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  • 1. Hereditariedade ligada aos CROMOSSOMAS SEXUAISThomas H. Morgan – embriologista, desenvolveu trabalho com as moscas DrosophilaMelanogaster (mosca da fruta).Razões para o uso de Drosophila Melanogaster:Apresenta um curto período de desenvolvimento e apresenta cromossomas muito grandes,que facilitam o seu estudo e observação. Aspeto da Drosophila Melanogaster Forma selvagem Forma mutante Corpo cinzento Corpo negro Olhos vermelhos Olhos brancos Asas longas Asas vestigiais Representamos a constituição genética das formas alternativas pela letra inicial da palavrainglesa que expressa a característica que elas manifestam. Exemplo: alelo para olhos brancos -> w (white). Quando é da forma selvagem é w+. Nas experiências de Mendel não era relevante que um determinado fenótipo pertencesse auma fêmea ou a um macho – o cruzamento recíproco não interferia nos resultados. Os resultados obtidos por Morgan eram diferentes – ao cruzar uma fêmea de olhosvermelhos com um macho de olhos brancos não obtinha os mesmos resultados de quandocruzava uma fêmea de olhos brancos com um macho de olhos vermelhos. No 1º cruzamento todos os indivíduos apresentavam olhos vermelhos, sendo 50% machose 50% fêmeas – de acordo com o previsto por Mendel. ☺ No 2º cruzamento as fêmeas têm todas olhos vermelhos e os machos olhos brancos – nãose verifica a uniformidade fenotípica dos indivíduos da primeira geração.
  • 2. COMO EXPLICAR? Na Drosophila, como na maioria das espécies animais, existe um par de cromossomaschamado cromossomas sexuais. Indivíduos que apresentam dois HOMOGAMÉTICOS cromossomas sexuais idênticos Indivíduos que apresentam dois HETEROGAMÉTICOS cromossomas sexuais diferentes entre si Como a espécie humana, as fêmeas de Drosophila, para além dos autossomas, apresentamdois cromossomas sexuais X, enquanto que os machos apresentam, para além dosautossomas, um cromossoma sexual X e outro, mais curto e praticamente desprovido degenes, Y. O sexo heterogamético é portanto o masculino. Se considerarmos que o alelo da cor branca dos olhos de Drosophila se localiza nocromossoma X, podemos justificar o resultado dos dois cruzamentos. As características hereditárias que dependem de genes localizados no cromossoma X sãocaracterísticas ligadas ao sexo. Nestes casos, os resultados obtidos no cruzamento direto e no seu recíproco sãodiferentes. Estes resultados devem-se ao facto de o cromossoma Y do macho não possuir osalelos correspondentes do cromossoma X, dado que os dois cromossomas não são totalmentehomólogos. A maior parte dos genes localizados no cromossoma X não têm alelo correspondente nocromossoma Y, pelo que existe um único alelo para esse gene e esse alelo exprime-se sempreno fenótipo dos machos, que são hemizigóticos. Os genes presentes no cromossoma Y são transmitidos DE PAI PARA FILHO. Os genespresentes no cromossoma X são transmitidos de PAI PARA FILHA e de MÃE PARA FILHO OUFILHA. Transmissão de um alelo DOMINANTE Transmissão de um alelo RECESSIVO ligado ao cromossoma X ligado ao cromossoma X O caráter exprime-se sempre nos O caráter exprime-se sempre nos homens, de uma forma mais severa do homens que nas mulheres O caráter exprime-se nas mulheres O caráter exprime-se apenas nas homozigóticas dominantes e mulheres homozigóticas recessivas ( e heterozigóticas nos homens?) Um homem afetado tem uma mãe Um homem afetado tem uma mãe afetada ou portadora afetada Uma mulher afetada tem Uma mulher afetada tem uma mãe obrigatoriamente um pai afetado e afetada ou um pai afetado uma mãe afetada ou portadora Daltonismo, hemofilia, diabetes Síndrome de Rett, hipertricose insípidos Os trabalhos de Morgan são exceções às Leis de Mendel – contudo, apoiaram a teoriacromossómica da hereditariedade.
