1. AUTO-BIORREMEDIACION DE AGUAS
RESIDUALES DEL PROCESAMIENTO DEL
CORCHO POR BACTERIAS DEGRADADORAS DE
FENOLES Y CLOROFENOLES INMOVILIZADAS
EN PARTICULAS DE CORCHO
PAOLA HERNANDEZ GALVIS
Sevilla, Diciembre de 2011
Bacterias inmovilizadas en
partículas de corcho
Agua residual del
lavado del corcho
Aislamiento e identificación
de bacterias
Resistencia a fenol
2. AUTO-BIORREMEDIACION DE AGUAS RESIDUALES DEL PROCESAMIENTO
DEL CORCHO POR BACTERIAS DEGRADADORAS DE FENOLES Y
CLOROFENOLES INMOVILIZADAS EN PARTICULAS DE CORCHO
Trabajo Fin de Máster
Máster en Genética y Biotecnología Microbiana
Este trabajo ha sido realizado en el Departamento de Microbiología y Parasitología de la
Facultad de Farmacia (Universidad de Sevilla)
TUTORA AUTORA
Eloísa Pajuelo Domínguez Paola Yamile Hernández Galvis
Sevilla, 12 de Diciembre de 2011
4. Quiero expresar mi agradecimiento a aquellas personas que me han ayudado en la
realización de este trabajo.
Especialmente quiero agradecer a mi tutora, Eloísa Pajuelo, la formación científica que de
Ella he recibido, siendo para mí un punto de referencia no solo por su alto nivel académico
sino también por la comprensión y el respeto con el que trata a las personas que la rodean.
Realmente me siento afortunada por haber tenido la oportunidad de trabajar con Ella
durante estos meses.
Quisiera mostrar mi más profundo agradecimiento al Dr. Miguel Ángel Caviedes por
haberme aceptado en su laboratorio.
De manera especial, agradezco sinceramente a todos mis compañeros de laboratorio con los
que he compartido mis buenos y malos momentos, la amistad, comprensión y a veces
paciencia que siempre, han demostrado hacia mí, a Nacho, a Julián Delgadillo, a Bouchra, a
Alejandro, a Ana Marí y a Pati. Gracias por haberme creado un ambiente de amistad y
compañerismo a mí alrededor, facilitándome la integración en el grupo.
También quisiera agradecer a mis amigos de Marchena y en particular a Marielita y a Don
José por Haberme acogido en su hogar como una hija, por haberme brindado todo el amor y
el calor de unos verdaderos padres, sin ellos no hubiera sido posible mi estancia en España.
Quisiera agradecer a mis padres y hermanos, por el constante apoyo y comprensión que
siempre me han ofrecido y el estar lejos de Ellos me hizo comprender cuanto los amaba y lo
importante que son en mi vida.; en los momentos de tristeza y soledad fueron el motor que
me impulsaba a seguir adelante y hoy me siento muy feliz por el resultado obtenido en este
trabajo, porque es el fruto del esfuerzo propio y el de muchas personas que me quieren.
Por ultimo quiero agradecer a Sergio, por su comprensión y apoyo, por demostrarme que su
amor es más fuerte de lo que pensaba y estar lejos de El me hizo comprender lo mucho que lo
amo.
Este trabajo es financiado por el MEC (proyecto BIO-2009-7766). Agradezco al Servicio de
Microscopía del CITIUS (Universidad de Sevilla) por la ayuda técnica.
5. ABREVIATURAS
API 20: Sistema estandarizado para la identificación de bacterias
ATSDR: Agency for Toxic Substances & Disease Registry
BA: Balsa de Almacenamiento
BAE: Balsa de Almacenamiento Enriquecida
BC: Balsa de Cocción
BCE: Balsa de Cocción Enriquecida
Benzoil-CoA: Benzoil – Coenzima A
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool
C 1,2O: Catecol 1,2-dioxigenasa
C 2,3O: Catecol 2,3-dioxigenasa
CWAO: Oxidación de aire húmedo catalítico
dNTP: Deoxiribonucleótidos trifosfato
DTT: 1, 4 Ditio – 1 – treitol
EHD: Descargas Electro – Hidráulicas
EPA: Environmental Protection Agency
FC: Folin` Ciocalteau
G1, 2O: Gentisato 1, 2-dioxigenasa
IARC: Agencia Internacional para la investigación del Cáncer
KPa: KiloPascal
mM: miliMolar
MTBE: metil-terbutil-éter
MMS: Medio Mínimo Suplementado
MTC: Concentration Maxima Tolerable
NCBI: National Center for Bioinformatics
NADH: Nicotinamin – Adenín Dinucleótido Reducido
PCR: Polymerase Chain Reaction
PMSF: Fluoruro de fenil-metano-sulfonilo
P3, 4O: Protocatecuato 3,4-dioxigenasa
P4, 5O: Protocatecuato 4,5-dioxigenasa
RDP: Ribosomal Database Project
rpm: revoluciones por minuto
7. 1. Título: Self-Bioremediation of cork-processing wastewaters by (chloro) phenol-
degrading bacteria immobilized onto cork particles.
Autores: I. Del Castillo; P. Hernández, I.D. Rodríguez-Llorente; M.A. Caviedes; E. Pajuelo.
Artículo aceptado en la revista “WATER RESEARCH” con revisión moderada. Nº de
referencia: WR18785. Índice de impacto: 4.546.
Ranking de esta revista según el índice de impacto:
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ENGINEERING, ENVIRONMENTAL 45 4 Q1
ENVIRONMENTAL SCIENCES 193 11 Q1
WATER RESOURCES 76 1 Q1
2. Comunicación en congreso
Autores: I. Del Castillo; P. Hernández, I.D. Rodríguez-Llorente; M.A. Caviedes; E. Pajuelo.
Título: Diseño de un sistema para la Auto – Biorremediación de aguas residuales del hervido
del corcho.
Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia de la Universidad de
Sevilla.
Congreso Nacional de la Sociedad Española de Microbiología. Junio 2011.
Tipo de comunicación: Póster.
8. ÍNDICE
1. ANTECEDENTES………………..………………………………………………............1
1.1 Generalidades de la industria productora del corcho…….……..………………........1
1.2 Aguas residuales de la industria del corcho ...…………………….……..………......2
1.3 Tratamientos para la depuración de aguas residuales……………….………….…....4
1.3.1 Métodos físico-químicos………………...…….……...…………..….…..........4
1.3.1.1 Separación de fenol en soluciones acuosas….....…..………....…........4
1.3.1.2 Destrucción de fenol en soluciones acuosas……..………...…..…….4
1.3.2 Métodos biológicos………....………………………..…………...……...…....6
1.3.2.1 Biodegradación en condiciones aerobias……….…………………….7
1.3.2.2 Biodegradación en condiciones anaerobias….…….……….…….......8
2. Objetivos………………………………………………………………………………...10
2.1 Objetivos específicos……………………….………………………………………10
3. MATERIALES Y METODOS………………………………………………………….10
3.1 Determinación de polifenoles totales en aguas residuales del corcho…………..….10
3.2 Material biológico……………..………………………………………………........11
3.3 Aislamiento e identificación de microorganismos…...………………….….……...12
3.3.1 Pruebas bioquímicas........................................................................................12
3.3.2 Extracción de ADN..........................................................................................12
3.3.3 PCR 16S...........................................................................................................12
3.4 Resistencia a fenol y clorofenoles…………….....…………..………….………......13
3.5 Degradación de fenol……………………………………………………………….13
3.6 Actividades enzimáticas de la ruta aerobia de degradación del fenol........................14
3.6.1 Fenol hidroxilasa……………..…………………………………….….……..14
3.6.2 Catecol 1,2–dioxigenasa………..………………………...……………….....14
3.6.3 Catecol 2,3-dioxigenasa…………...………………………...……………….15
3.7 Formación de “biofilms” en partículas de corcho……….……....…...………….…15
3.8 Optimización de condiciones para la biodegradación del fenol................................15
4. RESULTADOS OBTENIDOS………….………………………………......……..…....16
4.1 Cuantificación de polifenoles totales en aguas residuales del hervido del corcho....16
4.2 Aislamiento e identificación de microorganismos………………………………….17
4.2.1 Caracterización bioquímica………………………………..………...……….19
9. 4.3 Resistencia a fenol y clorofenoles…………………………………………………..20
4.4 Consumo de fenol en medio líquido......…………………………………………....22
4.5 Degradación de fenol……………………………………..…………………….…..22
4.6 Actividades enzimáticas de la vía aerobia de la degradación del fenol…………….24
4.7 Capacidad de formación de “biofilms” sobre partículas de corcho…………...…..26
4.8 Optimización de condiciones para la degradación del fenol………………………..28
5. DISCUSIÓN………………………………………………………………………….....31
6. CONCLUSIONES………………….………………………………………………...…34
7. BIBLIOGRAFIA……….……………………………………………………..………...35
10. Probablemente no va en contra de la ciencia
sugerir que en un lugar u otro existe algún
organismo que, bajo las condiciones
adecuadas, pueda oxidar cualquier sustancia.
(Gale, 1952)
11. 1
Auto-biorremediación de aguas residuales del procesamiento del corcho por bacterias
degradadoras de fenoles y clorofenoles inmovilizadas en partículas de corcho.
1. Antecedentes
La inadecuada utilización del agua y la contaminación proveniente de la industria es uno de
los principales problemas medioambientales de la actualidad. El agua es un componente
esencial en la vida del hombre que se encuentra en cantidades abundantes en la naturaleza y
ocupa grandes extensiones, pero el crecimiento poblacional y la industrialización han
aumentado la demanda y la contaminación de este recurso natural. La mayor fuente de
contaminación de las aguas superficiales y subterráneas se debe principalmente al vertido de
residuos derivados de actividades industriales.
