de laempresa Aglomerados Morell, S.A (Villanueva del Río, Sevilla), para determinar la
  • 21. 11concentración de fenoles totales. Estas muestras fueron esterilizadas por filtración y calorhúmedo para su posterior almacenamiento a -20ºC.Se realizaron varias curvas de calibración para determinar la concentración de fenoles totales,a partir de soluciones “stock” de 1000 ppm; de ácido tánico, ácido cafeico y fenol(compuestos químicos que se encuentran en altas concentraciones en las aguas residuales delprocesamiento del corcho). La determinación de fenoles totales se realizó por dos métodosespectrofotométricos: El método de Folin Ciocalteau (Box JD., 1983) y 4-aminoantipirina(Lacoste et al. 1959).- Método de Folin Ciocalteau: Se tomaron 10 mL de muestra: 1,5 ml de NaCO3 0,1 M: 0,5mL de reactivo FC, se homogenizó y se esperó una hora para medir las absorbancias a 750nm.- Método 4-aminoantipirina: Se tomó 0,4 mL de cada muestra y se colocó 10 L dehidróxido de potasio (KOH 0,1 M), 10 L de H2O2 30%; se homogenizó. Se añadió 0,5mL de tampón fosfato potásico y se homogenizó. A continuación, en oscuridad seadicionó 0,5 mL de solución de 4-aminoantipirina, se mezcló bien y posteriormente seañadió 0,5 mL de solución de ferricianuro de potasio (K3Fe (CN)6), se homogenizó. Seesperó 15 min y finalmente se tomó las lecturas de absorbancia de cada muestra a unalongitud de onda de 540 nm.Las absorbancias obtenidas se extrapolaron en las curvas estándar preparadas y se determinóla concentración de fenol presente.3.2 Material biológico: Se utilizaron bacterias aisladas de las balsas de aguas residuales delprocesamiento del corcho procedentes de la empresa Aglomerados Morell, S.A (Villanuevadel Río, Sevilla). Las bacterias objeto de estudio se clasificaron según la balsa deprocesamiento de la siguiente manera:a. Balsa de Cocción (BC), donde se mantienen las planchas de corcho a temperatura de 95ºChasta su reblandecimiento. A partir de esta balsa se aislaron las bacterias denominadas BC3,BC4 y BC6.b. Balsa de Almacenamiento (BA), donde se acumula el agua procedente del procesado delcorcho. A partir de este residuo se aislaron las bacterias denominadas BA3, BAC2, BAC4,BAC5, BAC6 y BASTAF.A si mismo parte de las muestras obtenidas de estas balsas se enriquecieron con medio TSBen una proporción de 9:1 (muestra: TSB). El agua residual enriquecida con medio TSB seincubó durante 48 horas a 28ºC, transcurrido este periodo se aislaron las siguientes bacterias.
  • 22. 12c. Balsa de Cocción Enriquecida (BCE): A partir de este residuo se aisló la cepa bacterianaBCE5A.d. Balsa de Almacenamiento Enriquecida (BAE): Se aislaron dos bacterias denominadasBAE9A y BAE5A.e. Adicionalmente se estudiaron otras cepas bacterianas, VN2, VN10, VN20, VH1 y VH2,provenientes de sedimentos de balsas de cocción de Villanueva del Río.3.3 Aislamiento e identificación de microorganismosSe hizo recuento de microorganismos en todas las muestras, tanto de BC y BA como de BCEy BAE. De estas muestras se aislaron aquellos microorganismos que mostraban morfologíade las colonias diferente, tras incubarse 24 horas a 28 ºC en placas de TSA, identificándosecon las iniciales correspondientes a la balsa de la que procedían y un número. Los organismosaislados se caracterizaron de forma preliminar mediante tinción de Gram. (Bergey, Holt,Krieg, & Sneath, 1994).3.3.1 Pruebas BioquímicasLa caracterización bioquímica de los microorganismos en estudio se realizó mediante elsistema de identificación comercial API (API20E, API20NE, API20STAPH de Biomérieux,Rap ID de Oxoid), siguiendo la metodología recomendada por el fabricante.3.3.2 Extracción de ADN: para realizar este procedimiento se empleó el kit de extraccióni.genomic CTB DNA Extraction mini kit, siguiendo las instrucciones del fabricante.3.3.3 PCR 16SSe amplificó la región ribosómica 16S. Para cada bacteria la reacción se preparó con lassiguientes concentraciones de reactivos en un volumen final de 25l: buffer a unaconcentración final de 1X, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 M de cada dNTP, 0,4 M de cada uno delos primers específicos, 0,5 U/reacción de la enzima Taq polimerasa y 1 L de ADN a unaconcentración aproximada de 40 ng/L. La reacción en el termociclador fue de 2 minutos a95ºC, seguido de 31 ciclos de 45 segundos a 95ºC, 45 segundos a 58ºC y 45 segundos a 72ºC,con un periodo de elongación final de 10 minutos a 72ºC. El resultado obtenido se observó engel de agarosa 1%, 100V, 30 minutos. El producto de la PCR se secuenció para determinar elgénero y posible especie. Las secuencias obtenidas se compararon con las bases de datos de