  • 3. Exemplos de situações em que Descrição se verifica Os genes localizados no mesmo cromossoma, não sofrem geralmente, segregação independente na O gene do grupo sanguíneo Rh e meiose – ficam juntos nos mesmos gâmetas e, por o gene da eliptocitose (uma isso, os fenótipos da descendência não seguem as forma de anemia) estão proporções previstas pelas Leis de Mendel. localizados no mesmo Ligação Os fenómenos de crossing-over podem separar genes cromossoma. Estes dois fatorial ligados, o que faz com que se comportem como se cromossomas são herdados em estivessem localizados em cromossomas diferentes e bloco por 96% dos indivíduos e apareçam recombinados na descendência. Quanto 4% dos indivíduos são mais distantes estiverem dois genes no mesmo recombinantes. cromossoma, maior a probabilidade de serem separados por crossing-over. Explicação do manual Cada cromossoma tem de ter muitos genes. Os genes que se dispõem linearmente ao longo do mesmo cromossoma dizem-se emlinkage e constituem um grupo de ligação fatorial – são transmitidos em bloco. Cruzam-se indivíduos de duas linhas puras com características antagónicas. Fenotipicamente Corpo negro e x Corpo cinzento e asas asas vestigiais longas + + + + Genotipicamente bbvgvg x b b vg vg b – símbolo do alelo responsável pela cor negra (black) vg – símbolo do alelo responsável pelas asas vestigiais ( vestigials) b+ - símbolo do alelo responsável pela cor selvagem (cinzenta – DOMINANTE) vg+ - símbolo do alelo responsável pela forma selvagem das asas (longas – DOMINANTE) O cruzamento destas linhas puras resulta numa geração F1 – cujos resultadoscorrespondem a uma situação normal de diibridismo, em que os descendentes sãoHETEROZIGÓTICOS e manifestam as características do ALELO DOMINANTE. Fenótipo – Corpo cinzento e asas longas Genótipo – heterozigótico b+bvg+vgpara que se mantivessem as previsões mendelianas, deviam agora surgir quatro classesfenotípicas, que seriam:Fenótipo dos Resultados Resultadosdescendentes esperados em observados Estes resultados são explicados pelo diibridismo facto de os alelos do corpo negro e asasCorpo cinzento e 9/16 3/4 vestigiais estão situados no mesmoasas longas cromossoma – são transmitidos emCorpo negro e asas 3/16 -longas conjunto (não há segregaçãoCorpo cinzento e 3/16 - independente prevista por Mendel) –asas vestigiais correspondem a um cruzamento deCorpo negro e asas 1/16 1/4 Linhas puras em monibridismo.vestigiais
  • 4. Nem sempre os genes em linkage se comportam como uma unidade inseparável – podeacontecer, que como resultado de crossing-over durante a meiose, os genes se separarem,como se estivessem em cromossomas separados. Assim, obtém-se uma descendência qualitativamente igual à prevista numa segregaçãoindependente (em que os alelos são segregados de forma aleatória). Contudo, estes genes sóse transmitem deste modo quando há a sua separação em crossing-over, e isto ocorre muitomenos frequentemente que a transmissão em bloco. Embora possam surgir as 4 classes fenotípicas esperadas, as suas proporções sãocompletamente aleatórias. Organização e regulação do material genético Genoma – totalidade do material genético de um indivíduo (contém todos os genes). Gene – sequência de nucleótidos de uma molécula de DNA que origina uma molécula deRNA funcional. Organização do Material Genético Genoma dos procariontes Genoma dos eucariontes Várias moléculas lineares de DNA nuclear associadas a uma grande quantidade deMolécula circular de DNA associada a proteínas proteínas, especialmente histonas, formando anão histónicas, que forma o seu único cromatina. Cada molécula de DNA associada acromossoma e se concentra na região do proteínas constitui um cromossoma.nucleoide. Também possui material genético extranuclear.Algumas bactérias também possuem moléculas As mitocôndrias e cloroplastos contêm DNA quecirculares de DNA chamadas plasmídeos. codifica produtos essenciais à sua função biológica e que é muito semelhante ao DNA bacteriano. Um cariótipo organiza os cromossomas metafásicos aos pares com base no seu tamanho enoutras marcas físicas, como a posição do centrómero. O cariótipo humano tem 46 cromossomas, organizados em 23 pares. 44 são autossomas e são idênticos nos dois sexos (possuem os mesmos genes, na mesmasequencia) e 2 são heterossomas (ou cromossomas sexuais). A análise do cariótipo é útil para confirmar diagnósticos clínicos de certas doenças detransmissão hereditária – a comparação de cariótipos de diferentes espécies permiteencontrar relações evolutivas.