1.1 Generalidades de la industria productora del corcho
El aprovechamiento principal del Quercus suber o alcornoque es el corcho; el alcornoque
tiene una limitada distribución geográfica. En Portugal se encuentra la masa alcornocal más
grande y mejor conservada (803.000 Has); en segundo lugar se encuentra España (725.000
Has) y detrás Argelia (463.000 Has), Marruecos (350.000 Has), Italia (150.000 Has), Francia
(65.000 Has) y Túnez (45.500 Has) (Fuente: Feria de Montado Portel, 2005). En España en
cuanto a superficie alcornocal, Andalucía es la comunidad con mayor superficie, con un 50%
del total; Extremadura ocupa el segundo lugar con un 30% de la superficie; Cataluña ocupa el
tercer lugar con 8% y el resto de comunidades representan el 11,7% de los alcornoques de
España. (Consejería de Medio Ambiente, Junta de Andalucía, 2006). Dentro de la producción
mundial de corcho, Portugal y España son los países con mayor producción anual de corcho
con un 50,5% y 22,7%, respectivamente.
La naturaleza química del corcho está dada por la suberina (40%), lignina (22%) y
polisacáridos (celulosa y hemicelulosa, 20%); a su vez está compuesto por ceras, taninos y
otros componentes extraíbles, (Gil, 1997). Actualmente se sabe que la suberina es una
combinación de ácidos grasos, aunque todavía se desconoce la composición de los mismos; se
han identificado algunos como el felogénico, esteárico, floiónico y subérico; siendo el
primero el más abundante. La suberina es inflamable e insoluble en agua, éter, cloroformo,
ácido sulfúrico, ácido clorhídrico y amoniaco, y es el mayor determinante de las numerosas
cualidades del corcho. Las células del corcho son impermeables a líquidos y gases; por lo cual
el corcho es un material idóneo para la elaboración de utensilios de pesca y flotadores en
general. Otra propiedad del corcho es la elasticidad, en virtud de la flexibilidad de sus
12. 2
membranas celulares, el tejido suberoso posee una gran capacidad para soportar presiones
fuertes. El corcho como aislante puede ser usado en diferentes situaciones por ejemplo, posee
un coeficiente de conductividad térmica de 0,035 Kcal.m/m2
para una densidad de 110Kg/m3
,
lo que sitúa a la corteza suberosa entre las sustancias más adecuadas para el aislamiento
térmico (Góngora y Benítez de Lugo, 1980). Así mismo por el efecto de elasticidad
mencionada, el corcho es un excelente aislante acústico y amortiguador de vibraciones, otras
cualidades que le permiten ser usado en la técnica de aislamiento, son la capacidad de
absorber humedad, ser inodoro, higiénico, compacto y resistente. Gracias a las propiedades
del corcho se usa en diversas áreas como: construcción, aislamiento térmico, corrección
acústica, aislamiento de vibraciones, tabiques prefabricados, revestimientos, decoración; en
la industria del frío, la industria naval, la automoción; transportes, maquinaria en general, la
industria textil, la industria química-farmacéutica y la industria pesquera, etc. El polvo o
serrín producido en el procesamiento del corcho puede ser usado como combustible o como
agente de llenado (mezclado con cola) para tapones de corcho con menor calidad y para la
producción de linóleo, producto que puede usarse en la fabricación de explosivos y en la
agricultura.
1.2 Aguas residuales de la industria del corcho
Esta industria se destaca como el grupo industrial más importante de todo el sector forestal
gracias a la fabricación de tapones para el vino y de accesorios como calzado, bolsos y demás
artículos elaborados con corcho; a pesar de que la industria corchera es considerada una
industria ecológica, ya que el corcho es un producto natural no contaminante y en la mayoría
de sus procesos de transformación el impacto ambiental puede considerarse casi nulo. Hay
que tener en cuenta que el corcho natural contiene una estructura lignificada, una serie de
compuestos tánicos o clorados que durante el proceso de cocción se hidrolizan,
transformándose en sustancias como el pentaclorofenol, el 2, 4,6–tricloroanisol y los ácidos
polifenólicos. Estos compuestos además de conferir mal sabor al vino y otros licores; por su
carácter toxico están siendo objeto de control de sus niveles en tapones de corcho y en las
aguas residuales usadas para el procesamiento de dicho material. El procesamiento del
corcho requiere un lavado a 95° C para limpiar y ablandar el material. Generalmente con la
misma agua se suelen lavar 15-20 partidas de corcho, hasta que el agua residual se vuelve de
un color negruzco y es preciso desecharla. Estas aguas en ocasiones son vertidas directamente
13. 3
a los afluentes de aguas naturales, ocasionando graves problemas medioambientales por la
elevada contaminación.
Entre los contaminantes más abundantes en el agua que afectan los diversos sistemas
biológicos encontramos los compuestos fenólicos, los cuales se caracterizan por tener un
núcleo aromático unido a un grupo hidroxil. Bajo esta definición quedan incluidos el fenol,
los fenoles di y trihídricos, los ácidos hidrobenzoicos, nitrofenoles, clorofenoles,
aminofenoles, metoxifenoles, fenoxifenoles, alquilfenoles y derivados de núcleos aromáticos
condensados (naftofenoles). Del total de los compuestos fenólicos conocidos
aproximadamente el 4% son producidos naturalmente y el 96% son de origen sintético. De los
fenoles sintéticos, los clorofenoles son los más comunes, son altamente tóxicos y persistentes
en el medio ambiente. La contaminación del medio marino por fenoles es causada
principalmente por las descarga de aguas residuales, destacando las aguas procedentes del
procesamiento de fármacos, papel, carbón, refinerías, explosivos, producción de celulosa y
madera, tintorerías, manufactura de plaguicidas y herbicidas, plásticos y resinas, entre otros
(Moussavi et al., 2009; Patel & Rajkumar, 2009; Varma & Gaikwad, 2009). Adicionalmente,
las aguas de desechos industriales son tratadas con cloro, proceso mediante el cual se forman
otros fenoles como el clorofenol, di y triclorofenol. Una vez que los compuestos fenólicos se
localizan en el agua, se pueden diluir con la misma o dispersarse en función de la fuerza y
dirección de las corrientes marinas, de igual forma son susceptibles de experimentar un
proceso de foto-oxidación cerca de la superficie acuática. Dicho proceso incluye la
hidroxilación del anillo, su condensación y dimerización, y por último, una eliminación
fotoinducida (Bianchi, T. S., M. Argyrou & H. F. Chippett, 1999).
Los fenoles pueden adsorberse en las partículas suspendidas y precipitarse posteriormente.
El comportamiento de los compuestos fenólicos en el ecosistema marino abarca también su
absorción por diversos organismos; o bien al acumularse, en los sedimentos están sujetos a la
degradación por microorganismos.
Los compuestos fenólicos en los seres humanos pueden entrar por inhalación, contacto por la
piel o ingestión, ya sea por medio de alimentos o agua contaminada; vía por la cual el fenol
ingresa rápidamente al cuerpo a través del tubo digestivo. Dicha ingestión de productos
líquidos que contienen fenol pueden producir daño intestinal grave y aun causar la muerte.
Según análisis toxicológicos realizados en animales de laboratorio beber agua con niveles de
fenol extremadamente altos puede ocasionar temblores musculares, dificultad para caminar,
alteraciones en hígado y sistema inmunológico y llevar a la muerte (ATSDR, 2008abc). No
hay ninguna evidencia que indique que la exposición al fenol produce cáncer en seres
14. 4
humanos, la IARC y la EPA han determinado que el fenol no es clasificable en cuanto a
carcinogenicidad en seres humanos (ATSDR, 2008abc). Sin embargo, existen normativas a
nivel mundial que fijan el valor máximo permisible de compuestos fenólicos en el agua. La
EPA en Estados Unidos ha fijado una concentración de una parte por millón (1 mg.L-1
) de
fenol en aguas superficiales. Por otro lado, la Unión Europea acuerda que el límite de fenoles
en agua potable y mineral es de 0,5 g.L-1
. El límite de emisiones de fenol en agua residual
son de 0,5 mg.L-1
para aguas de superficie y 1 mg.L-1
para sistemas de alcantarillado.
1.3 Tratamientos para la depuración de aguas residuales
1.3.1 Métodos físico–químicos
1.3.1.1 Separación de fenol de soluciones acuosas
- La destilación se basa en la volatilidad del fenol, este proceso demanda alta cantidad de
energía, puesto que el fenol destila a 180ºC. Se puede emplear otros procesos como la
extracción de fenol del agua con la ayuda de algunos solventes orgánicos como
hidrocarburos, compuestos oxigenados, n-hexano, ciclohexanol, benceno, tolueno, entre
otros; los cuales pueden ser más tóxicos que el fenol como es el caso del tolueno.
- La adsorción es ampliamente usada en la purificación de pequeños ríos contaminados y
aguas residuales. Algunos adsorbentes usados son el carbón activado o resinas
poliméricas. También se pueden emplear membranas de polipropileno y solventes
orgánicos tales como MTBE, cumeno y una mezcla de hidrocarburos, con una sobre
presión de 31–38 kPa, para la extracción de fenol.