  • 23. 13secuencias disponibles, Ez – Taxon, RDP y también se utilizó la herramienta BLAST de lapágina WEB del NCBI, de este modo se buscaron las secuencias altamente homologas de labase de datos de nucleótidos no redundante (nr).3.4 Resistencia a fenol y clorofenolesLa resistencia de los aislamientos a fenoles y clorofenoles se determinó en el medio TSAsuplementado con concentraciones crecientes de estos compuestos, que van desde 0-15 mM(fenol), 0-4 mM (4-clorofenol) y 0-3 mM (2,4-diclorofenol). Las placas fueron incubadas a 28ºC durante 3 a 4 días. La resistencia se expresa según el índice MTC, que es la máximaconcentración del tóxico que permite el crecimiento bacteriano.3.5 Degradación de fenolLa capacidad de degradación de fenol se probó en medios de cultivo que contenían estecompuesto como única fuente de carbono.- Protocolo 1: Degradación de fenol en solución acuosa. Las bacterias se cultivaron enmedio mínimo (Foght et al. 1989) durante 72 h a 28ºC en agitación constante a 200 rpm.25 mL de medio mínimo suplementado (MMS) con fenol (2,5 mM), se inoculó con 100L de las cepas bacterianas (aprox. 108C.F.U. /mL), alícuotas de 2 mL fueron tomadas enintervalos de 2 horas para medir la D.O a 600 nm y determinar el crecimiento bacteriano.Las alícuotas fueron centrifugadas a 10.000 rpm durante 10 minutos y la concentración defenol se determinó en el sobrenadante por el método colorimétrico de la 4-aminoantipirina(Lacoste et al. 1959).- Protocolo 2: Degradación de fenol por bacterias inmovilizadas en partículas decorcho. Una colonia bacteriana fue inoculada en 2 mL de TSB y se incubo a 28ºC por 24horas en agitación. Luego en un tubo ependorf se tomó 60 L de la suspensión bacterianaen medio TSB y se mezcló con 1 mL de medio mínimo, 150 L de fenol (1 mM) ypartículas de corcho estériles y se incubó a 28 ° C en agitación constante a 200rpm. Comocontrol se usó 150 L de fenol en 1 mL de medio mínimo estéril. Después de 12 días deincubación las partículas de corcho se pasaron por un colador y se extrajo el sobrenadantede cada tubo mediante centrifugación a 10000 rpm por 15 minutos para obtener unsobrenadante libre de bacterias y así evitar interferencias en la determinación del fenolmediante el método colorimétrico 4-aminoantipirina (Lacoste et al. 1959).
  • 24. 143.6 Actividades Enzimáticas de la ruta aerobia de degradación del fenolLa actividad fenol hidroxilasa, catecol 1,2-dioxigenasa y catecol 2,3-dioxigenasa se midieronde la siguiente manera:Cada cepa bacteriana se inoculó en medio de cultivo líquido TSB y tras 24 horas deincubación, se adicionó 1,5 mL del medio TSB con crecimiento bacteriano en un matraz conmedio MMS suplementado con fenol 2,5 mM como única fuente de carbono. Los matracesse mantuvieron a una temperatura de 28ºC en agitación constante a 200 rpm durante 12 días.Posteriormente se centrifugaron las muestras a 10000 rpm por 5 minutos y se realizaron 5lavados con tampón fosfato-potásico 50 mM pH 7 y cada bacteria se resuspendió en 1,6 mLdel mismo tampón conteniendo 1mM de PMSF y 100 M de DTT. Se realizó el rompimientode las células mediante sonicación (ultrasonido), las muestras se transfirieron a tubos de 5 mLde volumen sumergidos en hielo y se sometieron a 5 ciclos de sonicación de 30 segundos,separados por ciclos de 30 segundos de reposo. Luego se centrifugaron a 10000 rpm por 10minutos y el sobrenadante correspondiente al extracto crudo de proteínas solubles se transfirióa tubos limpios. Los ensayos enzimáticos se realizaron a una temperatura de 28ºC usando unespectrofotómetro MARCA Pharmacia – LKB modelo Ultrospec III.3.6.1 Fenol hidroxilasa: la oxidación de NADH en presencia del fenol en los extractoscelulares fue monitoreada a 340 nm. La mezcla de reacción contenía 250 L de tampónfosfato-potásico 50 mM pH 7, 100 L de NADH (1 mM) y 500 L de extracto de proteína(la reacción se equilibró a 55ºC durante una hora después de la adición de la muestra), semidieron las absorbancias en el tiempo 0, a los 5, 10 y 15 minutos. Esta medida refleja lasactividades reductasas dependientes de NADH inespecíficas del extracto crudo.Posteriormente se adicionaron 100 L de Fenol (10mM) y se midieron las absorbancias desdeel tiempo 0, y cada 10 minutos, hasta completar 3 horas. Una unidad de actividad es definidacomo la cantidad de enzima que cataliza la oxidación de 1 mol de NADH por minuto(Gibson et al. 1990).3.6.2 Catecol 1,2-dioxigenasa: Para esta determinación se mezclaron 500 L de tampónfosfato-potásico 50 mM pH 7, 100 L de catecol (10mM) y se equilibró la reacción a 55ºCdurante una hora después de la adición de 400 L de extracto de proteína. La formación de unproducto llamado ácido cis, cis-mucónico, se determinó mediante la absorbancia a 260 nm