  • 5. Regulação do material genético Temos muitos genes no nosso corpo, mas só apenas alguns se manifestam. Tem de haverportanto uma regulação dos genes. Este processo foi estudado pelos franceses François Jacobe Jacques Monod. Os organismos unicelulares reagem às variações do meio ambiente, variando a expressãodos genes e ajustando o seu metabolismo – desenvolveram mecanismos de resposta RÁPIDOSface às alterações das condições do meio, das quais dependem muito. Nos eucariontes multicelulares, o controlo da expressão dos genes torna possível que ascélulas com o mesmo DNA possam divergir (em forma e função), tornando-se especializadas. A transcrição do DNA para mRNA é um exemplo da regulação da expressão dos genes. Modelo do Operão (principal mecanismo de controlo da expressão dos genes em bactérias) Operão Unidade funcional constituída pelos elementos descritos abaixo. Genes Conjunto de genes que codificam proteínas com funções relacionadas. estruturais Ex.: enzimas de uma determinada via metabólica Gene Sequência específica de nucleótidos do DNA à qual se liga a RNA promotor polimerase e onde tem início a transcrição Gene Sequência de DNA que controla o acesso da RNA polimerase ao operador promotor e que permite ativar ou desativar a transcrição de todos os genes estruturais Gene Encontra-se a uma determinada distância do operão, tem o seu regulador próprio promotor e codifica o repressor Repressor É uma proteína alostérica com duas formas, uma ativa e uma inativa. É específico, reconhece e liga-se apenas ao operador de um determinado operão. Explicação do funcionamento do operão lac.: Funcionamento de um operação do tipo indutivo NA AUSÊNCIA DE LACTOSE NA PRESENÇA DE LACTOSE O gene regulador determina a síntese de A lactose liga-se ao repressor, um repressor; inativando-o; O repressor bloqueia o promotor, ao O operador fica desbloqueado; ligar-se ao operador; A enzima RNA polimerase liga-se ao A enzima RNA polimerase não se liga ao promotor; promotor; Os genes estruturais são transcritos; Os genes estruturais não são transcritos; Dá-se a síntese de enzimas. Não ocorre a síntese das três enzimas.
  • 6. Explicação do funcionamento do operão trp.: Funcionamento de um operação do tipo repressivo NA AUSÊNCIA DE TRIPTOFANO NA PRESENÇA DE TRIPTOFANO O gene regulador produz um repressor O triptofano liga-se ao repressor, que está inativo; ativando-o; O operador está livre; O repressor liga-se ao operador; A RNA polimerase pode ligar-se ao A RNA polimerase não pode ligar-se promotor; ao promotor; Dá-se a transcrição; Não se dá a transcrição; Ocorre a síntese de enzimas. Não se sintetizam as enzimas. Muitos genes de um genoma se destinam a regular o funcionamento de outros genes. Os genes que se expressam numa determinada situação dependem das interações que oambiente estabelece com o DNA. Transmissão Genética de Genes Mitocôndriais O material genético contido nas mitocôndrias é transmitido pela mãe para os filhos e filhas.A razão para este facto é simples: o citoplasma (e todos os seus constituintes) que vai darorigem ao zigoto é proveniente do oócito (tem, portanto, todos os organelos celulares da mãe– incluindo a mitocôndria!); o espermatozoide, apenas contribui com o núcleo para a formaçãodo zigoto, pelo que não são transmitidas as mitocôndrias do progenitor masculino.