1.3.1.2 Destrucción de fenol en soluciones acuosas
- Oxidación con aire húmedo no catalítico se basa en las propiedades oxidativas del
oxígeno del aire, es aplicado en tratamiento de aguas residuales, en especial cuando son
muy diluidas para incinerar y demasiado tóxicas para tratamientos biológicos. Una
mineralización completa de aguas residuales es imposible con este método, debido a que
algunos compuestos de bajo peso molecular son resistentes a la oxidación.
- Oxidación con aire húmedo catalítico (CWAO): las catálisis homogéneas de CWAO
son usualmente la transición catiónica de un metal (iones Cu y Fe). El carbón activado
también puede actuar como catalizador aunque pueda ser consumido por la oxidación.
- Polimerización oxidativa con oxígeno en presencia de enzimas: la tirosina polifenol
oxidasa y lacasa convierten los fenoles usando oxígeno en o-quinonas. (Amjad & Qay
2007). Estos compuestos también pueden ser fácilmente filtrados y/o adsorbidos en
sólidos.
15. 5
Otro tipo de oxidación puede ser la oxidación húmeda con químicos oxidantes los cuales
incluyen:
- Oxidación con ozono: consiste en que el ozono molecular actúa directamente en los
sitios nucleofílicos y radicales insaturados de los compuestos orgánicos. Sus principales
intermediarios son hidroquinona, benzoquinona y catecol, pero el principal producto es el
ácido oxálico.
- Oxidación con peróxido de hidrógeno: el H2O2 tiene una cantidad de oxígeno
efectiva, su costo es bajo, de fácil almacenamiento, manejo y sobre todo, amigable con el
ambiente. Sin embargo, la reactividad del H2O2 es generalmente baja y en gran parte
incompleta debido a su cinética.
Otra forma de empleo del H2O2 es en conjunto con una sal de hierro II (reactivo de
Fenton) para producir radicales hidroxilos, los cuales pueden oxidar compuestos
orgánicos en solución. Sin embargo, el monitoreo de la reacción de Fenton hace de éste un
proceso costoso e inhibe su uso común; además pueden producirse intermediarios mucho
más tóxicos que el propio fenol.
También existe la posibilidad de usar una polimerización oxidativa con H2O2 catalizada
por peroxidasas; sin embargo, el costo elevado de las enzimas limita su uso.
- Oxidación con otros químicos oxidantes: incluyen la oxidación con clorina, dióxido
de cloro y permanganato de potasio. Estos métodos no son amigables con el ambiente
debido a la formación de compuestos orgánicos clorados y a la dispersión de compuestos
como el Mn. Además de ser costoso, también requieren un control preciso de pH.
También se puede usar el ión ferrato (VI), el cual es un oxidante fuerte amigable con el
ambiente, pero su potencial redox decrece fuertemente por incremento de pH.
- La oxidación electroquímica: Es un proceso indirecto de electro-oxidación incluyendo
“electro-Fenton” (Mohan et al. 2007). Esta técnica puede oxidar efectivamente muchos
contaminantes orgánicos e inorgánicos en concentraciones altas de cloro. Es posible la
formación de compuestos intermediarios orgánicos clorados. El ozono también puede ser
usado como electro-oxidación, con la ayuda de mediadores (iones metálicos). Tanto la
electroxidación como la oxidación mediada por electro-Fenton, necesitan operar en medio
ácido para evitar la precipitación de los hidróxidos metálicos. Este método se ve limitado
por la adición de metales pesados que pueden formar contaminantes secundarios.
- La oxidación directa anódica por “oxígeno activo": Se basa en la electro-oxidación
de contaminantes aplicada directamente en ánodos por “oxígeno activo”. La adsorción
física del “oxígeno activo” puede causar una completa combustión de compuestos
16. 6
orgánicos. La oxidación directa no necesita añadir una alta cantidad de químicos para
aguas residuales o colocar O2 para los cátodos. No tienden a producir contaminantes
secundarios y requiere muy pocos accesorios. Lo importante de una oxidación directa
(oxidación anódica) es el material del ánodo. Sin embargo, ninguno tiene suficiente
actividad y al mismo tiempo estabilidad.
- Oxidación fotocatalítica. También se puede destruir el fenol mediante la oxidación
catalítica, se han reportado conversiones de fenol significativas por luz UV sola. Sin
embargo, la actividad en la oxidación de fenol sobre la irradiación UV puede ser
fuertemente mejorada en presencia de fotocatálisis. El TiO2 tiene actividad fotocatalítica
y ha sido usado en la destrucción de contaminantes tóxicos del ambiente. Este es
económico, no tóxico, resistente a la foto-corrosión y tiene un alto poder oxidativo. Por
otro lado, permite la adsorción de contaminantes pero también la desorción de
intermediarios y productos. Existen otros métodos de destrucción de fenol que no son
oxidativos, como por ejemplo la gasificación de fenol en agua superficial, que consiste
en la conversión de material orgánico en productos gaseosos como el H2, CO, CO2 y
CH4. La aplicación de descargas electro-hidráulicas (EHD) y electrólisis también son
empleadas para la degradación de compuestos fenólicos.
La sonicación y cavitación hidrodinámica son sistemas que proveen energía para
destruir fenol en soluciones acuosas; sin embargo, son pobremente eficientes si son
empleadas solas, sin la co-presencia de oxidantes químicos.
Según la literatura existente, se han desarrollado pocas tecnologías basadas en la
utilización de organismos vivos para el tratamiento de aguas residuales procedentes de la
fabricación del corcho, a pesar que es una industria importante en Andalucía y
Extremadura. Adicionalmente, existen otras industrias importantes como, la extracción del
aceite a partir de la aceituna, que también son generadoras de gran cantidad de
compuestos fenólicos (Cabrera y col., 1996). La existencia de bacterias capaces de
degradar el fenol en soluciones puras e incluso en las aguas procedentes del hervido del
corcho sugiere una importante aplicación de estos microorganismos en la remediación de
estos residuos.
1.3.2. Métodos biológicos
Los procesos biológicos, como la biorremediación han recibido mayor atención debido a que
son amigables con el medio ambiente (Agarry & Solomon, 2008). Además, al trabajar con
17. 7
tratamientos biológicos se evitan problemas secundarios en los efluentes, como es el caso de
los tratamientos físico-químicos, en los que se generan compuestos secundarios
potencialmente más tóxicos que el propio contaminante (Hidalgo et al., 2002; Suárez et al.,
2007; Saravanan et al., 2008). Actualmente, existen varios estudios relacionados con la
biodegradabilidad de fenol, aplicando tanto procesos aerobios como anaerobios (Bajaj et al.,
2008a; Lin et al., 2009). La biorremediación permite que los microorganismos transformen o
degraden compuestos peligrosos en agua y suelos (Muñoz et al., 2001). Muchas bacterias son
capaces de usar los compuestos aromáticos como única fuente de carbono y energía (Jiang et
al., 2004). Sin embargo, uno de los problemas que representa trabajar con fenol como única
fuente de carbono, es que el crecimiento microbiano puede sufrir una inhibición con el
sustrato, debido a que es usado en altas concentraciones; para combatir este problema se
puede colocar una fuente convencional de carbono, como la glucosa, extracto de levadura o
glutamato de sodio. Este tipo de compuestos incrementan la tolerancia celular al sustrato,
mejorando además la biodegradación de fenol. Muchos de los cultivos analizados son capaces
de degradar fenol en bajas concentraciones. Sin embargo, el fenol es tóxico para muchos tipos
de microorganismos en altas concentraciones y puede ser un inhibidor para su crecimiento.
Por lo tanto, para obtener mejores resultados, la concentración de fenol necesita ser mantenida
bajo los límites de toxicidad y se requiere de una aclimatación de los microorganismos en el
ambiente del agua residual. En el ecosistema las bacterias pueden eliminar rápidamente el
fenol, generalmente es eliminado en aire (1–2 días), en agua (9 días) y en suelo (2–5 días)
(Busca et al., 2008). Existen varias géneros bacterianos capaces de degradar fenol, entre ellos
podemos nombrar, Pseudomonas, Acinetobacter, Bacillus, Serratia, Alcaligenes,
Burkholderia, Geobacillus entre otros (Adrian y col., 2000. Hidalgo et al., 2002;
Arutchelvan, 2006; Agarry & Solomon, 2008; Van der Meer, 2008; Cordova, 2009). Sin
embargo, los compuestos haloaromáticos como los clorofenoles y pentaclorofenoles son
mucho más difíciles de degradar, aunque se conocen algunos microorganismos capaces de
realizar este proceso, tanto en condiciones aerobias como anaerobias, tales como
Sphingobium chlorophenolicum, Dechloromonas y Dehalococcoides (Smidt y de Vos, 2004;
Janssen y col., 2005; Van der Meer, 2008).
1.3.2.1 Biodegradación bajo condiciones aerobias
El primer paso de esta ruta consiste en la incorporación de grupos hidroxilos en el anillo
bencénico para lo cual los microorganismos han desarrollado una serie de rutas de oxidación,
18. 8
deshalogenación, desnitración o desulfuración, que dan lugar a un intermediario dihidroxilado
susceptible a la acción de dioxigenasas específicas que provocan la apertura del anillo. Estos
derivados dihidroxilados serán canalizados por la ruta del catecol, en la que los intermediarios
(muchos derivados aromáticos se transforman en catecol) son metabolizados mediante la ruta
orto o meta, dependiendo de la posición en la que se efectué la apertura del anillo, o por la
ruta del gentisato. Los metabolitos finales entran directamente en el metabolismo
intermediario de la célula (Figura 1). El gentisato es un metabolito dihidroxilado
intermediario de compuestos aromáticos como el antranilato (Ladd, 1962) B-naftol (Walker y
Lippert, 1965), 3- y 4-hidroxibenzoato, salicilato (Crawford y cols., 1975),
nafialenodisulfonato (Whittich y cols., 1988), m-cresol, 2,5- y 3,5-xilenol (Hopper y
Chapman, 1970). En el primer paso de esta ruta catabólica interviene la gentisato 1,2-
dioxigenasa que provoca la apertura del anillo aromático dando lugar a maleilpiruvato que
puede degradarse directamente por el metabolismo microbiano o transformarse previamente
en flimarilpiruvato mediante isomerización.