  • 25. 15(Ornston, et al. 1966). A través de mediciones seriadas desde el tiempo 0, y cada 5 minutos,hasta completar una hora desde el inicio de la reacción. Una unidad de actividad es definidacomo la cantidad de enzima que cataliza la producción de 1 mol de cis, cis-ácido mucónicopor minuto a 55 ºC.3.6.3 Catecol 2,3-dioxigenasa: Las condiciones de reacción son idénticas al ensayo de lacatecol 1,2-dioxigenasa, excepto por la formación del 2-semialdehidohidroximucónico quepuede ser monitoreado a 375 nm (Masai, et al. 1995).3.7 Formación de “biofilms” en partículas de corchoLa partículas de corcho fueron recogidas en terrenos de la industria del corcho (residuos de laindustria) se homogenizaron con una maquina moledora de café y fueron tamizadas paralograr un tamiz de 0,5 mm, estas fueron lavadas con 25 mL de HCl (10 mM) por 10 minutos yneutralizado con un volumen apropiado de NaOH (1M), se realizaron 5 lavados con aguaestéril y se secaron al aire. Se tomaron 15 ml de medio mínimo suplementado con 2,5 mM defenol y 0,15 gramos de partículas de corcho fueron inoculados con las bacterias quemostraron mayor porcentaje de degradación de fenol y se incubaron por 12 días a 28ºC enagitación constante a 200 rpm. Posteriormente las partículas fueron transferidas a cajas depetri y lavadas 5 veces con agua destilada estéril y se secaron al aire para luego ser teñidascon naranja de acridina (Johansson et al., 2008). La adhesión bacteriana a la superficie delcorcho se examinó con un microscopio de epifluorescencia (Olympus BX61) usando lente deobjetivo 100X y filtro verde TRITC.La fijación bacteriana de todas las cepas fueron analizadas por SEM (MicroscopiaElectrónica de Barrido), las partículas de corcho (0,01 gr) se inocularon con 1 mL de mediomínimo, 150 L de fenol (1 mM) y 60 L de medio TSB con inoculo bacteriano (incubadopor 24 horas), esta mezcla se mantuvo a 28ºC por 12 días y en agitación constante de 200rpm. Transcurrido este tiempo las partículas de corcho se lavaron 5 veces con agua destiladaestéril y se fijaron durante la noche en presencia de OsO4 y luego fueron tratadas con Au paraser observadas en un microscopio electrónico de barrido Jeol 6460LV.3.8 Optimización de las condiciones para la biodegradación del fenolEn base a los resultados obtenidos de la resistencia y degradación de fenol, así como lacapacidad de formación de “biofilms” en la superficie del corcho se seleccionó la cepa
  • 26. 16BAE9A para determinar las condiciones óptimas en el proceso de biodegradación de fenol enaguas residuales del corcho.Se usaron dos tipos de controles, agua de corcho estéril, agua de corcho con medio TSB enproporción (25mL: 2,5mL), agua de corcho con 250 L de H2O2, agua de corcho con 250 Lde H2O2 y 2,5 mL de TSB. La cepa BAE9A (200 L) fue inoculada con diferentescantidades de H2O2 (100, 150, 200, 250 y 1000 L), adición o no de medio liquido TSB (2,5mL), y las muestras se mantuvieron en distintas condiciones de temperatura (25ºC, 28ºC y37ºC), luz y oscuridad y en agitación constante a 200 rpm. Transcurridos 17 días deincubación se cuantificó la cantidad de fenoles totales por los métodos de FC y 4–aminoantipirina, usando como estándar el ácido tánico y el fenol, respectivamente. Despuésde definir las condiciones ideales de incubación se realizó el mismo procedimiento con VN2,VH1 y VH2. También se utilizaron dos consorcios bacterianos (BAE9A/BC4 y BAE9A/BASTAF), que fueron incubados en un periodo de tiempo de 12 días.4. RESULTADOS4.1 Cuantificación de polifenoles totales en aguas residuales del hervido del corchoLa determinación de fenoles totales en las muestras obtenidas de las balsas del hervido decorcho de la empresa Aglomerados Morell, S.A (Villanueva del Río), se realizó mediante losmétodos de Folin-Ciocalteau para el cual se usó como estándar el ácido tánico (el mayoracido fenólico presente en aguas residuales del corcho) y 4–aminoantipirina, cuyo patrón decalibración fue fenol y los resultados de la Tabla 1 muestran que el método FC es máseficiente en la determinación de fenoles totales. El reactivo contiene fosfomolibdato yfosfofungstato, sustancias que se usan para determinar compuestos polifenólicos (Polvoledo& Gerletti, 1968; Berk & Schroeder, 1942; Pro, 1952; Englis et al., 1955; Swain & Hillis,1959; Kloster, 1974; Chian, 1977). Es un método de estandarización para la determinación detaninos y derivados de la lignina (APHA, 1971, 1976), lo cual lo hace específico para elanálisis de compuestos fenólicos en aguas residuales del corcho donde se encuentran un altoporcentaje de sustancias derivadas de la lignina (componente principal del corcho) y decompuestos tánicos. Sin embargo el método de la 4–aminoantipirina es muy sensible en ladeterminación de fenoles (APHA, 1976), exceptuando los compuestos fenólicos que tienencomo sustituyente un grupo halógeno, carboxilo o metoxilo. En el caso de los nitrofenoles,el grupo nitro en la posición meta inhibe la reacción y en la posición orto la bloquea (Faust &