  • 7. Diferenças e semelhanças entre o DNA mitocondrial e o DNA nuclear. DNA mitocondrial DNA nuclearNão possui exões Possui exõesNão ocorre crossing-over Ocorre crossing-overPossui várias cópias de DNA em cadamitocôndria, permitindo que na mesma Só possui uma cadeia (com dupla hélice) decélula existam diferentes alelos para o DNA no núcleo da célulamesmo geneTaxa de mutação muito elevada Taxa de mutação pouco elevadaNão possui enzimas que reparam o DNA Possui enzimas que reparam o DNA Mutações Mutação – alteração permanente no material genético que afeta a expressão de um oumais genes. Apesar de se darem centenas de alterações do DNA por dia, as células possuem enzimas capazes de corrigir ou eliminar porções mutadas do DNA, diminuindo a hipótese de esta ser uma mutação que se manifeste fenotipicamente. Podem ser génicas ou cromossómicas. m. génicas – alteram a estrutura do DNA; m. cromossómicas – alteram a estrutura/número de cromossomas; m. silenciosas – não alteram a proteína ou a sua ação; m. letais – provocam a morte ou doenças e anomalias; m. benéficas – levam à evolução das espécies; m. prejudiciais – provocam a morte do indivíduo. Agentes mutagénicos são fatores do meio que provocam mutações em genes e/oucromossomas.
  • 8. As mutações podem ocorrer em células somáticas ou germinativas. Mutação somática Ocorre durante a replicação do DNA que precede uma divisão mitótica. Pode originar um conjunto ou um clone de células mutantes identicas entre si, que se distinguem das restantes células do indivíduo. A descendência do indivíduo não é afetada. Este tipo de mutação está na origem de certos cancros. Mutação nas células germinativas Ocorre durante a replicação do DNA que precede a meiose. A mutação afeta os gâmetas e todas as células que dela descendem após a fecundação. Mutações génicas Ocorrem quando se dá uma alteração pontual ao nível dos nucleótidos de um gene,constituindo-se uma nova versão do gene. Alteram a sequencia de nucleótidos do DNA, por substituição, adição (inserção) ouremoção (delecção) de bases. Estas mutações podem conduzir à modificação da molécula de mRNA que é transcrita apartir do DNA e à alterção da proteína produzida. O efeito desta alteração é imprevisível,dependendo de qual o tipo de mutação e qual a proteína que passa a ser codificada. Pode terefeitos benéficos e levar à evolução da espécie, ou pode ser prejudicial e causar a morte doindivíduo ou um grande numero de doenças e anomalias. Pode também ter um efeito neutro,não causando quaisquer modificações. Mutações génicas Substituição Ocorre a troca de um ou mais pares de bases. Acontece quando uma ou mais bases são adicionadas ao DNA, modificando a Inserção ordem de leitura da molécula durante a A adição/remoção de um numero replicação ou transcrição. que não seja múltiplo de três Acontece quando uma ou mais bases altera completamente a são retiradas do DNA, modificando a mensagem do gene. Delecção ordem de leitura, durante a replicação ou transcrição. Mutações cromossómicas Traduzem-se numa alteração da estrutura ou do número de cromossomas. Podem afetaruma determinada região de um cromossoma, um cromossoma inteiro ou todo o complementocromossómico de um indivíduo.