Figura 1. Rutas aerobias de biodegradación de compuestos fenólicos (de Lorenzo y Rojo,
1994).
1.3.2.2 Biodegradación bajo condiciones anaerobias: Este tipo de biorremediación es la
preferida, debido al ahorro de energía usada en la aireación con producción de menores
cantidades de lodos (Fang et al., 2006).
Existen varias vías metabólicas de degradación de fenol bajo condiciones anaerobias, en este
caso el anillo aromático no es oxidado, pero sí reducido (Rigo & Alegre, 2004). En
condiciones mesófilas se han sugerido las siguientes vías, el fenol es convertido primero a
19. 9
través de carboxilación para producir benzoato; después, es desaromatizado para formar
cicloheanocarboxilato, el cual es fraccionado para formar heptanoato y este es posteriormente
degradado a través de β-oxidación para formar valerato, propionato y acetato, o directamente
formar propionato y butirato, los cuales más tarde pueden ser degradados en acetato. Estas
vías metabólicas se basan en la presencia de enzimas que realizan reacciones de
carboxilación, descarboxilación y dehidroxilación durante la degradación anaerobia (Fang et
al., 2006).
En otra vía metabólica de degradación, el fenol es reducido en presencia de nitrato a
ciclohexanona y después a n-caproato, el cual subsecuentemente sufre una β-oxidación para
formar ácidos grasos volátiles (Figura 2. Fang et al., 2006). También, el fenol puede ser
transformado a benzoato por vía de carboxilación reductiva y después a través de la vía del
benzoil-CoA producir acetato e hidrógeno (Bell, J., Young, e., Stephens, S., 2011; Lob &
Tar, 2000).
Figura 2. Biodegradación anaerobia del fenol, vía del benzoato (Bell, J., Young, e.,
Stephens, S., 2011).
20. 10
Figura 3. Biodegradación anaerobia del fenol a través de la vía de la ciclohexanona
2. Objetivos
El objetivo general de este trabajo es la realización de un estudio de la población bacteriana
aislada en las dos balsas presentes en el proceso de tratamiento del corcho: la balsa de
cocción, donde se sumergen las planchas de corcho para sucesivos hervidos, donde se
acumulan progresivamente compuestos fenólicos, y las balsas de almacenamiento, donde se
conservan las aguas residuales procedentes del proceso hasta alcanzar un volumen suficiente
para enviar a la planta de depuración. Así mismo hemos realizado aislamientos de
microorganismos aerobios, presentes en ambas balsas, entre los cuales hemos seleccionado
aquellos con mayor capacidad de crecimiento en presencia de fenol y clorofenoles, con los
que pretendemos diseñar un inoculante que permita la eliminación de los compuestos
fenólicos hasta niveles permitidos por la normatividad vigente, para que estas aguas
residuales tratadas puedan ser vertidas en las cuencas hidrológicas.
2.1 Objetivos Específicos
- Cuantificar fenoles totales en aguas residuales del hervido del corcho a través de métodos
espectrofotométricos.
- Aislar e identificar bacterias procedentes de aguas del hervido del corcho.
- Selección de un inoculo con capacidad de degradación de fenol.
- Optimización de las condiciones para la biodegradación del fenol, con el fin de diseñar un
sistema piloto de biorremediación, como alternativa al tratamiento físico–químico de las
aguas residuales del procesamiento del corcho.
3. MATERIALES Y METODOS
3.1 Determinación de polifenoles totales en aguas residuales del corcho
Se obtuvieron muestras de aguas residuales procedentes del procesamiento del corcho de la
empresa Aglomerados Morell, S.A (Villanueva del Río, Sevilla), para determinar la
21. 11
concentración de fenoles totales. Estas muestras fueron esterilizadas por filtración y calor
húmedo para su posterior almacenamiento a -20ºC.
Se realizaron varias curvas de calibración para determinar la concentración de fenoles totales,
a partir de soluciones “stock” de 1000 ppm; de ácido tánico, ácido cafeico y fenol
(compuestos químicos que se encuentran en altas concentraciones en las aguas residuales del
procesamiento del corcho). La determinación de fenoles totales se realizó por dos métodos
espectrofotométricos: El método de Folin Ciocalteau (Box JD., 1983) y 4-aminoantipirina
(Lacoste et al. 1959).
- Método de Folin Ciocalteau: Se tomaron 10 mL de muestra: 1,5 ml de NaCO3 0,1 M: 0,5
mL de reactivo FC, se homogenizó y se esperó una hora para medir las absorbancias a 750
nm.
- Método 4-aminoantipirina: Se tomó 0,4 mL de cada muestra y se colocó 10 L de
hidróxido de potasio (KOH 0,1 M), 10 L de H2O2 30%; se homogenizó. Se añadió 0,5
mL de tampón fosfato potásico y se homogenizó. A continuación, en oscuridad se
adicionó 0,5 mL de solución de 4-aminoantipirina, se mezcló bien y posteriormente se
añadió 0,5 mL de solución de ferricianuro de potasio (K3Fe (CN)6), se homogenizó. Se
esperó 15 min y finalmente se tomó las lecturas de absorbancia de cada muestra a una
longitud de onda de 540 nm.
Las absorbancias obtenidas se extrapolaron en las curvas estándar preparadas y se determinó
la concentración de fenol presente.
3.2 Material biológico: Se utilizaron bacterias aisladas de las balsas de aguas residuales del
procesamiento del corcho procedentes de la empresa Aglomerados Morell, S.A (Villanueva
del Río, Sevilla). Las bacterias objeto de estudio se clasificaron según la balsa de
procesamiento de la siguiente manera:
a. Balsa de Cocción (BC), donde se mantienen las planchas de corcho a temperatura de 95ºC
hasta su reblandecimiento. A partir de esta balsa se aislaron las bacterias denominadas BC3,
BC4 y BC6.
b. Balsa de Almacenamiento (BA), donde se acumula el agua procedente del procesado del
corcho. A partir de este residuo se aislaron las bacterias denominadas BA3, BAC2, BAC4,
BAC5, BAC6 y BASTAF.
A si mismo parte de las muestras obtenidas de estas balsas se enriquecieron con medio TSB
en una proporción de 9:1 (muestra: TSB). El agua residual enriquecida con medio TSB se
incubó durante 48 horas a 28ºC, transcurrido este periodo se aislaron las siguientes bacterias.
22. 12
c. Balsa de Cocción Enriquecida (BCE): A partir de este residuo se aisló la cepa bacteriana
BCE5A.
d. Balsa de Almacenamiento Enriquecida (BAE): Se aislaron dos bacterias denominadas
BAE9A y BAE5A.
e. Adicionalmente se estudiaron otras cepas bacterianas, VN2, VN10, VN20, VH1 y VH2,
provenientes de sedimentos de balsas de cocción de Villanueva del Río.
3.3 Aislamiento e identificación de microorganismos
Se hizo recuento de microorganismos en todas las muestras, tanto de BC y BA como de BCE
y BAE. De estas muestras se aislaron aquellos microorganismos que mostraban morfología
de las colonias diferente, tras incubarse 24 horas a 28 ºC en placas de TSA, identificándose
con las iniciales correspondientes a la balsa de la que procedían y un número. Los organismos
aislados se caracterizaron de forma preliminar mediante tinción de Gram. (Bergey, Holt,
Krieg, & Sneath, 1994).
3.3.1 Pruebas Bioquímicas
La caracterización bioquímica de los microorganismos en estudio se realizó mediante el
sistema de identificación comercial API (API20E, API20NE, API20STAPH de Biomérieux,
Rap ID de Oxoid), siguiendo la metodología recomendada por el fabricante.
3.3.2 Extracción de ADN: para realizar este procedimiento se empleó el kit de extracción
i.genomic CTB DNA Extraction mini kit, siguiendo las instrucciones del fabricante.
3.3.3 PCR 16S
Se amplificó la región ribosómica 16S. Para cada bacteria la reacción se preparó con las
siguientes concentraciones de reactivos en un volumen final de 25l: buffer a una
concentración final de 1X, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 M de cada dNTP, 0,4 M de cada uno de
los primers específicos, 0,5 U/reacción de la enzima Taq polimerasa y 1 L de ADN a una
concentración aproximada de 40 ng/L. La reacción en el termociclador fue de 2 minutos a
95ºC, seguido de 31 ciclos de 45 segundos a 95ºC, 45 segundos a 58ºC y 45 segundos a 72ºC,
con un periodo de elongación final de 10 minutos a 72ºC. El resultado obtenido se observó en
gel de agarosa 1%, 100V, 30 minutos. El producto de la PCR se secuenció para determinar el
género y posible especie. Las secuencias obtenidas se compararon con las bases de datos de
23. 13
secuencias disponibles, Ez – Taxon, RDP y también se utilizó la herramienta BLAST de la
página WEB del NCBI, de este modo se buscaron las secuencias altamente homologas de la
base de datos de nucleótidos no redundante (nr).