  • 27. 17Mikulewiez, 1967a), por lo cual usamos los dos métodos estándar para la determinación decompuestos fenólicos, el FC y 4-aminoantipirina (APHA, 1971, 1976) en aguas residuales dellavado del corcho.Tabla 1. Cuantificación de polifenoles totales (mg.L-1) en muestras de aguas residuales delhervido de corcho de la empresa Aglomerados Morell, S.A (Villanueva del Río).4.2 Aislamiento e identificación de bacterias procedentes de aguas residuales delprocesamiento del corcho:Se analizaron 17 cepas bacterianas en total, de las muestras de las balsas de almacenamiento(BA y BAE) y cocción (BC y BCE) se aislaron bacterias Gram negativas y Gram positivas, adiferencia de las muestras obtenidas de sedimentos donde se identificaron solamente bacteriasGram positivas. Entre los microorganismos presentes en aguas residuales del procesamientodel corcho se encontraron bacterias Gram positivas como Bacillus, Arthrobacter yStaphylococcus y Gram negativas como Stenotrophomonas, Acinetobacter, Serratia yEnterobacter. La Tabla 2 muestra la identificación de los microorganismos mediante tinciónde Gram (Bergey, Holt, Krieg, & Sneath, 1994), sistema comercial API (API20E, API20 NE,API STAPH de Biomérieux, Rap ID de Oxoid) y 16S, las secuencias obtenidas se compararoncon las bases de datos de secuencias disponibles, Ez–Taxón, RDP y también se utilizó laherramienta BLAST de la página WEB del NCBI, los datos obtenidos en esta última base dedatos fueron los de mayor porcentaje de identidad.Muestra agua decorchoFC –acido tánico(mg.L-1)4 –aminoantipirina -fenol (mg.L-1)AC # 1 0,85 0,91AC # 2 0,82 0,90AC # 3 0,85 0,84AC # 4 0,84 0,83AC # 5 0,78 0,75AC # 6 0,81 0,76AC # 7 0,80 0,82AC # 8 0,76 0,74MEDIA 0,814 0,819R20.9883 0.9865
  • 28. 18Tabla 2. Resultados de las pruebas de tinción de Gram, API y 16S de bacterias aisladas deaguas residuales del procesamiento del corchoFigura 4. Tinción de Gram y API20NE de la cepa bacteriana BAE5ACEPA GRAM Identificación presuntiva (API) 16 s (NCBI/ Ez – Taxón - RDP)BA3 Bacilos Gram - Stenotrophomonas maltophila Stenotrophomonas maltophila 100%BAE5A Bacilos Gram - Acinetobacter baumannii/calcoaceticusAcinetobacter 98%BAE9A Bacilos Gram - Acinetobacter baumannii/calcoaceticusAcinetobacter soli 99%BASTAF Cocos Gram + Staphylococcus chromogenes Staphylococcus Warneri 99%BAC2 Bacilos Gram + ND Bacillus cereus 99%BAC4 Cocos Gram + Staphylococcus xylosus Staphylococcus saprophyticus 99%BAC5 Bacilos Gram + ND Bacillus cereus 99%BAC6 Cocos Gram + Staphylococcus saprophyticus Staphylococcus sp. 98%BC3 Cocobacilos Gram - Serratia marcescens Serratia sp. 98%BC4 Cocobacilos Gram - Enterobacter cloacae Enterobacter sp. 98%BC6 Bacilos Gram + ND Bacillus cereus / thuriengiensis 99%BCE5A Bacilos Gram + ND Arthrobacter arilaitensis 99%VN2 Bacilos Gram + ND Bacillus benzoevorans 98%VN10 Bacilos Gram + ND Staphylococcus pasteuri 99%VN20 Cocobacilos Gram + ND Microbacterium hydrocarbonoxydans/carbonoxydans 99%VH1 Bacilos Gram + ND Bacillus weihenstephanensis 93%VH2 Bacilos Gram + ND Pseudomonas putida 98%API20NE
  • 29. 194.2.1 Caracterización bioquímica de bacterias procedentes de aguas residuales delprocesamiento del corcho.Tabla 3. Resultados de las pruebas bioquímicas de la galería API20NE y API20E para lasbacterias Gram negativasFigura 5. Imagen de los resultados del API20NE y API20E para bacterias Gram negativasAPI20NE API20ENO –ENTEROBACTERIAS BAE5A BAE9A BA3 ENTEROBACTERIAS BC3 BC4REDUC. DE NITRATOS A NITRITOS + + + B – GALACTOSIDASA + +REDUC. NITRATOS – NITROGENO - - - ARGININA –DIHIDROXILASA- +FORMACION DE INDOL - - - LISINA –DesCARBOXILASA+ -FERMENTACION DE GLUCOSA + + - ORNITINA-DesCARBOXILASA+ +ARGINININA DIHIDROLSA - - - CITRATO + +UREASA - + - PRODUCCION DE H2S - -HIDROLASA - - + UREASA - -B – GLUCOSIDASA - - - TRIPTOFANODEAMINASA- -PROTEASA - - + PRODUCCION- INDOL - -ASIMILACION DE GLUCOSA - - - PROD. DE ACETOINA + +ARABINOSA - - - GELATINASA + -MANOSA - - - FER. GLUCOSA + +MANITOL - - - MANITOL + +N – ACETIL GLUCOSAMINA - - - INOSITOL + -MALTOSA - - + SORBITOL + +GLUCONATO POTASICO - - - RHAMNOSA - +ACIDO CAPRICO - - - SACAROSA + +ACIDO ADIPICO - + - MELIBIOSA + +MALATO - + - AMYGDALINA + +CITRATO SODICO - + - ARABINOSA - +AC. FENILACETICO - + - OXIDASA - -OXIDASA - - - CATALASA + +CATALASA + + + - - -
  • 30. 20Tabla 4. Resultados de las pruebas bioquímicas de la galería API STAPH para cocos Grampositivos/catalasa +4.3 Resistencia a fenoles y clorofenolesEn todas las bacterias aisladas se probó su resistencia a compuestos fenólicos. Los resultadosse muestran en la Tabla 5. La resistencia a fenol fue variable que va desde una concentraciónde 5 a 15 mM. Dos cepas fueron capaces de crecer en la concentración máxima probada(BAE9A y VN10). La resistencia a los clorofenoles se determinó en las 17 cepas. Las cepasmás resistentes al 4–clorofenol fueron BC4, BC6, BCE5A y VH2 y al 2,4–diclorofenol fueronVN2, VN10 y VH2.APISTHAP BASTAF BAC4 BAC6 VN10D – GLUCOSA + + + +FRUCTOSA + + + -MANOSA + + - -MALTOSA + + + -LACTOSA + + + -TREHALOSA + + + -MANITOL - + + -XILITOL - - - -MELIBIOSA - - - -REDUCCION DE NITRATOS ANITRITOS- + - -FOSFATASA ALCALINA + + - +ACETIL- METIL-CARBINOL - + + -RAFINOSA - - - -XYLOSA - + - -SACAROSA + + + -METIL – GLUCOPIRANOSIDA - - - -N – ACETIL - GLUCOSAMINA - + + -ARGININA DiHIDROLASA + - - +UREASA + + - -OXIDASA - - - -CATALASA + + + +