  • 9. Mutações cromossómicas numéricasTipo de Definição/causas Consequências/exemplosmutação Existe pelo menos um conjunto completo de É comum nas plantas. As Poliploidia cromossomas a mais. plantas poloplóides podem autopolinizar-se ou cruzar-se com plantas semelhantes. Entre as causas possiveis: Nos humanos embiões -fecundação de um oócito por 2 poliploides não se desenvolvem espermatozoides; e são abortados -fecundação de um gâmeta diploide (triploidia); espontaneamente. Algumas -falta de divisão do zigoto após a replicação dos células somáticas podem ser cromossomas poliploides. Existem cromossomas a mais ou a menos Anuploidias mais comuns em em relação ao numero normal. seres humanos são as Geralmente, envolve apenas um par de Aneuploidia trissomias dos cromossomas 21, cromossomas e pode ser autossómica ou nos 13, 18 e a monossomia do X. cromossomas sexuais. Aneuploidias de outros Podem distinguir-se: cromossomas não permitem o Polissomia – um ou mais cromossomas extra; desenvlvimento até ao Monossomia – um cromossoma em falta; nascimento e resultam num aborto espontâneo. As aneuploidias são causadas pela não-disjunção As aneuploidias nos dos cromossomas homólogos ou dos cromatídeos cromossomas sexuais são na anafase da meiose I ou II. melhor toleradas que as dos Um gâmeta recebe 2 cromossomas do mesmo autossomas. Síndrome. par e outro não recebe nenhum. Sindromes estudadas: Trissomia 21 – (47,XX) ou (47,XY) – SÍNDROME DE DOWN Cromossoma extra no ‘lote’ 21. Monossomia do X – (45,X0) – SÍNDROME DE TURNER Afeta apenas mulheres, que carecem de um dos cromossomas sexuais. (47,XXY) – SÍNDROME DE KLINEFELTER
  • 10. Mutações cromossómicas estruturais Tipo de Definição/Causas Consequências/Exemplos mutação Representa uma perda no material cromossómico. Delecção As delecções visíveis de cromossomas humanos estão sempre associadas a grandes incapacidades. Caracteriza-se pela repetição de uma porção de cromossoma. As duplicações são alterações cromossómicas Duplicação muito importantes sob o ponto de vistaa evolutivo, porque fornecem informação genética complementar, potencialmente capaz de assumir novas funções. Ocorre uma inversao quando um segmento cromossómico experimenta uma rotação de 180ºTranslocação em relação à posição normal, sem alterar a sua localização no cromossoma. A transferencia de uma porção de um cromossoma, ou mesmo de um cromossoma inteiro para outro não homólogo designa-se por translocação simples. As translocações mais comuns são as Inversão translocações recíprocas, havendo troca de segmentos entre cromossomas não homólogos. As translocações podem alterar drasticamente o tamanho dos cromossomas, assim como a posição do centrómero. Poliploidia Os inivíduos poliploides são indivíduos em que o número de conjuntos completos decromossomas é multiplo do numero haploide primitivo existente nos gâmetas. Apresentamcariótipos triploides (3n), tetraploides (4n) ou mesmo numeros mais elevados decromossomas. A poliploidia surge: - acidentalmente; - a partir da não-disjunção dos cromossomas durante a meiose ou mitose. Também podeacontecer que não há citocinese na repartição dos cromossomas pelas células filhas. - cruzamento entre indivíduos de espécies diferentes (o que é muito comum entre asplantas) – os indivíduos resultantes deste processo são naturalmente estéreis, uma vez quenão possuem cromossomas homologos, não podendo estes emparelhar durante a meiose. Como é que estes indivíduos se reproduzem então? Através de reprodução assexuada – no caso dos individuos que resultam do cruzamentoentre espécies diferentes, estes acabam por tornar-se ferteis apos algumas gerações, devido auma ocorrencia de uma duplicação cromossómica resultante de uma não-disjunção doscromossomas na divisão celular. A poliploidia é muitas vezes provocada em laboratório para que se obtenham plantas maisresistentes, com grandes frutos, sem caroço ou sementesm grãos de trigo maiores, etc.