3.4 Resistencia a fenol y clorofenoles
La resistencia de los aislamientos a fenoles y clorofenoles se determinó en el medio TSA
suplementado con concentraciones crecientes de estos compuestos, que van desde 0-15 mM
(fenol), 0-4 mM (4-clorofenol) y 0-3 mM (2,4-diclorofenol). Las placas fueron incubadas a 28
ºC durante 3 a 4 días. La resistencia se expresa según el índice MTC, que es la máxima
concentración del tóxico que permite el crecimiento bacteriano.
3.5 Degradación de fenol
La capacidad de degradación de fenol se probó en medios de cultivo que contenían este
compuesto como única fuente de carbono.
- Protocolo 1: Degradación de fenol en solución acuosa. Las bacterias se cultivaron en
medio mínimo (Foght et al. 1989) durante 72 h a 28ºC en agitación constante a 200 rpm.
25 mL de medio mínimo suplementado (MMS) con fenol (2,5 mM), se inoculó con 100
L de las cepas bacterianas (aprox. 108
C.F.U. /mL), alícuotas de 2 mL fueron tomadas en
intervalos de 2 horas para medir la D.O a 600 nm y determinar el crecimiento bacteriano.
Las alícuotas fueron centrifugadas a 10.000 rpm durante 10 minutos y la concentración de
fenol se determinó en el sobrenadante por el método colorimétrico de la 4-aminoantipirina
(Lacoste et al. 1959).
- Protocolo 2: Degradación de fenol por bacterias inmovilizadas en partículas de
corcho. Una colonia bacteriana fue inoculada en 2 mL de TSB y se incubo a 28ºC por 24
horas en agitación. Luego en un tubo ependorf se tomó 60 L de la suspensión bacteriana
en medio TSB y se mezcló con 1 mL de medio mínimo, 150 L de fenol (1 mM) y
partículas de corcho estériles y se incubó a 28 ° C en agitación constante a 200rpm. Como
control se usó 150 L de fenol en 1 mL de medio mínimo estéril. Después de 12 días de
incubación las partículas de corcho se pasaron por un colador y se extrajo el sobrenadante
de cada tubo mediante centrifugación a 10000 rpm por 15 minutos para obtener un
sobrenadante libre de bacterias y así evitar interferencias en la determinación del fenol
mediante el método colorimétrico 4-aminoantipirina (Lacoste et al. 1959).
24. 14
3.6 Actividades Enzimáticas de la ruta aerobia de degradación del fenol
La actividad fenol hidroxilasa, catecol 1,2-dioxigenasa y catecol 2,3-dioxigenasa se midieron
de la siguiente manera:
Cada cepa bacteriana se inoculó en medio de cultivo líquido TSB y tras 24 horas de
incubación, se adicionó 1,5 mL del medio TSB con crecimiento bacteriano en un matraz con
medio MMS suplementado con fenol 2,5 mM como única fuente de carbono. Los matraces
se mantuvieron a una temperatura de 28ºC en agitación constante a 200 rpm durante 12 días.
Posteriormente se centrifugaron las muestras a 10000 rpm por 5 minutos y se realizaron 5
lavados con tampón fosfato-potásico 50 mM pH 7 y cada bacteria se resuspendió en 1,6 mL
del mismo tampón conteniendo 1mM de PMSF y 100 M de DTT. Se realizó el rompimiento
de las células mediante sonicación (ultrasonido), las muestras se transfirieron a tubos de 5 mL
de volumen sumergidos en hielo y se sometieron a 5 ciclos de sonicación de 30 segundos,
separados por ciclos de 30 segundos de reposo. Luego se centrifugaron a 10000 rpm por 10
minutos y el sobrenadante correspondiente al extracto crudo de proteínas solubles se transfirió
a tubos limpios. Los ensayos enzimáticos se realizaron a una temperatura de 28ºC usando un
espectrofotómetro MARCA Pharmacia – LKB modelo Ultrospec III.
3.6.1 Fenol hidroxilasa: la oxidación de NADH en presencia del fenol en los extractos
celulares fue monitoreada a 340 nm. La mezcla de reacción contenía 250 L de tampón
fosfato-potásico 50 mM pH 7, 100 L de NADH (1 mM) y 500 L de extracto de proteína
(la reacción se equilibró a 55ºC durante una hora después de la adición de la muestra), se
midieron las absorbancias en el tiempo 0, a los 5, 10 y 15 minutos. Esta medida refleja las
actividades reductasas dependientes de NADH inespecíficas del extracto crudo.
Posteriormente se adicionaron 100 L de Fenol (10mM) y se midieron las absorbancias desde
el tiempo 0, y cada 10 minutos, hasta completar 3 horas. Una unidad de actividad es definida
como la cantidad de enzima que cataliza la oxidación de 1 mol de NADH por minuto
(Gibson et al. 1990).
3.6.2 Catecol 1,2-dioxigenasa: Para esta determinación se mezclaron 500 L de tampón
fosfato-potásico 50 mM pH 7, 100 L de catecol (10mM) y se equilibró la reacción a 55ºC
durante una hora después de la adición de 400 L de extracto de proteína. La formación de un
producto llamado ácido cis, cis-mucónico, se determinó mediante la absorbancia a 260 nm
25. 15
(Ornston, et al. 1966). A través de mediciones seriadas desde el tiempo 0, y cada 5 minutos,
hasta completar una hora desde el inicio de la reacción. Una unidad de actividad es definida
como la cantidad de enzima que cataliza la producción de 1 mol de cis, cis-ácido mucónico
por minuto a 55 ºC.
3.6.3 Catecol 2,3-dioxigenasa: Las condiciones de reacción son idénticas al ensayo de la
catecol 1,2-dioxigenasa, excepto por la formación del 2-semialdehidohidroximucónico que
puede ser monitoreado a 375 nm (Masai, et al. 1995).
3.7 Formación de “biofilms” en partículas de corcho
La partículas de corcho fueron recogidas en terrenos de la industria del corcho (residuos de la
industria) se homogenizaron con una maquina moledora de café y fueron tamizadas para
lograr un tamiz de 0,5 mm, estas fueron lavadas con 25 mL de HCl (10 mM) por 10 minutos y
neutralizado con un volumen apropiado de NaOH (1M), se realizaron 5 lavados con agua
estéril y se secaron al aire. Se tomaron 15 ml de medio mínimo suplementado con 2,5 mM de
fenol y 0,15 gramos de partículas de corcho fueron inoculados con las bacterias que
mostraron mayor porcentaje de degradación de fenol y se incubaron por 12 días a 28ºC en
agitación constante a 200 rpm. Posteriormente las partículas fueron transferidas a cajas de
petri y lavadas 5 veces con agua destilada estéril y se secaron al aire para luego ser teñidas
con naranja de acridina (Johansson et al., 2008). La adhesión bacteriana a la superficie del
corcho se examinó con un microscopio de epifluorescencia (Olympus BX61) usando lente de
objetivo 100X y filtro verde TRITC.
La fijación bacteriana de todas las cepas fueron analizadas por SEM (Microscopia
Electrónica de Barrido), las partículas de corcho (0,01 gr) se inocularon con 1 mL de medio
mínimo, 150 L de fenol (1 mM) y 60 L de medio TSB con inoculo bacteriano (incubado
por 24 horas), esta mezcla se mantuvo a 28ºC por 12 días y en agitación constante de 200
rpm. Transcurrido este tiempo las partículas de corcho se lavaron 5 veces con agua destilada
estéril y se fijaron durante la noche en presencia de OsO4 y luego fueron tratadas con Au para
ser observadas en un microscopio electrónico de barrido Jeol 6460LV.
3.8 Optimización de las condiciones para la biodegradación del fenol
En base a los resultados obtenidos de la resistencia y degradación de fenol, así como la
capacidad de formación de “biofilms” en la superficie del corcho se seleccionó la cepa
26. 16
BAE9A para determinar las condiciones óptimas en el proceso de biodegradación de fenol en
aguas residuales del corcho.
Se usaron dos tipos de controles, agua de corcho estéril, agua de corcho con medio TSB en
proporción (25mL: 2,5mL), agua de corcho con 250 L de H2O2, agua de corcho con 250 L
de H2O2 y 2,5 mL de TSB. La cepa BAE9A (200 L) fue inoculada con diferentes
cantidades de H2O2 (100, 150, 200, 250 y 1000 L), adición o no de medio liquido TSB (2,5
mL), y las muestras se mantuvieron en distintas condiciones de temperatura (25ºC, 28ºC y
37ºC), luz y oscuridad y en agitación constante a 200 rpm. Transcurridos 17 días de
incubación se cuantificó la cantidad de fenoles totales por los métodos de FC y 4–
aminoantipirina, usando como estándar el ácido tánico y el fenol, respectivamente. Después
de definir las condiciones ideales de incubación se realizó el mismo procedimiento con VN2,
VH1 y VH2. También se utilizaron dos consorcios bacterianos (BAE9A/BC4 y BAE9A/
BASTAF), que fueron incubados en un periodo de tiempo de 12 días.