  • 31. 21Tabla 5. Resistencia al fenol de bacterias aisladas de aguas residuales del lavado del corchoFigura 6. Imagen de placas control y bacterias resistentes a una concentración de 15 mM deFenolCEPA Máxima identidad ( 16S r DNA)CMT (mM)fenol 4–clorofenol 2,4–diclorofenolBA3 Stenotrophomonas maltophila 100% 5,0 1,0 1,0BAE5A Acinetobacter sp. 100% 7,5 1,0 1,0BAE9A Acinetobacter soli 100% 15,0 2,0 1,5BC3 Serratia spp. 98% 7,5 1,0 1,0BC4 Enterobacter sp. 98% 7,5 2,5 2,0BC6 Bacillus cereus/ thuriengiensis 99% 10,0 2,5 2,0BCE5A Arthrobacter arilaitensis 99% 5,0 2,5 1,0BASTAF Staphylococcus warneri 99% 7,5 1,0 1,5BAC2 Bacillus cereus 99% 10,0 2,0 1,0BAC4 Staphylococcus saprophyticus 98% 7,5 1,5 2,0BAC6 Staphylococcus sp. 98% 10,0 1,5 2,0VN2 Bacillus benzoevorans 99% 12,5 2,0 2,5VN10 Staphylococcus pasteuri 99% 15,0 2,0 2,5VN20 M. hydrocarbonoxydans/carbonoxydans 99% 7,5 1,5 1,0VH1 Bacillus weihenstephanensis 93% 5,0 1,0 1,0VH2 Pseudomonas putida 98% 12,5 2,5 2,5
  • 32. 224.4 Consumo de fenol en medio líquidoLa habilidad bacteriana para degradar fenoles se investigó en dos niveles, primero se analizóla capacidad de las 17 cepas de utilizar el fenol como única fuente de carbono y energía (Fig.7) y en segundo lugar se determinó las actividades de las primeras enzimas implicadas en ladegradación de fenol, la fenol hidroxilasa, las catecol 1,2 dioxigenasa y la catecol 2,3dioxigenasa, con el fin de conocer si la ruptura del anillo aromático se produce en la posiciónorto o meta.4.5 Degradación de fenolLas cepas fueron cultivadas en medio mínimo suplementado con 2,5 mM de fenol comoúnica fuente de carbono y energía. La densidad óptica a 600 nm se midió como un parámetrode crecimiento bacteriano. Por otro lado, se evaluó la desaparición de fenol en el medio decultivo. Los resultados se muestran en la Figura 8. La capacidad de crecer en fenol comoúnica fuente de carbono varía entre cepas. En la mayoría de cepas se observó un retraso delcrecimiento de 2h-4h aproximadamente, Después de este período algunas cepas como:BAE9A, VN2, VN10, VN20, VH1 y VH2 mostraron una tasa de crecimiento rápido enpresencia de fenol. Por el contrario, BA3, BAE5A, BASTAF, BAC2, BAC4, BAC5, BAC6,BC3, BC4, BC6 y BCE5A mostraron una fase de latencia más larga (6 horas) y una tasa decrecimiento más lento en comparación con las cepas anteriores. BAE9A, VN2, VH1 y VH2parecen ser las bacterias degradadoras de fenol más eficientes. Una disminución significativade fenol se detectó después de 8 horas con las otras cepas bacterianas (Fig. 8).Figura 7. Concentración final de fenol en medio liquido expresado en (%) de cepasbacterianas aisladas de aguas residuales del corcho
  • 33. 23Figura 8. Degradación de fenol por bacterias aisladas de aguas residuales del procesamientodel corchoCRECIMIENTOBACTERIANO D.O 600FENOL EN ELSOBRENADANTE D.O 540
  • 34. 244.6 Determinación de actividades enzimáticas de la vía aerobia de la degradación del fenolEn todas las bacterias capaces de crecer en presencia del fenol se midió la actividad de lafenol hidroxilasa. Las cepas que tienen el nivel más alto de actividad enzimática fueron VH1y BAE9A (Fig. 9), coincidiendo con las de mayor consumo de fenol y tolerancia, seguidas porBC3 y BC4 que son bacterias capaces de crecer en un medio con fenol como única fuente decarbono y energía (Figura 8). La menor actividad fenol hidroxilasa se observó en las cepasVN10, VN20, BAE5A y BCE5A, mientras que BA3 y BC6 muestran niveles casiindetectables (Fig.9). No se observó actividad fenol hidroxilasa utilizando NADPH comodonante de electrones en ninguna de las cepas.Las actividades enzimáticas catecol 1,2 y 2,3 dioxigenasas también fueron mediadas en todaslas cepas para saber si la ruptura del anillo ocurría en la posición orto o meta. La actividad dela catecol 2,3 dioxigenasa mostró un valor superior respecto a la a la catecol 1,2 dioxigenasa(Tabla 6). Sin embargo, en algunas cepas como BC6, BA3, BAE5A y BASTAF, la diferenciade valores entre la vía meta y orto es muy alta, lo que indica que la degradación de fenol se daprincipalmente por la vía meta. Por el contrario, cepas como (BAC2, VN20 y VH2) parecenllevar a cabo la degradación de fenol por las dos vías, de forma simultánea. La cepa BAE9Amostró los niveles más altos de degradación de fenol en medio de cultivo. Estos datosfueron confirmados con la determinación de la concentración final de fenol que queda en elsobrenadante de los cultivos, evidenciando que BAE9A es una bacteria degradadora de fenolmuy eficiente, ya que sólo el 20% de fenol se mantuvo en el sobrenadante después de 5 díasde incubación (Figura 7).