  • 11. As Mutações, a tecnologia e a vida Um agente mutagénico é qualquer agente responsável por uma mutação. O processo que conduz ao aparecimento de mutações pelo agente mutagénico é amutagénese. As nossas células tem a capacidade de reparar alguns danos causados ao DNA. Há portanto,um equilíbrio entre a proliferação celular, em que as células se renovam e multiplicam e entrea morte das células. Apesar disso, este equilíbrio por vezes perde-se – umas das consequências é oaparecimento de um cancro. Um cancro (neoplasia maligna/tumor maligno) é um conjunto muito heterogéneo emultifatorial de doenças que têm em comum o facto de apresentarem sempre o crescimentode um tecido neoformado. Outra definição O cancro é uma doença genética que resulta da perda de controlo do ciclo celular. A divisãoda célula com mais frequência dá origem a uma população de células em proliferaçãodescontrolada e forma um tumor. As células cancerosas: -são pouco especializadas e com forma arredondada; -dividem-se continuamente; -invadem os tecidos adjacentes; -podem instalar-se noutros lugares do organismo. O aparecimento de cancros está normalmente associado a alterações dos mecanismos queregulam a divisão celular. Necrose – as células morrem devido à ação de substâncias tóxicas ou à falta de nutrientesessenciais. Apesar de manterem o núcleo intacto, aumentam de volume, rompe-se amembrana plasmática e verte-se o conteúdo da célula no meio extracelular, causando umapequena inflamação. Apoptose – ocorre um conjunto de fenómenosprogramados geneticamente e que levam à morte dacélula – processo mais comum. Quando as célulasapresentam anomalias – sobretudo genéticas – ou jánão são necessárias ao organismo, desencadeia-seum “suicídio” por parte das células. 1. A cromatina começa a condensar; 2. A célula isola-se das células vizinhas, compactando o citoplasma e a cromatina; 3. Uma enzima (endonuclease/enzima de restrição) fragmenta o DNA em pequenas unidades; 4. A célula fragmenta-se sem que ocorra rutura nem resposta inflamatória. Quando este equilíbrio, entre a divisão celular e a apoptose é quebrado, pode surgir um cancro. As neoplasias têm origem genética, pois resultam de alterações no DNA.
  • 12. No caso de as alterações se darem a nível dos proto-oncogenes: Estes são genes que estimulam a divisão celular, mas que estão inativos em células que não se dividem. Devido à ação de agentes mutagénicos podem tornar-se ativos, e passam a estimular permanentemente a divisão celular, passando a oncogenes. No caso de as alterações se dares ao nível dos genes supressores tumorais: Estes genes têm a função de regulam a proliferação celular, contrabalançando a ação dosproto-oncogenes, inibindo-os. Estes genes estão normalmente ativos (bloqueiam a divisãocelular), mas devido à influencia de agentes mutagénicos podem desativá-los, fazendo comque as células se continuem a dividir. As infeções por vírus contribuem para o aparecimento de cancro pela integração domaterial genético do vírus no DNA das células infetadas. O DNA viral pode ser inserido numlocal onde destrua a atividade de um gene supressor tumoral ou converta um proto-oncogenenum oncogene. Todos os cancros são genéticos, mas quase nenhuns são hereditários. Nestes casos, aalteração genética está presente em todas as células do indivíduo, manifestando-se muitocedo. A maioria dos cancros é esporádica (95%) e surgem como resultado de mutações nascélulas somáticas. Estas alterações são promovidas pela interação entre o genoma doindivíduo e o ambiente. As componentes genética e ambiental estão sempre presentes, apesar de nem sempreassumirem igual importância. Ex: melanoma – radiações solares + alteração de um gene supressor tumoral (MTS)localizado no cromossoma 9. Todos os dias surgem neoplasias no nosso corpo, que são eliminadas por apoptose. Quandoisto não acontece, inicia-se um cancro, que corresponde ao momento em que estas células seproliferam e invadem tecidos vizinhos. Pode seguir-se um processo de metastização, em que as células cancerosas se podemmovimentar através da corrente sanguínea ou linfática e continuar a desenvolver-se noutraspartes do corpo. Fundamentos da Engenharia Genética A engenharia genética permite manipular diretamente os genes de determinadosorganismos com objetivos práticos. Após a descoberta de que também o DNA podia ser manipulado, a primeira “ferramenta”da engenharia genética foram as enzimas de restrição (ou endonucleases). Estas enzimas cortam a hélice dupla do DNA em zonas específicas, sempre que asencontram. Funcionamento das enzimas de restrição Os vírus invadem as bactérias e afetam o seu DNA. Algumas bactérias têm um mecanismo de defesa contra os vírus, que consiste na produçãode enzimas de restrição.