4. RESULTADOS
4.1 Cuantificación de polifenoles totales en aguas residuales del hervido del corcho
La determinación de fenoles totales en las muestras obtenidas de las balsas del hervido de
corcho de la empresa Aglomerados Morell, S.A (Villanueva del Río), se realizó mediante los
métodos de Folin-Ciocalteau para el cual se usó como estándar el ácido tánico (el mayor
acido fenólico presente en aguas residuales del corcho) y 4–aminoantipirina, cuyo patrón de
calibración fue fenol y los resultados de la Tabla 1 muestran que el método FC es más
eficiente en la determinación de fenoles totales. El reactivo contiene fosfomolibdato y
fosfofungstato, sustancias que se usan para determinar compuestos polifenólicos (Polvoledo
& Gerletti, 1968; Berk & Schroeder, 1942; Pro, 1952; Englis et al., 1955; Swain & Hillis,
1959; Kloster, 1974; Chian, 1977). Es un método de estandarización para la determinación de
taninos y derivados de la lignina (APHA, 1971, 1976), lo cual lo hace específico para el
análisis de compuestos fenólicos en aguas residuales del corcho donde se encuentran un alto
porcentaje de sustancias derivadas de la lignina (componente principal del corcho) y de
compuestos tánicos. Sin embargo el método de la 4–aminoantipirina es muy sensible en la
determinación de fenoles (APHA, 1976), exceptuando los compuestos fenólicos que tienen
como sustituyente un grupo halógeno, carboxilo o metoxilo. En el caso de los nitrofenoles,
el grupo nitro en la posición meta inhibe la reacción y en la posición orto la bloquea (Faust &
27. 17
Mikulewiez, 1967a), por lo cual usamos los dos métodos estándar para la determinación de
compuestos fenólicos, el FC y 4-aminoantipirina (APHA, 1971, 1976) en aguas residuales del
lavado del corcho.
Tabla 1. Cuantificación de polifenoles totales (mg.L-1
) en muestras de aguas residuales del
hervido de corcho de la empresa Aglomerados Morell, S.A (Villanueva del Río).
4.2 Aislamiento e identificación de bacterias procedentes de aguas residuales del
procesamiento del corcho:
Se analizaron 17 cepas bacterianas en total, de las muestras de las balsas de almacenamiento
(BA y BAE) y cocción (BC y BCE) se aislaron bacterias Gram negativas y Gram positivas, a
diferencia de las muestras obtenidas de sedimentos donde se identificaron solamente bacterias
Gram positivas. Entre los microorganismos presentes en aguas residuales del procesamiento
del corcho se encontraron bacterias Gram positivas como Bacillus, Arthrobacter y
Staphylococcus y Gram negativas como Stenotrophomonas, Acinetobacter, Serratia y
Enterobacter. La Tabla 2 muestra la identificación de los microorganismos mediante tinción
de Gram (Bergey, Holt, Krieg, & Sneath, 1994), sistema comercial API (API20E, API20 NE,
API STAPH de Biomérieux, Rap ID de Oxoid) y 16S, las secuencias obtenidas se compararon
con las bases de datos de secuencias disponibles, Ez–Taxón, RDP y también se utilizó la
herramienta BLAST de la página WEB del NCBI, los datos obtenidos en esta última base de
datos fueron los de mayor porcentaje de identidad.
Muestra agua de
corcho
FC –acido tánico
(mg.L-1
)
4 –aminoantipirina -
fenol (mg.L-1
)
AC # 1 0,85 0,91
AC # 2 0,82 0,90
AC # 3 0,85 0,84
AC # 4 0,84 0,83
AC # 5 0,78 0,75
AC # 6 0,81 0,76
AC # 7 0,80 0,82
AC # 8 0,76 0,74
MEDIA 0,814 0,819
R2
0.9883 0.9865
29. 19
4.2.1 Caracterización bioquímica de bacterias procedentes de aguas residuales del
procesamiento del corcho.
Tabla 3. Resultados de las pruebas bioquímicas de la galería API20NE y API20E para las
bacterias Gram negativas
Figura 5. Imagen de los resultados del API20NE y API20E para bacterias Gram negativas
API20NE API20E
NO –ENTEROBACTERIAS BAE5A BAE9A BA3 ENTEROBACTERIAS BC3 BC4
REDUC. DE NITRATOS A NITRITOS + + + B – GALACTOSIDASA + +
REDUC. NITRATOS – NITROGENO - - - ARGININA –
DIHIDROXILASA
- +
FORMACION DE INDOL - - - LISINA –
DesCARBOXILASA
+ -
FERMENTACION DE GLUCOSA + + - ORNITINA-
DesCARBOXILASA
+ +
ARGINININA DIHIDROLSA - - - CITRATO + +
UREASA - + - PRODUCCION DE H2S - -
HIDROLASA - - + UREASA - -
B – GLUCOSIDASA - - - TRIPTOFANO
DEAMINASA
- -
PROTEASA - - + PRODUCCION- INDOL - -
ASIMILACION DE GLUCOSA - - - PROD. DE ACETOINA + +
ARABINOSA - - - GELATINASA + -
MANOSA - - - FER. GLUCOSA + +
MANITOL - - - MANITOL + +
N – ACETIL GLUCOSAMINA - - - INOSITOL + -
MALTOSA - - + SORBITOL + +
GLUCONATO POTASICO - - - RHAMNOSA - +
ACIDO CAPRICO - - - SACAROSA + +
ACIDO ADIPICO - + - MELIBIOSA + +
MALATO - + - AMYGDALINA + +
CITRATO SODICO - + - ARABINOSA - +
AC. FENILACETICO - + - OXIDASA - -
OXIDASA - - - CATALASA + +
CATALASA + + + - - -
30. 20
Tabla 4. Resultados de las pruebas bioquímicas de la galería API STAPH para cocos Gram
positivos/catalasa +
4.3 Resistencia a fenoles y clorofenoles
En todas las bacterias aisladas se probó su resistencia a compuestos fenólicos. Los resultados
se muestran en la Tabla 5. La resistencia a fenol fue variable que va desde una concentración
de 5 a 15 mM. Dos cepas fueron capaces de crecer en la concentración máxima probada
(BAE9A y VN10). La resistencia a los clorofenoles se determinó en las 17 cepas. Las cepas
más resistentes al 4–clorofenol fueron BC4, BC6, BCE5A y VH2 y al 2,4–diclorofenol fueron
VN2, VN10 y VH2.
APISTHAP BASTAF BAC4 BAC6 VN10
D – GLUCOSA + + + +
FRUCTOSA + + + -
MANOSA + + - -
MALTOSA + + + -
LACTOSA + + + -
TREHALOSA + + + -
MANITOL - + + -
XILITOL - - - -
MELIBIOSA - - - -
REDUCCION DE NITRATOS A
NITRITOS
- + - -
FOSFATASA ALCALINA + + - +
ACETIL- METIL-CARBINOL - + + -
RAFINOSA - - - -
XYLOSA - + - -
SACAROSA + + + -
METIL – GLUCOPIRANOSIDA - - - -
N – ACETIL - GLUCOSAMINA - + + -
ARGININA DiHIDROLASA + - - +
UREASA + + - -
OXIDASA - - - -
CATALASA + + + +
31. 21
Tabla 5. Resistencia al fenol de bacterias aisladas de aguas residuales del lavado del corcho
Figura 6. Imagen de placas control y bacterias resistentes a una concentración de 15 mM de
Fenol
CEPA Máxima identidad ( 16S r DNA)
CMT (mM)
fenol 4–clorofenol 2,4–diclorofenol
BA3 Stenotrophomonas maltophila 100% 5,0 1,0 1,0
BAE5A Acinetobacter sp. 100% 7,5 1,0 1,0
BAE9A Acinetobacter soli 100% 15,0 2,0 1,5
BC3 Serratia spp. 98% 7,5 1,0 1,0
BC4 Enterobacter sp. 98% 7,5 2,5 2,0
BC6 Bacillus cereus/ thuriengiensis 99% 10,0 2,5 2,0
BCE5A Arthrobacter arilaitensis 99% 5,0 2,5 1,0
BASTAF Staphylococcus warneri 99% 7,5 1,0 1,5
BAC2 Bacillus cereus 99% 10,0 2,0 1,0
BAC4 Staphylococcus saprophyticus 98% 7,5 1,5 2,0
BAC6 Staphylococcus sp. 98% 10,0 1,5 2,0
VN2 Bacillus benzoevorans 99% 12,5 2,0 2,5
VN10 Staphylococcus pasteuri 99% 15,0 2,0 2,5
VN20 M. hydrocarbonoxydans/carbonoxydans 99% 7,5 1,5 1,0
VH1 Bacillus weihenstephanensis 93% 5,0 1,0 1,0
VH2 Pseudomonas putida 98% 12,5 2,5 2,5
32. 22
4.4 Consumo de fenol en medio líquido
La habilidad bacteriana para degradar fenoles se investigó en dos niveles, primero se analizó
la capacidad de las 17 cepas de utilizar el fenol como única fuente de carbono y energía (Fig.
7) y en segundo lugar se determinó las actividades de las primeras enzimas implicadas en la
degradación de fenol, la fenol hidroxilasa, las catecol 1,2 dioxigenasa y la catecol 2,3
dioxigenasa, con el fin de conocer si la ruptura del anillo aromático se produce en la posición
orto o meta.
4.5 Degradación de fenol
Las cepas fueron cultivadas en medio mínimo suplementado con 2,5 mM de fenol como
única fuente de carbono y energía. La densidad óptica a 600 nm se midió como un parámetro
de crecimiento bacteriano. Por otro lado, se evaluó la desaparición de fenol en el medio de
cultivo. Los resultados se muestran en la Figura 8. La capacidad de crecer en fenol como
única fuente de carbono varía entre cepas. En la mayoría de cepas se observó un retraso del
crecimiento de 2h-4h aproximadamente, Después de este período algunas cepas como:
BAE9A, VN2, VN10, VN20, VH1 y VH2 mostraron una tasa de crecimiento rápido en
presencia de fenol. Por el contrario, BA3, BAE5A, BASTAF, BAC2, BAC4, BAC5, BAC6,
BC3, BC4, BC6 y BCE5A mostraron una fase de latencia más larga (6 horas) y una tasa de
crecimiento más lento en comparación con las cepas anteriores. BAE9A, VN2, VH1 y VH2
parecen ser las bacterias degradadoras de fenol más eficientes. Una disminución significativa
de fenol se detectó después de 8 horas con las otras cepas bacterianas (Fig. 8).