  • 35. 25Figura 9. Actividad fenol hidroxilasa de bacterias aisladas del agua residual del hervido delcorcho.NADH – FENOLHIDROXILASA
  • 36. 26Tabla 6. Actividades enzimáticas de la vía de degradación del fenol en extracto crudo debacterias procedentes de aguas residuales del procesamiento del corcho.Bacteria Fenolhidroxilasa(mU. mL-1)Catecol 1,2–dioxigenasa(mU. mL-1)Catecol 2,3-dioxigenasa(mU. mL-1)Relaciónmeta/ortoBA3 0,20 0,05 1,90 38,0BAE5A 1,80 0,11 4,60 42,0BAE9A 4,75 1,43 37,5 27,0BC3 2,20 0,40 2,10 5,3BC4 3,50 0,43 2,00 4,7BC6 0,07 0,10 5,70 57,0BCE5A 1,50 0,40 2,50 6,3BASTAF 2,11 0,05 2,6 52,0BAC2 2,00 1,52 2,30 1,5BAC4 2,30 0,60 2,40 4,0BAC5 2,30 0,50 2,00 4,0BAC6 2,20 0,30 1,90 6,3VN2 2,30 0,30 5,20 17,3VN10 1,40 0,80 4,00 5,0VN20 1,00 0,80 1,80 2,3VH1 6,10 1,00 4,80 4,8VH2 2,00 0,80 1,30 1,64.7 Formación de “biofilms” sobre partículas de corchoEn las industrias del corcho, por lo general hay una capa residual de partículas de corchopequeñas en el suelo, que son residuos del proceso de fabricación. También hay algunaspiezas de corcho de baja calidad, espesor inadecuado u otros defectos, estas partículaspodrían ser utilizadas como soporte para la inmovilización de las bacterias. La capacidad deformar “biofilms” en la superficie de las partículas de corcho fue evaluada. Las cepasbacterianas se incubaron con pequeñas partículas de corcho y crecieron en presencia de fenol2,5 mM como única fuente de carbono, con el fin de evaluar el efecto de este compuesto en lafijación de las bacterias a las partículas de corcho. Cuando se observó bajo el microscopio defluorescencia, las partículas control incubadas sin bacterias mostraron un nivel de fondo deautofluorescencia (Figura 10.A), con zonas verdes oscuras. Sin embargo, cuando las
  • 37. 27partículas de corcho se incubaron en presencia de bacterias, se observó una intensafluorescencia verde (Fig. 10.B). En la figura 10 C.D. Podemos observar la adhesión de ungran número de bacterias a la superficie del corcho.También hemos confirmado la inmovilización bacteriana en las partículas de corcho residualpor medio de microscopia electrónica de barrido (Fig. 11). La estructura del corcho contieneuna gran superficie de pared celular vegetal que parece ser un material adecuado parainmovilización bacteriana (Fig. 11 A, B). De hecho, hemos observado que la cepa BAE9A,que es una degradadora de fenol eficiente, es capaz de colonizar y crecer sobre las departículas de corcho, con una cobertura superficial muy alta (Fig. 11C). Otra cepa bacterianacon resistencia y capacidad de degradación de fenol intermedia, como BC6 mostró una menordensidad sobre la superficie del corcho (Fig. 11D). Estos resultados indican que las partículasde corcho son un soporte adecuado para inmovilizar las bacterias aisladas de aguas residualesdel procesamiento de dicho material. (Fig.12).Figura 10. Evaluación de formación de “biofilms” sobre partículas de corcho incubadas conbacterias en MMS suplementado con fenol 2,5 mM. La fijación bacteriana se observómediante tinción de naranja de acridina. A. Control; partículas de corcho incubadas conmedio sin bacterias, que muestra el nivel de autotofluorescencia de las partículas, B.partículas de corcho incubadas con la cepa BCE5A, C y D. adhesión bacteriana en lasuperficie del corcho; C (BC6) y D (BC4).CCA BD
  • 38. 28Figura 11. Evaluación de la formación de “biofilms” sobre la superficie del corcho por SEM.A. Estructura de partícula de corcho. B. Control sin bacterias. C. Colonización de la superficiedel corcho por la cepa BAE9 A. D. Colonización de la superficie del corcho por la cepa BC6.Figura 12. Capacidad de colonización y adhesión sobre la superficie de partículas de corcho4.8 Optimización de condiciones para la degradación del fenolPor medio de los métodos de FC y 4–aminoantipirina se determinó la concentración defenoles totales en muestras de agua de corcho inoculadas con BAE9A, VN2, VH1 y VH2(cepas de estudio con mayor resistencia y degradación de fenol), bajo diferentes condicionesVN10A BC DVN10