  • 13. Ou seja: 1. As enzimas cindem a cadeia de DNA do vírus quando encontram uma determinadasequência de pares de bases. 2. Estas enzimas atuam em pontos específicos (ZONAS DE RESTRIÇÃO), catalisando odesdobramento do DNA em fragmentos menores. 3. Estes fragmentos possuem nas extremidades a sequência de nucleótidos reconhecidapela enzima de restrição – são constituídos por cadeia simples ligada a cadeia dupla echamam-se extremidades coesivas. As extremidades coesivas podem ligar-se por complementaridade a outro DNA. Intervêm asligases do DNA, que catalisam o processo que permite que fragmentos de DNA se voltem aligar. Para a transferência destes genes, é também necessária a existência de um vetor, que seráa entidade que leva o material genético do genoma de onde foi retirado para o genoma que ovai receber. Os plasmídeos das bactérias são exemplos de vetores. Técnica do DNA recombinante A técnica do DNA recombinante permite combinar na mesma molécula de DNA genesprovenientes de fontes diferentes, mas não necessariamente de espécies diferentes, obtendouma molécula de RNA recombinante (rDNA). Nesta técnica, recorre-se a enzimas de restrição para cortar o DNA em pontos específicos ea ligases do DNA para reconstruir a molécula. Obtenção e expressão da molécula de rDNA: 1. Seleção de uma molécula de DNA (a integrar) contendo um gene com interesse, que sepretende transferir e clonar; seleção de um vetor adequado (plasmídeo); 2. A molécula de DNA e o vetor são tratados com a mesma enzima de restrição, que cortaas duas moléculas em regiões com a mesma sequência de nucleótidos; 3. Misturam-se os fragmentos de restrição da molécula de DNA e o vetor, adicionandoligases do DNA. O vetor e os fragmentos de restrição emparelham pelas extremidades coesivase a ligase estabelece a ligação entre eles; 4. O vetor, contendo o DNA dador, é transferido para uma célula/organismo recetor; 5. O DNA dador é incorporado no genoma da célula/organismo recetor, que passa apossuir um DNA recombinante; Os plasmídeos possuem genes que lhes conferem resistência a um antibiótico, permitindolocalizar as bactérias que têm o DNA recombinante. O cultivo de bactérias que forammisturadas com plasmídeos num meio com esse antibiótico, é possível isolar as bactérias queresistem – essas têm certamente os plasmídeos recombinantes, porque as que não têmdesaparecem com a aplicação do antibiótico. Os vírus também podem ser utilizados como vetores. As células hospedeiras dos genes jánão são só bactérias, mas podem ser outras células, como leveduras e mesmo célulaseucarióticas. São comuns as plantas e os animais em cujo genoma foram introduzidos genes quedeterminam características vantajosas, constituindo os OGM. A técnica do rDNA é utilizada, por exemplo, na produção de insulina humana.
