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PCR     Polymerase Chain Reaction   <ul><li>Es la amplificación de DNA  in vitro  por medio de la polimerización en cadena...
Polimerasa Chain Reaction: Reacción en Cadena de la Polimerasa   <ul><li>Fue diseñada por el Dr. Kary Mullis en 1987.  </l...
Termociclador Es una máquina que calienta y enfría la reacción en periodos cortos de tiempo. Es el aparato que ciclifica l...
<ul><li>1. Desnaturalización:  Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla. </li></ul><ul><l...
<ul><li>2. Apareamiento o “anneling”: </li></ul><ul><li>Los cebadores “primers” previamente diseñados, reaccionan con la h...
<ul><ul><li>3.   Polimerización o Extensión.  </li></ul></ul><ul><ul><li>Una Polimerasa de DNA extiende los “primers”, en ...
 
En el PCR hay una amplificación exponencial
Reactivos necesarios para PCR: <ul><li>Amortiguador (Buffer):  50mM KCl, 10mM Tris. Cl (pH 8.3 a temperatura ambiente) y 1...
Reactivos necesarios para PCR: <ul><li>Cebadores “primers”:   Son secuencias cortas de nucleótidos 20-24 nucleótidos de lo...
<ul><li>En un principio, la polimerasa de DNA que se utilizaba era de la bacteria  E. coli ,  pero esta es   sensitiva a a...
Análisis de la Muestra <ul><li>La detección del producto de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electroforético...
Análisis de la Muestra <ul><li>En algunos casos, los productos amplificados poseen secuencias que son reconocidas por endo...
Ventajas del “PCR” <ul><li>A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una cantidad considerable para el estud...
Desventajas  del “PCR” <ul><li>Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se conoce por lo menos una mínima ...
 
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  1. 2. PCR Polymerase Chain Reaction <ul><li>Es la amplificación de DNA in vitro por medio de la polimerización en cadena de DNA utilizando un termociclador. </li></ul><ul><li>El propósito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de DNA. </li></ul><ul><li>Se realiza la amplificación de un segmento específico de DNA, teniendo poco material disponible. </li></ul>
  2. 3. Polimerasa Chain Reaction: Reacción en Cadena de la Polimerasa <ul><li>Fue diseñada por el Dr. Kary Mullis en 1987. </li></ul><ul><li>Ganó el premio Nóbel de Química en 1993 por su invento. </li></ul><ul><li>Utilizo el PCR para amplificación del gen de  -hemoglobina humana, y el diagnostico prenatal de anemia falciforme. </li></ul>
  3. 4. Termociclador Es una máquina que calienta y enfría la reacción en periodos cortos de tiempo. Es el aparato que ciclifica las temperaturas necesarias para que se lleve a cabo la replicación del ADN requerido, por lo tanto, es programable .
  4. 5. <ul><li>1. Desnaturalización: Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla. </li></ul><ul><li>-Típicamente se usa una temperatura de 95 ˚C - 97˚C, por 15 a 40 segundos –el tiempo depende del tamaño del genoma- </li></ul>El proceso de “PCR” incluye 3 pasos básicos que se repiten 25 veces o más:
  5. 6. <ul><li>2. Apareamiento o “anneling”: </li></ul><ul><li>Los cebadores “primers” previamente diseñados, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares específicos por complementariedad de bases. Para esto, se baja la temperatura -ej: 55˚C por 30 segundos-. La temperatura y el tiempo puede variar entre cebadores según sea el caso. </li></ul>
  6. 7. <ul><ul><li>3. Polimerización o Extensión. </li></ul></ul><ul><ul><li>Una Polimerasa de DNA extiende los “primers”, en el espacio comprendido entre ambos “primers”, y coloca dinucleotidos trifosfatados (dNTP’s) de 5’a 3’ leyendo el DNA de 3’a 5’. De estas forma sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de DNA molde </li></ul></ul><ul><ul><li>Se efectúa a 70 ˚C por 1½ minutos (puede variar según sea necesario) </li></ul></ul>Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario.
  7. 9. En el PCR hay una amplificación exponencial
  8. 10. Reactivos necesarios para PCR: <ul><li>Amortiguador (Buffer): 50mM KCl, 10mM Tris. Cl (pH 8.3 a temperatura ambiente) y 1.5 mM MgCl2. </li></ul><ul><li>MgCl2 : Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se usa 25mM -Es un cofactor para la función de la polimerasa- </li></ul><ul><li>dNTP’s (Dinucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP, dCTP, dTTP. </li></ul><ul><li>-La concentración de dNTPS, es proporcional al tamaño del fragmento que se desea amplificar. Ej: Si vamos a amplificar un fragmento de 500pb vs uno de 5500 pb, necesitamos más concentración de dNTPS para el de 5500pb. </li></ul><ul><li>-Generalmente, se usa una concentración de 200  M de cada uno. </li></ul>
  9. 11. Reactivos necesarios para PCR: <ul><li>Cebadores “primers”: Son secuencias cortas de nucleótidos 20-24 nucleótidos de longitud, complementarias a una región del DNA que se quiere amplificar. -Se usa a concentración de 1  M- </li></ul><ul><li>DNA molde: El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000 nucleótidos de longitud. </li></ul><ul><li>El mínimo va de 10-100 ng. y el máximo entre 400-500 ng. </li></ul><ul><li>Polimerasa: Generalmente se usa 2 unidades por reacción. </li></ul>
  10. 12. <ul><li>En un principio, la polimerasa de DNA que se utilizaba era de la bacteria E. coli , pero esta es sensitiva a alta temperatura, por lo que había que añadir enzima fresca al comenzar el tercer ciclo. </li></ul><ul><li>Se reemplazo la enzima por la de la bacteria “ Thermus aquaticus ” conocida como Taq pol </li></ul>Polimerasa
  11. 13. Análisis de la Muestra <ul><li>La detección del producto de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electroforético. </li></ul><ul><li>Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución que deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones. </li></ul>
  12. 14. Análisis de la Muestra <ul><li>En algunos casos, los productos amplificados poseen secuencias que son reconocidas por endonucleasas </li></ul><ul><li>Hibridación, Southern Blot </li></ul>
  13. 15. Ventajas del “PCR” <ul><li>A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una cantidad considerable para el estudio que se vaya a realizar. </li></ul><ul><li>El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y análisis. </li></ul><ul><li>Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto. </li></ul><ul><li>Sus aplicaciones son múltiples: medicina forense, diagnósticos, análisis prenatales, etc. </li></ul>
  14. 16. Desventajas del “PCR” <ul><li>Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se conoce por lo menos una mínima secuencia de 20 – 40 pb. </li></ul><ul><li>Se necesitan “ primers ” específicos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar. </li></ul><ul><li>La polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN </li></ul><ul><li>Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo investigador o de cualquier otro) </li></ul>
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