  • 39. 29de temperatura, luz, adición de glucosa (TSB), H2O2 y con un periodo de incubación de 17días. Los resultados obtenidos mostraron que las condiciones ideales que le permiten a lascepas BAE9A, VN2, VH1 y VH2 degradar con mayor eficiencia compuestos fenólicos son:- Adición de una fuente mínima de glucosa a la muestra de agua de corcho en unaproporción de (1:10), ya que al aumentar la cantidad de glucosa adicional se puedeinhibir la utilización del fenol como fuente de carbono y energía.- Adición de H2O2 (250 L) para potenciar la reacción enzimática microbiana, pero alaumentar la cantidad de H2O2 hasta 1 mL se observa una disminución en la degradaciónde compuestos fenólicos por parte de las cepas bacterianas analizadas. Esta disminuciónse puede deber al efecto tóxico del H2O2 a ésta concentración.- Las condiciones de temperatura de 28ºC y luz constante durante el periodo de incubación,fueron las que mostraron mejores resultados de degradación en las cepas BAE9A, VN2,VH1 y VH2 (Fig. 13).Figura 13. Optimización de condiciones de incubación para bacterias degradadoras defenol aisladas del agua residual del hervido del corchoMatraz A. Control de agua de corcho estérilMatraz B. Temperatura 28ºC, luz, TSB, H2O2 y BAE9A.Matraz C. Temperatura 28ºC, oscuridad, H2O2, TSB yBAE9A.Matraz D. Temperatura 37ºC, luz, H2O2, TSB y BAE9A.Matraz E. Temperatura 25ºC, luz/ oscuridad, H2O2, TSB,y BAE9A.A B C D E
  • 40. 30Por el método FC (estándar: acido tánico) y bajo las condiciones óptimas mencionadasanteriormente BAE9A degradó el 76% (0,19 mg/L), VN2 el 70% (0,24 mg/L), VH1 el 60%(0,32 mg/L) y VH2 el 62% (0,31 mg/L) y por el método 4–aminoantipirina (estándar: fenol),BAE9A degradó el 61% (0,32 mg/L), VN2 el 54% (0,37 mg/L), VH1 el 47% (0,43 mg/L) yVH2 el 51% (0,39 mg/L) de fenoles totales presentes en las muestras de agua de corchoanalizadas ( Fig. 14).Figura 14. Determinación de polifenoles totales en las cepas BAE9A, VN2, VH1 y VH2El uso de dos consorcios bacterianos (BAE9A/BC4 y BAE9A/BASTAF) mostró un aumentode la degradación de compuestos fenólicos, ya que bajo las mismas condiciones de incubación(excepto el tiempo: 12 días) y por el método de FC, BAE9A degrada 53% (0,38 mg/L), elconsorcio BAE9A/BC4 degrada el 73% (0,23 mg/L) y BAE9A/BASTAF degrada el 72%(0,24 mg/L). Por el método de la 4–aminoantipirina BAE9A degrada 41% (0,48 mg/L),BAE9A/BC4 degradan el 52% (0,40 mg/L) y BAE9A/BASTAF degradan el 44% (0,46 mg/L)de fenoles totales presentes en el agua residual del lavado del corcho.Figura 15. Determinación de polifenoles totales en agua de corcho inoculada con dosconsorcios bacterianos (BAE9A/BC4 y BAE9A/BASTAF)
  • 41. 31DISCUSIÓNLa producción del corcho es una industria muy importante en Extremadura y Andalucía, yestá constituida por pequeñas empresas. El hervido del corcho genera residuos tóxicos quecontienen altas concentraciones de fenoles y clorofenoles (Benítez et al., 2006; Domínguez etal., 2007; Pintor et al., 2011). Las aguas residuales se almacenan en grandes tanques cerca delas industrias del corcho y se transportan en contenedores a una estación de depuracióncomún. La remediación de las aguas residuales antes de verterlas en los afluentes naturales seencuentra estipulada en las leyes ambientales. Los procedimientos físico–químicos para eltratamiento de aguas residuales son de alto consumo energético y son muy costosos,especialmente para las pequeñas empresas.La biorremediación permite el uso de microorganismos para la recuperación del suelo y elagua como una alternativa frente a los métodos físico-químicos tradicionales (Singh y Ward,2004; Stapleton y Singh, 2002). La biorremediación es un método con una aceptación cadavez mayor, tanto a nivel científico como público, siendo rentable, efectiva y amigable con elmedio ambiente. Muchos microorganismos con capacidad para degradar compuestosfenólicos han sido descritos, tanto en condiciones aeróbicas (Pseudomonas, Burkholderia,Sphingomonas, Ralstonia, Arthrobacter, Acinetobacter, Alcaligenes, Microbacterium), comoanaeróbicas (Desulfitebacterium, Dehalomonas, Dehalococcoides, Dehalobacter) (Bunge,2003; Chan et al, 2003; Díaz, 2004; Furukawa, 2003; Parvanov y Topalova de 2008, Van derMeer, 2008; Wang et al, 2005).A pesar de esto, hay poca información disponible sobre el uso de microorganismos para laremediación de las aguas residuales del procesamiento de corcho. Algunos estudiospreliminares han llevado a cabo el aislamiento de bacterias Gram negativas comoPseudomonas, Klebsiella, Stenotrophomonas y Burkholderia de este residuo (Días-Machadoet al., 2006). Estas bacterias se han utilizado, en combinación con ozono y se ha logrado laeliminación de hasta un 90% de carbono orgánico total de las aguas residuales de corcho.En este trabajo, se han aislado bacterias aerobias cultivables a partir de aguas residuales de laindustria del corcho. Todas las cepas fueron analizadas en cuanto a su capacidad de resistir ydegradar fenol. Las cepas fueron identificadas y se encontraron bacterias Gram negativascomo Acinetobacter, Enterobacter, Serratia y Stenotrophomonas y algunas bacterias Grampositivas como Arthrobacter y Bacillus. Se ha descrito que estos géneros bacterianos sondegradadores de fenol y clorofenoles (Solyanikova y Golovleva, 2004).