  • 14. Técnica do DNA complementar Os procariontes são organismos muito utilizados em Engenharia Genética como recetoresde DNA estranho porque: São fáceis de cultivar, Têm um crescimento rápido, Processos bioquímicos bem conhecidos. No entanto, os seres procariontes não processam o mRNA e se, em alternativa, recebemgenes com intrões, não são capazes de os retirar e a proteína produzida não é funcional. Este problema é ultrapassado pela obtenção e transferência de DNA complementar oucDNA. Para a técnica de DNA complementar são necessários: Molécula de mRNA; Transcriptase reversa (enzima que catalisa a formação da cadeia complementar do DNA – transcriptase porque é um processo de transcrição, reversa porque é inverso ao processo de transcrição da molécula de DNA em mRNA); DNA polimerase – que catalisa a formação da cadeia complementar de DNA; Nucleótidos livres. O cDNA é uma molécula de DNA sem intrões, que é diretamente transcrita numa moléculade mRNA funcional. O processo de obtenção de cDNA é o seguinte: 1. Isola-se uma molécula de mRNA funcional das células; 2. Adiciona-se a trancriptase reversa e nucleótidos livres; 3. Junta-se uma enzima que degrada o mRNA que serviu de molde e DNA polimerase,que catalisa a formação da cadeia complementar do DNA. O cDNA pode ser inserido num procarionte através de um vetor contendo o promotor esequências reguladoras. Reações de polimerização em Cadeia – PCR O PCR é uma técnica que permite amplificar qualquer porção de DNA fora das células. Esta técnica é útil para quando é necessária uma determinada quantidade de DNA que nãose possui, mas que pode ser obtido através desta técnica. Esta técnica consiste nas seguintes etapas: 1. O fragmento de DNA a amplificar é aquecido de modo a separar as duas cadeias dadupla hélice, quebrando as ligações entre os aminoácidos - DESNATURAÇÃO; 2. Obtêm-se duas cadeias simples; 3. São adicionados nucleótidos livres e DNA polimerase resistente ao calor – esta DNApolimerase é obtida a partir de microrganismos termófilos, uma vez que vivem a temperaturasmuito elevadas, e aguentam ser mantidos às mesmas, enquanto a DNA polimerasenormalmente usada acaba por sofrer também DESNATURAÇÃO quando sujeita a temperaturasmuito elevadas; 4. A DNA polimerase catalisa a formação das cadeias complementares, restituindo adupla hélice, formando duas moléculas de DNA a partir de uma; 5. Arrefecimento das novas moléculas; 6. Repetição do processo – em cada ciclo a quantidade de DNA é duplicada. Esta técnica permite a obtenção de biliões de cópias de uma porção de DNA em poucas horas e é executada por aparelhos
  • 15. DNA fingerprint No genoma humano existem sequências de DNA repetitivas que são reconhecidas ecortadas por determinadas enzimas de restrição. O DNA fica então fragmentado – estes fragmentos apresentam tamanhos e composiçãodiferentes, variando de pessoa para pessoa. Quando submetidos a técnicas como a eletroforese, o resultado é um padrão de bandasque difere de indivíduo para individuo, sendo possível identificar uma pessoa através destasbandas, com quase (ou mesmo) 100% de certezas. O processo de identificação por DNA fingerprint é feito da seguinte forma: 1. Obtenção de fragmentos da molécula de DNA, colocando em recipientes amostras deDNA e enzimas de restrição, que a fragmentam nas respetivas zonas de restrição; 2. Os fragmentos obtidos são colocados num meio apropriado (por exemplo gel) equando submetidos a um campo elétrico, deslocam-se até à extremidade oposta de ondeforam inseridos, a velocidades diferentes, consoante o tamanho e “peso” do fragmento; 3. Ao fim de algum tempo, os fragmentos localizam-se em diferentes secções do gel,permitindo identificar um indivíduo pelo padrão obtido por eletroforese. Técnica Aplicações Investigação fundamental – torna possível isolar genes de organismos complexos e estudar as suas funções a nível molecular Obtenção de organismos geneticamente modificados (OGM) – organismos em cujo genoma foram introduzidos genes que conferem DNA características vantajosas. São usados:Recombinante -na produção de alimentos em maior quantidade e qualidade; (rDNA) -na produção de grandes quantidades de substancias com aplicação médica ou farmacêutica; -na com aplicação industrial; -biorremediação. DNAComplementar Obtenção de cópias de genes que codificam produtos com interesse. (cDNA)Polimerizaçãopor reação em Obtenção de grandes quantidades de DNA em pouco tempo. cadeia (PCR) -Investigação criminal, forense e histórica;DNA fingerprint -Determinação de paternidade.