Figura 7. Concentración final de fenol en medio liquido expresado en (%) de cepas
bacterianas aisladas de aguas residuales del corcho
33. 23
Figura 8. Degradación de fenol por bacterias aisladas de aguas residuales del procesamiento
del corcho
CRECIMIENTO
BACTERIANO D.O 600
FENOL EN EL
SOBRENADANTE D.O 540
34. 24
4.6 Determinación de actividades enzimáticas de la vía aerobia de la degradación del fenol
En todas las bacterias capaces de crecer en presencia del fenol se midió la actividad de la
fenol hidroxilasa. Las cepas que tienen el nivel más alto de actividad enzimática fueron VH1
y BAE9A (Fig. 9), coincidiendo con las de mayor consumo de fenol y tolerancia, seguidas por
BC3 y BC4 que son bacterias capaces de crecer en un medio con fenol como única fuente de
carbono y energía (Figura 8). La menor actividad fenol hidroxilasa se observó en las cepas
VN10, VN20, BAE5A y BCE5A, mientras que BA3 y BC6 muestran niveles casi
indetectables (Fig.9). No se observó actividad fenol hidroxilasa utilizando NADPH como
donante de electrones en ninguna de las cepas.
Las actividades enzimáticas catecol 1,2 y 2,3 dioxigenasas también fueron mediadas en todas
las cepas para saber si la ruptura del anillo ocurría en la posición orto o meta. La actividad de
la catecol 2,3 dioxigenasa mostró un valor superior respecto a la a la catecol 1,2 dioxigenasa
(Tabla 6). Sin embargo, en algunas cepas como BC6, BA3, BAE5A y BASTAF, la diferencia
de valores entre la vía meta y orto es muy alta, lo que indica que la degradación de fenol se da
principalmente por la vía meta. Por el contrario, cepas como (BAC2, VN20 y VH2) parecen
llevar a cabo la degradación de fenol por las dos vías, de forma simultánea. La cepa BAE9A
mostró los niveles más altos de degradación de fenol en medio de cultivo. Estos datos
fueron confirmados con la determinación de la concentración final de fenol que queda en el
sobrenadante de los cultivos, evidenciando que BAE9A es una bacteria degradadora de fenol
muy eficiente, ya que sólo el 20% de fenol se mantuvo en el sobrenadante después de 5 días
de incubación (Figura 7).
35. 25
Figura 9. Actividad fenol hidroxilasa de bacterias aisladas del agua residual del hervido del
corcho.
NADH – FENOL
HIDROXILASA
36. 26
Tabla 6. Actividades enzimáticas de la vía de degradación del fenol en extracto crudo de
bacterias procedentes de aguas residuales del procesamiento del corcho.
Bacteria Fenol
hidroxilasa
(mU. mL-1
)
Catecol 1,2–
dioxigenasa
(mU. mL-1
)
Catecol 2,3-
dioxigenasa
(mU. mL-1
)
Relación
meta/orto
BA3 0,20 0,05 1,90 38,0
BAE5A 1,80 0,11 4,60 42,0
BAE9A 4,75 1,43 37,5 27,0
BC3 2,20 0,40 2,10 5,3
BC4 3,50 0,43 2,00 4,7
BC6 0,07 0,10 5,70 57,0
BCE5A 1,50 0,40 2,50 6,3
BASTAF 2,11 0,05 2,6 52,0
BAC2 2,00 1,52 2,30 1,5
BAC4 2,30 0,60 2,40 4,0
BAC5 2,30 0,50 2,00 4,0
BAC6 2,20 0,30 1,90 6,3
VN2 2,30 0,30 5,20 17,3
VN10 1,40 0,80 4,00 5,0
VN20 1,00 0,80 1,80 2,3
VH1 6,10 1,00 4,80 4,8
VH2 2,00 0,80 1,30 1,6
4.7 Formación de “biofilms” sobre partículas de corcho
En las industrias del corcho, por lo general hay una capa residual de partículas de corcho
pequeñas en el suelo, que son residuos del proceso de fabricación. También hay algunas
piezas de corcho de baja calidad, espesor inadecuado u otros defectos, estas partículas
podrían ser utilizadas como soporte para la inmovilización de las bacterias. La capacidad de
formar “biofilms” en la superficie de las partículas de corcho fue evaluada. Las cepas
bacterianas se incubaron con pequeñas partículas de corcho y crecieron en presencia de fenol
2,5 mM como única fuente de carbono, con el fin de evaluar el efecto de este compuesto en la
fijación de las bacterias a las partículas de corcho. Cuando se observó bajo el microscopio de
fluorescencia, las partículas control incubadas sin bacterias mostraron un nivel de fondo de
autofluorescencia (Figura 10.A), con zonas verdes oscuras. Sin embargo, cuando las
37. 27
partículas de corcho se incubaron en presencia de bacterias, se observó una intensa
fluorescencia verde (Fig. 10.B). En la figura 10 C.D. Podemos observar la adhesión de un
gran número de bacterias a la superficie del corcho.
También hemos confirmado la inmovilización bacteriana en las partículas de corcho residual
por medio de microscopia electrónica de barrido (Fig. 11). La estructura del corcho contiene
una gran superficie de pared celular vegetal que parece ser un material adecuado para
inmovilización bacteriana (Fig. 11 A, B). De hecho, hemos observado que la cepa BAE9A,
que es una degradadora de fenol eficiente, es capaz de colonizar y crecer sobre las de
partículas de corcho, con una cobertura superficial muy alta (Fig. 11C). Otra cepa bacteriana
con resistencia y capacidad de degradación de fenol intermedia, como BC6 mostró una menor
densidad sobre la superficie del corcho (Fig. 11D). Estos resultados indican que las partículas
de corcho son un soporte adecuado para inmovilizar las bacterias aisladas de aguas residuales
del procesamiento de dicho material. (Fig.12).
Figura 10. Evaluación de formación de “biofilms” sobre partículas de corcho incubadas con
bacterias en MMS suplementado con fenol 2,5 mM. La fijación bacteriana se observó
mediante tinción de naranja de acridina. A. Control; partículas de corcho incubadas con
medio sin bacterias, que muestra el nivel de autotofluorescencia de las partículas, B.
partículas de corcho incubadas con la cepa BCE5A, C y D. adhesión bacteriana en la
superficie del corcho; C (BC6) y D (BC4).
C
C
A B
D
38. 28
Figura 11. Evaluación de la formación de “biofilms” sobre la superficie del corcho por SEM.
A. Estructura de partícula de corcho. B. Control sin bacterias. C. Colonización de la superficie
del corcho por la cepa BAE9 A. D. Colonización de la superficie del corcho por la cepa BC6.
Figura 12. Capacidad de colonización y adhesión sobre la superficie de partículas de corcho
4.8 Optimización de condiciones para la degradación del fenol
Por medio de los métodos de FC y 4–aminoantipirina se determinó la concentración de
fenoles totales en muestras de agua de corcho inoculadas con BAE9A, VN2, VH1 y VH2
(cepas de estudio con mayor resistencia y degradación de fenol), bajo diferentes condiciones
VN10
A B
C D
VN10
39. 29
de temperatura, luz, adición de glucosa (TSB), H2O2 y con un periodo de incubación de 17
días. Los resultados obtenidos mostraron que las condiciones ideales que le permiten a las
cepas BAE9A, VN2, VH1 y VH2 degradar con mayor eficiencia compuestos fenólicos son:
- Adición de una fuente mínima de glucosa a la muestra de agua de corcho en una
proporción de (1:10), ya que al aumentar la cantidad de glucosa adicional se puede
inhibir la utilización del fenol como fuente de carbono y energía.
- Adición de H2O2 (250 L) para potenciar la reacción enzimática microbiana, pero al
aumentar la cantidad de H2O2 hasta 1 mL se observa una disminución en la degradación
de compuestos fenólicos por parte de las cepas bacterianas analizadas. Esta disminución
se puede deber al efecto tóxico del H2O2 a ésta concentración.
- Las condiciones de temperatura de 28ºC y luz constante durante el periodo de incubación,
fueron las que mostraron mejores resultados de degradación en las cepas BAE9A, VN2,
VH1 y VH2 (Fig. 13).
Figura 13. Optimización de condiciones de incubación para bacterias degradadoras de
fenol aisladas del agua residual del hervido del corcho
Matraz A. Control de agua de corcho estéril
Matraz B. Temperatura 28ºC, luz, TSB, H2O2 y BAE9A.
Matraz C. Temperatura 28ºC, oscuridad, H2O2, TSB y
BAE9A.
Matraz D. Temperatura 37ºC, luz, H2O2, TSB y BAE9A.
Matraz E. Temperatura 25ºC, luz/ oscuridad, H2O2, TSB,
y BAE9A.