  • 42. 32La resistencia al fenol en estas bacterias es variable, entre 2,5 y 15 mM; dos cepas fueroncapaces de tolerar 15 mM fenol. Varias cepas fueron capaces de crecer en presencia de fenolcomo única fuente de carbono. Para saber, si las bacterias eran capaces de degradar el fenolademás de tolerarlo, se han llevado a cabo experimentos de consumo de fenol, determinandoel fenol residual que queda tras la incubación. Algunos microorganismos como VN20degradan bajas concentraciones de fenol (88% de fenol queda en la disolución), mientrasBAE9A es capaz de degradar eficientemente el fenol (reduce la concentración de fenol al20%). La presencia de actividad fenol hidroxilasa, la primera enzima en la ruta dedegradación aerobia del fenol, se confirmó en todas las cepas en estudio. Un análisispreliminar también se realizó con el fin de saber si la vía de degradación siguió la ruta orto ometa. Algunas de las cepas parecen degradar fenol, principalmente por la vía meta como(BA3, BAE5A, BC6 Y BASTAF), mientras que algunas otras como (BAC2,VN20 y VH2),parecen usar las dos vías simultáneamente.La capacidad de formar “biofilms” es una característica importante para una cepa bacterianaque va ser usada en la biorremediación de aguas residuales. Bacterias inmovilizadas son másestables que las bacterias de vida libre, y son capaces de realizar la degradación decontaminantes por períodos más largos y de una manera más eficiente. La Inmovilizaciónmejora la viabilidad, la durabilidad y la estabilidad de los cultivos microbianos para labiorremediación (Fantroussi y Agathos, 2005; Tavares dos Passos et al 2010). Diferentesproductos residuales han sido utilizados como soportes para inmovilizar cultivos, tales comotuberías, columnas de relleno, carbón activado granulado, cáscara de coco, etc. (Amuda eIbrahim, 2006; Carvalho et al 2001; Chan et al, 2003; Eker y Kargi, 2006; Shieh et al, 1990;Wobus et al, 1995). Por lo tanto, la capacidad de formar biofilms se puso a prueba, sobre lasuperficie del corcho. Las partículas de corcho que tienen una distribución de tamañoinsuficiente para ser utilizadas en la fabricación de aglomerados son quemadas para producirenergía (Gil, 1996), por lo cual, planteamos la posibilidad de usar estas partículas comosoporte de inmovilización bacteriana, puesto que varias cepas fueron capaces de multiplicarsey colonizar la superficie del corcho en presencia de fenol como única fuente de carbono yenergía.Teniendo en cuenta todos los resultados anteriores (resistencia y capacidad de degradación defenol y clorofenoles, y la formación de “biofilms” en la superficie del corcho), finalmente,cuatro cepas bacterianas (BAE9A, VN2, VH1 y VH2) fueron consideradas como las mejorescandidatas para diseñar un sistema de auto-biorremediación, basado en la degradación defenoles y clorofenoles por bacterias inmovilizadas en partículas de corcho.
  • 43. 33Cuando un procedimiento de biorremediación se va a diseñar, es importante la obtención deuna ganancia económica adicional. En nuestro trabajo es posible lograr este objetivo, porqueexiste gran cantidad de partículas de corcho en el suelo de dicha industria, que son elresultado de los diferentes tratamientos de este material, siendo un producto residual. Ennuestro caso, el sistema de auto-biorremediación propuesto tiene ventajas como, el uso debacterias nativas de las balsas de procesamiento del corcho y la utilización de partículasresiduales, como soporte para la inmovilización bacteriana. Las condiciones para mejorar ladetoxificación de fenol (temperatura, luz, consorcio bacteriano y adición de nutrientes, etc)fueron optimizadas y se ha constatado que las mejores condiciones son:- Consorcio bacteriano compuesto por BAE9A/BC4 inmovilizados en partículas de corcho- Adición de medio de cultivo (10%V:V)- Temperatura de 28 ºC y luz constante- H2O2 (3,3 g/mL)Por otra parte, es importante resaltar que existen otras actividades industriales en nuestraregión que también generan aguas residuales con un alto contenido de compuestos fenólicos,tales como la extracción de aceite de oliva (Cabrera et al, 1996) o la fabricación de fármacos,papel, carbón, refinerías, explosivos, producción de celulosa y madera, tintorerías,manufactura de plaguicidas y herbicidas, plásticos y resinas, entre otros (Moussavi et al.,2009; Patel & Rajkumar, 2009; Varma & Gaikwad, 2009). Se podría suponer que un sistemasimilar al propuesto en este trabajo podría ser diseñado para aguas residuales de diferentesindustrias.
  • 44. 34CONCLUSIONES1. Se han aislado e identificado bacterias del agua residual del hervido del corcho.Corresponden a géneros/especies conocidos como degradadores de compuestos fenólicos.2. Algunas de estas bacterias presentan elevada resistencia a fenol y clorofenoles, y puedenutilizar el fenol como única fuente de carbono y energía.3. La inmovilización de bacterias en partículas residuales de corcho ha demostrado ser unmétodo adecuado y de bajo coste para la auto-biorremediación de este residuo.4. Se han optimizado las condiciones de degradación: consorcio bacteriano inmovilizado enpartículas de corcho, adicionando al agua residual una mínima cantidad de medio decultivo y agua oxigenada en presencia de luz y a 28 ºC.
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