A B C D E
40. 30
Por el método FC (estándar: acido tánico) y bajo las condiciones óptimas mencionadas
anteriormente BAE9A degradó el 76% (0,19 mg/L), VN2 el 70% (0,24 mg/L), VH1 el 60%
(0,32 mg/L) y VH2 el 62% (0,31 mg/L) y por el método 4–aminoantipirina (estándar: fenol),
BAE9A degradó el 61% (0,32 mg/L), VN2 el 54% (0,37 mg/L), VH1 el 47% (0,43 mg/L) y
VH2 el 51% (0,39 mg/L) de fenoles totales presentes en las muestras de agua de corcho
analizadas ( Fig. 14).
Figura 14. Determinación de polifenoles totales en las cepas BAE9A, VN2, VH1 y VH2
El uso de dos consorcios bacterianos (BAE9A/BC4 y BAE9A/BASTAF) mostró un aumento
de la degradación de compuestos fenólicos, ya que bajo las mismas condiciones de incubación
(excepto el tiempo: 12 días) y por el método de FC, BAE9A degrada 53% (0,38 mg/L), el
consorcio BAE9A/BC4 degrada el 73% (0,23 mg/L) y BAE9A/BASTAF degrada el 72%
(0,24 mg/L). Por el método de la 4–aminoantipirina BAE9A degrada 41% (0,48 mg/L),
BAE9A/BC4 degradan el 52% (0,40 mg/L) y BAE9A/BASTAF degradan el 44% (0,46 mg/L)
de fenoles totales presentes en el agua residual del lavado del corcho.
Figura 15. Determinación de polifenoles totales en agua de corcho inoculada con dos
consorcios bacterianos (BAE9A/BC4 y BAE9A/BASTAF)
41. 31
DISCUSIÓN
La producción del corcho es una industria muy importante en Extremadura y Andalucía, y
está constituida por pequeñas empresas. El hervido del corcho genera residuos tóxicos que
contienen altas concentraciones de fenoles y clorofenoles (Benítez et al., 2006; Domínguez et
al., 2007; Pintor et al., 2011). Las aguas residuales se almacenan en grandes tanques cerca de
las industrias del corcho y se transportan en contenedores a una estación de depuración
común. La remediación de las aguas residuales antes de verterlas en los afluentes naturales se
encuentra estipulada en las leyes ambientales. Los procedimientos físico–químicos para el
tratamiento de aguas residuales son de alto consumo energético y son muy costosos,
especialmente para las pequeñas empresas.
La biorremediación permite el uso de microorganismos para la recuperación del suelo y el
agua como una alternativa frente a los métodos físico-químicos tradicionales (Singh y Ward,
2004; Stapleton y Singh, 2002). La biorremediación es un método con una aceptación cada
vez mayor, tanto a nivel científico como público, siendo rentable, efectiva y amigable con el
medio ambiente. Muchos microorganismos con capacidad para degradar compuestos
fenólicos han sido descritos, tanto en condiciones aeróbicas (Pseudomonas, Burkholderia,
Sphingomonas, Ralstonia, Arthrobacter, Acinetobacter, Alcaligenes, Microbacterium), como
anaeróbicas (Desulfitebacterium, Dehalomonas, Dehalococcoides, Dehalobacter) (Bunge,
2003; Chan et al, 2003; Díaz, 2004; Furukawa, 2003; Parvanov y Topalova de 2008, Van der
Meer, 2008; Wang et al, 2005).
A pesar de esto, hay poca información disponible sobre el uso de microorganismos para la
remediación de las aguas residuales del procesamiento de corcho. Algunos estudios
preliminares han llevado a cabo el aislamiento de bacterias Gram negativas como
Pseudomonas, Klebsiella, Stenotrophomonas y Burkholderia de este residuo (Días-Machado
et al., 2006). Estas bacterias se han utilizado, en combinación con ozono y se ha logrado la
eliminación de hasta un 90% de carbono orgánico total de las aguas residuales de corcho.
En este trabajo, se han aislado bacterias aerobias cultivables a partir de aguas residuales de la
industria del corcho. Todas las cepas fueron analizadas en cuanto a su capacidad de resistir y
degradar fenol. Las cepas fueron identificadas y se encontraron bacterias Gram negativas
como Acinetobacter, Enterobacter, Serratia y Stenotrophomonas y algunas bacterias Gram
positivas como Arthrobacter y Bacillus. Se ha descrito que estos géneros bacterianos son
degradadores de fenol y clorofenoles (Solyanikova y Golovleva, 2004).
42. 32
La resistencia al fenol en estas bacterias es variable, entre 2,5 y 15 mM; dos cepas fueron
capaces de tolerar 15 mM fenol. Varias cepas fueron capaces de crecer en presencia de fenol
como única fuente de carbono. Para saber, si las bacterias eran capaces de degradar el fenol
además de tolerarlo, se han llevado a cabo experimentos de consumo de fenol, determinando
el fenol residual que queda tras la incubación. Algunos microorganismos como VN20
degradan bajas concentraciones de fenol (88% de fenol queda en la disolución), mientras
BAE9A es capaz de degradar eficientemente el fenol (reduce la concentración de fenol al
20%). La presencia de actividad fenol hidroxilasa, la primera enzima en la ruta de
degradación aerobia del fenol, se confirmó en todas las cepas en estudio. Un análisis
preliminar también se realizó con el fin de saber si la vía de degradación siguió la ruta orto o
meta. Algunas de las cepas parecen degradar fenol, principalmente por la vía meta como
(BA3, BAE5A, BC6 Y BASTAF), mientras que algunas otras como (BAC2,VN20 y VH2),
parecen usar las dos vías simultáneamente.
La capacidad de formar “biofilms” es una característica importante para una cepa bacteriana
que va ser usada en la biorremediación de aguas residuales. Bacterias inmovilizadas son más
estables que las bacterias de vida libre, y son capaces de realizar la degradación de
contaminantes por períodos más largos y de una manera más eficiente. La Inmovilización
mejora la viabilidad, la durabilidad y la estabilidad de los cultivos microbianos para la
biorremediación (Fantroussi y Agathos, 2005; Tavares dos Passos et al 2010). Diferentes
productos residuales han sido utilizados como soportes para inmovilizar cultivos, tales como
tuberías, columnas de relleno, carbón activado granulado, cáscara de coco, etc. (Amuda e
Ibrahim, 2006; Carvalho et al 2001; Chan et al, 2003; Eker y Kargi, 2006; Shieh et al, 1990;
Wobus et al, 1995). Por lo tanto, la capacidad de formar biofilms se puso a prueba, sobre la
superficie del corcho. Las partículas de corcho que tienen una distribución de tamaño
insuficiente para ser utilizadas en la fabricación de aglomerados son quemadas para producir
energía (Gil, 1996), por lo cual, planteamos la posibilidad de usar estas partículas como
soporte de inmovilización bacteriana, puesto que varias cepas fueron capaces de multiplicarse
y colonizar la superficie del corcho en presencia de fenol como única fuente de carbono y
energía.
Teniendo en cuenta todos los resultados anteriores (resistencia y capacidad de degradación de
fenol y clorofenoles, y la formación de “biofilms” en la superficie del corcho), finalmente,
cuatro cepas bacterianas (BAE9A, VN2, VH1 y VH2) fueron consideradas como las mejores
candidatas para diseñar un sistema de auto-biorremediación, basado en la degradación de
fenoles y clorofenoles por bacterias inmovilizadas en partículas de corcho.
43. 33
Cuando un procedimiento de biorremediación se va a diseñar, es importante la obtención de
una ganancia económica adicional. En nuestro trabajo es posible lograr este objetivo, porque
existe gran cantidad de partículas de corcho en el suelo de dicha industria, que son el
resultado de los diferentes tratamientos de este material, siendo un producto residual. En
nuestro caso, el sistema de auto-biorremediación propuesto tiene ventajas como, el uso de
bacterias nativas de las balsas de procesamiento del corcho y la utilización de partículas
residuales, como soporte para la inmovilización bacteriana. Las condiciones para mejorar la
detoxificación de fenol (temperatura, luz, consorcio bacteriano y adición de nutrientes, etc)
fueron optimizadas y se ha constatado que las mejores condiciones son:
- Consorcio bacteriano compuesto por BAE9A/BC4 inmovilizados en partículas de corcho
- Adición de medio de cultivo (10%V:V)
- Temperatura de 28 ºC y luz constante
- H2O2 (3,3 g/mL)
Por otra parte, es importante resaltar que existen otras actividades industriales en nuestra
región que también generan aguas residuales con un alto contenido de compuestos fenólicos,
tales como la extracción de aceite de oliva (Cabrera et al, 1996) o la fabricación de fármacos,
papel, carbón, refinerías, explosivos, producción de celulosa y madera, tintorerías,
manufactura de plaguicidas y herbicidas, plásticos y resinas, entre otros (Moussavi et al.,
2009; Patel & Rajkumar, 2009; Varma & Gaikwad, 2009). Se podría suponer que un sistema
similar al propuesto en este trabajo podría ser diseñado para aguas residuales de diferentes
industrias.
44. 34
CONCLUSIONES
1. Se han aislado e identificado bacterias del agua residual del hervido del corcho.
Corresponden a géneros/especies conocidos como degradadores de compuestos fenólicos.
2. Algunas de estas bacterias presentan elevada resistencia a fenol y clorofenoles, y pueden
utilizar el fenol como única fuente de carbono y energía.
3. La inmovilización de bacterias en partículas residuales de corcho ha demostrado ser un
método adecuado y de bajo coste para la auto-biorremediación de este residuo.
4. Se han optimizado las condiciones de degradación: consorcio bacteriano inmovilizado en
partículas de corcho, adicionando al agua residual una mínima cantidad de medio de
cultivo y agua oxigenada en presencia de luz y a 28 ºC.
45. 35
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